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基因组靶向治疗含有融合基因的细胞的方法

阅读：57发布：2020-05-13

专利汇可以提供基因组靶向治疗含有融合基因的细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及治疗具有癌症或肿瘤或恶变前病症的患者的方法。它至少部分基于以下发现：特异性靶向融合基因的基因组编辑技术可诱导具有该融合基因的除前列腺癌细胞之外的癌细胞(例如肝细胞癌细胞)中的细胞死亡。本发明提供用于治疗癌症患者的方法，包括进行靶向对象的一个或多个细胞中存在的融合基因的基因组编辑技术，以产生抗癌作用。，下面是基因组靶向治疗含有融合基因的细胞的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种治疗对象的方法，包括确定获自对象的样品中至少一种融合基因的存在，然后进行靶向该对象的一个或多个细胞中的所述融合基因的基因组编辑技术，以实现抗肿瘤作用，其中该对象没有前列腺癌。
2.一种治疗患癌对象的方法，包括确定获自对象的样品中至少一种融合基因的存在，然后进行靶向该对象的癌症的一个或多个细胞中的所述融合基因的基因组编辑技术，以产生抗癌作用，其中该对象没有前列腺癌。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述融合基因选自下组：TRMT11-GRIK2，
SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1及其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述对象具有肿瘤或恶变前病症。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述对象患有癌症。
6.如权利要求2或5所述的方法，其中，所述癌症是乳腺癌，肝癌，肺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，胰腺癌，卵巢癌，胃癌，甲状腺癌，多形性胶质母细胞瘤，结直肠癌，弥漫性大B细胞淋巴瘤，肉瘤，急慢性淋巴细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤或食管腺癌。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述融合基因通过FISH分析检测。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述融合基因通过反转录聚合酶链式反应检测。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述融合基因是MAN2A1-FER。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述融合基因是TMEM135-CCDC67。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述融合基因是PTEN-NOLC1。
12.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述基因组编辑技术使用CRISPR/Cas系统。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述CRISPR/Cas系统切割融合基因基因组序列中的序列，以将核酸插入该融合基因中，以诱导细胞死亡。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述CRISPR/Cas系统采用选自下组的Cas核酸内切酶：Casl，CaslB，Cas2，Cas3，Cas4，Cas5，Cas6，Cas7，Cas8，Cas9(也称为Csnl或Csxl2)，CaslO，Csyl，Csy2，Csy3，Csel，Cse2，Cscl，Csc2，Csa5，Csn2，Csm2，Csm3，Csm4，Csm5，Csm6，Cmrl，Cmr3，Cmr4，Cmr5，Cmr6，Csbl，Csb2，Csb3，Csxl7，Csxl4，CsxlO，Csxl6，CsaX，Csx3，Csxl，CsxlS，Csfl，Csf2，CsO，Csf4，Cpfl，c2cl，c2c3，Cas9HiFi及其组合。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述Cas核酸内切酶是Cas9。
16.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述基因组编辑技术包括：用(i)包含编码Cas蛋白和两种向导RNA(gRNA)的核酸的载体，和(ii)包含供体核酸和一种或多种靶向序列的载体转导一个或多个细胞或癌细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中，一种gRNA与融合基因的一个基因中的区域互补，而另一种gRNA与该融合基因的第二基因中的区域互补。
18.如权利要求16所述的方法，其中，所述供体核酸编码HSV-1胸苷激酶。
19.如权利要求16或18所述的方法，其中，该方法还包括给予所述对象治疗有效量的更昔洛韦或缬更昔洛韦。
20.如权利要求16所述的方法，其中，一种gRNA与MAN2A1-FER融合基因的MAN2A1基因中的区域互补，而另一种gRNA可与FER基因中的区域互补。
21.如权利要求16所述的方法，其中，一种gRNA与TMEM135-CCDC67融合基因的TMEM135基因中的区域互补，而另一种gRNA可与CCDC67基因中的区域互补。
22.一种治疗对象的方法，包括，确定该对象的一个或多个细胞是否包含选自下组的融合基因：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1及其组合；并且其中，若所述一个或多个细胞包含融合基因，则进行靶向所述对象的一个或多个细胞中存在的融合基因的基因组编辑技术，其中该对象没有前列腺癌。
23.一种治疗具有肿瘤或恶变前病症的对象的方法，包括，确定该对象的一个或多个细胞是否包含选自下组的融合基因：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1及其组合；并且其中，若所述一个或多个细胞包含融合基因，则进行靶向所述对象的一个或多个细胞中存在的融合基因的基因组编辑技术，其中该对象没有前列腺癌。
24.如权利要求21所述的方法，其中，所述对象的一个或多个细胞是癌细胞。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述癌细胞是乳腺癌，肝癌，肺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，胰腺癌，卵巢癌，胃癌，甲状腺癌，多形性胶质母细胞瘤，结直肠癌，弥漫性大B细胞淋巴瘤，肉瘤，急慢性淋巴细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤或食管腺癌细胞。
26.如权利要求2-3、5-21和24-25中任一项所述的方法，其中，所述癌症不是肺腺癌，多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌。
27.一种用于进行靶向细胞中存在的融合基因的基因组编辑技术的试剂盒，其中所述细胞不是前列腺癌细胞，其中所述试剂盒包含：(i)含有编码Cas蛋白和一种或多种向导RNA(gRNA)的核酸的载体，和(ii)含有供体核酸和一种或多种靶向序列的载体。
28.如权利要求27所述的试剂盒，其中，一种gRNA与融合基因的一个基因中的区域互补，而另一种gRNA与该融合基因的第二基因中的区域互补。
29.如权利要求27所述的试剂盒，其中，所述供体核酸编码HSV-1胸苷激酶。
30.如权利要求27、28或29所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含更昔洛韦和/或缬更昔洛韦。
31.如权利要求27所述的试剂盒，其中，所述融合基因选自下组：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1及其组合。
32.如权利要求27所述的试剂盒，其还包含用于对一种或多种融合基因进行PCR分析的核酸引物，所述融合基因选自下组：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，MTOR-TP53BP，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1或PCMTD1-SNTG11。
33.如权利要求27所述的试剂盒，其还包含用于对一种或多种融合基因进行FISH分析的核酸探针，所述融合基因选自下组：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，MTOR-TP53BP1，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1。
34.如权利要求27所述的试剂盒，其中，所述细胞是来自乳腺癌，肝癌，肺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，胰腺癌，卵巢癌，胃癌，甲状腺癌，多形性胶质母细胞瘤，结直肠癌，弥漫性大B细胞淋巴瘤，肉瘤，急慢性淋巴细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤或食管腺癌细胞的细胞。
35.如权利要求27所述的试剂盒，其中，所述细胞是肿瘤和/或恶变前细胞。
36.如权利要求27所述的试剂盒，其中，所述Cas蛋白是Cas9或Cas9D10A。
37.如权利要求27所述的试剂盒，其中，所述细胞不是来自肺腺癌，多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌的细胞。
38.一种能够用于在治疗或预防对象中癌症的方法中进行靶向基因组编辑的试剂，所述方法包括(i)确定该对象的样品是否包含融合基因；和(ii)若该样品包含一种或多种融合基因，则采用该试剂进行基因组编辑操作，以靶向该对象中的一个或多个癌细胞中的融合基因，其中所述癌症不是前列腺癌。
39.一种能够用于在治疗对象的方法中进行靶向基因组编辑的试剂，所述方法包括(i)确定该对象的样品是否包含融合基因；和(ii)若该样品包含一种或多种融合基因，则采用该试剂进行基因组编辑操作，以靶向该对象中的一个或多个细胞中的融合基因，其中所述对象没有前列腺癌。
40.一种能够用于在治疗具有肿瘤或恶变前病症的对象的方法中进行靶向基因组编辑的试剂，所述方法包括(i)确定该对象的样品是否包含融合基因；和(ii)若该样品包含一种或多种融合基因，则采用该试剂进行基因组编辑操作，以靶向该对象中的一个或多个细胞中的融合基因，其中所述对象没有前列腺癌。
41.如权利要求38、39或40所述的试剂，其中，所述试剂是Cas9蛋白。
42.如权利要求41所述的试剂，其中，所述Cas9蛋白是Cas9D10A。
43.如权利要求38所述的试剂，其中，所述癌症是乳腺癌，肝癌，肺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，胰腺癌，卵巢癌，胃癌，甲状腺癌，多形性胶质母细胞瘤，结直肠癌，弥漫性大B细胞淋巴瘤，肉瘤，急慢性淋巴细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤或食管腺癌。
44.如权利要求38所述的试剂，其中，所述癌症不是肺腺癌，多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌。
45.一种用于治疗具有包含一种或多种融合基因的一个或多个细胞的对象的组合物，所述融合基因选自下组：TMEM135-CCDC67，TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1及其组合，所述组合物包含用于靶向所述一个或多个细胞中存在的一种或多种融合基因的基因组编辑技术中的一种或多种试剂，其中所述对象没有前列腺癌。
46.如权利要求45所述的组合物，其中，用于基因组编辑技术的一种或多种试剂包含一种或多种向导RNA和核酸内切酶。
47.如权利要求46所述的组合物，其中，所述核酸内切酶是Cas9。
48.如权利要求45-47中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种向导RNA包含，与融合基因的一个基因中的区域互补的一种gRNA，和与该融合基因的第二基因中的区域互补的第二gRNA。
49.如权利要求45-47中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种向导RNA包含与一种或多种融合基因的染色体断裂点中的特定序列互补的一种gRNA。
50.一种确定用于具有含一种或多种融合基因的一个或多个细胞的对象的治疗的方法，包括
i)提供来自该对象的样品；
ii)确定该对象的一个或多个细胞是否包含选自下组的一种或多种融合基因：
TMEM135-CCDC67，TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1及其组合；和
iii)若在所述一个或多个细胞中检测到一种或多种融合基因，则指示进行基因组编辑技术，其中该基因组编辑技术靶向所述一个或多个细胞中检测到的一种或多种融合基因，并且其中，所述对象没有前列腺癌。
51.如权利要求50所述的方法，其中，所述基因组编辑技术采用CRISPR/Cas9系统进行。

说明书全文

基因组靶向治疗含有融合基因的细胞的方法

[0001] 优先权信息

[0002] 本申请要求于2016年12月13日提交的美国临时专利申请号62/433,608和2017年10月16日提交的美国临时专利申请号62/572,960的优先权，其内容通过引用其全文纳入本
文。

[0003] 资助信息

[0004] 本发明是在美国国立卫生研究院授予的基金号CA098249和CA190766和由美国陆军医学研究与装备司令部授予的基金号W81XWH-16-1-0541和W81XWH-16-1-0364的政府支
持下完成的。政府对本发明拥有一定的权利。

[0005] 1.介绍

[0006] 本发明涉及通过进行基因组靶向技术治疗携带一种或多种特定融合基因的患者的方法。
2.背景技术

[0007] 最初发现规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)是原核细胞中针对外来病原体的免疫防御机制(Mojica等(2005)J.of Molecular Evolution 60:
174-182)。发现Cas9(II型CRISPR/Cas系统的蛋白质)具有DNA切割活性。Cas9的核酸酶活性可由CRISPR RNA和与基因组中的靶向DNA序列互补的反式激活型CRISPR RNA指导(Jinek等
(2012)Science 337:816-821)。由于可以将反式激活型CRISPR RNA和CRISPR RNA制成含有
两种RNA物质的全部功能的嵌合RNA，因此产生人工融合RNA序列(也称为向导RNA(gRNA))以
将Cas9的活性靶向靶DNA序列(Esvelt等(2014)eLife:e03401)。存在于Cas9的催化结构域
中的D10A突变将其转化为在靶DNA处产生单核苷酸断裂的切口酶(Jinek等.(2012)Science
337:816-821)。靶DNA的双切口可使基因组编辑特异性增加50-1500倍(Ran等.(2013)Cell
154:1380-1389)，脱靶率低至1/10,000。这种特异性可使体细胞基因组靶向成为治疗人类
疾病的可行方法。

[0008] 在美国，前列腺癌是男性中观察到的最常见的恶性肿瘤之一。2014年，前列腺癌的死亡率达到27540，是男性第二大致命癌症(Siegel等.(2015)A Cancer Journal For Clinicians 65:5-29))。如WO 2015/103057和WO 2016/011428中所公开的，在已经显示出
复发和致死的前列腺癌中鉴定了由染色体重排产生的许多融合基因。这些融合基因的表达
在侵袭性前列腺癌中广泛存在，但不存在于正常组织中。WO2016/011428公开了融合基因
TMEM135-CCDC67的染色体断裂点的基因组靶向，其导致小鼠中异种移植的前列腺癌的细胞
死亡和缓解。

[0009] 一般而言，在美国，癌症是导致死亡的主要原因之一。仅在美国，2015年癌症死亡率就达到了595690，成为心血管疾病后死亡的第二大致命原因(Siegel等.(2016)A Cancer Journal For Clinicians 66(1):7-30)。癌症的治疗，特别是转移性癌症的治疗仍然存在问题，并且癌症的治愈仍然是难以捉摸的。因此，本领域仍需要治疗癌症的方法。

[0010] 3.发明概述

[0011] 本发明涉及治疗患有癌症或肿瘤或恶变前病症的患者的方法。它至少部分基于以下发现：特异性靶向融合基因的基因组编辑技术可诱导癌细胞中的细胞死亡，例如具有该
融合基因的除前列腺癌细胞之外的癌细胞，例如肝细胞癌细胞。

[0012] 在各种非限制性实施方式中，本发明提供了治疗携带融合基因的对象的方法。例如但不限于，对象可患有癌症，恶变前病症或肿瘤病症。在某些实施方式中，本发明的方法包括进行靶向对象的一个或多个癌细胞内存在的融合基因的基因组编辑技术。此类融合基
因的非限制性实例包括TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1。在某些实施方式中，融合基因是PTEN-NOLC1。在某些实施方式中，融合基因是MAN2A1-FER。在一些实施方式中，癌症不是前列腺癌。在某些实施方式中，癌症不是肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌。

[0013] 在某些非限制性实施方式中，本发明还提供了用于进行治疗携带融合基因的对象的方法的试剂盒。例如非限制性地，对象可患有癌症，恶变前病症或肿瘤病症。在某些实施方式中，本发明的试剂盒可包含一种或多种载体或质粒，其包含编码Cas9蛋白的核酸，例如Cas9D10A。在某些实施方式中，所述一种或多种载体可以进一步包含对融合基因特异(例如对融合基因的断裂点和/或融合基因断裂点侧翼的序列特异)的一种或多种gRNA。

[0014] 在某些实施方式中，本发明的试剂盒还可包括包含核酸的一种或多种载体或质粒，所述核酸在表达时导致细胞死亡。在某些实施方式中，核酸编码HSV-1胸苷激酶。在某些实施方式中，该载体还可包含与融合基因内的序列互补的一个或多个靶向序列，以促进核
酸的同源重组和插入。在某些实施方式中，当核酸编码HSV-1胸苷激酶时，试剂盒还可包含更昔洛韦和/或缬更昔洛韦。

[0015] 在某些实施方式中，试剂盒可包括用于PCR分析的核酸引物或用于RNA原位分析的核酸探针，以检测来自对象的样品中一种或多种融合基因的存在。在某些非限制性实施方
式中，所述一种或多种融合基因可选自下组：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-
TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，MTOR-TP53BP，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG11及其组合。
4.附图说明

[0016] 图1.独特的融合基因事件。左图：融合基因的基因组，转录方向，连接基因之间的距离和融合的方向的微型图。中图：融合基因的代表性测序色谱图。显示了连接基因序列(SEQ ID NO:45-52)。右图：融合基因翻译产物的图表。蓝色驱动基因翻译产物；红色-乘客基因(passenger gene)翻译产物；橙色-新型翻译产物，其归因于来自非基因区域的移码或翻译产物。

[0017] 图2.融合基因的基因组断裂点分析。上图：融合基因基因组，转录方向，连接基因之间的距离和染色体连接的方向的微型图。中图：融合基因组和转录方向的微型图。下图：代表性的测序色谱图，包括染色体的连接断裂点(SEQ ID NO:53-55)。

[0018] 图3A-B.PTEN-NOLC1融合基因(A)PTEN-NOLC1融合转录物。上图：PTEN和NOLC1基因的基因组，转录方向，连接基因之间的距离和融合的方向的微型图。中图：PTEN-NOLC1转录物的代表性测序色谱图。显示了连接基因序列。下图：融合转录物的翻译产物图。蓝-头部基因翻译产物；红-尾部基因翻译产物。(B)PTEN和NOLC1基因组重组和FISH探针位置的示意
图。

[0019] 图4.MAN2A1-FER的基序分析。MAN2A1，FER和MAN2A1-FER融合蛋白的功能结构域和在不同细胞系中观察到MAN2A1-FER融合基因的染色体断裂点图。在融合基因MAN2A1-FER
中，FER的N末端的SH2和FHC结构域缺失。这些结构域被糖苷水解酶和α-甘露糖苷酶中间结构域(来自MAN2A1)取代。

[0020] 图5.基因组编辑的示意图，其靶向CCNH-C5orf30阳性的癌细胞中的融合基因断裂点。前列腺癌病例3T中的基因组重组在染色体5中产生断裂点，其将CCNH的内含子6与
C5orf30的内含子1连接。包含原型间隔区相邻基序(PAM)序列的23bp的指导RNA(gRNA)被设
计为对断裂点区域具有特异性。将对应于该靶序列的DNA序列人工连接到含有gRNA和Cas9
的剩余部分的载体中。将该序列重组并包装到重组病毒(腺病毒或慢病毒)中。将无启动子
单纯疱疹病毒1型(HSV-1)胸苷激酶构建进入腺病毒的穿梭载体，与来自CCNH外显子7的内
含子/外显子接合点的剪接标签序列一起。还将来自各侧围绕CCNH-C5orf30断裂点的500bp
序列连接到穿梭载体中，以产生有效的同源重组以完成供体DNA构建。将载体重组并包装到AdEasy中以产生重组病毒。可将这些病毒给予呈CCNH-C5orf30融合转录物阳性的癌症患者
或动物。这导致供体DNA插入靶位点(融合断裂点)。由于重组病毒中的HSV-1TK是无启动子
的(promoterless)，如果HSV-1TK cDNA不整合到转录活性基因组中，则不会发生转录。然
而，如果HSV-1TK整合到患者的CCNH-C5orf30的靶位点，则HSV-1TK的转录是活跃的，并且当给予患者更昔洛韦(ganciclovir)或其口服同系物缬更昔洛韦(valganciclovir)时，同系
物容易通过HSV-1TK转化为三磷酸鸟嘌呤类似物并整合进入癌细胞的基因组中。这导致
CCNH-C5orf30阳性的细胞中DNA延伸停止。

[0021] 图6.融合基因的示意图。左图：融合伴侣基因组的示意图。显示了遗传基因座，伴侣之间的距离，转录方向和融合方向。中图：围绕每个融合基因的融合点的桑格测序的直方图(SEQ ID NO:40-44)。右图：融合基因的预测蛋白质产物。蓝色：头部基因蛋白质；黄色：移码翻译；红色：尾部。

[0022] 图7.ZMPSTE24-ZMYM5融合形成的示意图。指示了功能结构域。ZMPSTE24和ZMYM4之间的融合形成产生自ZMPSTE24的C末端的159个氨基酸截短和自ZMYM4的N末端的1315个氨
基酸截短。基序分析表明，ZMPSTE24-ZMYM4融合将从ZMPSTE24中去除约50％的肽酶结构域
并从ZMYM4中移除所有锌指，但将保留完整的ZUF3504(未知功能结构域)和凋亡抑制剂结构
域。

[0023] 图8.CLTC-ETV1融合形成的示意图。指示了功能结构域。CLTC-ETV1融合在ETV1中保留了基本上完整的转录结构域，并从CLTC中缺失了3个网格蛋白结构域。ETV1的N末端截
短消除了ETV1的所有这些调节元件。

[0024] 图9.ACPP-SEC13融合形成的示意图。指示了功能结构域。在ACPP-SEC13融合中，仅保留ACPP的N-末端72个氨基酸，并且超过2/3的磷酸酶结构域被截短，而SEC13从其N-末端丢失196个氨基酸并且缺失3个WD-重复结构域。

[0025] 图10.DOCK7-OLR1融合形成的示意图。指示了功能结构域。DOCK7-OLR1不产生嵌合蛋白。DOCK7和OLR1的单独翻译发生在融合转录物上。融合基因使DOCK的胞质分裂区域的显著部分缺失，而融合转录物将产生完整的OLR1蛋白。

[0026] 图11.PCMTD1-SNTG1融合形成的示意图。指示了功能结构域。PCMTD1-SNTG1融合不产生嵌合蛋白。PCMTD1-SNTG1融合产生截短的PCMTD1，其去除PCMTD1的一半甲基转移酶结
构域，并且SNTG1保持完整。

[0027] 图12.SLC45A2-AMACR嵌合蛋白的示意图。SLC45A2和AMACR之间的融合导致SLC45A2中三分之二的(MFS)结构域的截短，但在很大程度上保留了AMACR的CoA-转移酶结
构域。SLC45A2-AMACR产生嵌合蛋白，其具有SLC45A2的N末端187个氨基酸和AMACR的C末端
311个氨基酸。SLC45A2-AMACR用来自AMACR的完整消旋酶结构域替换SLC45A2的5跨膜和胞
质结构域，同时使胞外和N末端跨膜结构域保持完整。

[0028] 图13A-C.将EGFP-tk引入TMEM135-CCDC67融合基因断裂点的策略示意图。(A)TMEM135-CCDC67染色体断裂点的图示和桑格测序。转录方向用箭头表示。(B和C)将EGFP-tk引入TMEM135-CCDC67断裂点的策略示意图。gRNA-和gRNA+的位置用框表示。将这些gRNA与
Cas9D10A连接到VQAd5-CMV穿梭载体中并重组到pAd5病毒中。另外，设计584bp的TMEM135内含子13序列和561bp的CCDC67内含子9序列以夹住无启动子的EGFP-tk cDNA，连接进入
PAdlox穿梭载体并重组进入腺病毒。将来自TMEM135的外显子14的剪接受体和剪接供体分
别插入TMEM内含子13和EGFP-tk之间和EGFP-tk和CCDC67内含子9之间，以允许发生合适的
EGFP-tk RNA剪接。用这些重组病毒感染含有TMEM135-CCDC67染色体断裂点的细胞。通过融合头部基因启动子，整合的EGFP-tk在这些细胞中转录，剪接并翻译成EGFP-tk的蛋白质产
物，其进而通过将更昔洛韦转化为更昔洛韦三磷酸来阻断DNA合成。

[0029] 图14.qPCR定量转化的前列腺癌细胞基因组中TMEM135-CCDC67断裂点和pCMV载体序列的相对拷贝数。使用表2中列出的引物，通过qPCR针对β-肌动蛋白或TMEM135-CCDC67断裂点定量1微克PC3BP(用pCMV-TMEM135int13-CCDC67int9转化的PC3细胞)或DU145BP(用pCMV-TMEM135int13-CCDC67int9转化的DU145细胞)或PC3CMV(用pCMVscript转化的PC3细胞)或
DU145CMV(用pCMVscript转化的DU145细胞)的基因组DNA。分别用已知拷贝数的BP和β-肌动蛋白的连续滴定产生的标准曲线拟合BP和β-肌动蛋白的拷贝数。绘制BP/β-肌动蛋白比率。

[0030] 图15A-I。靶向MAN2A1-FER断裂点的基因组疗法。(A)MAN2A1-FER融合基因的gRNA和重组供体腺病毒的设计。上图：HUH7细胞MAN2A1-FER染色体断裂点的桑格测序图；中图：
pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14的gRNA设计；下图：pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14的同源DNA序列和EGFP-tk的设计。剪接受体和供体序列对应于MAN2A1的内含子13-外显子14和FER的外显子15-内含子15的连接序列。(B)MAN2A1-FER在HUH7细胞中的表达。泳道1和2：来自HUH7和HEP3B细胞的蛋白质提取物的免疫印迹，其用对FER或GAPDH有特异性的抗体。显示了MAN2A1-FER(MF)和FER蛋白。泳道3和4：来自HUH7和HEP3B细胞的RNA的RT-PCR，其用对MAN2A1-FER(MF)或β-肌动蛋白具有特异性的引物。(C)使用重组Cas9，化脓性链球菌和体外转录的gRNA-或gRNA+，如图所示，在BamH1线性化的pTAMAN2A1int13-FERint14载体上进行体外切割测定。对于gRNA-，切割产生pTAMAN2A1int13-FERint14载体的2446和1906bp片段，对于gRNA+，产生2484和1906bp。(D)HUH7或HEP3B细胞的感染导致EGFP-tk在HUH7而非HEP3Bint13 int14 int13
细胞中表达。用pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1 -gRNAFER (Ad-MF)和pAD-MAN2A1 -
EGFP-tk-FERint14(Ad-MF-EGFP-tk)感染HUH7和HEP3B细胞。Cas9D10A-RFP的表达用红色荧光表示，而表达EGFP-tk用绿色表示。用pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9(Ad-gTC)和pADTMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9(Ad-TC-EGFP-tk)感染的HUH7细胞用作特异性对照。(E)通过流式细胞术定量EGFP-tk整合/表达。(F)用更昔洛韦杀伤HUH7细胞。用pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14(Ad-MF)感染HUH7或HEP3B细胞。然后将这些细胞与不同浓度的更昔洛韦孵育24小时。然后通过流式细胞仪用藻红蛋白标记的膜联蛋白V定量细胞死亡。用pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-
gRNACCDC67int9/pAD-TMEM135int13-EGF P-tk-CCDC67int9(Ad-TC)感染的HUH7细胞用作特异性对照。(G)将HUH7和HEP3B细胞异种移植到SCID小鼠的皮下区域。在治疗前使这些肿瘤生
长2周。用指定的病毒加更昔洛韦(G，80mg/kg)或PBS(P)处理这些小鼠。所示药物通过腹膜注射每周施用3次，直至来自对照处理的所有小鼠都死亡。每周测量肿瘤体积。(H)用
MAN2A1-FER断裂点疗法治疗的小鼠没有癌症转移。(I)经过MAN2A1-FER断裂点治疗的小鼠
没有死亡率。

[0031] 图16A-B.(A)用Ad-TC或pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-F ERint14(Ad-MF)处理的HUH7或HEP3B肿瘤中Cas9D10A和HSV1-tk的表达。绿色箭头表示未染色的小鼠基质细胞。(B)基因组疗法诱导含有融合基因断裂点的异种移植癌的细胞凋亡。对用Ad-TC或Ad-MF处理的PC3BP，DU145BP，PC3CMV，DU145CMV或HUH7异种移植癌进行末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定。

[0032] 图17A-C.Pten-NOLC1融合。(A)Pten-NOLC1融合的示意图。上图：融合基因的基因组，转录方向，连接基因之间的距离和融合的方向的微型图。中图：融合转录物的代表性测序色谱图。显示了连接基因序列。下图：Pten-NOLC1融合基因翻译产物的图表。蓝-头部基因翻译产物；红-尾部基因翻译产物。(B)荧光原位杂交表明前列腺癌细胞中的基因组重组。
Pten和NOLC1基因组重组和FISH探针位置的示意图。显示了正常前列腺上皮细胞和Pten-
NOLC1融合阳性的癌细胞的代表性FISH图像。橙色表示探针1；绿色表示探针2。融合信号用绿色箭头表示。(C)Pten-NOLC1融合的基因组断裂点分析。上图：融合基因基因组，转录方向，连接基因之间的距离和染色体连接的方向的微型图。中图：融合基因组和转录方向的微型图。下图：代表性的测序色谱图，包括染色体的连接断裂点。指示了Pten的内含子11(蓝色)和NOLC1的内含子1(红色)。

[0033] 图18。独特的融合基因事件。左图：融合基因的基因组，转录方向，连接基因之间的距离和融合的方向的微型图。中图：融合转录物的代表性测序色谱图。显示了连接基因序列。右图：融合转录物的翻译产物的图表。蓝色-头部基因翻译产物；红色-尾部基因翻译产物；橙色-归因于移码的新型翻译产物，或来自非基因区域的翻译产物。

[0034] 图19A-E.荧光原位杂交表明前列腺癌细胞中的基因组重组。(A)DOCK7和NOLC1基因组重组和FISH探针位置的示意图。显示了正常前列腺上皮细胞和DOCK7-OLR1融合阳性的
癌细胞的代表性FISH图像。橙色表示探针1；绿色表示探针2。融合连接信号用绿色箭头表
示。(B)SNTG1和PCMTD1基因组重组和FISH探针位置的示意图。显示了正常前列腺上皮细胞
和SNTG1-PCMTD1融合阳性的癌细胞的代表性FISH图像。橙色表示探针1；绿色表示探针2。融合连接信号用绿色箭头表示。(C)ACPP和SEC13基因组重组和FISH探针位置的示意图。显示
了正常前列腺上皮细胞和ACPP-SEC13融合阳性的癌细胞的代表性FISH图像。橙色表示探针
1；绿色表示探针2。融合连接信号用绿色箭头表示。(D)ZMPSTE24和ZMYM4基因组重组和FISH探针位置的示意图。显示了正常前列腺上皮细胞和ZMPSTE24-ZMYM4融合阳性的癌细胞的代
表性FISH图像。橙色表示探针1；绿色表示探针2。融合连接信号用绿色箭头表示。(E)CLTC和ETV1基因组重组和FISH探针位置的示意图。显示了正常前列腺上皮细胞和CLTC-ETV1融合
阳性的癌细胞的代表性FISH图像。橙色表示探针1；绿色表示探针2。融合连接信号用绿色箭头表示。

[0035] 图20A-C.人类癌症中的Pten-NOLC1。(A)Taqman qRT-PCR用以检测人癌细胞系和健康器官供体前列腺样品中的Pten-NOLC1。(B)Pten-NOLC1在原发性人类癌症中的频率。
(C)Pten-NOLC1蛋白的表达。上图：Pten和NOLC1蛋白以及Pten-NOLC1融合蛋白的功能结构
域图。截短位点用箭头表示。NLS表示核定位信号；SRP40表示酿酒酵母SRP40蛋白的C末端的同源结构域；snoRNA结合表示小核仁RNA的结合位点；T表示与HSV1转录因子ICP4同源的富
含丝氨酸的序列。下图：来自原发性前列腺癌样品(PCa638T，PCa207T，PCa624T，PCa099T和PCa090T)或健康器官供体前列腺样品(DO12和DO17)或指定细胞系(泳道8-12)的Pten和
Pten-NOLC1蛋白的免疫印迹。

[0036] 图21A-B.转移和人类癌症的多个基因座中的Pten-NOLC1。(A)原发性癌症(P)及其相匹配的淋巴结转移(LN)中的Pten-NOLC1。红色-阳性；灰色-阴性；空白-无样品。(B)Pten-NOLC1存在于大多数前列腺癌基因座中。红色-阳性；灰色-阴性；空白-无样品。

[0037] 图22A-C.Pten-NOLC1易位至细胞核并且缺乏脂质磷酸酶活性。(A)NIH3T3和PC3细胞中Pten，NOLC1和Pten-NOLC1的免疫荧光分析。上图：分别使用对Pten，NOLC1或FLAG具有特异性的抗体，免疫染色NIH3T3细胞中的Pten(左)，NOLC1(中)和Pten-NOLC1-FLAG(右)。下图：用pPten-EGFP(左)，pNOLC1-mCherry(中)和pPten-NOLC1-EGFP(右)转染PC3细胞。(B)用Pten-NOLC1-FLAG(PNOL-FLAG)转染的DU145细胞或NIH3T3细胞的细胞核和细胞质组分中的
Pten和PTEN-NOLC1的免疫印迹。使用对GAPDH和组蛋白3具有特异性的抗体的免疫印迹用作
组分纯度对照。(C)Pten-NOLC1在体外缺乏PIP3磷酸酶活性。GST-谷氨酸S-转移酶；PNOL-
Pten-NOLC1；IP-免疫沉淀；T+-四环素诱导；Ab-抗体。

[0038] 图23A-I.Pten-NOLC1促进癌细胞生长和侵袭。(A)Pten-NOLC1敲除策略的示意图。Pten的内含子11序列用蓝色表示，而NOLC1的内含子1序列用红色表示。将pCas9D10A-EGFP和Pten供体-博来霉素-mCherry-NOLC1供体载体共转染到DU145细胞中。图像代表共表达
Cas9D10A-EGFP和整合的博来霉素-mCherry，代表DU145KO1细胞中Pten-NOLC1的敲除。(B)对Pten-NOLC1敲除DU145和MCF7细胞的Taqman定量RT-PCR。β-肌动蛋白的Taqman RT-PCR用于RNA量对照。(C)Pten-NOLC1表达促进细胞进入S期。插图是DU145，DU145KO1，MCF7和MCF7KO1的10,000个细胞的BrdU标记的代表性图像。进行三个重复实验。标示标准偏差。(D)Pten-
NOLC1促进集落形成。插图是DU145/DU145KO1和MCF7/MCF7KO1细胞的集落的代表性结晶紫
染色图像。进行三个重复实验。标示标准偏差。(E)Pten-NOLC1促进对UV诱导的细胞死亡的抗性。插图是在暴露于175mj UV辐照后细胞的膜联蛋白V和PI染色的代表性图像。进行三个重复实验。标示标准偏差。(F)Pten-NOLC1的去除减少癌细胞侵袭。对DU145，DU145KO1和
DU145KO2细胞进行基质胶示踪分析。进行三个重复实验。标示标准偏差。MCF7细胞无法迁移通过基质胶。(G)Pten-NOLC1的去除减少了异种移植的DU145细胞的肿瘤体积。(H)Pten-
NOLC1的去除降低了异种移植DU145癌症的转移发生率。(I)Pten-NOLC1的去除可改善异种
移植DU145癌症的动物的存活率。

[0039] 图24A-C.Pten-NOLC1促进促生长基因的表达。(A)基于DU145，DU145KO1和DU145KO2的微阵列分析，Pten-NOLC1的去除诱导EGFR，VEGFA，GAB1EREG，AXL和c-MET的下调。(B)EGFR，AXL，EREG，VEGFA，c-MET和GAB1的Taqman定量RT-PCR。显示了亲本DU145细胞的相对倍数变化。进行三个重复实验。标示标准偏差。(C)Pten-NOLC1的去除减少c-MET和GAB1蛋白表达。

[0040] 图25A-E.Pten-NOLC1的生成产生自发性肝癌。(A)体细胞缺失Pten的过程和pT3-Pten-NOLC1-mCherry/pSB的流体动力学尾静脉注射的示意图。插图是用pT3-Pten-NOLC1-
mCherry/pSB转染的PC3细胞的代表性图像。(B)来自用AAV8-cre和pT3-Pten-NOLC1-
mCherry/pSB(右)处理或用AAV8-cre和pT3/pSB(左)处理的小鼠的肝脏的代表性图像。(C)
来自AAV8-cre和pT3-Pten-NOLC1-mCherry/pSB处理的小鼠的肝癌的代表性组织学图像
(右)，对比AAV8-cre和pT3/pSB处理的小鼠的组织学图像(左)。(D)肝癌细胞中Ki-67表达的高频率。结果是每个较高视野中Ki-67阳性的细胞数的平均值。每个样品计算7个视野。(E)Pten-NOLC1促进肝癌细胞中c-MET和GAB1表达的表达。

[0041] 图26。转录组测序读取Pten和NOLC1基因的分布。该图表示单个样品的第一外显子的读数计数与Pten(左上)或NOLC1(左下)的所有外显子的读数之比率，或最末外显子的读
数与Pten(右上)或NOLC1(右下)的所有外显子的读数之比率。橙色-来自TCGA数据集的样品
(550个样品)；蓝色-Luo等的数据集(86个样品)。指示P值。

[0042] 图27A-C.17种人类恶性肿瘤中Pten外显子11和NOLC1外显子2之间的跨越性缺失(spanning deletion)。(A)Pten和NOLC1小基因组的示意图以及通过TCGA Affymetrix
SNP6.0数据的拷贝数分析检测2个基因之间的跨越性缺失(红线)。显示了被认为呈缺失阳
性的样品数量。(B)17种不同类型的人恶性肿瘤中Pten和NOLC1之间跨越性缺失的频率。指
出了每种类型的人恶性肿瘤的总样品数。(C)具有建议的Pten-NOLC1融合的样品中Pten缺
失的频率。显示了具有建议的Pten-NOLC1融合的样品总数。

[0043] 图28A-D.Pten-NOLC1与基因组DNA相互作用并激活促生长基因的表达。(A)使用对NOLC1具有特异性的抗体，分析来自DU145对比DU145KO1/KO2(上图)和MCF7对比MCF7KO1/
KO2(下图)的ChIP测序的定位DNA片段的分布。右侧显示了从其敲除对应物中减去后DU145
或MCF7细胞的DNA片段的分布。(B)与MET，EGFR，RAF1，AXL，GAB1和VEGFA的启动子/增强子区域结合的Pten-NOLC1的Taqman Q-PCR定量。(C)Pten-NOLC1的去除减少c-MET，EGFR，RAF1和GAB1蛋白表达，以及STAT3和RAF1的磷酸化。(D)MET，EGF和ECM的信号转导途径受到Pten-
NOLC1存在的影响。红色图标表示与Pten-NOLC1相互作用但不与NOLC1蛋白相互作用的基
因。

[0044] 图29.与MET，EGFR，RAF1，AXL和VEGFA的启动子区域结合的Pten-NOLC1。映射到这些基因的启动子区域的来自Pten-NOLC1阳性样品的ChIP测序映射峰以红色显示。显示了映射的DNA的基因组位置(使用HG19作为参考)。转录起始位点用箭头表示。框表示富含Pten-
NOLC1结合片段的区域。

[0045] 图30.由Pten-NOLC1的基因组中断诱导的细胞死亡。PC3(前列腺癌)，DU145(前列腺癌)，MCF7(乳腺癌)，H1299(肺癌)，SNU449(肝癌)，SNU475(肝癌)，HEP3B(肝癌)，T98G(多D10A
形性胶质母细胞瘤)，MB231(乳腺癌)和NIH3T3(小鼠永生化成纤维细胞)细胞用Cas9 或
Cas9D10A加对Pten-NOLC1具有特异性的gRNA或Cas9D10A对Pten-NOLC1具有特异性的gRNA加
Pten-NOLC1敲除盒进行处理。然后使用膜联蛋白V和碘化丙锭染色在处理后2天分析细胞死
亡。

[0046] 图31.检测TMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9整合到PC3细胞基因组中的TMEM135-CCDC67断裂点的示意图。箭头表示PCR的引物位置。产生突变的推定整合位点由黄色星星指示。从病毒处理前含有TMEM135-CCDC67断裂点的异种移植PC3细胞获得的PCR产物用作参照
对照。对病毒(Ad-TC)感染后获得的PCR产物进行测序。通过桑格测序检测因DNA整合引起的突变位置。

[0047] 5.发明详述

[0048] 为了清楚而非限制，本发明的详细描述分为以下小节：

[0049] (i)融合基因；

[0050] (ii)融合基因检测；

[0051] (iii)癌症靶标；

[0052] (iv)治疗方法；

[0053] (v)基因组编辑技术；和

[0054] (vi)试剂盒。

[0055] 5.1融合基因

[0056] 本文所用术语“融合基因”指核酸或蛋白质序列，其以野生型/正常核酸或蛋白质序列中未发现的方式组合所述基因的元件或其RNA转录物。例如但非限制性地，在基因组
DNA形式的融合基因中，相对于野生型/正常序列(例如，如NCBI染色体位置或本文所示序列中反映的)，所述基因的基因组序列的部分的相对位置有改变。在mRNA形式的融合基因中，存在来自两种组成基因的RNA转录物的部分(不一定在与野生型转录物相同的登记信息
(register)中，并且可能包括通常不存在于正常成熟转录物中的部分)。在非限制性实施方式中，基因组DNA或mRNA的这种部分可包含至少约10个连续核苷酸，或至少约20个连续核苷酸，或至少约30个连续核苷酸，或至少40个连续核苷酸。在某些实施方式中，基因组DNA或mRNA的这种部分可包含融合基因中存在的基因的核苷酸序列的至多约10个连续核苷酸，至
多约50个连续核苷酸，至多约100个连续核苷酸，至多约200个连续核苷酸，至多约300个连续核苷酸，至多约400个连续核苷酸，至多约500个连续核苷酸，至多约600个连续核苷酸，至多约700个连续核苷酸，至多约800个连续核苷酸，至多约900个连续核苷酸，至多约1,000个连续核苷酸，至多约1,500个连续核苷酸或至多约2,000个连续核苷酸。在某些实施方式中，基因组DNA或mRNA的这种部分可包含融合基因中存在的基因的核苷酸序列的不超过约10个
连续核苷酸，约50个连续核苷酸，约100个连续核苷酸，约200个连续核苷酸，约300个连续核苷酸，约400个连续核苷酸，约500个连续核苷酸，约600个连续核苷酸，约700个连续核苷酸，约800个连续核苷酸，约900个连续核苷酸，约1,000个连续核苷酸，约1,500个连续核苷酸或约2,000个连续核苷酸。在某些实施方式中，基因组DNA或mRNA的这种部分不包含融合基因
中存在的基因的完整野生型/正常核苷酸序列。在蛋白质形式的融合基因中，存在来自两种组成基因的氨基酸序列的部分(非限制性地，至少约5个连续氨基酸或至少约10个氨基酸或
至少约20个氨基酸或至少约30个氨基酸)。在某些实施方式中，融合基因蛋白的这种部分可包含由融合基因中存在的基因编码的氨基酸序列的至多约10个连续氨基酸，至多约20个连
续氨基酸，至多约30个连续氨基酸，至多约40个连续氨基酸，至多约50个连续氨基酸，至多约60个连续氨基酸，至多约70个连续氨基酸，至多约80个连续氨基酸，至多约90个连续氨基酸，至多约100个连续氨基酸，至多约120个连续氨基酸酸，至多约140个连续氨基酸，至多约
160个连续氨基酸，至多约180个连续氨基酸，至多约200个连续氨基酸，至多约220个连续氨基酸，至多约240个连续氨基酸，至多约260个连续氨基酸，至多约280个连续氨基酸或至多约300个连续氨基酸。在某些实施方式中，融合基因蛋白的这种部分可包含由融合基因中存在的基因编码的氨基酸序列的不超过约10个连续氨基酸，约20个连续氨基酸，约30个连续
氨基酸，约40个连续氨基酸，约50个连续氨基酸，约60个连续氨基酸，约70个连续氨基酸，约
80个连续氨基酸，约90个连续氨基酸，约100个连续氨基酸，约120个连续氨基酸，约140个连续氨基酸，约160个连续氨基酸，约180个连续氨基酸，约200个连续氨基酸，约220个连续氨基酸，约240个连续氨基酸，约260个连续氨基酸，约280个连续氨基酸或约300个连续氨基
酸。在某些实施方式中，融合基因蛋白的这种部分不包含融合基因中存在的基因编码的完
整野生型/正常氨基酸序列。在该段中，由基因、转录物或蛋白质产生的部分不是指在两种基因的野生型形式中可能碰巧相同的序列(也就是说，这些部分是“非共享的”)。因此，一般而言，融合基因表示通常不连接在一起的基因组元件剪接在一起或融合。关于所公开的融
合基因的其它信息，参见WO 2015/103057和WO 2016/011428，其内容通过引用并入本文。

[0057] 融合基因TRMT11-GRIK2是tRNA甲基转移酶11同源物(“TRMT11”)和谷氨酸受体，离子型红藻氨酸盐2(“GRIK2”)基因之间的融合。人TRMT11基因通常位于染色体6q11.1上，人GRIK2基因通常位于染色体6q16.3上。在某些实施方式中，TRMT11基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：60487，序列染色体6；NC_000006.11(126307576..126360422)和/或GRIK2基因是这样的人基因：具有NCBI基因编号：2898，序列染色体6；NC_000006.11
(101841584..102517958)。在某些实施方式中，TRMT11-GRIK2融合基因的连接(在本文中也称为染色体断裂点和/或连接片段)包含如图1和/或表1中所示的序列。

[0058] 融合基因SLC45A2-AMACR是溶质载体家族45，成员2(“SLC45A2”)和α-甲基酰基-CoA消旋酶(“AMACR”)基因之间的融合。人SLC45A2基因通常位于人染色体5p13.2上，人
AMACR基因通常位于染色体5p13上。在某些实施方式中，SLC45A2基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：51151，序列染色体5；NC_000005.9(33944721..33984780，互补物)和/或AMACR基因是这样的人基因：具有NCBI基因编号：23600，序列染色体5；NC_000005.9
(33987091..34008220，互补物)。在某些实施方式中，SLC45A2-AMACR融合基因的连接和/或连接片段包含如图1和/或表1中所示的序列。

[0059] 融合基因MTOR-TP53BP1是雷帕霉素的机制靶标(“MTOR”)和肿瘤蛋白p53结合蛋白1(“TP53BP1”)基因之间的融合。人MTOR基因通常位于染色体1p36.2上，人TP53BP1基因通常位于染色体15q15-q21上。在某些实施方式中，MTOR基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：2475，序列染色体1NC_000001.10(11166588..11322614，互补物)和/或TP53BP1基因是这样的人基因，其具有NCBI基因编号：7158，序列染色体15；NC_000015.9
(43695262..43802707，互补物)。在某些实施方式中，MTOR-TP53BP1融合基因的连接和/或连接片段包含如图1和/或表1中所示的序列。

[0060] 融合基因LRRC59-FLJ60017是含富含亮氨酸的重复序列的59(“LRRC59”)基因和“FLJ60017”核酸之间的融合。人LRRC59基因通常位于染色体17q21.33上，编码人FLJ60017的核酸通常位于染色体11q12.3上。在某些实施方式中，LRRC59基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：55379，序列染色体17；NC_000017.10(48458594..48474914，互补物)和/或FLJ60017具有GeneBank AK_296299中所示的核酸序列。在某些实施方式中，LRRC59-
FLJ60017融合基因的连接和/或连接片段包含如图1、图2和/或表1中所示的序列。

[0061] 融合基因TMEM135-CCDC67是跨膜蛋白135(“TMEM135”)和含卷曲螺旋结构域的67(“CCDC67”)基因之间的融合。人TMEM135基因通常位于染色体11q14.2上，人CCDC67基因通常位于染色体11q21上。在某些实施方式中，TMEM135基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：65084，序列染色体11；NC_000011.9(86748886..87039876)和/或CCDC67基因是这样的人基因，其具有NCBI基因编号：159989，序列染色体11；NC_000011.9
(93063156..93171636)。在某些实施方式中，TMEM135-CCDC67融合基因的连接和/或连接片段包含如图1、图2、图13和/或表1中所示的序列。

[0062] 融合基因CCNH-C5orf30是细胞周期蛋白H(“CCNH”)和染色体5开放阅读框30(“C5orf30”)基因之间的融合。人CCNH基因通常位于染色体5q13.3-q14上，人C5orf30基因通常位于染色体5q21.1上。在某些实施方式中，CCNH基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：902，序列染色体5；NC_000005.9(86687310..86708850，互补物)和/或C5orf30基因是这样的人基因，其具有NCBI基因编号：90355，序列染色体5；NC_000005.9
(102594442..102614361)。在某些实施方式中，CCNH-C5orf30融合基因的连接和/或连接片段包含如图1、图2和/或表1中所示的序列。

[0063] 融合基因KDM4B-AC011523.2是赖氨酸(K)特异性脱甲基酶4B(“KDM4B”)和染色体区域“AC011523.2”之间的融合。人KDM4B基因通常位于染色体19p13.3上，人AC011523.2区通常位于染色体19q13.4上。在某些实施方式中，KDM4B基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：23030，序列染色体19；NC_000019.9(4969123..5153609)；和/或AC011523.2区域包含如图1中所示的序列。在某些实施方式中，KDM4B-AC011523.2融合基因的连接和/或连接
片段包含如图1和/或表1中所示的序列。

[0064] 融合基因MAN2A1-FER是甘露糖苷酶，α，2A类，成员1(“MAN2A1”)和(fps/fes相关)酪氨酸激酶(“FER”)之间的融合。人MAN2A1基因通常位于染色体5q21.3上，人FER基因通常位于染色体5q21上。在某些实施方式中，MAN2A1基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：4124，序列染色体5；NC_000005.9(109025156..109203429)或NC_000005.9
(109034137..109035578)；和/或FER基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：2241，序列染色体5：NC_000005.9(108083523..108523373)。在某些实施方式中，MAN2A1-FER融合基因的连接和/或连接片段包含如图1、图4、图15和/或表1中所示的序列。

[0065] 融合基因PTEN-NOLC1是磷酸酶和张力蛋白同源物(“PTEN”)和核仁与卷曲体磷蛋白1(“NOLC1”)之间的融合。人PTEN基因通常位于染色体10q23.3上，人NOLC1基因通常位于染色体10q24.32上。在某些实施方式中，PTEN基因是这样的人基因，其具有NCBI基因编号：
5728，序列染色体10；NC_000010.11(87863438..87970345)和/或NOLC1基因是这样的人基
因：其具有NCBI基因编号：9221，序列染色体10；NC_000010.11(102152176..102163871)。在某些实施方式中，PTEN-NOLC1融合基因的连接和/或连接片段包含如图3、图17和/或表1中
所示的序列。

[0066] 融合基因ZMPSTE24-ZMYM4是锌金属肽酶STE24(“ZMPSTE24”)和锌指，MYM-4型(“ZMYM4”)之间的融合。人ZMPSTE24通常位于染色体1p34上，人ZMYM4基因通常位于染色体
1p32-p34上。在某些实施方式中，ZMPSTE24基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：
10269，序列染色体1；NC_000001.11(40258050..40294184)和/或ZMYM4基因是这样的人基
因：具有NCBI基因编号：9202，序列染色体1；NC_000001.11(35268850..35421944)。在某些实施方式中，ZMPSTE24-ZMYM4融合基因的连接和/或连接片段包含如图6和/或图18中所示
的序列。

[0067] 融合基因CLTC-ETV1是网格蛋白，重链(Hc)(“CLTC”)和ets变体1(“ETV1”)之间的融合。人CLTC通常位于染色体17q23.1上，人ETV1基因通常位于染色体7p21.3上。在某些实施方式中，CLTC基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：1213，序列染色体17；NC_000017.11(59619689..59696956)和/或ETV1基因是这样的人基因，其具有NCBI基因编号：
2115，序列染色体7；NC_000007.14(13891229..13991425，互补物)。在某些实施方式中，CLTC-ETV1融合基因的连接和/或连接片段包含如图6和/或图18中所示的序列或其片段。

[0068] 融合基因ACPP-SEC13是酸性磷酸酶，前列腺(“ACPP”)和SEC13同源物(“SEC13”)之间的融合。人ACPP通常位于染色体3q22.1上，人SEC13基因通常位于染色体3p25-p24上。在某些实施方式中，ACPP基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：55，序列染色体3；NC_000003.12(132317367..132368302)和/或SEC13基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编
号：6396，序列染色体3；NC_000003.12(10300929..10321188，互补物)。在某些实施方式中，ACPP-SEC13融合基因的连接和/或连接片段包含如图6和/或图18中所示的序列。

[0069] 融合基因DOCK7-OLR1是胞质分裂异构体7(“DOCK7”)和氧化低密度脂蛋白(凝集素样)受体1(“OLR1”)之间的融合。人DOCK7通常位于染色体1p31.3上，人OLR1基因通常位于染色体12p13.2-p12.3上。在某些实施方式中，DOCK7基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：85440，序列染色体1；NC_000001.11(62454726..62688368，互补物)和/或OLR1基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：4973，序列染色体12；NC_000012.12
(10158300..10172191，互补物)。在某些实施方式中，DOCK7-OLR1融合基因的连接和/或连接片段包含如图6和/或图18中所示的序列。

[0070] 融合基因PCMTD1-SNTG1是含蛋白-L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸)O-甲基转移酶结构域1(“PCMTD1”)和肌萎缩蛋白，γ1(“SNTG1”)之间的融合。人PCMTD1通常位于染色体
8q11.23上，人SNTG1基因通常位于染色体8q11.21上。在某些实施方式中，PCMTD1基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：115294，序列染色体8；NC_000008.11
(51817575..51899186，互补物)和/或SNTG1基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：
54212，序列染色体8；NC_000008.11(49909789..50794118)。在某些实施方式中，PCMTD1-SNTG1融合基因的连接和/或连接片段包含如图6和/或图18中所示的序列。

[0071] 5.2融合基因检测

[0072] 可以通过本领域已知的方法鉴定和/或检测上文在5.1节中描述的任何前述融合基因。融合基因可以通过检测以DNA分子，RNA分子或蛋白质形式表现的融合基因来检测。在某些实施方式中，可以通过确定由融合基因编码的DNA分子，RNA分子或蛋白质的存在来检
测融合基因。例如但非限制性地，可以通过确定融合基因编码的蛋白质的存在来检测融合
基因的存在。

[0073] 可以在对象的样品中检测融合基因。“患者”或“对象”在本文中可互换使用，指人或非人对象。非人类对象的非限制性实例包括非人灵长类动物，狗，猫，小鼠等。对象可能先前或可能未被诊断为患有癌症。

[0074] 在某些非限制性实施方式中，样品包括但不限于培养中的细胞，细胞上清液，细胞裂解物，血清，血浆，生物液体(例如，血液，血浆，血清，粪便，尿液，淋巴液，腹水，导管灌洗，唾液和脑脊液)和组织样本。样品的来源可以是实体组织(例如，来自新鲜的，冷冻的和/或保存的器官，组织样品，活组织检查或抽吸物)，血液或任何血液成分，体液(例如尿液，淋巴液，脑脊液，羊水，腹膜液或间质液)，或来自个体的细胞，包括循环癌细胞。在某些非限制性实施方式中，样品获自癌症。在某些实施方式中，样品可以是“活检样品”或“临床样品”，其是源自对象的样品。在某些实施方式中，样品包括来自对象的一种或多种癌细胞。在某些实施方式中，可以在从对象获得的一个或多个样品中(例如在一个或多个癌细胞样品中)检测一种或多种融合基因。在某些实施方式中，样品不是前列腺癌样品或一个或多个前列腺癌
细胞。在某些实施方式中，样品不是肺腺癌，多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌样品。

[0075] 在某些非限制性实施方式中，通过核酸杂交分析检测融合基因。

[0076] 在某些非限制性实施方式中，通过荧光原位杂交(FISH)分析检测融合基因。FISH是一种可以直接鉴定细胞或生物样品中特定DNA或RNA序列的技术，并且能够目测确定组织
样品中融合基因的存在和/或表达。在某些非限制性实施方式中，当融合基因与通常不存在于同一染色体上的基因组合时，FISH分析可证明探针与同一染色体结合。例如但非限制性
地，分析可以集中在一个基因通常存在的染色体上，然后可以进行杂交分析以确定另一个
基因是否也存在于该染色体上。

[0077] 在某些非限制性实施方式中，通过DNA杂交检测融合基因，例如但不限于Southern印迹分析。

[0078] 在某些非限制性实施方式中，通过RNA杂交检测融合基因，例如但不限于Northern印迹分析。在某些实施方式中，Northern印迹分析可用于检测融合基因，其中分离的RNA样品在变性琼脂糖凝胶上跑动，并转移至合适的支持物，例如活化的纤维素，硝酸纤维素或玻璃或尼龙膜。然后，将放射性标记的cDNA或RNA与制剂杂交，洗涤并通过放射自显影分析以检测RNA样品中融合基因的存在。

[0079] 在某些非限制性实施方式中，通过核酸测序分析检测融合基因。

[0080] 在某些非限制性实施方式中，融合基因通过DNA阵列，芯片或微阵列上存在的探针检测。例如但非限制性地，可以将对应于一种或多种融合基因的寡核苷酸固定在芯片上，然后将芯片与获自对象的样品的标记核酸杂交。用含有融合基因转录物的样品获得阳性杂交
信号。

[0081] 在某些非限制性实施方式中，通过包括反转录聚合酶链反应(“RT-PCR”)的方法检测融合基因。在某些实施方式中，通过包括使用本文公开的一对或多对引物的RT-PCR的方法(参见例如，表5)检测融合基因。

[0082] 在某些非限制性实施方式中，通过抗体结合分析检测融合基因，例如但不限于Western印迹分析和免疫组化。

[0083] 表5.用于RT-PCR的引物序列。

[0084]

[0085] 5.3癌症靶标

[0086] 可适用于本公开的发明的癌症的非限制性实例包括前列腺癌，乳腺癌，肝癌(liver cancer)，肝脏癌症(hepatocarcinoma)，肝肿瘤(hepatoma)，肺癌，非小细胞肺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，胰腺癌，卵巢癌，胃癌，甲状腺癌，多形性胶质母细胞瘤，结直肠癌，弥漫性大B细胞淋巴瘤，肉瘤，急性和慢性淋巴细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤和腺癌，例如食道腺癌。在某些实施方式中，治疗靶标是涉及肺，子宫颈，子宫内膜，胰腺，卵巢，胃，甲状腺，神经胶质，肠，食道，肌肉或B细胞的肿瘤或恶变前病症。在一些实施方式中，癌症不是前列腺癌。在某些实施方式中，癌症不是肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤或肝细胞
癌。在某些实施方式中，治疗靶标是携带至少一种融合基因(例如PTEN-NOLC1或MAN2A1-
FER)的细胞。

[0087] 5.4治疗方法

[0088] 本发明提供了治疗具有携带融合基因的一个或多个细胞的对象的方法。在某些实施方式中，所述对象患有或疑似患有癌症或携带一种或多种融合基因的肿瘤或恶变前病症
(恶变前病症的特征尤其是存在恶变前或肿瘤细胞)。融合基因的非限制性实例在本文和
5.1节中公开。在某些实施方式中，治疗方法包括对对象体内的一个或多个癌细胞进行靶向基因组编辑技术，以产生抗癌或抗肿瘤或抗增殖作用。可使用所公开的方法治疗的癌症的
非限制性实例在5.3节中提供。基因组编辑技术的非限制性实例在5.5节中公开。

[0089] “抗癌作用”是指聚集的癌细胞团减少，癌细胞生长速度降低，癌症进展减少，癌细胞增殖减少，肿瘤质量减小，肿瘤体积减小，肿瘤细胞增殖减少，肿瘤生长速率降低和/或肿瘤转移减少中的一种或多种。在某些实施方式中，抗癌作用可以指完全应答，部分应答，稳定疾病(没有进展或复发)，在诊断患有癌症的患者中具有较晚复发或无进展存活的应答。在某些实施方式中，抗癌作用可以指诱导细胞死亡，例如癌症的一个或多个细胞的死亡，
和/或增加肿瘤块中的细胞死亡。类似地，“抗肿瘤作用”是指聚集的肿瘤细胞团减少，肿瘤细胞生长速率降低，肿瘤进展减少(例如，进行性去分化或上皮细胞向间充质细胞转变)，肿瘤细胞增殖减少，肿瘤质量减少，肿瘤体积减小和/或肿瘤生长速率降低中的一种或多种。

[0090] 在某些实施方式中，治疗对象的方法包括确定来自对象的样品中一种或多种融合基因的存在，其中如果样品中存在一种或多种融合基因，则在该对象中的一个或多个细胞
上进行靶向基因组编辑技术。在某些实施方式中，基因组编辑技术导致对象的一个或多个
细胞中融合基因的表达和/或融合基因编码的蛋白质的表达减少和/或消除。在某些实施方
式中，基因组编辑技术特异性地靶向携带融合基因的细胞，例如通过特异性靶向融合基因
的核酸序列。例如但不限于，本发明的方法特异性地靶向一种或多种融合基因的染色体断
裂点。在某些实施方式中，本发明的方法涉及靶向侧接断裂点的序列。在某些实施方式中，本发明的方法涉及靶向侧接断裂点且与断裂点部分重叠的序列。用于鉴定和/或检测融合
基因的技术的非限制性实例在5.2节中公开。

[0091] 在某些实施方式中，治疗对象的癌症的方法包括确定来自对象的含癌细胞样品中一种或多种融合基因的存在，其中如果样品中存在一种或多种融合基因，则在该对象中的
一个或多个癌细胞上进行靶向基因组编辑技术，以产生抗癌作用或抗肿瘤作用。

[0092] 在某些实施方式中，该方法可包括确定融合基因的存在或不存在。例如且非限制性地，该方法可包括确定本文公开的融合基因中的一种或多种，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，六种或更多种，七种或更多种，八种或更多种，九种或更多种，十种或更多种，十一种或更多种，十二种或更多种，十三种或更多种或全部十四种的存在或不存在。在某些实施方式中，所述一种或多种融合基因可以是TRMT11-GRIK2，
SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1或其组合。

[0093] 在某些实施方式中，融合基因可以是TMEM135-CCDC67。

[0094] 在某些实施方式中，融合基因可以是CCNH-C5orf30。

[0095] 在某些实施方式中，融合基因可以是MAN2A1-FER。

[0096] 在某些实施方式中，融合基因可以是PTEN-NOLC1。

[0097] 在某些实施方式中，融合基因不是TMEM135-CCDC67或CCNH-C5orf30。

[0098] 在某些实施方式中，治疗对象的方法包括确定对象的样品中一种或多种融合基因的存在(例如，选自下组：MAN2A1-FER，TMEM135-CCDC67，TRMT11-GRIK2，CCNH-C5orf30，LRRC59-FLJ60017，SLC45A2-AMACR，KDM4B-AC011523.2，PTEN-NOLC1，MTOR-TP53BP1或其组合)，其中如果在样品中检测到一种或多种融合基因，则对对象体内的一个或多个癌细胞中的融合基因进行靶向基因组编辑技术，以产生抗癌作用。

[0099] 在某些实施方式中，治疗患有癌症的对象的方法包括，确定对象的一个或多个癌细胞中选自下组的一种或多种融合基因的存在：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-
TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-
NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1或其组合，其中如果在癌细胞中检测到一种或多种融合基因，则进行靶向对象的一个或多个癌细胞内存在的融合基因的基因组编辑技术，以产生抗癌作用。在某些实施方式中，与癌症相邻的正常或非癌细胞不经历基因组编辑技术，因为gRNA对融合基因的序列是特异
性的，例如对断裂点的序列具有特异性。

[0100] 在某些实施方式中，治疗患癌对象的方法包括，确定对象的一个或多个癌细胞中存在选自下组的一种或多种融合基因：ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1或其组合，其中如果在癌细胞中检测到一种或多种融合基因，则对对象中的一个或多个癌细胞进行靶向基因组编辑技术，以产生抗癌作用。

[0101] 在某些实施方式中，治疗对象的方法包括确定对象的一个或多个细胞中存在选自下组的一种或多种融合基因：CCNH-C5orf30，TMEM135-CCDC67，PTEN-NOLC1，MAN2A1-FER及其组合，其中如果在细胞中检测到一种或多种融合基因，则在对象中的一个或多个细胞上
进行靶向基因组编辑技术，例如，以减少和/或消除该对象的一个或多个细胞中融合基因的表达和/或减少和/或消除由该对象的一个或多个细胞中的融合基因编码的蛋白质的表达。

[0102] 在某些实施方式中，治疗患有癌症的对象的方法包括确定对象的一个或多个癌细胞中存在选自下组的一种或多种融合基因：CCNH-C5orf30，TMEM135-CCDC67，PTEN-NOLC1，MAN2A1-FER及其组合，其中如果在癌细胞中检测到一种或多种融合基因，则对对象的一个
或多个癌细胞进行靶向基因组编辑技术，以产生抗癌作用。

[0103] 在某些实施方式中，本发明提供了在患有癌症的对象中产生抗癌作用的方法，包括在对象体内含有融合基因的一个或多个癌细胞上进行靶向基因组编辑技术，例如通过靶
向融合基因，产生抗癌作用。

[0104] 本发明进一步提供了预防，最小化和/或减少肿瘤生长的方法，包括确定对象样品中一种或多种融合基因的存在，其中如果样品中存在一种或多种融合基因，则进行靶向该
对象肿瘤中存在的融合基因的基因组编辑技术，以预防，最小化和/或减少肿瘤的生长。

[0105] 本发明提供预防，最小化和/或减少癌细胞生长和/或增殖的方法，包括确定对象样品中一种或多种融合基因的存在，其中如果样品中存在一种或多种融合基因，则进行靶
向融合基因的基因组编辑技术，例如，通过靶向对象的癌细胞内存在的染色体断裂点进行，以预防，最小化和/或减少癌细胞的生长和/或增殖。在某些实施方式中，可以通过基因组编辑技术靶向侧接断裂点的序列。

[0106] 在某些非限制性实施方式中，本发明提供治疗和/或抑制对象中癌症和/或肿瘤和/或肿瘤生长进展的方法，包括确定对象样品中一种或多种融合基因的存在，如果样品中存在一种或多种融合基因，则在来自对象的癌症和/或肿瘤的一个或多个细胞上进行靶向
基因组编辑技术，以治疗和/或抑制癌症和/或肿瘤的进展。

[0107] 在某些实施方式中，本发明提供了延长患有癌症的对象的存活期的方法。在某些实施方式中，所述方法包括确定对象的样品中存在一种或多种融合基因，其中如果样品中
存在一种或多种融合基因，则在该对象中的一个或多个癌细胞上进行靶向基因组编辑技
术，以产生抗癌作用。在某些实施方式中，使用所公开的方法，患有癌症的对象的存活期可延长约1个月，约2个月，约4个月，约6个月，约8个月，约10个月，约12个月，约14个月，约18个月，约20个月，约2年，约3年，约5年或更长时间。

[0108] 在某些实施方式中，本发明提供治疗对象的方法，其包括确定从对象获得的样品中至少一种融合基因的存在，然后在该对象中的一个或多个细胞内进行靶向融合基因的基
因组编辑技术，以实现抗肿瘤作用，其中对象没有前列腺癌。

[0109] 在某些实施方式中，本发明提供了能够进行靶向基因组编辑的试剂或包含试剂的组合物，其用于治疗对象的方法中。例如但非限制性地，本发明提供了能够进行靶向基因组编辑的试剂，用于治疗或预防对象中的癌症的方法，其中该方法包括使用该试剂在对象体
内含有融合基因的一个或多个细胞(例如癌细胞)上进行靶向基因组编辑操作。在某些实施
方式中，本发明提供能够进行靶向基因组编辑的试剂或其组合物，用于治疗或预防对象中
的癌症的方法，其中所述方法包括(i)确定对象的癌症样品中一种或多种融合基因的存在，和(ii)若样品含有融合基因，则使用所述试剂对对象中的一种或多种癌细胞进行靶向基因
组编辑操作。在某些实施方式中，所述试剂靶向一种或多种融合基因的特定染色体断裂点。
在某些实施方式中，本发明的方法涉及靶向侧接断裂点的序列。在某些实施方式中，所述试剂是内切核酸酶。例如但非限制性地，内切核酸酶是Cas9蛋白。在某些实施方式中，内切核酸酶是Cas9的突变形式，例如Cas9D10A。在某些实施方式中，所述试剂是与一种或多种gRNA(例如核糖核蛋白)复合的内切核酸酶，例如Cas9。在某些实施方式中，所述试剂是siRNA分子。

[0110] 在某些实施方式中，本发明还提供了用于确定对具有含一种或多种融合基因的一个或多个细胞的对象的治疗的方法。在某些实施方式中，该方法可包括：i)提供来自对象的样品；ii)确定对象的一个或多个细胞是否含有选自下组的一种或多种融合基因：TMEM135-CCDC67，TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，KDM4B-
AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1及其组合；和iii)如果在一个或多个细胞中检测到一种或多种融合基因，则指示进行基因组编辑技术，其中基因组编辑技术靶向一个或多个细胞
中检测到的一种或多种融合基因，并且其中对象没有前列腺癌。在某些实施方式中，使用
CRISPR/Cas 9系统进行基因组编辑技术。

[0111] 在某些实施方式中，其中检测到一种或多种融合基因的样品是前列腺癌，乳腺癌，肝癌，肝脏癌症，肝肿瘤，腺癌，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，胰腺癌，卵巢癌，胃癌，甲状腺癌，多形性胶质母细胞瘤，结直肠癌，肉瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤和食管腺癌。

[0112] 在某些实施方式中，样品是胶质母细胞瘤样品，乳腺癌样品，肺癌样品，肝癌样品，卵巢癌样品，腺癌或结肠癌样品。

[0113] 在某些实施方式中，其中检测到一种或多种融合基因的样品是乳腺癌样品，肺癌样品或结肠癌样品。

[0114] 在某些实施方式中，其中检测到一种或多种融合基因的样品不是前列腺癌样品。

[0115] 在某些实施方式中，样品不是肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌样品。

[0116] 在某些实施方式中，通过基因组测序检测样品中的融合基因。在某些实施方式中，通过RNA测序检测样品中的融合基因。例如但不限于，可以使用表5中公开的引物进行RNA测序。在某些实施方式中，通过FISH检测样品中的融合基因。

[0117] 在某些实施方式中，治疗对象(例如，患有携带本文公开的融合基因的癌症的对象)的方法可进一步包括施用治疗有效量的抗癌剂或导致抗肿瘤作用的药剂。“治疗有效
量”是指能够实现以下一种或多种作用的量：抗癌作用，抗肿瘤作用，存活期延长和/或复发期前时间延长。抗癌剂可以是具有抗癌作用的任何分子，化合物化学品或组合物。抗癌剂包括但不限于化学治疗剂，放射治疗剂，细胞因子，抗血管生成剂，凋亡诱导剂或抗癌免疫毒素。在某些非限制性实施方式中，本文公开的基因组编辑技术可以与一种或多种抗癌剂组
合使用。如本文所用，“与......组合”是指基因组编辑技术和一种或多种抗癌剂(或导致抗肿瘤作用的试剂)是针对对象的治疗方案或计划的一部分。

[0118] 5.5基因靶向/编辑技术

[0119] 基因组编辑是一种技术，其中存在于对象中的一个或多个细胞中的内源染色体序列可以使用靶向核酸内切酶和单链核酸进行编辑，例如修饰。基因组编辑方法可以导致在
基因组内的特定区域插入核酸序列，从基因组中切除特定序列和/或用新的核酸序列替换
特定的基因组序列。在某些实施方式中，基因组编辑技术可导致基因(例如融合基因)表达
的抑制。例如但非限制性地，核酸序列可以插入融合基因的染色体断裂点。用于所公开方法的基因组编辑技术的非限制性实例是CRISPR系统，例如CRISPR/Cas 9系统。所述基因组编
辑技术的非限制性实例公开于PCT申请号WO 2014/093701和WO 2014/165825中，其内容通
过引用其全文并入本文。

[0120] 在某些实施方式中，基因组编辑技术可包括使用与基因组内的特定序列互补的一种或多种向导RNA(gRNA)，所述特定序列例如与融合基因相关的染色体断裂点，包括原型间隔区相邻基序(PAM)，以将核酸酶(例如内切核酸酶)引导至特定基因组序列。在某些实施方式中，基因组编辑技术可包括使用与染色体断裂点相邻和/或重叠的序列互补的一种或多
种向导RNA(gRNA)(参见例如图13、15和23)，以引导一种或多种核酸酶。

[0121] 在某些实施方式中，一种或多种gRNA可包括与融合基因内存在的序列互补的靶向序列，例如与染色体断裂点相邻和/或重叠的序列互补。在某些实施方式中，用于靶向融合基因的一种或多种gRNA可包含与融合基因的断裂点序列至少部分互补并且与包含融合基
因的基因之一的序列至少部分互补的序列。在某些实施方式中，靶向序列的长度为约10至
约50个核苷酸，例如，约10至约45个核苷酸，约10至约40个核苷酸，约10至约35个核苷酸，约
10至约30个核苷酸，约10至约25个核苷酸，约10至约20个核苷酸，约10至约15个核苷酸，约
15至约50个核苷酸，约20至约50个核苷酸，约25至约50个核苷酸，约30至约50个核苷酸，约
35至约50个核苷酸，约40至约50个核苷酸或约45至约50个核苷酸长度。在某些实施方式中，靶向序列的长度大于约50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，
69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，
94，95，96，97，98，99，100或更多个核苷酸。

[0122] 在某些实施方式中，所述一种或多种gRNA包含与靶位点的相对链互补的一对偏移(offset)gRNA。在某些实施方式中，所述一种或多种gRNA包含与靶位点的相反链互补的一
对偏移gRNA，以通过内切核酸酶产生偏移切口。在某些实施方式中，使用切口酶(例如Cas9D10A
切口酶，例如Cas9 )，采用一对偏移gRNA诱导偏移切口。在某些实施方式中，该对偏移
gRNA偏移至少约5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，
27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，
52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，
77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或至少100个核苷酸。在某些实施方式中，该对偏移sgRNA偏移约5至约100个核苷酸，约10至约50个核苷酸，约10至约40个核苷酸，约10至约30个核苷酸，约10至约20个核苷酸或约15至30个核苷
酸。

[0123] 在某些非限制性实施方式中，PAM可以被CRISPR内切核酸酶(例如Cas蛋白)识别。Cas蛋白的非限制性实例包括但不限于Cas1，CaslB，Cas2，Cas3，Cas4，Cas5，Cas6，Cas7，Cas8，Cas9(也称为CsnI或Csx12)，Cas10，Csyl，Csy2，Csy3。，Cse1，Cse2，Cscl，Csc2，Cs5，Csn2，Csm2，Csm3，Csm4，Csm5，Csm6，Cmr1，Cmr3，Cmr4，Cmr5，Cmr6，Csbl，Csb2，Csb3，Csx17，Csx14，Csx10，Csx16，CsaX，Csx3，Csx1，Csx1S，Csf1，Csf2，CsO，Csf4，Cpf1，c2cl，c2c3，Cas9HiFi，其同源物或其修饰形式。

[0124] 在某些实施方式中，内切核酸酶可以是成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白9(Cas9)内切核酸酶。在某些实施方式中，Cas9内切核酸酶获自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。在某些实施方式中，Cas9内切核酸酶获自金黄色葡萄球菌
(Staphylococcus aureus)。在某些实施方式中，内切核酸酶可以导致靶向的基因组序列的切割，并允许通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组在切割位点修饰基因组。在某些实施
方式中，Cas9内切核酸酶可以是Cas9的突变形式，例如，其产生单链断裂或“切口”。例如但不限于，Cas9蛋白可包括D10A突变，即Cas9D10A(参见Cong等.Science.339:819-823(2013)；
Gasiunas等，PNAS 109:E2579-2586(2012)；和Jinek等.Science.337:816-821(2012)，其内容通过引用并入本文)。

[0125] 在某些实施方式中，基因组编辑方法和/或技术可用于靶向细胞中(例如癌细胞中)存在的融合基因的一个或多个序列，以促进同源重组以将核酸插入所述细胞的基因组
中。例如但非限制性地，基因组编辑技术可用于靶向融合基因的两个基因连接在一起的区
域(即，连接和/或染色体断裂点)。

[0126] 在某些实施方式中，基因组编辑方法和/或技术可用于敲除融合基因(例如通过切除融合基因的至少一部分)，以使打断融合基因序列。例如但不限于，内切核酸酶，例如野生型Cas9核酸内切酶，可用于特异性切割融合基因的双链DNA序列，并且在不存在同源修复模板非同源末端连接的情况下可导致插入缺失(indel)以打断融合基因序列。

[0127] 在某些实施方式中，基因组编辑方法和/或技术可用于抑制融合基因的表达，例如通过使用核酸酶缺陷型Cas9。例如但非限制性地，Cas9的催化结构域中的突变，例如HNH结构域中的H840A和RuvC结构域中的D10A，使Cas9的切割活性失活，但不阻止DNA结合。在某些实施方式中，Cas9D10A H840A(本文称为dCas9)可用于靶向融合基因的两个基因连接在一起的区域而不切割，并且通过与不同效应结构域融合，dCas9可用于沉默融合基因。

[0128] 正常情况下，非癌细胞不含融合基因，因此不含有与融合基因相关的染色体断裂点，可以使用该基因组编辑技术特异性靶向细胞。在某些实施方式中，基因组编辑技术可用于靶向融合基因的连接(即，断裂点)，所述融合基因包括但不限于，TRMT11-GRIK2，
SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1。

[0129] 在某些实施方式中，可在所公开的方法中使用的一种或多种gRNA可靶向包含SEQ ID NO:40-56、106和113中所示的核苷酸序列的断裂点和/或包含图4,15,17和18中公开的
核苷酸序列(例如SEQ ID NO:143-145和148-154)的断裂点。在某些实施方式中，在所公开
的方法中使用的一种或多种gRNA可与本文公开的染色体断裂点约80％，约85％，约90％，约
91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％同源和/或互补。

[0130] 在某些实施方式中，可以设计gRNA以靶向(例如，互补)侧接染色体断裂点区域的序列(参见例如，图13、15、23和31)，以将内切核酸酶(例如Cas9D10A)引导至染色体断裂点区域或断裂点周围的区域。可以在所公开的方法中使用的gRNA序列的非限制性实例在图13B、图15A和图23A中详述(例如，SEQ ID NO:107、112、146、147、272和274)。在某些实施方式中，在所公开的方法中使用的一种或多种gRNA可与本文公开的gRNA约80％，约85％，约90％，约
91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％同源。在某些实施方式中，所公开的gRNA可包括约1，约2，约3，约4或约5个核苷酸取代和/或突变。

[0131] 在某些实施方式中，一种或多种gRNA可以靶向TMEM135的内含子13和CCDC67的内含子9，例如，一种gRNA可以靶向TMEM135的内含子13，并且第二gRNA可以靶向CCDC67的内含子9，其侧接TMEM135-CCDC67融合基因的断裂点。在某些实施方式中，用于靶向TMEM135-
CCDC67融合基因的一种或多种gRNA可具有包含图13B或13C中所示的一种或多种核苷酸序
列的核苷酸序列。在某些实施方式中，用于靶向TMEM135-CCDC67的一种或多种gRNA可与图
13中公开的gRNA约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％同源。

[0132] 在某些实施方式中，一种或多种gRNA可以靶向MAN2A1的内含子13和/或外显子14(或内含子13和外显子14的剪接受体位点)和FER的内含子14，其侧接MAN2A1-FER融合基因
的断裂点。在某些实施方式中，用于靶向MAN2A1-FER融合基因的一种或多种gRNA可具有包
含图15A中所示的一种或多种核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方式中，用于靶向
MAN2A1-FER的一种或多种gRNA可与图15公开的gRNA约80％，约85％，约90％，约91％，约
92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％同源。

[0133] 在某些实施方式中，一种或多种gRNA可以靶向PTEN的内含子11和NOLC1的内含子1，其侧接PTEN-NOLC1融合基因的断裂点。在某些实施方式中，用于靶向PTEN-NOLC1融合基因的一种或多种gRNA可具有包含图17A或图23A中所示的一种或多种核苷酸序列的核苷酸
序列。在某些实施方式中，一种或多种gRNA可以靶向PTEN的内含子11和NOLC1的内含子1，其侧接PTEN-NOLC1融合基因的断裂点。在某些实施方式中，用于靶向PTEN-NOLC1的一种或多
种gRNA可与图17和23公开的gRNA约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％同源。

[0134] 在某些实施方式中，融合基因是CCNH-C5orf30。

[0135] 在某些实施方式中，融合基因是TMEM135-CCDC67。

[0136] 在某些实施方式中，融合基因是MAN2A1-FER。

[0137] 在某些实施方式中，融合基因可以是PTEN-NOLC1。

[0138] 在某些实施方式中，融合基因不是CCNH-C5orf30或TMEM135-CCDC67。

[0139] 在某些实施方式中，所公开的基因组编辑技术可用于促进与融合基因序列的同源重组，例如在对象的一个或多个细胞中的融合基因的染色体断裂点(接合)处，以允许插入
核酸序列，该核酸序列当表达时导致该一个或多个细胞死亡，例如细胞凋亡。例如但非限制性地，核酸序列(在本文中也称为供体核酸)可编码单纯疱疹病毒1(HSV-1)胸苷激酶，来自
 铜绿假单胞菌的外毒素A，来自棒状杆菌的白喉毒素，来自蓖麻(蓖麻油植物)的蓖麻毒素或相思豆毒素，来自细菌或酵母的胞嘧啶脱氨酶，羧基酯酶或水痘带状疱疹病毒(VZV)胸苷激酶。可以插入携带融合基因的细胞的基因组以诱导细胞死亡的的核酸和/或基因的其它非
限制性实例公开于Rajab等(2013)(J.of Genetics Syndromes and Gene Therapy,4(9):
187)和Zarogoulidis等(2013)(J.of Genetics Syndromes and Gene Therapy,4(9):pii:
16849)。在某些非限制性实施方式中，核酸序列，例如HSV-1胸苷激酶核酸序列，不与调节型序列启动子(例如启动子)可操作地连接，并且需要整合到基因组中以供表达。例如但不限
于，融合基因的头部基因的启动子可以促进供体核酸序列的表达。

[0140] 在编码HSV-1胸苷激酶的核酸插入对象的一个或多个细胞的基因组中的某些实施方式中，可以给予该对象治疗有效量的鸟嘌呤衍生物更昔洛韦或其口服同源物缬更昔洛
韦。HSV-1胸苷激酶可以在对象的一个或多个细胞中磷酸化并将更昔洛韦和/或缬更昔洛韦
转化为更昔洛韦和/或缬更昔洛韦的三磷酸盐形式。三磷酸盐形式的更昔洛韦和/或缬更昔
洛韦作为脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)的竞争性抑制剂并且是DNA延伸的不良底物，从而可导致
DNA合成的抑制。DNA合成的抑制进而可导致含有靶向的染色体断裂点和整合的HSV-1胸苷
激酶核酸序列的癌细胞的生长和/或存活的减少和/或抑制和/或细胞死亡。该基因组编辑
方法可用于在已确定具有融合基因的对象中产生抗癌作用。

[0141] 在某些实施方式中，本公开的基因组编辑技术可包括将包含编码Cas蛋白或其突变体(例如Cas9D10A)的核酸序列的表达载体引入对象的携带融合基因的一个或多个细胞
(例如，癌细胞)中。在某些实施方式中，所述细胞不是前列腺癌细胞。在某些实施方式中，载体可以进一步包含一种或多种gRNA，用于将Cas9蛋白靶向基因组内的特定核酸序列。在某
些实施方式中，表达载体可以是病毒载体。

[0142] 在某些实施方式中，一种或多种gRNA可以与融合基因内的靶序列杂交。例如但非限制性地，一种或多种gRNA可以靶向融合基因的染色体断裂点和/或靶向侧接染色体断裂
点区域的一个或多个序列。本文和附图中公开了融合基因染色体断裂序列的非限制性实例
(参见例如，表1)。在某些实施方式中，一种gRNA可以与融合基因的一种基因内的区域互补，而另一种gRNA可以与融合基因的另一基因内的区域互补。例如但非限制性地，一种gRNA可
以与TMEM135-CCDC67融合基因的TMEM135基因内的区域互补，另一种gRNA可以与CCDC67基
因内的区域互补。在某些实施方式中，一种gRNA可以与MAN2A1-FER融合基因的MAN2A1基因
内的区域互补，而另一种gRNA可以与FER基因内的区域互补。在某些实施方式中，一种gRNA可以与PTEN-NOLC1融合基因的PTEN基因内的区域互补，而另一种gRNA可以与NOLC1基因内
的区域互补。在某些实施方式中，一种gRNA可以与融合基因的染色体断裂点上游的区域互
补，而另一种gRNA可以与染色体断裂点下游的区域互补。在某些实施方式中，可以进行基因组测序以确定可以被gRNA靶向的融合基因的区域。在某些实施方式中，gRNA靶向的基因区
域可以是内含子和/或外显子。

[0143] 在某些实施方式中，编码Cas蛋白(例如Cas9)的核酸序列可以与调节元件可操作地连接，并且当转录时，一种或多种gRNA可以将Cas蛋白导向基因组中的靶序列并诱导由该Cas蛋白进行的基因组基因座切割。在某些实施方式中，Cas9蛋白在靶序列附近存在的PAM
序列上游约3-4个核苷酸处切割。在某些实施方式中，与编码Cas蛋白的核酸序列可操作地
连接的调节元件可以是启动子，例如诱导型启动子，例如多西环素诱导型启动子。当应用于DNA序列时，例如在表达载体中，术语“可操作地连接”表示序列经排列从而它们协同作用以实现其预期目的，即启动子序列允许转录起始，进行通过连接的编码序列，到达终止信号。

[0144] 在某些实施方式中，由本发明的载体编码的Cas9酶可包含一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变或获得功能或丧失功能的突变。此类突变的非限制性实例包括Cas9
蛋白的催化结构域，例如RuvC和HNH催化结构域中的突变，例如RuvC催化结构域内的D10突
变和HNH催化结构域中的H840。在某些实施方式中，Cas9蛋白的催化结构域之一中的突变导致Cas9蛋白起“切口酶”的作用，其中突变的Cas9蛋白仅切割靶DNA的一条链，产生单链断裂或“缺口。”在某些实施方式中，使用突变的Cas9蛋白，例如Cas9D10A，允许使用两种gRNA来促进靶DNA的两条链的切割。Cas9突变的其它非限制性实例包括VP64，KRAB和SID4X，FLAG，
EGFP和RFP。在某些实施方式中，本公开的基因组编辑技术还可包括向所述一个或多个细胞中引入包含核酸的其它载体，所述核酸在表达时导致所述一个或多个细胞的死亡，例如细
胞凋亡。在某些实施方式中，该载体还可包含一个或多个靶向序列，其与gRNA靶向的基因组序列相同和/或相邻的序列互补(例如，可以杂交)，以允许发生同源重组和核酸序列(即供
体核酸序列)插入基因组。在某些实施方式中，另外的载体还可包含构成融合基因的基因的外显子/内含子连接的一个或多个剪接标签序列。在某些实施方式中，靶向序列可以与融合基因的基因内的内含子，外显子序列和/或内含子/外显子剪接序列互补。在某些实施方式
中，一个靶向序列可以与gRNA靶向的融合基因的一个基因内的区域互补，并且第二个靶向
序列可以与融合基因的另一个基因内的区域互补，以允许包含供体核酸的载体和由Cas9蛋
白切割的基因组序列之间的同源重组。例如但非限制性地，一种靶向序列可以与TMEM135-
CCDC67融合基因的TMEM135基因内的区域互补，另一种靶向序列可以与CCDC67基因内的区
域互补。在某些实施方式中，一种靶向序列可以与MAN2A1-FER融合基因的MAN2A1基因内的
区域互补，而另一种靶向序列可以与FER基因内的区域互补。在某些实施方式中，一种靶向序列可以与PTEN-NOLC1融合基因的PTEN基因内的区域互补，而另一种靶向序列可以与
NOLC1基因内的区域互补。在某些实施方式中，一种靶向序列可以与由Cas9蛋白产生的切割位点上游的区域互补，而另一种靶向序列可以与染色体断裂点下游的区域互补。以上公开
了可插入基因组中的核酸序列类型的非限制性实例。在某些实施方式中，待插入基因组的
核酸编码HSV-1胸苷激酶。可以插入携带融合基因的细胞的基因组以诱导细胞死亡的核酸
和/或基因的其它非限制性实例如上所述。

[0145] 用于本公开的载体可以是本领域已知的任何载体。例如但不限于，载体可以衍生自质粒，粘粒，病毒载体和酵母人工染色体。在某些实施方式中，载体可以是含有来自几种来源的DNA序列的重组分子。在某些实施方式中，载体可以包括其它片段，例如但不限于启动子，转录终止子，增强子，内部核糖体进入位点，非翻译区，多腺苷酸化信号，选择标志物，复制起点等。在某些实施方式中，可以通过本领域已知的任何技术(例如通过电穿孔，转染和转导)将载体引入一个或多个细胞中。在某些实施方式中，可以通过腺病毒转导引入载
体。

[0146] 表1.融合基因连接序列和靶向融合基因连接的siRNA序列。

[0147]

[0148]

[0149]

[0150]

[0151] 头部基因用斜体字体表示。

[0152] 靶向的序列带下划线并加粗。

[0153] 5.5.1特定的非限制性实例

[0154] 在某些实施方式中，本发明的基因组编辑技术包括向对象的一个或多个细胞(例如癌细胞)中引入：(i)包含编码Cas9蛋白或其突变体的核酸序列的载体；(ii)包含与融合
基因的一个或多个靶序列互补的一种或多种gRNA的载体，其在表达时诱导Cas9介导的融合
基因内的DNA切割；和(iii)载体，其包含供体核酸序列(其在表达时导致细胞死亡)，和与融合基因的一个或多个序列互补的一个或多个靶向序列，以促进同源重组和供体核酸序列向
融合基因中的插入。在某些实施方式中，所述癌细胞不是前列腺癌细胞。

[0155] 在某些实施方式中，本发明的基因组编辑技术包括向对象的一个或多个细胞中引入：(i)载体，其包含编码Cas9蛋白或其突变体(例如Cas9D10A)的核酸序列，和与融合基因的一个或多个靶序列互补的一个或多个gRNA，其中，当转录时，一个或多个gRNA指导一个或多个Cas9蛋白与融合基因的一个或多个靶序列的序列特异性结合，以促进融合基因的切割；
和(ii)载体，其包含供体核酸序列，其在表达时导致细胞死亡，和与融合基因的一个或多个序列互补的一个或多个靶向序列，以促进同源重组和供体核酸序列向融合基因中的插入。
在某些实施方式中，一种或多种靶向序列可包括融合基因的染色体断裂点和/或侧接染色
体断裂点区域的一个或多个序列或其组合。例如但非限制性地，靶序列可包含融合基因的
断裂点序列的至少一部分和包含融合基因的基因之一的序列的至少一部分。

[0156] 在某些实施方式中，本发明的基因组编辑技术包括向对象的一个或多个细胞中引入：(i)载体，其包含编码Cas9蛋白或其突变体的核酸序列，和与融合基因的一个或多个靶序列互补的一个或多个gRNA，其中，当转录时，一个或多个gRNA指导Cas9蛋白与融合基因的一个或多个靶序列的序列特异性结合，以促进融合基因的切割；和(ii)载体，其包含编码
HSV-1胸苷激酶的供体核酸序列和与融合基因的一个或多个序列互补的一个或多个靶向序
列，以促进同源重组和编码HSV-1胸苷激酶的供体核酸序列向融合基因中的插入。在某些实施方式中，基因组编辑技术还包括施用治疗有效量的更昔洛韦和/或缬更昔洛韦。

[0157] 5.6试剂盒

[0158] 本发明进一步提供了用于治疗携带本文公开的一种或多种融合基因的对象和/或用于实施上述检测和治疗方法中的任何一种的试剂盒。在某些实施方式中，本公开提供了
用于对携带本文公开的一种或多种融合基因的对象中的一个或多个癌细胞进行靶向基因
组编辑技术的试剂盒。在某些实施方式中，一个或多个癌细胞不是前列腺癌细胞。

[0159] 试剂盒的类型包括但不限于，包装的融合基因特异性探针和引物组(例如，TaqMan探针/引物组)，阵列/微阵列，抗体，其还含有用于检测一种或多种融合基因的一种或多种探针、引物或其它试剂和/或可包括用于进行基因组编辑技术的器具。

[0160] 在某些实施方式中，试剂盒可包括用于进行本文公开的基因组编辑技术的器具。例如但非限制性地，本公开的试剂盒可包括容器，所述容器包含一种或多种载体或质粒，所D10A
述载体或质粒包含编码Cas蛋白或其突变体(例如Cas9 )的核酸。在某些实施方式中，编
码Cas蛋白的核酸可以与调节元件如启动子可操作地连接。在某些实施方式中，所述一种或多种载体还可包含对融合基因具有特异性(例如对融合基因的断裂点和/或融合基因断裂
点侧翼的序列具有特异性)的一种或多种gRNA。

[0161] 在某些实施方式中，本发明的试剂盒可任选地在与包含编码Cas蛋白的核酸的载体相同的容器中或在另一容器中包含含有核酸的一种或多种载体或质粒，其在表达时(在
存在不存在化合物下)导致细胞死亡。例如但非限制性地，核酸序列可编码单纯疱疹病毒1
(HSV-1)胸苷激酶，来自铜绿假单胞菌的外毒素A，来自棒状杆菌的白喉毒素，来自蓖麻(蓖麻油植物)的蓖麻毒素或相思豆毒素，来自细菌或酵母的胞嘧啶脱氨酶，羧基酯酶或水痘带状疱疹病毒(VZV)胸苷激酶。在某些实施方式中，该载体还可包含与融合基因内的序列互补的一个或多个靶向序列，以促进供体核酸的同源重组和插入。

[0162] 在某些实施方式中，当供体核酸编码HSV-1胸苷激酶时，试剂盒还可包含更昔洛韦和/或缬更昔洛韦。

[0163] 在某些非限制性实施方式中，本公开的试剂盒还包含一种或多种核酸引物或探针和/或抗体探针，用于实施任何上述方法。所述探针可以可检测地标记，例如用生物素，比色，荧光或放射性标志物。核酸引物可以以一对的一部分形式提供，例如用于聚合酶链式反应。在某些非限制性实施方式中，核酸引物的长度可以是至少约10个核苷酸或至少约15个
核苷酸或至少约20个核苷酸长度和/或至多约200个核苷酸或至多约150个核苷酸或至多约
100个核苷酸或至多约75个核苷酸或至多约50个核苷酸。核酸探针可以是寡核苷酸探针和/
或适用于FISH分析的探针。在具体的非限制性实施方式中，试剂盒包含用于分析TRMT11-
GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-
AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1中至少两种，至少三种，至少四种，至少五种，六种，七种，八种，九种，十种，十一种，十二种，十三种，十四种的引物和/或探针。在某些实施方式中，试剂盒包含用于分析TMEM135-CCDC67，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1和CCNH-C5orf30的引
物。

[0164] 在某些非限制性实施方式中，核酸引物和/或探针可以固定在固体表面，底物或支持物上，例如固定在核酸微阵列上，其中与固体表面或支持物结合的每种引物和/或探针的位置是已知且可识别的。核酸引物和/或探针可以固定到基材上，例如玻璃，塑料，纸，尼龙或其它类型的膜，过滤器，芯片，珠子或任何其它合适的固体支持物。核酸引物和/或探针可以直接在基材上合成，或者与基材分开合成，然后固定在基材上。可以使用已知方法制备阵列。

[0165] 在非限制性实施方式中，试剂盒提供用于FISH分析的核酸探针，以确定从对象获得的样品中一种或多种融合基因的存在。在某些实施方式中，所述一种或多种融合基因选
自下组：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-
CCDC67，CCNH-C5orf30，TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，MTOR-TP53BP1，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，
PCMTD1-SNTG1及其组合。在非限制性实施方式中，试剂盒提供用于一种或多种融合基因的
FISH分析的核酸探针。在某些实施方式中，所述一种或多种融合基因可包括：TRMT11-
GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，PTEN-NOLC1和CCNH-C5orf30，和TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，MTOR-TP53BP1或其组合。在具体的非限制性实施方式中，可以提供用于检测融合基因的探针，使得分开的探针各自结合融合基因的两个组分，或探针可以结合包含剪接基因之间的边界的
“连接”。例如但非限制性地，连接是两个基因连接在一起的区域。在具体的非限制性实施方式中，试剂盒包含用于分析ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1或
PCMTD1-SNTG1中的至少两种，至少三种，至少四种或全部五种的所述探针。

[0166] 在非限制性实施方式中，试剂盒提供用于PCR分析的核酸引物，以确定从对象获得的样品中一种或多种融合基因的存在。在某些实施方式中，所述一种或多种融合基因可选
自下组：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-
CCDC67，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，MTOR-TP53BP1及其组合。在非限制性实施方式中，试剂盒提供用于PCR分析一种或多种融合基因的核酸引物，所述融合基因选自下组：ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，
ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1或PCMTD1-SNTG1。在具体的非限制性实施方式中，试剂盒包含用于分析TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1中至少两种，至少三种，至少四种，至少五种，六种，七种，八种，九种，十种，十一种，十二种，十三种，十四种的所述引物。

[0167] 提供以下实施例以更全面地说明本公开，但不应解释为限制其范围。

[0168] 6.实施例1：靶向导致异种移植人类癌症的复发的融合基因的染色体断裂点的基因组治疗

[0169] 6.1介绍

[0170] 在该实施例中，开发了基因组干预方法以基于由基因组重排产生的独特序列杀伤癌细胞。来自MAN2A1-FER和TMEM135-CCDC67融合基因的染色体断裂点被用作治疗靶标。先
前已经确定MAN2A1-FER和TMEM135-CCDC67融合基因存在于前列腺癌中(参见WO2016/
011428，其内容通过引用整体并入本文)。此外，已显示MAN2A1-FER融合基因存在于多形性胶质母细胞瘤，非小细胞肺癌，卵巢癌，食道腺癌和肝癌中，其百分比范围为2-25.9％。已显示MAN2A1-FER融合基因存在于16.8％的非小细胞肺癌，15.7％的肝癌，7.1％的GBM，25.9％的食道腺癌，5.2％的前列腺癌和1.7％的卵巢癌中。

[0171] 最初发现规律成簇的间隙短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)是原核细胞中针对外来病原体的免疫防御机制之一2。Cas9是CRISPR/Cas系统II型的关键蛋白，发现其含有DNA切割活性。Cas9的核酸酶活性由来自CRISPR RNA的20-碱基互补序列和反式激活
型CRISPR RNA向靶DNA的引导3。由于可以将反式激活型CRISPR RNA和CRISPR RNA制成含有
两种RNA物质的全部功能的嵌合RNA，因此将向导RNA(gRNA)用于人工融合RNA4。Cas9催化结构域中的D10A突变将其转化为切口酶，该切口酶在靶DNA处产生单核苷酸断裂4。通过使用
细胞同源定向修复(HDR)途径，可以使用切口基因组DNA将序列精确地引入特定基因组基因
座。在靶DNA中引入两个相邻的切口(双切口)将引入序列效率提高了50至1500倍5，超过了
天然同源重组率，脱靶率低至1/10000。这种特异性使得体细胞基因组靶向成为治疗人类疾病的可行方法，特别是治疗携带正常细胞中不存在的融合基因的肿瘤。

[0172] 单纯疱疹病毒1胸苷激酶(HSV1-tk)使胸苷磷酸化并形成胸苷单磷酸，这是DNA合成的基础。然而，HSV1-tk的底物特异性不同于其哺乳动物对应物的底物特异性，因为其还使合成的核苷同源物更昔洛韦(前药)7磷酸化，它不被哺乳动物胸苷激酶识别。这种磷酸化导致在用更昔洛韦处理后，表达HSV1-tk的哺乳动物细胞中单磷酸更昔洛韦的积累。单磷酸更昔洛韦通过另外两种激酶转化为其三磷酸盐形式8。三磷酸更昔洛韦通过延长终止来阻
断DNA合成。相反，对HSV1-tk呈阴性的哺乳动物细胞由于不能使更昔洛韦磷酸化而免于这
种作用。

[0173] 在本实施例中，我们显示通过使用Cas9D10A介导的基因组编辑，我们已成功地将HSV1-tk插入融合基因MAN2A1-FER的染色体断裂点。用更昔洛韦治疗携带该染色体断裂点
的肿瘤导致细胞培养中的细胞死亡和重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中异种移植的前列腺
癌和肝癌的缓解。

[0174] 6.2材料和方法

[0175] 材料与载体构建。PC3(前列腺癌)，Du145(前列腺癌)和肝细胞癌细胞系HUH7和HEP3B细胞购自美国细胞培养收藏中心(American Type Cell Culture，弗吉尼亚州马纳萨
斯)。用补充有10％胎牛血清(InVitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的F12K培养基培养
PC3细胞。用补充有10％胎牛血清(Invitrogen)的改良伊氏培养基培养DU145细胞。用补充
有10％胎牛血清(InVitrogen)的改良伊氏培养基培养HEP3B细胞。将HUH7细胞与补充有
10％胎牛血清的杜氏改良的伊氏培养基一起培养。使用以下几组引物，通过PCR测试这些细胞系的基因组在基因组的八个不同基因座(CSF1PO，D13S317，D16S539，D5S818，D7S820，THO1，TPOX和vWA)上的短串联重复(STR)DNA谱。

[0176] CSF1PO:AACCTGAGTCTGCCAAGGACTAGC(SEQ ID NO:78)/TTCCACACACCACTGG CCATCTTC(SEQ ID NO:79)；

[0177] D13S317:ACAGAAGTCTGGGATGTGGA(SEQ ID NO:80)/GCCCAAAAAGACAGACAGAA(SEQ ID NO:81)，

[0178] D16S539:GATCCCAAGCTCTTCCTCTT(SEQ ID NO:82)/ACGTTTGTGTGTGCATCTGT(SEQ ID NO:83)；

[0179] D5S818:GGGTGATTTTCCTCTTTGGT(SEQ ID NO:84)/TGATTCCAATCATAGCCACA(SEQ ID NO:85)；

[0180] D7S820:TGTCATAGTTTAGAACGAACTAACG(SEQ ID NO:86)/CTGAGGTATCAAAAACTC AGAGG(SEQ ID NO:87)；

[0181] TH01:GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT(SEQ ID NO:88)/ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTGG(SEQ ID NO:89)；

[0182] TPOX:ACTGGCACAGAACAGGCACTTAGG(SEQ ID NO:90)/GGAGGAACTGGGAACCACACAGGT(SEQ ID NO:91)；

[0183] vWA:CCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATG(SEQ ID NO:92)/GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGG(SEQ ID NO:93)。

[0184] 这些细胞系经过鉴定，因为细胞系的STR谱与ATCC公布的完美匹配。兔多克隆抗Cas9抗体购自Clontech公司，加利福尼亚州。兔抗HSV-1TK多克隆抗体购自Sigma公司，俄亥俄州。

[0185] 载体的构建。为了构建gRNA表达载体，分析了侧接TMEM135-CCDC67断裂点区的序列，并使用DNA 2.0工具设计了gRNA：https：//www.dna20.com/eCommerce/cas9/input。将gRNA-和gRNA+连接进入All-in- 载体中，该载体还包含Cas9D10A。然
后，插入物通过用XbaI限制酶切来释放，并连接到类似限制酶切的VQAd5穿梭载体中，以产生VQAd5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9。然后使用先前描述的方法(14)将重组穿梭载体与pAD5病毒重组以产生pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9。

[0186] 为了构建供体DNA重组病毒，使用以下引物对pEGFP-N1进行PCR：GTACTCACGTAAGCTTTCGCCACCATGGTGAGCAAGG(SEQ ID NO:94)；和GACTCAGATGGGCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
(SEQ ID NO:95)。PCR产物用KasI和HindIII限制酶切，并连接到类似限制酶切的pSELECT-
zeo-HSV1tk载体中，以产生pEGFP-HSV1-tk。

[0187] 对来自样品的基因组DNA(其中发现TMEM135-CCDC67融合)进行PCR，以获得TMEM135的内含子13序列，使用以下引物：GACTCAGATGGCGGCCGCCTGTATTCTTTGTTTTACAGATT
TGCTGTCAGGGGTTAGATAGCTTGCCAG(SEQ ID NO:96)/GTACTCACGTAAGCTTGAGCTAACATTACCAAT
GAGGC(SEQ ID NO:97)。然后，PCR产物用NotI和HindIII限制酶切，并连接到类似限制酶切的pEGFPtk载体中，以产生pTMEM135int13-EGFP-tk。随后，对来自发现TMEM135-CCDC67融合的样品的基因组DNA进行PCR，以获得CCDC67的内含子9序列，使用以下引物：GACTCAGATGGCTAGCAGTTCACTGAGTGTGCCATGC(SEQ ID NO:98)/GTACTCACGTGAATTCCTATTCTGCCTGCTTGCATACC
TTTTGTTTT GGTTGCA GTATAGTGGGCTGAG(SEQ ID NO:99)。然后，PCR用NheI和EcoRI限制酶
int13 int13
切，并连接到类似限制酶切的pTMEM135 -EGFP-tk载体中以产生pTMEM135 -EGFP-tk-
CCDC67int9。然后，载体用EcoR1和NotI限制酶切并连接到类似限制酶切的pAdlox中，以产生pAdlox-pTMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9。然后，将重组穿梭载体与腺病毒重组，以产生pAd-TMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9。为了构建pCMV-TMEM135-CCDC67bp载体，对来自
TMEM135-CCDC67融合阳性的前列腺癌样品的基因组DNA进行PCR，使用以下引物：GACTCAGA
TGAAGCTTAAGAGCATGGGCTTTGGAGTC(SEQ ID NO:100)/GTACTCACGTTCTAGACTGGAATCTAGGACT
CTTGGC(SEQ ID NO:101)。然后对PCR产物测序以确认TMEM135-CCDC67断裂点的存在。PCR产物用HindIII和XbaI消化，并连接到类似消化的pCMVscript载体中。随后使用
lipofectamine 3000将构建体转染到PC3和DU145细胞中。通过将转染的细胞在含有G418
(200μg/ml)的培养基中孵育来选择稳定表达TMEM135-CCDC67断裂点转录物的细胞。

[0188] pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14的构建遵循构建用于靶向如上所述的TMEM135-CCDC67融合基因的gRNA的类似操作。为了构建pAdlox-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14，对来自HUH7细胞的1μg基因组DNA进行延伸的长PCR，使用以下引物：

[0189] GACTCAGATGGCGGCCGCGAACATCAGAACTGGGAGAGG(SEQ ID NO:102)/GTACTCACGTAAGCTTCAGGAGAATCACTTGAACCCG(SEQ ID NO:103)。然后，PCR产物用HindIII和Not1消化，并连接到类似消化的pEGFP-tk载体中，以产生pMAN2A1int13-EGFP-tk。对应于MAN2A1内含子13/外显子14的剪接受体位点的合成序列

[0190] (TAATGTTGGTTTTACCAAAAATATAAATGGTTTGCCTCTCAGTAGATAACATTTATCTTTAATAAATTCCCTTCCCTATCTTTTAAAGATCTCTTTTCGAGCACATAT(SEQ ID NO:104)/TAATATGTGCTCGAAAAGA
GATCTTTAAAAGATAGGGAAGGGAA TTTATTAAAGATAAATGTTATCTACTGAGAGGCAAACCATTTATATTTTT
GGTAAAACCAACAT(SEQ ID NO:105))连接至ASE1限制酶切的pMAN2A1int13-EGFP-tk。单独地，使用引物GACTCAGATGGAATTCAAGGTGGAACACAGAAGGAGG(SEQ ID NO:121)/GTACTCACGTGAATT
CGATTACTTTAAATAACTCACTTGGCTTCT TGCAGAGGTAGAGCTGAGAGAAG(SEQ ID NO:122)对HUH7基
因组DNA进行PCR，以产生对应于FER的内含子14的1984-bp序列，包括对应于FER外显子15/
内含子15的31bp剪接供体位点序列。然后，PCR用EcoR1限制酶切，并连接到类似限制酶切的pMAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14中，以产生pMAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14。然后，载体用NotI限制酶切，并用T4DNA聚合酶钝端化。然后，产物用XmaI限制酶切。另外，pAdlox载体用HindIII限制酶切，用T4DNA聚合酶钝端化。产物用XmaI限制酶切，并与pMAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14的消化产物连接。然后，将重组穿梭载体与腺病毒重组，以产生pAd-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14。

[0191] 体外Cas9靶标切割测定。从一体(all-in-one)载体扩增gRNA DNA序列加支架DNA序列的+或-DNA链，采用以下引物：

[0192] 用于MAN2A1-FER的gRNA+模板的GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGAGAGATAGAGGGCCCCCTAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG(SEQ ID NO:108)，以及用于MAN2A1-FER的
gRNA-模板的GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGATAGCTAGAAGGTGGATCACGTTTTA
GAGCTAGAAATAGCAAG(SEQ ID NO:109)。使用来自加利福尼亚州Ambion公司的体外转录试剂
盒体外转录PCR产物，以获得gRNA+和gRNA-产物。裂解测定在25℃下进行10分钟，然后在以下条件下在37℃下进行1小时：1x Cas9核酸酶反应缓冲液，30nM gRNA 3nM DNA模板和30nM Cas9核酸酶，酿脓链球菌。切割的DNA在1％琼脂糖凝胶电泳中观察。

[0193] 凋亡细胞的荧光激活细胞分选(FACS)分析。测定于先前描述(8,9)。简言之，用pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-F ERint14和各种浓度的更昔洛韦处理的细胞用胰蛋白酶消化并用冷PBS洗涤两次。然后将细胞重悬于100μl膜联蛋白结合缓冲液(Invitrogen)中，并与5μl藻红蛋白(PE)-偶联的膜联蛋白V和1μl的100μg/ml碘化丙啶在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入400μl冷膜联蛋白结合缓冲液终止
结合测定。使用BD-LSR-II流式细胞仪(BD Science，加利福尼亚州圣何塞)进行FACS分析。
在533nm(FL2)的荧光发射下分析荧光染色的细胞。阴性对照，孵育培养基中既不具有PE也
不具有PI的细胞，用于设定采集的背景。UV处理的细胞用作细胞凋亡的阳性对照。对于每次采集，基于细胞的荧光颜色对10000至20000个细胞进行分析和分选。对于HUH7和HEP3B
FACS分析，进行类似的操作，不同之处在于仅用1μM scr-7处理这些细胞(伴病毒感染)以提高基因组编辑效率(10)。

[0194] 肿瘤生长与自发转移。异种移植操作如前所述(11,12)。对于HUH7和HEP3B异种移植肿瘤处理，应用如先前在WO 2016/011428的实施例7中所述的类似操作，不同之处在于由于癌症的快速生长而在肿瘤异种移植后2周开始治疗。处理组的分解如下：用pAD5-
Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-F ERint14和更昔洛韦处理用异种移植HUH7细胞的5只小鼠；用pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9/pAD-TMEM135int13-EG FP-tk-CCDC67int9和更昔洛韦(对照)处理异种移植HUH7细胞的5只小鼠；
D10A int13 int14 int13 int14
用pAD5-Cas9 -gRNAMAN2A1 -gRNAFER /pAD-MAN2A1 -EGFP-tk-F ER 和PBS
(对照)处理异种移植HUH7细胞的5只小鼠；用pAD5-Cas9D10AgRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FE Rint14和更昔洛韦(对照)处理异种移植HEP3B细胞的5只小鼠。
将所有动物用scr-7(10mg/kg)与病毒一起处理。所有动物操作均经匹兹堡大学动物护理和
使用委员会批准。

[0195] 免疫组化。如前所述，用对HSV-1TK(1:100稀释)或Cas9(1:100稀释)具有特异性的抗体进行免疫组化。阴性对照中省去抗体。然后将切片与辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG在室温下孵育30分钟(来自Vector Labs公司的ABC试剂盒)。然后将载玻片暴露于3,3'-二氨
基联苯胺溶液以观察免疫染色。通过在室温下将载玻片在1％苏木精溶液中孵育2分钟来进
行复染。然后将载玻片在蒸馏水中短暂冲洗以除去过度染色。TUNEL测定的操作类似于先前描述的操作(13)。

[0196] 6.3结果

[0197] 在前列腺癌中发现的一种复发融合基因位于编码跨膜蛋白135(TMEM135)的基因和含卷曲螺旋结构域67(CCDC67)之间，即TMEM135-CCD676,16。融合基因通过染色体
11q14.2-21区域中的6-Mb缺失产生。该缺失使TMEM135的内含子13与染色体11中的CCDC67
的内含子9连接(图13A)，并产生在正常组织中不存在的独特序列断裂点，从而在癌细胞中
提供用于治疗干预的独特靶标。

[0198] 为了靶向该连接序列，设计了两个sgRNA，每个sgRNA与相对链上侧接染色体断裂点的一个区域互补(图13B)。将这些向导RNA(gRNA)和Cas9D10A序列连接到VQAd5-CMV穿梭载体中，并重组到pAD5腺病毒中，以产生pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9。为了向靶向的癌细胞提供潜在致死基因，将HSV-1tk的cDNA与EGFP cDNA框内连接，从而产生嵌合基
因EGFP-tk。嵌合cDNA是无启动子的，但含有完整的开放阅读框和核糖体结合位点，用于独立的翻译起始。为了提供与HDR途径接合的同源序列，然后，将该构建体在5'末端与TMEM135的内含子13序列的584bp并在3'末端与CCDC67的内含子9序列的561bp连接。随后，将这些序列连接到PAdlox穿梭载体中，并重组到腺病毒中，从而产生pAD-TMEM135int13-EGFP-tk-
CCDC67int9(图13C)。在含有TMEM135-CCDC67断裂点并用重组病毒处理的PC3或DU145细胞
中检测TMEM135int13–EGFP-tk–CCDC67int9的整合，EGFP-tk的表达和细胞凋亡(图31)。在WO 2016/011428中公开了TMEM135-CCD67在前列腺癌中的遗传靶向，其内容全文在此公开
(参见WO 2016/011428的图30、31和32，以及所附文本)。

[0199] 分析其它癌症的融合基因表达。筛选人肝细胞癌细胞系HUH7表明其表达融合基因之一，MAN2A1-FER(图15A和B)。在该细胞系中检测到MAN2A1-FER mRNA和蛋白质(图15A和
B)。在HUH7细胞中鉴定MAN2A1的内含子13和FER的内含子14之间的基因组断裂点。嵌合蛋白保留了来自FER的完整酪氨酸激酶结构域，但失去了调节激酶活性的SH2结构域。为了评估
靶向具有天然融合基因断裂点的癌细胞的基因组疗法的适用性，我们设计了对于MAN2A1的
内含子13和FER的内含子14具有特异性的一对gRNA(图15A)。将gRNA和Cas9D10A包装到腺病
D10A int13 int14
毒中以产生pAD5-Cas9 gRNAMAN2A1 -gRNAFER 。该重组病毒与含有侧接切口位点的
序列的“供体”重组腺病毒(pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14)共同感染。该“供体”病毒还含有分别对应于MAN2A1的内含子14的受体和FER的内含子15的供体的剪接序列，使得EGPF-
tk被中断为MAN2A1-FER的mRNA。结果显示，用这些病毒感染的HUH7细胞中高达27％表达
EGFP-tk(图15D和E；图16A)，而对于MAN2A1-FER融合阴性的HEP3B细胞的相似感染，这些病毒诱导最少的荧光蛋白表达。当TMEM135-CCDC67融合阴性的HUH7细胞被对TMEM135-CCDC67
断裂点具有特异性的腺病毒感染时，几乎没有EGFP-tk表达(图15D和E；图16A)。这些结果证实了这种基因组靶向技术的特异性。

[0200] 表2用于PCR和RT-PCR的引物序列。

[0201]

[0202] 当HUH7细胞用pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pADMAN2A1int13-EGFP-tk-FE Rint14(Ad-MF)感染并用不同浓度的更昔洛韦处理时，在10μg/ml更昔洛韦下，高达27％的细胞死亡，而即使在高浓度的更昔洛韦下，用相同病毒感染的HEP3B细胞也具有最少的细胞死亡(表3)。当HUH7细胞用Ad-TC感染并用更昔洛韦处理时，细胞死亡没有明显增加，清楚地表明，与含有TMEM135-CCDC67断裂点的PC3BP克隆和DU145BP克隆相比，更昔洛韦诱
导的细胞死亡是MAN2A1-FER断裂点依赖性的(表3；图16B)。如图14所示，选择转化的PC3细胞的克隆以定量相对于基因组中β-肌动蛋白的TMEM135-CCDC67断裂点的拷贝数。估计
PC3BP克隆的每个基因组含有一个拷贝的TMEM135-CCDC67断裂点，并根据其与β-肌动蛋白的比例(约1:4，PC3细胞对于含有β-肌动蛋白的染色体区域而言是超倍体)进行选择(图14)15。
类似的选择也应用于含有TMEM135-CCDC67断裂点的DU145克隆(DU145BP)。如通过tunel染
色所观察到的，用更昔洛韦处理的PC3BP和DU145BP克隆显示出显著的细胞死亡(图16B)。

[0203] 为了检测体内靶向MAN2A1-FER的基因组疗法的有效性，将SCID小鼠用HUH7和3
HEP3B细胞异种移植，并在异种移植后2周用重组病毒和更昔洛韦处理(平均约400mm)。用
HUH7细胞异种移植并用Ad-MF和更昔洛韦处理的小鼠的肿瘤大小从峰值降低了29％，并且
在治疗期间没有显著的转移或死亡。相反，用更昔洛韦和Ad-TC(对于HUH7细胞不携带的
TMEM135-CCDC67断裂点具有特异性的腺病毒)处理的用HUH7细胞异种移植的小鼠，肿瘤大
小有73倍增加。这些小鼠中有4只在肺和肝脏中有转移。所有5只小鼠在异种移植后40天内
死亡。在用AD-MF和PBS处理的小鼠中也发生了类似的死亡率，转移率和肿瘤体积的增加。用Ad-MF和更昔洛韦处理用HEP3B(一种呈MAN2A1-FER融合阴性的肝细胞癌细胞系)异种移植
的小鼠同样无效。这些结果表明靶向癌症基因组的治疗是高度特异和有效的。

[0204] 此外，我们的方法看来具有高度特异性，HEP3B细胞和HUH7细胞(EGFP-tk+细胞/Cas9D10A-RFP+细胞，用腺-MF处理，表4)的平均功能性脱靶率小于1％。这些脱靶率主要通过定量测序方法证实：1亿次读数中的脱靶率范围为<0.1％至2.5％，包括来自体外组织培养
实验，异种移植癌症的样品和来自小鼠的肝脏样品(用重组病毒处理)(表18-21)。基于测
序，体外中靶整合率范围为15.9％至25.5％，而异种移植肿瘤的比率范围为21.1％至
33.5％。异种移植肿瘤中较高的整合率可能反映了重组腺病毒的重复应用。

[0205] 表3.更昔洛韦的染色体断裂点依赖性癌细胞杀伤

[0206]

[0207] *-腺+Gan的处理包括10个感染复数的pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9和

[0208] pAD-TMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9和10μg/ml的更昔洛韦。

[0209] **-腺+Gan的处理包括10个感染复数的pAD5-Cas9D10A-gRNATMAN2A1int13-gRNAFERint14和

[0210] pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint9和10μg/ml的更昔洛韦。

[0211] 表4.染色体断裂点依赖的整合和EGFP-tk的表达

[0212]

[0213] *-处理包括10个感染复数的pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9和

[0214] pAD-TMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9。

[0215] **-处理包括10个感染复数的pAD5-Cas9D10A-gRNATMAN2A1int13-gRNAFERint14和

[0216] pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint9。

[0217] 6.4讨论

[0218] 由于新蛋白质的产生或蛋白质结构域的大幅截短的产生，融合基因对所涉及的基因功能的影响可能是显著的。例如，不限于特定理论，似乎在MAN2A1-FER融合基因中消除
FER的SH2结构域可导致FER酪氨酸激酶的组成型活化。

[0219] 对于MAN2A1-FER断裂点，我们的gRNA靶设计将在距离37bp的不同链上产生两个切口。这些切口不太可能产生双链DNA的完全断裂。结果，这些DNA损伤很可能通过同源重组过程而不是通过非同源末端连接来修复。我们的结果与其它几项研究一致，即CRISPR/Cas介
导的同源重组率可达到20-30％7。

[0220] 据我们所知，这是首次报告，显示这种系统可用于特异性靶向癌症基因组，并具有足以实现异种移植癌症缓解的重组率。EGFP-tk在基因组治疗中的精确特异性和整合率可能使这种方法应用于临床环境。提高将靶向盒整合到基因组靶位点的整合速率的未来发展
可能有助于提高基因组治疗的效率。值得注意的是，腺病毒GFP-tk基因组的供体序列在
gRNA靶位点之外，因此该病毒不含有可被gRNA-Cas9活性识别的靶序列。两种病毒之间的重组率可能很低。在超过300000个整合的EGFP-tk测序读数(表20-22)中，我们未发现任何指
示EGPFP-tk和Cas9之间重组的读数。

[0221] 目前针对人类癌症的治疗方法严重依赖于对于驱动癌症生长的信号转导途径的拦截。然而，这种方法总是导致药物耐受性和对药物治疗的抗性，因为癌症基因组会调整其基因表达模式，并且通过绕过信号转导阻遏的新突变，发展支持生长的新途径。随后，应用二次化学疗法可能会影响癌症和正常组织，因此通常可能产生不良的治疗效果。基因组方
法可能具有优于化疗的显著优势，因为它对癌症基因组序列具有特异性，并且无论突变是
否是癌症驱动因素，它都会杀死癌细胞。在癌症治疗的压力下，可能会产生额外的新突变和融合基因。原则上，可以设计其它载体以靶向这些基因组损伤，并且由于每个细胞的多重整合，甚至可以提高整合率(表22)。仍待确定这种适应性策略在临床中是否可行。对于包含具有若干不同融合基因靶标的多个癌细胞群的癌症，可以通过基因组靶向方案同时靶向这些
靶标。此外，我们的方法不限于在治疗盒(therapeutic cassette)中使用HSV-tk，而是可以使用多种基因装置，例如来自病毒的免疫原或来自植物或细菌的毒素。充分记录的几种前
17
药对肿瘤细胞杀伤的“旁观者”效应可以增强该基因组靶向策略的治疗效果。必要时，基因组靶向可以与其它癌症治疗方法结合，例如肿瘤免疫疗法或信号转导分子靶向，以获得更
好的治疗效果。

[0222] 表18.中靶序列和脱靶序列(SEQ ID NO:159-182，按顺序)

[0223]

[0224]

[0225] **与人类基因组的GRCh38 .p7初级组装数据库或与小鼠基因组的GRCm38.p4C57BL/6J比对。Chr-染色体

[0226] 表19.用于Illumina HiSEQ2500的中靶和脱靶测序引物(SEQ ID NO:182-223，按顺序)

[0227]

[0228] **与人类基因组的GRCh38 .p7初级组装数据库或与小鼠基因组的GRCm38.p4C57BL/6J比对。

[0229] Chr-染色体

[0230] 表20.在体外定量TMEM135-CCD67和MAN2A-FER基因组治疗的中靶和脱靶读数。

[0231]

[0232] DU145BP-DU145细胞系，含有TMEM135-CCDC67断裂点。

[0233] PC3BP-PC3细胞系，含有TMEM135-CCDC67断裂点。

[0234] 体外DU145BP-DU145BP细胞培养物，用Ad-TC处理。

[0235] 体外PC3BP–PC3BP细胞培养物，用Ad-TC处理。

[0236] DU145BP肿瘤-DU145BP异种移植肿瘤，用Ad-TC处理。

[0237] PC3BP肿瘤-PC3BP异种移植肿瘤，用Ad-TC处理。

[0238] 体外HUH7-HUH7细胞培养物，用Ad-MF处理。

[0239] HUH7肿瘤-HUH7异种移植肿瘤，用Ad-MF处理。

[0240] 中靶-对-末端读数，映射到一端的正确中靶基因组序列和配对端的EGFP-tk序列。

[0241] 脱靶-对-末端读数，映射到一端的脱靶基因组序列和配对端的EGFP-tk序列。

[0242] Off/On：脱靶率(％)。

[0243] 总读数-包括未映射和映射读数的读数总数。

[0244] 表21.在没有融合基因断裂点的细胞中定量基因组EGFP-tk读数。

[0245]

[0246] Ad-TC-AD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9和AD-TMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9。

[0247] Ad-MF-AD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14和AD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14。

[0248] gEGFP-tk读数-对-末端读数，映射到一端的正确中靶或脱靶基因组序列和配对端的EGFP-tk序列。

[0249] 映射的读数-对-末端读数，映射到测序引物附近的正确基因组序列。

[0250] 总读数-包括未映射和映射读数的读数总数。

[0251] mLiver-小鼠肝细胞，来自异种移植癌细胞的动物，并用重组腺病毒处理。

[0252] ％Off-gEGFP-tk/映射的读数

[0253] DU145CMV-含有pCMVscript的DU145细胞.

[0254] PC3CMV-含有pCMVscript的PC3细胞。

[0255] 体外DU145CMV-DU145CMV细胞培养物，用Ad-TC处理。

[0256] 体外PC3CMV-PC3CMV细胞培养物，用Ad-TC处理。

[0257] DU145CMV肿瘤-DU145CMV异种移植肿瘤，用Ad-TC处理。

[0258] PC3CMV肿瘤-PC3CMV异种移植肿瘤，用Ad-TC处理。

[0259] mLiver(DU145BP)-mLiver，来自用DU145BP细胞异种移植的小鼠，并用Ad-TC处理。

[0260] mLiver PC3BP)-mLiver，来自用PC3BP细胞异种移植的小鼠，并用Ad-TC处理。

[0261] 体外HEP3B-HEP3B细胞培养物，用Ad-MF处理。

[0262] HEP3B肿瘤-HEP3B异种移植肿瘤，用Ad-MF处理。

[0263] mLiver(HUH7)-mLiver，来自用HUH7细胞异种移植的小鼠，并用Ad-MF处理。

[0264] 表22.EGFP-tk在体外和体内基因组治疗中的整合率。

[0265]

[0266] 体外DU145BP-DU145BP细胞培养物，用Ad-TC处理。

[0267] DU145BP肿瘤-DU145BP异种移植肿瘤，用Ad-TC处理。

[0268] 体外PC3BP-PC3BP细胞培养物，用Ad-TC处理。

[0269] PC3BP肿瘤-PC3BP异种移植肿瘤，用Ad-TC处理。

[0270] 体外HUH7-HUH7细胞培养物，用Ad-MF处理。

[0271] HUH7肿瘤-HUH7异种移植肿瘤，用Ad-MF处理。

[0272] 基因组-EGFP-tk读数-对-末端读数，映射到一端的正确中靶基因组序列和配对端的EGFP-tk序列。

[0273] BP读数-对-末端读数，映射到一端的染色体断裂点的左侧和配对端的染色体断裂点的右侧，或包含染色体断裂点的任何映射的读数。

[0274] 整合率-基因组-EGFP-tk读数/BP读数

[0275] 6.5参考文献

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[0293] 7.实施例2：核Pten-NOLC1融合在人类癌症中是致癌的。

[0294] 7.1介绍

[0295] 在该实施例中，开发了基因组干预方法以基于由基因组重排产生的独特序列杀伤癌细胞。来自Pten-NOLC1融合基因的染色体断裂点被用作治疗靶标。先前已经确定Pten-
NOLC1融合基因存在于前列腺癌中(参见WO2016/011428，其内容通过引用其全文并入本
文)。

[0296] 磷酸酶和张力蛋白同源物(Pten)(1,2)，PIP3的磷酸酶(3,4)，维持稳态Akt/PI3K信号转导，是细胞存活和生长的关键调节因子(5,6)。Pten的多泛素化导致细胞质中Pten的失活，而Pten的单泛素化将该蛋白质转移到细胞核中(7,8)。核Pten调节Rad51的DNA修复活性并维持染色体稳定性(9)。Pten的缺失可能与基因组重排有关(10)。已经在多种人类恶性肿瘤中报道了Pten缺失或突变，并且认为其是人类癌症发展的最重要的驱动事件之一
(11)。然而，Pten的唯一未经检查的Akt/PI3K信号转导或核功能是否足以供于癌症发展仍
不清楚。

[0297] 本文中，通过对87个前列腺样本的高覆盖度(600-1500x)转录组测序分析鉴定了一种新的Pten相关融合蛋白，包括来自健康个体的20份器官供体前列腺样品，与癌症相邻
的3份良性前列腺组织和64份前列腺癌。通过Fusion-Catcher筛选和多重过滤，鉴定了96种癌症特异性融合转录物(表6)。通过桑格测序和荧光原位杂交验证了这些融合基因中的六
个(FISH，图17-19)。这些融合基因之一涉及Pten和NOLC1。肿瘤抑制基因Pten(1)与NOLC1
(12,13)，一种用于核仁器官发生的核仁和卷曲体磷蛋白(13)框内融合产生Pten-NOLC1的
嵌合蛋白。

[0298] PTEN的缺失或突变在多种人类癌症中是常见的，并且是人类癌症发展的潜在机制之一。本文中，我们报告人类恶性肿瘤中Pten和核仁器官发生蛋白NOLC1之间的融合蛋白。

[0299] Pten-NOLC1融合在8种人类恶性肿瘤中高度复发(66-85％)。Pten-NOLC1之间的基因融合导致Pten蛋白的C2结构域的缺失，以及融合基因产物向细胞核的易位。DU145和MCF7细胞的Pten-NOLC1基因组断裂点的靶向中断阻碍了肿瘤细胞生长，延迟了S期进入，延迟了细胞迁移和侵袭，并且易于发生UV诱导的细胞凋亡。Pten-NOLC1的敲除阻断了SCID小鼠中
异种移植的DU145肿瘤生长，而通过对小鼠流体动力学注射Pten-NOLC1的强制表达导致肝
细胞癌的发展。在Pten-NOLC1诱导的肿瘤中检测到C-Met/HGFR信号转导的上调。这些结果
表明Pten-NOLC1融合产生功能增益，并将肿瘤抑制基因转化为致癌基因。

[0300] 7.2材料和方法

[0301] 组织样品：

[0302] 研究中使用的总共815份组织样品包括268份前列腺癌，10份相匹配的血液样本，20份供体前列腺，102份非小细胞肺癌，61份卵巢癌，60份结肠癌，70份肝癌，156份胶质母细胞瘤，60份乳腺癌，和34份食管腺癌根据机构监管指南(表7和12)，从匹兹堡大学组织库获得。先前描述了PCa样品的显微切割和DNA提取(21-23)。组织采购和操作方案由匹兹堡大学机构审查委员会批准。所有细胞系均购自美国典型细胞培养公司(ATCC)。细胞培养操作遵
循制造商的手册。

[0303] 还从其它研究所获得癌组织：从堪萨斯大学获得的16份非小细胞肺癌样品；来自爱荷华大学的28份非小细胞肺癌样品；来自西北大学的3份多形性胶质母细胞瘤样品；来自斯坦福大学的50份前列腺癌样品；和来自威斯康星大学麦迪逊分校的163份样品；所有方案均由机构审查委员会批准。研究中使用的细胞系购自美国典型细胞培养中心(ATCC)，并按
照制造商的建议进行培养和维持。

[0304] 载体的构建：为了构建Pten-NOLC1的cDNA，使用引物AGGGGCATCAGCTACCCTTAAGTCCAGAGCCATTTC(SEQ ID NO:127)/GGCATTGGCATCCTGCTGTGT CTTAAAATTTGGAGAAAAGTA(SEQ
ID NO:128)对Pten的cDNA模板进行PCR，得到与Pten的5'末端对应的cDNA，在以下条件下进行：94℃2分钟，94℃30秒，61℃30秒，72℃30秒，35个循环。另外，使用引物TACTTTTCTCCAAATTTTAAGACACAGCAGGATGCCAATGCC(SEQ ID NO:129)/ACCGAAGATGGCCTCTCTAGACTCGCTGTCAA
ACTT(SEQ ID NO:130)对NOLC1的cDNA模板进行PCR，在相同条件下进行，以获得NOLC1的3'
末端。合并2个反应的PCR产物。在相同条件下，使用AGGGGCATCAGCTACCCTTAAGTCCAGAGCCATTTC(SEQ ID NO:131)/ACCGAAGATGGCCTCTCTAGACTCGCTGTCAAACTT(SEQ ID NO:132)进行
PCR，以获得全长Pten-NOLC1cDNA。然后用AflII和XbaI限制酶切PCR产物，并连接到类似消化的pCDNA4-FLAG载体中以产生pPten-NOLC1-FLAG载体。

[0305] 为了构建Pten-EGFP载体，使用引物：CTTAAAATTTGGAGATCTAGATCGGTTGGCTTTGTC(SEQ ID NO:133)/ACCGAAGATGGCCTCTCTAGAGACTTTTGTAATTTGTGTATGCTG ATC(SEQ ID NO:
134)对Pten的cDNA模板进行PCR。PCR产物用NdeI和Xba1限制酶切，并连接到类似限制酶切
的pEGFP载体中以产生pPten-EGFP。为了构建pNOLC1-cherry，对NOLC1的cDNA模板进行PCR，使用引物：TCAGCTACCCTTAAGCGGTAGTGACGCGTATTGC(SEQ ID NO:135)/ACCGAAGATGGCCTCTC
TAGACTCGCTGTCAAACTT(SEQ ID NO:136)。PCR产物用AflII和XbaI限制酶切，并连接到类似
限制酶切的pCNDA4-Cherry载体中。

[0306] 为了构建pGST-Pten载体，使用引物GTGGGATCCACATGACAGCCATCATCAAAGAG(SEQ ID NO:137)/CATACACAAATTACAAAAGTCTGAGGATCCCCAGGAATTCCCGGGTCGACTC(SEQ ID NO:138)在
以下条件下进行PCR：94℃2分钟，然后94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环。PCR产物用BamH1限制酶切，并连接到类似限制酶切的pGEX5T载体，以产生pGST-Pten。

[0307] 为了构建pGST-Pten-NOLC1载体，使用引物GTGGGATCCACATGACAGCCATCATCAAAGAG(SEQ ID NO:139)/CGAGTCGACCCGGGAATTCCTGGGGATCCTCACTCGCTGTCAAA CTTAATAG(SEQ ID
NO:140)，对Pten-NOLC1cDNA模板进行PCR，用BamH1限制酶切，并连接到类似限制酶切的
pGEX5T载体中，以产生pGST-Pten-NOLC1。

[0308] 为了构建pPT3-EF1α-Pten-NOLC1，使用引物5’CTCCGGACTCTAGCGTCGACACTTAAGTCCAGAGCC(SEQ ID NO:224)/5’ATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCTTAACTAGATCCGG(SEQ ID NO:225)
对pcDNA4-Pten-NOLC1-Cherry作为模板进行PCR，以获得含有Sal1和Not1限制性位点的
Pten-NOLC1-Cherry的全长。然后PCR产物用Sal1和Not1限制酶切，并连接到类似限制酶切
的pENTR 1A双载体(Invitrogen)中以产生pENTR-attL1-Pten-NOLC1-attL2。然后使用
LR ClonaseTM II酶混合物(Invitrogen)，将pENTR-attL1-Pten-NOLC1-attL2与
目的载体pPT3-EF1α重组，以产生Pten-NOLC1-Cherry表达载体。

[0309] 基因组和转录组测序文库制备和测序：将前列腺样品新鲜冷冻并储存在-80℃。它们获自匹兹堡大学组织库。该方案得到了匹兹堡大学机构审查委员会的批准。对于转录组
测序，使用Trizol从来自没有泌尿疾病的个体的20份器官供体前列腺的样品，与癌症相邻
的3份良性前列腺组织和64份前列腺样品中提取总RNA，并用DNA酶1处理。然后使用RIBO-
ZeroTM 磁性试剂盒(Epicenter，威斯康星州麦迪逊)从样品中除去核糖体RNA。将RNA反转录成cDNA，并使用来自Illumina公司(加利福尼亚州圣迭戈)的TruSeqTM RNA样品制备试剂盒
v2进行扩增。按照制造商提供的手册进行文库制备过程，例如腺苷酸化，连接和扩增。然后使用Illumina测序引物用qPCR分析转录组文库的质量，并用Agilent2000生物分析仪量化。
Illumina HiSeq2500中200个循环配对末端测序的步骤遵循制造商的手册。

[0310] 检测Pten-NOLC1基因组重排的基因组断裂点：为了检测Pten和NOLC1之间基因组的断裂点，设计了多个引物。正向引物经设计与Pten的外显子11和内含子11的区域退火，且反向引物与NOLC1的内含子1和外显子2的区域退火(表16)。使用AccuPrimeTM Pfx DNA聚合
酶(Invitrogen)以不同引物组合进行多次巢式PCR，其中35个热循环为95℃15秒，65℃30秒和72℃10分钟。证明内含子引物对5'ATTCACCACACTCGTTTCTTTCTC(SEQ ID NO:226)/5'
CCTGCCTGCCAATCTATATTGATC(SEQ ID NO:227)产生PCR产物。纯化的PCR产物的直接测序证
实了Pten-NOLC1的基因组内含子断裂点序列。

[0311] 使用CRISP/Cas9基因组编辑敲除Pten-NOLC1。载体pSPCAS9N(BB)-2A-GFP得自Addgene公司(Addgene#PX461)。gRNA的靶序列用软件CRISPR gRNA设计工具-DNA2.0TM分
析，并选择作为侧接Pten和NOLC1的破坏性接合的CGGTTATACCGCTTTGGGATcaaa(Pten)(SEQ
ID NO:228)/caccGAGATGGGGTTTCACCATGT(NOLC1)(SEQ ID NO:229)。将对应于gRNA(Pten)
和gRNA(NOLC1)的合成寡核苷酸分别构建到修饰的pSPCAS9N(BB)-2A-GFP和pX330s-2载体
的Bbs1位点中。然后用Bsa1限制酶切两种载体，随后将用Bsa1切割的pX330s-2载体释放的
gRNA(NOLC1)插入gRNA(Pten)-pSPCAS9n(BB)-2A-GFP的Bsa1位点。T7连接酶用于克隆。对于插入基因在断裂点处的同源定向重组，构建供体载体：mCherry载体(Clontech公司，加利福尼亚州)用作骨架以将博莱霉素(Zeocin)的cDNA构建到mCherry编码区的上游。除去
mCherry载体的启动子序列；将与gRNA(Pten)序列上游的Pten内含子11的952bp序列区段相
同的同源臂序列加上55bp剪接受体序列插入到博莱霉素(zeocin)的核糖体RNA结合kozak
序列的上游。将来自gRNA(NOLC1)下游的NOLC1内含子1的845bp区段的第二同源臂序列插入
SV40多聚A下游的区域，用于mcherry编码序列。使用lipofectamine 3000(Invitrogen)将
供体载体与gRNA-Cas9D10A载体共转染到DU145和MCF7细胞系中。插入基因的整合通过
mCherry表达和博莱霉素(zeocin)抗性识别。Pten-NOLC1表达的丧失通过以下证实，通过采用针对Pten-NOLC1融合检测的引物的Taqman qRT-PCR，和针对dKO1和dKO2，mKO1和mKO2克
隆的免疫印迹，采用针对Pten的N末端或NOLC1的C末端的抗体。

[0312] 融合转录物检测：为了鉴定融合转录物事件，将Fusioncatcher(v0.97)算法(24)应用于RNA测序样品。嵌入融合捕获器，BOWTIE和BLAT用于将序列与参考基因组比对。基于文献中的现有生物学知识，在Fusioncatcher中过滤候选融合转录物的初步列表，包括：(1)如果已知基因是Ensembl中的另一个旁系同源物；(2)如果其中一个融合转录本是伴侣的假
基因；(3)如果融合转录物之一是微小/转移/小核RNA；(4)如果已知融合转录物是假阳性事件(例如，Conjoin基因数据库(25))；(5)如果其在健康样品中被发现(Illumina Body Map
2.0[http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-513/])；(6)如果头部和
尾部基因在同一条链上彼此重叠。用CIRCOS软件显示融合基因(26)。

[0313] TCGA SNP 6.0数据分析：从TCGA 3级数据(http://cancergenome.nih.gov/)下载CNV节段化数据。过滤出少于10个标志物的CNV。仅选择与Pten的外显子11和NOLC1区域的外显子2(89728532-89728532/hg19)重叠的区段。区段_平均(segment_mean)值小于-0.23的
CNV被定义为缺失。对于每个样品，Pten和NOLC1之间的跨越缺失定义为Pten和NOLC1之间的区域的整个长度上的缺失区段的长度等于或大于0.8(图23中所示)。分析了17种类型的癌
症在Pten和NOLC1之间的跨越性缺失(spanning deletion)：膀胱癌(BLCA)，乳腺癌(BRCA)，结肠癌(COAD)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)，食管癌(ESCA)，多形性胶质母细胞瘤(GBM)，头颈部鳞状细胞癌(HNSC)，肝癌(LIHC)，肺腺癌(LUAD)，肺鳞状细胞癌(LUSC)，卵巢癌(OV)，胰腺癌(PAAD)，前列腺癌(PRAD)，直肠腺癌(READ)，肉瘤(SARC)，甲状腺癌(THCA)和子宫内膜癌(UCEC)。

[0314] 荧光原位杂交：先前描述了类似的操作(12-14)。简言之，将组织切片(4微米)置于0.2N HCl中20分钟，然后使用预处理溶液(32-801200，Vysis)，置于80度下30分钟。然后将组织在蛋白酶溶液中于37℃消化36分钟，并风干。通过将含有Pten 5'末端(RP11-124B18，InVitrogen公司，纽约州大岛)/50％甲酰胺的7ml SpectrumOrange标记的细菌人工染色体
(BAC)序列与1ml含有用SpectrumGreen标记的3'末端NOLC1的BAC序列(CTD-3082D22)组合
来制备FISH探针。将探针在75℃下变性5分钟。将福尔马林固定的组织切片在70％甲酰胺中变性3分钟，并在室温下各在70％，85％和100％乙醇中脱水2分钟。将变性的探针置于载玻片上，盖上盖玻片，用橡胶粘合剂密封，置于加湿室中并在37℃下杂交过夜。移去盖玻片，将载玻片在2×SSC/0.3％Igepal(Sigma)中于72℃洗涤2分钟。将载玻片在黑暗中风干。载玻
片用DAPI复染。使用具有CytoVision的Olympus BX61进行分析，所述CytoVision配备有
Chroma Technology 83000过滤器组，具有用于SpectrumOrange，SpectrumGreen和DAPI(uv
360nm)的单带出口。仅对具有两个杂交信号的个体和良好描绘的细胞进行评分。从分析中
排除重叠细胞。对每个样品的50至100个细胞进行评分以获得平均信号。MCM8增益的截止值是平均至少2.5个拷贝/基因组。超过10％的细胞具有合并的Pten和NOLC1信号的样品被认
为是Pten-NOLC1融合阳性。

[0315] RNA提取,cDNA合成和Taqman RT-PCR：在FFPE样品的载玻片上进行显微切割以获得至少50％的癌细胞。用Trizol方法(InVitrogen，加利福尼亚州)从上皮细胞中提取总
RNA。根据制造商的建议进行提取操作。在第一链cDNA合成中使用随机六聚体，采用1μg总RNA和Superscript II TM(InVitrogen公司，加利福尼亚州)。然后在Eppendorf RealplexTM循环仪中使用引物GAGCGTGCAGATAATGACAAGG(SEQ ID NO:141)/
GCCAGAAGCTATAGATGTCTAAGAG(SEQ ID NO:142)和Taqman探针：5’-/56-FAM/CAG GAT GCC/
ZEN/AAT GCC TCT TCC C/3IABkFQ/-3’，进行Taqman PCR(94℃2分钟，然后94℃30秒，61℃
30秒，72℃30秒，50个循环)。Pten-NOLC1检测的Ct阈值：福尔马林固定的石蜡包埋组织38 5个循环，冷冻组织35个循环。没有模板阴性对照，且Pten-NOLC1cDNA模板分别用作每批中的阴性和阳性对照。

[0316] 免疫印迹分析和免疫沉淀。在H522，H358，PC3DU145和A-172细胞中检查Pten-NOLC1表达。首先，细胞用PBS洗涤并用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4,1％Nonidet P-
40,0.25％脱氧胆酸钠，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/mL抑肽酶，1μg/mL亮抑酶肽，1μg/mL胃蛋白酶抑制剂，和1mM Na3VO4)裂解。将裂解物超声处理并在12,000g，4℃下离心30分钟以除去不溶物质。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在
8.5％聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白质，并将条带印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用Tris-
吐温20缓冲液(0.1M Tris-HCl和0.1％吐温-20，pH7.4)中的5％脱脂奶粉在室温下封闭膜1
小时，然后与一抗Pten抗体(1:1000稀释，Santa Cruz)，抗NOLC1抗体(1:1000稀释；Santa Cruz，加利福尼亚州)，抗FLAG(Santa Cruz)，抗β-肌动蛋白抗体(1:500稀释；Santa Cruz)或针对C-MET，GAB1C-RAF，Akt，MAPK，p-MAPK，Stat3，pStat3(细胞信号转导)的抗体孵育2小时。然后将膜用Tris-吐温20缓冲液洗涤三次，并与对以下具有特异性的辣根过氧化物酶偶联的二抗：兔(抗β-肌动蛋白，1:1000稀释)，小鼠(抗-Pten，1:1000稀释)，或山羊(抗NOLC1，
1:1000稀释)在室温下孵育1小时。根据制造商的方案用ECL系统(Amersham Life Science)
检测蛋白质表达。还对来自前列腺癌样品PCa638T，PCa207T，PCa624T，PCa099T，PCa090T的蛋白质提取物，和来自无泌尿系统疾病DO12和DO17的个体的器官供体前列腺进行类似免疫
印迹。为进行免疫沉淀，将细胞裂解物与A/G磁珠(Millipore)一起孵育20分钟以除去非特
异性结合。将上清液与4-6μg一抗在4℃孵育过夜，并将A/G磁珠加入免疫复合物中并继续在
4℃摇动反应2小时。在磁力架上收集磁珠，并用含有蛋白酶抑制剂的1x PBS洗涤3次。SDS-PAGE上样缓冲液直接用于重悬并从珠洗脱蛋白质。

[0317] Pten和Pten-NOLC1的磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PI(3,4,5)P3)磷酸酶测定。为了量化纯化的GST-Pten，Pten-NOLC1-FLAG或GST-Pten-NOLC1的PI(3,4,5)P3上的磷酸酶活
性。用FLAG抗体免疫纯化Pten-NOLC1-FLAG，用GST柱纯化GST-Pten-NOLC1。对纯化的Pten-NOLC1的磷酸酶进行竞争性ELISA测定：将2-10pmol纯化的蛋白质与8μM PI(3,4,5)P3一起
孵育37℃1小时。然后通过加热至95℃3分钟终止反应。然后将反应转移至“检测板
(Detection Pate)”(Echelon公司，犹他州)，并在37℃下孵育60分钟。然后用PBS-吐温20洗涤“检测板”3次。向板中加入由Echelon公司提供的100μl二级检测物，并在室温下孵育30分钟，然后用PBS-吐温20洗涤3次。然后通过加入Echelon提供的100μl TMB溶液15分钟来显
色。通过在分光光度计中读取450nm处的吸光度并拟合已知量的PI(3,4)P2的标准曲线来定
量PI(3,4)P2的量。将反应中纯化的Pten蛋白(Echelon)用作阳性对照，而仅GST蛋白或仅
Flag或仅IgG被作为阴性对照。

[0318] 细胞生长和细胞周期分析。在集落形成分析中使用DU145或其Pten-NOLC1敲除对应物，并将每个克隆的1000个细胞以三个重复涂布在各孔上。使单个细胞生长形成集落7-
10天。然后将集落用冰冷的甲醇固定10分钟，并用0.025％结晶紫染色15分钟。计数集落数并成像。在细胞周期分析中，使用FITC BrdU流动试剂盒(BD Biosciences)。通过在培养物中除去FBS 48小时使DU145或DU145KO1或KO2同步，然后重新供给10％FBS和BrdU持续4小
时。然后收获细胞用FITC-BrdU抗体和碘化丙啶核染色(BD bioscience)进行分析。通过流
式细胞术(BD Facscalibur)分析不同细胞周期阶段的细胞。对于MCF7细胞对比mKO1或
mKO2，PC3-PNOL(T+)对比PC3-PNOL(T-)，NIH3T3-PNOL(T+)对比NIH3T3-PNOL(T-)也进行了
类似的分析。

[0319] 紫外线诱导的细胞死亡。用60-70％融合的Du145，dKO1，dKO2，MCF7或mKO1的培养细胞用50mJ至200mj的UV辐照。17小时后，收获这些细胞用于细胞凋亡分析。使用Alexa Fluor 488-膜联蛋白V凋亡测定试剂盒(BD Biosciences)，并在流式细胞术(BD
Facscalibur)中定量凋亡细胞。相同的细胞凋亡分析也应用于PC3-PNOL(T+)，PC3-PNOL
(T-)，NIH3T3-PNOL(T+)和NIH3T3-PNOL(T-)克隆。

[0320] Pten-NOLC1敲除细胞死亡分析。使用携带Pten-NOLC1断裂点的癌细胞系。细胞用D10A
含有Cas9 的具有针对Pten和mCherry敲除盒的gRNA的重组腺病毒处理，或用含有
Cas9D10A与针对Pten供体盒的gRNA的病毒处理，或仅含有Cas9D10A的病毒作为对照。当它们达到70-80％融合18-24小时时，将这些病毒施加于细胞培养物。然后更换培养基。将细胞培养3天以发生Pten-NOLC1破坏。然后收获细胞用于细胞死亡分析。使用PE-膜联蛋白V凋亡测定试剂盒(BD Biosciences)：将细胞重悬于100μl膜联蛋白结合缓冲液(Invitrogen)中，并与5μl PE-偶联的膜联蛋白V和5μl碘化丙啶室温避光孵育20分钟。通过加入400μl膜联蛋白结合缓冲液终止结合测定。使用BD Facscalibur(BD Sciences，加利福尼亚州圣何塞)进行FACS分析。获得并分选了数万个细胞。采用WinMDI 2.9软件(来自Joseph Trotter的免费软件)分析数据。

[0321] 细胞运动和侵袭测定。估计5x104个细胞接种在每个基质凝胶室(24孔)中，而对照孔没有基质胶膜。22小时后，擦去膜顶部的细胞，迁移通过室膜或对照的分隔物的细胞用H&E染色，计数细胞数。将通过膜侵入的细胞数对于通过对照中的分隔物迁移的细胞进行标准化。每个克隆三个重复，并在DU145和DU145KO1或DU145KO2；MCF7或MCF7KO1或KO2；PC3-PNOL(T+)和PC3-PNOL(T-)；NIH3T3-PNOL(T+)和NIH3T3-PNOL(T-)的克隆之间进行比较。

[0322] 睡美人/转座子介导Pten-NOLC1的流体动力学转染。将pPt3-EF1α-Pten-NOLC1-Cherry转染到PC3细胞中，通过mCherry荧光标签的表达证实Pten-NOLC1-Cherry蛋白的表
达。然后将pT3-EF1α-Pten-NOLC1-Cherry(20μg)和SB(1μg)合并在2ml盐水中。对合并的质粒进行流体动力学注射以在肝脏中转染Pten-NOLC1-mCherry(Chen等，2017a；Liu等，
1999)。在转染之前，将4至6周龄的loxP-Pten小鼠用于腹膜内注射1010个AAV8-Cre(Penn
Vector Core，宾夕法尼亚大学)。

[0323] 染色质免疫沉淀(ChIP)。将Pten-NOLC1敲除克隆，dKO1，dKO2，mKO1，mKO2及其亲本细胞Du145和MCF7用于ChIP分析。使用MagnaChIP A/G试剂盒(Millipore，美国)并遵循制造5
商的方案。简言之，将培养物中80％汇合的2-3×10 个细胞在室温下在冷4％甲醛中孵育10
分钟以交联蛋白质和DNA，然后在室温下用甘氨酸淬灭5分钟，用冰冷1xPBS清洗3次，并离心细胞团块。然后用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液在冰上裂解细胞15分钟，并在4℃下以
800g离心5分钟。用核裂解缓冲液进一步裂解团块。然后通过超声处理将核裂解物(蛋白质/DNA)剪切成尺寸为100-800bp的DNA片段。使用聚焦超声波发生器M220(COVARIS)，设定功率为7.5，200脉冲/周期和因子10％。用针对NOLC1的C末端或Pten的N末端的抗体免疫沉淀片
段化和交联的染色质。A/G磁珠用于收集包括DNA片段的免疫复合物。然后洗脱DNA并纯化用于文库制备(Illumina，加利福尼亚州)。对来自PC3-PNOL-Flag，RWPE1-PNOL-Flag及其对照PC3-Flag和RWPE1-Flag；和PC3的裂解物也进行了类似的测定，使用对FLAG标签具有特异性的抗体。

[0324] ChIP测序：遵循制造商(Illumina)推荐的操作：在生物分析仪(Agilent)中分析片段DNA的数量和大小；首先用末端修复试剂钝化DNA，然后进行3'末端腺苷酸化并用索引衔
接子(indexing adaptor)连接；用Ampure XP磁珠纯化修饰的DNA，用SYBR Gold凝胶在2％
琼脂糖中分离。切下250至300bp大小的DNA，用MinElute凝胶提取试剂盒纯化，并用17个PCR热循环用TruSeqTM试剂(Illumina)富集。每个文库在Agilent生物分析仪中再次定量，并将每个样品标准化至2nM以进行加载。Illumina Highseq 2500中的测序过程遵循制造商的标
准方案。使用具有70G测序容量的两个泳道对15个ChIP样品进行测序。鉴定富含ChIP的读数的峰。Chip-Seq数据通过Burrows-Wheeler Aligner(BWA)与人类基因组参考物hg19比对
(Li和Durbin，2009)。通过基于模型的ChIP-Seq分析(MACS)从每个单独的样品判定峰
(Zhang等，2008)。显著的峰被定义为与局部背景比对相比读数富集的DNA区域。由于多重假设检验，通过Benjamini-Hochberg操作调整p值，并且将FDR设定为0.05以确定显著性
(Benjamini和Hochberg 1995)。在成对样品之间进一步比较显著峰以检测差异峰(补充表
1)。通过SAMtools提取与给定峰区域比对的读数以进行进一步分析(Li等，2009)。

[0325] 所有用于绘图和统计分析的编程都在R包中实现。产生了特定基因的转录起始位点(TSS)上游周围的读数的全局曼哈顿图和局部图(补充图4)。使用R包“qqman”(biorXiv DOI:10.1101/005165)生成全局曼哈顿图。通过在来自野生型样品的敲除样品中减去重叠
峰(在匹配时将峰延伸+/-2kb的范围)，来获得差减结果(subtraction result)。来自差减
结果的峰(特别是“DU145-(DKOR1+DKOR2)”+“MCF7-(MKO1+MKO2)”)注释基因并通过
Ingenuity通路分析( QIAGEN，红杉市，www.qiagen.com/ingenuity)进行分析并报告
最为富集的途径。当达到并注释野生型Du145中差异富集的读数时，进一步分析几个鉴定的基因MET，EGFR，AXL，VGEFA，RAF1和GAB1的启动子区域中的读数。将在8个野生型样品和7个敲减或其它阴性对照中鉴定的每个基因(例如MET)的所有读数沿启动子候选区域，tss位点
的-4kb至+500bp作图。来自不同野生型样品的读数频繁被映射到紧密的基因组位置。映射
到100bp距离内的近距离位置的两个或更多个读数被组合为图中相同位置的2到3个或更多
个读数。野生型组样品的密集分布区域中的读取序列用于设计表17中列出的Tagman PCR引
物和探针。使用ChIP样品通过Taqman PCR验证富集的DNA元件，并在3％琼脂糖凝胶上解析。

[0326] 7.3结果

[0327] Pten-NOLC1融合是染色体10重排的结果。

[0328] 为了研究Pten-NOLC1融合转录形成的机制，使用对应于Pten基因组5'末端(光谱红色)和NOLC1的3'末端(光谱绿色)的两个探针，对检测到Pten-NOLC1融合转录物的前列腺
癌样品进行荧光原位杂交(FISH)分析。结果显示Pten和NOLC1的信号重叠以在癌细胞中形
成单个杂交信号(黄色)。还清楚地鉴定了独立的NOLC1信号(绿色)，但在该前列腺癌病例中不存在野生型Pten信号(红色)。这与在正常器官供体前列腺组织中可见的Pten(红色)和
NOLC1(绿色)的不同的两对独立信号形成对比。在癌症基因组中Pten-NOLC1基因组重组和
半合子Pten缺失的共存表明该癌症中Pten等位基因的完全功能丧失。

[0329] 为了鉴定Pten-NOLC1的染色体断裂点的位置，使用对应于侧接断裂点接合的外显子附近的基因组序列的引物，对该前列腺癌样品的基因组DNA进行一系列巢式长延伸PCR。

[0330] 纯化PCR产物并进行桑格测序。这些PCR产物的测序结果显示(图17C)表明Pten-NOLC1的基因组断裂点位于Pten的内含子11和NOLC1的内含子1之间的序列，Pten和NOLC1内
含子两者共有8bp(TAGCTGGG)重叠序列。在随后的Pten-NOLC1断裂点分析中，我们发现癌细胞系LNCaP，DU145，VCaP，HEP3B，MCF7和PC3的基因组包含相同的断裂点序列，即使它们来自具有不同生物学特征的不同类型的恶性肿瘤也是如此。这些结果表明了人类癌症基因组中
Pten-NOLC1融合形成的共同重组机制。

[0331] Pten-NOLC1在人类恶性肿瘤中高度复发。

[0332] 为了研究Pten-NOLC1融合是否在人类癌症中频繁出现，使用图20A中所示的引物和探针对6种不同人类癌症的26种癌细胞系进行Taqman RT-PCR分析，并且发现Pten-NOLC1
融合转录物存在于测试的大多数肿瘤细胞系，包括4种测试的前列腺癌细胞系(PC3，DU145，LNCaP和VCaP)，肺癌细胞系(H358，H1299，H522和H23)，乳腺癌细胞系(MDAMB231，VACC3133，MDA-MB330，MCF7)，肝癌细胞系(HUH7，HEP3B，SNU449，SNU475，SNU375，SNU182和HEPG2)和胶质母细胞瘤细胞系(A-172，LN229，T98G，U138和U118)和结肠癌细胞系(HCT8和HCT15)。在20个正常器官供体前列腺样品和来自前列腺癌患者的10个血液样品中未检测到Pten-NOLC1
融合。为了研究Pten-NOLC1是否存在于原发性人类癌症样品中，对来自8种不同类型的人类恶性肿瘤的1030个癌症样品进行Taqman RT-PCR分析。结果显示，Pten-NOLC1广泛存在于这些癌症中：70.1％(481个中的337个)PCa，83％(60个中的50个)乳腺癌，75％(60个中的45
个)结肠癌，83％(153个中的127个)GBM，82.9％(70个中的58个)肝癌，75.2％(145个中的
109个)NSCLC，70.5％(61个中的43个)卵巢癌和85％(34个中的29个)食管腺癌(图20B、18和
19以及表7-12)。

[0333] 为了研究这种广泛存在的Pten-NOLC1转录物是否被翻译成癌细胞或组织中的蛋白质，采用Pten特异性抗体进行了肿瘤样品的western印迹。Pten-NOLC1融合的投射分子量约为120Kd，其尺寸明显大于Pten(48.3Kd)。在来自细胞系H522，H358，PC3，DU145和A-172的蛋白质提取物的印迹中，通过针对Pten的抗体在癌症系样品中容易地检测到110kDa条带
(图20C，第8-12行)。在Pten-NOLC1mRNA阳性的原发癌组织样品中也检测到Pten-NOLC1蛋
白，而在没有Pten-NOLC1融合的健康器官供体前列腺样品中检测到阴性(图20C，第1-7行)。
总之，Pten-NOLC1是体细胞基因组重排产物，并且在不同来源的人类癌症中作为融合转录
物和嵌合蛋白被反复检测到。

[0334] Pten-NOLC1仅位于细胞核中，不含磷酸酶功能。

[0335] 细胞质PIP3是Pten磷酸酶的特异性靶标，而NOLC1仅是核仁蛋白。因此，鉴定Pten-NOLC1融合蛋白的亚细胞定位是有意义的，因为它对融合蛋白的功能具有重要意义。产生Pten-NOLC1的cDNA并构建到哺乳动物表达载体中以产生pCNDA4-Pten-NOLC1-Flag并转染
到NIH3T3细胞系中以利用免疫染色分析Pten-NOLC1的位置。如图22所示，使用对FLAG标签
具有特异性的抗体分析用pCDNA4-Pten-NOLC1-FLAG转染的NIH3T3细胞，Pten-NOLC1的信号
仅位于细胞核中，类似于用NOLC1抗体染色的细胞核，而Pten抗体在NIH3T3细胞中显示Pten的弥散分布，覆盖细胞质和细胞核。在用pCNDA4-Pten-NOLC1-FLAG转染的PC3细胞中也观察到类似的结果(数据未显示)。此外，产生具有荧光标签的pCNDA4表达型蛋白以追踪嵌合的
Pten-NOLC1-EGFP，截短的Ptendel343-403-EGFP和截短的NOLC1del1-40-mCherry，在PC3细胞中表达。当载体分别转染到PC3细胞中时，Pten-NOLC1-EGFP和NOLC1-mCherry蛋白均仅位于细胞核中，而Pten-EGFP在有丝分裂阶段主要位于细胞质中，很少(但只有一个细胞)存在于细胞核中。此外，当用Pten抗体对Du145裂解物的核或细胞质组分进行印迹时，仅在细胞质组分中发现Pten条带(48kDa)，而在核组分中检测到Pten-NOLC蛋白(图22B)，如在Western印迹
分析期间通过对于采用分别针对Pten和FLAG的抗体检测到的相同蛋白质条带所证实。

[0336] 由于Pten的磷酸酶结构域在Pten-NOLC1融合蛋白中是完整的，而Pten的脂质结合C2结构域被截短，因此不清楚Pten-NOLC1是否具有磷脂磷酸酶活性。进行ELISA测定
(Echelon Pten Activity Elisa试剂盒)以测试纯化的重组GST-Pten或GST-Pten-NOLC1将
PI(3,4,5)P3转化PI(4,5)P2的能力。结果显示GST-Pten产生28pmol的PIP2(每ng GST-
Pten)。相反，GST-Pten-NOLC1未能产生可测得的PIP2(图22C)。细胞产生的Pten或Pten-
NOLC1发现相似的结果：在免疫沉淀中采用对Pten或NOLC1或FLAG具有特异性的抗体以纯化
Pten-NOLC1表达型PC3克隆中的Pten-NOLC1或Pten相关蛋白，但这些免疫纯化的蛋白质均
没有显示出任何磷酸酶活性。PC3细胞中内源性Pten无法显示PIP3磷酸酶活性可能反映了
癌细胞系中的突变酶(14)。总之，Pten-NOLC1仅存在于细胞核中，但不具有野生型Pten脂质磷酸酶功能。

[0337] Pten-NOLC1促进肿瘤生长并增加肿瘤存活率。

[0338] 接着，测试Pten-NOLC1的表达是否对肿瘤生长有影响。已经测试了不同器官来源的大多数癌细胞系含有Pten-NOLC1的弱至中度表达(图20A)。通过siRNA对Pten-NOLC1融合
的特异性敲减可用于研究Pten-NOLC1对细胞生长的影响。然而，由于Pten-NOLC1和Pten之
间或Pten-NOLC1和NOLC1之间的共有序列，这种方法可能是不可行的。

[0339] 首先，使用CRISPR-Cas9D10A方法制备DU145细胞和MCF7细胞中的Pten-NOLC1基因组敲除。如图23A所示，Pten-NOLC1的基因组断裂点由侧接该断裂点的两个gRNA靶向。然后将gRNA导向的Cas9D10A切口酶引至靶位点(gRNA-Cas9D10A载体)处形成切口，并通过同源重组将无启动子但含有核糖体结合位点的博来霉素-mCherry cDNA(供体载体)插入断裂点。当
这两种载体都转染到DU145(前列腺癌细胞)，MCF7(乳腺癌细胞)和其它癌细胞系中时，通过博来霉素抗性和mCherry荧光的显示表明Pten-NOLC1融合的成功中断。通过博来霉素抗性
选择获得Pten-NOLC1敲除的克隆。如图23B所示，获得DU145和MCF7的克隆以显示Pten-
NOLC1表达的敲除。

[0340] 随后，分析这些克隆的细胞周期特征。如图23C所示，与其亲本DU145相比，Pten-NOLC1敲除克隆DU145KO1和DU145KO2中S期细胞群分别从23.3％降至13％(p<0.05)和8％(p
<0.05)，并且在MCF7KO1细胞中从23％至15％(p<0.05)，而这些Pten-NOLC1敲除细胞的G0/
G1期呈中度增加。相反，在NIH3T3和PC3细胞中强制表达Pten-NOLC1增加了这些细胞的S期
进入(NIH3T3为7％至26％，p<0.05；PC3为9％至32％，p<0.05)。敲除Pten-NOLC1使Du145细胞的集落形成减少8-13倍(p<0.05)，MCF7细胞减少2.4倍(p<0.05)(图23D)。如果Pten-
NOLC1在NIH3T3(2.83倍增加，p<0.05)和PC3(2.8倍增加，p<0.05)细胞中强迫表达，则发现结果相反。另外，我们对这些DU145和MCF7KO细胞进行了紫外诱导的细胞死亡分析，如Alexa Fluor 488膜联蛋白V结合试验的FACS分析实例所示，用175mj紫外光处理的亲本DU145细胞
中36％死亡，对比其敲除对应物中的56％(DU145-KO1；p<0.05)，表明Pten-NOLC1的存在增加了癌细胞对紫外光辐照的抗性。实际上，去除Pten-NOLC1导致细胞更加敏感，并且DU145细胞的ED50从174mj降低至135mj，MCF7的ED50从175mj降低至127mj(图23E)。为了研究
Pten-NOLC1对癌症侵袭性的影响，进行了基质胶横穿分析。如图23F所示，去除DU145肿瘤细胞中的Pten-NOLC1使侵袭指数降低3.8-4倍。为了测试这些细胞在体内的侵袭性，将5×106
个这些细胞皮下移植到SCID小鼠的左胁区域。DU145肿瘤迅速生长并在移植后第二周开始
在侧腹区域显示可见的隆起，并且在观察结束时，第二周的隆起变成其原始大小的近35倍，而DU145的两个Pten-NOLC1KO克隆的移植物仅在异种移植后第4周变得可见(图23G)。大多
数具有DU145肿瘤的小鼠具有转移性病变和腹水，而仅一只来自敲除组的动物显示出该迹
象(图23H)。用缺乏Pten-NOLC1的DU145细胞异种移植的所有动物在异种移植的6周时间内
存活，而在同一时期内42％(3/7)异种移植DU145细胞肿瘤的SCID小鼠死亡。MCF7细胞无法
在基质胶中迁移，并且其异种移植物在SCID小鼠中不生长。总之，这些结果表明Pten-NOLC1融合对肿瘤生长和侵袭有显著贡献。

[0341] c-met，GAB1和EGFR的过表达依赖于Pten-NOLC1。

[0342] NOLC1是RNA聚合酶I12的辅助因子，并且已指示为共转录因子(15,16)。为了测试NOLC1和Pten之间的融合是否可以改变其转录谱，对来自使用NOLC1抗体的染色质免疫沉淀
的DU145和MCF7的DNA片段及其敲除对应物进行测序(ChIPseq)。如图28A所示，在DU145细胞中检测到6179个DNA片段峰。在2个Pten-NOLC1敲除克隆中峰值事件减少至2868。在MCF7细
胞中也发现了类似的结果：MCF7中总共有4347个峰，MKO1和MKO2中有1196个峰。NOLC1中
Pten结构域的存在产生了多2.2至3.6倍的基因组结合区域，显著扩大了NOLC1DNA结合活
性。为了验证这些DNA结合活性是否是Pten-NOLC1融合的直接结果，Pten-NOLC1-FLAG在PC3和RWPE1细胞中强迫表达，在FLAG抗体-ChIPseq中鉴定出大量DNA峰。许多峰与DU145和MCF7细胞中发现的峰重叠。这些Pten-NOLC1相关DNA片段的途径分析显示来自‘HGF信号转导’和‘癌症机制’途径的基因是最受影响的信号之一(表15)。富集包括来自MET，EGFR，RAF1，AXL，GAB1和VEGFA的启动子/增强子区域的DNA片段(图29和图28B)。

[0343] 为了研究从DU145细胞中去除Pten-NOLC1的影响，对DU145细胞及其敲除对应物进行基因表达微阵列测定。结果显示，与亲本DU145细胞相比，Du145KO1和Du145KO2克隆中有
500多个基因和转录物下调。在这些基因中，c-MET下调2.8-6倍，EGFR 1.4-1.41倍，GAB1
1.8-1.9倍，AXL 1.8-2.3倍，VEGFA1.5-1.6倍(图24A)。还使用定量RT-PCR测定方法鉴定了这些基因表达的类似下调(图24B)。有趣的是，在敲除Pten-NOLC1的MCF7细胞中类似地鉴定了这些发现(图24B)。确定了DU145KO1，DU145KO2和MCF7KO1中MET，EGFR，RAF1和GAB1蛋白表达的显著下调(图24C和图28C)。RAF1和STAT3均显示非常少的磷酸化。这些结果表明这些信号转导途径的激活在很大程度上取决于Pten-NOLC1的存在。当与ChIPseq/微阵列和免疫印
迹分析组合时，我们发现ECM，EGF和HGF信号转导途径中的许多分子的表达依赖于Pten-
NOLC1(图28D)。实际上，与其中影响最小的Pten-NOLC1阴性NIH3T3细胞相比，通过敲入博来霉素-cherry盒，破坏9种不同癌细胞系(包括PC3，DU145，SNU479，SNU449，HEP3B，T98G，MCF7，MB231和H1299细胞)中Pten-NOLC1的表达，产生大量细胞死亡(图30和表18)。这些结果表明，许多癌细胞可能会依赖Pten-NOLC1存活。

[0344] 表18

[0345] Pten-NOLCl的破坏诱导的细胞死亡

[0346]

[0347] Pten-NOLC1融合诱导小鼠肝癌。

[0348] Pten向Pten-NOLC1的转化代表野生型Pten的丧失和一种事件中的致癌基因产生。假设是该单一事件可能足以在哺乳动物中产生癌症。为了验证这一假设，通过腹膜内注射
AAV8-cre，从C57BlloxPten+/+小鼠的肝脏中体细胞敲除Pten。然后通过流体动力学尾静脉注射pT3-Pten-NOLC1-mCherry和pSB，使得用Pten-NOLC1-mCherry基因转染约1-5％的肝细胞
(图25A)。在18周内，七只小鼠中的六只发展成肝细胞癌，在肝脏中显示出独特的肿瘤结节(图25B)。一只小鼠在腹膜腔中发生癌症转移。两只动物腹水堆积。相比之下，具有体细胞Pten敲除和pT3/pSB注射的对照小鼠在同一时期均没有出现肿瘤征兆。这些肿瘤细胞具有
大的核仁，并且在细胞质中含有显著的脂肪积累，可能归因于Pten基因敲除。肿瘤细胞也显示出高频率的Ki-67染色，显示频率比非癌细胞高4.6倍(图25D)。免疫印迹分析显示所有癌症样品中均有Pten-NOLC1-mCherry蛋白表达，其通过对Pten或NOLC1具有特异性的抗体检
测，但是这种蛋白在pT3/pSB转染和AAV8-cre处理的小鼠肝组织中不存在(图25E)。在所有
肿瘤组织中检测到c-MET和GAB1的显著上调，包括转移性癌症样品。因此，这些结果表明
Pten-NOLC1融合产生的单个事件足以驱动自发性肝癌的发展，并且Pten-NOLC1的致癌活性
由c-MET信号转导途径的过度激活显著贡献。

[0349] 7.4讨论

[0350] 该实施例表明Pten-NOLC1融合在人类癌症中广泛存在，这表明Pten-NOLC1融合在癌症发展中的基础作用。Pten-NOLC1在癌症转移中的阳性率甚至更高，在某些类型的癌症
中达到90％(图21)。尽管Pten-NOLC1融合的频率很高，但据我们所知，这是第一份描述人类癌症融合的报告。筛选覆盖来自TCGA的17种不同癌症类型的2586个癌症样品的转录组测序
数据集，我们未能检测到Pten-NOLC1融合转录物的存在。由于该差异，我们通过比较Pten或NOLC1基因的头部或尾部外显子的标准化读数比对来调查两个数据集之间可能的差异。分
析显示，与我们的数据相比，显著较小比例的映射读数与来自TCGA前列腺癌数据集的Pten
或NOLC1基因的第一外显子比对上(图26)。由于Pten-NOLC1的检测需要大量NOLC1的外显子
1映射读数，3'末端偏差和相对低的测序覆盖率可能阻碍Pten-NOLC1融合转录物的检测。

[0351] Pten-NOLC1融合的产生是跨越Pten的外显子11和NOLC1的外显子1之间的染色体10序列的大量缺失(14.2MB)的结果。通过拷贝数分析可以容易地检测到这种缺失。实际上，在另通过Affymetrix SNP6.0阵列分析的12个Pten-NOLC1融合阳性前列腺癌样品中，均显
示Pten的外显子11和NOLC1的外显子1之间相似的14.2MB跨越性缺失(图27)。相反，发现
Pten-NOLC1融合阴性的10个前列腺癌样品对于这种跨越性缺失是阴性的。因此，跨越Pten
的外显子11和NOLC1的外显子1之间的缺失可以作为Pten-NOLC1融合存在的替代指标。我们
随后将此分析应用于来自TCGA数据库的SNP6.0数据集。发现大量癌症样品含有这样的跨越
性缺失，从甲状腺癌数据集的2％到多形性胶质母细胞瘤数据集的79％(图27A-C)。在癌症
基因组中广泛存在Pten-NOLC1跨越缺失表明在这些癌症样品中存在Pten-NOLC1融合基因。

[0352] Pten缺失和突变发生在许多人类癌症中。这些突变导致脂质磷酸酶活性的丧失并产生基因组稳定性。本文中，我们确定了Pten衍生的融合分子通过MET信号转导系统在功能上促进癌细胞生长。已知升高的MET促进膜上的MET-FAS相互作用以增加存活率(17)。Pten-NOLC1可通过提高c-MET的表达水平来增加癌细胞的存活，从而消除FAS细胞死亡信号转导
的影响。这可以解释Pten-NOLC1诱导的细胞死亡对紫外光辐照的抗性的作用。有趣的是，许多具有半合子Pten缺失的癌症样品对Pten-NOLC1也是阳性的(图27C)。结果，这些癌症缺乏功能性Pten蛋白，因为Pten-NOLC1对磷脂磷酸酶活性是阴性的，并且被易位至细胞核。由于缺乏PIP3(1,4,5)的失活，这些癌症也可能具有过度激活的PI3K/Akt信号转导。分析表明，Pten-NOLC1的单一事件足以在短时间内在动物中产生自发性肝癌。

[0353] Pten-NOLC1融合可能具有重要的临床意义。使用靶向Pten信号转导途径的药物的临床试验已经开始(18,19)。最近，已经开发出通过CRISPR-cas9系统靶向融合基因的染色
体断裂点的基因组治疗策略(20)。使用这种方法，已经实现了异种移植了对融合基因断裂
点呈阳性的癌症的动物的部分缓解。与其它融合基因不同，来自具有不同器官来源的癌细
胞系或原发癌样品的Pten-NOLC1的断裂点似乎相同，这可能归因于染色体重组过程中利用
相同的锚定序列。对于包含Pten-NOLC1的所有癌症，这可允许很容易地设计针对该融合基
因的染色体断裂点的靶向策略。因此，Pten-NOLC1融合基因的发现可为未来的癌症治疗奠
定重要基础。

[0354] 表6

[0355] 融合列表过滤器

[0356]

[0357]

[0358]

[0359]

[0360]

[0361]

[0362]

[0363] 表7

[0364] 前列腺

[0365]

[0366]

[0367]

[0368]

[0369]

[0370]

[0371]

[0372]

[0373]

[0374]

[0375]

[0376]

[0377]

[0378]

[0379]

[0380]

[0381]

[0382]

[0383]

[0384]

[0385] 堪萨斯大学样品

[0386] 肿瘤组织

[0387]

[0388] 1＝高分化

[0389] 2＝中分化

[0390] 3＝中到低分化

[0391] 4＝低分化

[0392] 5＝未分化

[0393] 依阿华大学

[0394]

[0395]

[0396]

[0397]

[0398]

[0399]

[0400]

[0401]

[0402]

[0403]

[0404]

[0405]

[0406]

[0407]

[0408]

[0409]

[0410]

[0411]

[0412]

[0413]

[0414]

[0415]

[0416]

[0417]

[0418]

[0419]

[0420]

[0421]

[0422]

[0423]

[0424]

[0425]

[0426]

[0427]

[0428]

[0429]

[0430] 表13

[0431] 食道

[0432]

[0433] 表14

[0434] (胶质母细胞瘤)

[0435]

[0436] 表14(续)

[0437]

[0438] 表14(续)

[0439]

[0440] 表15

[0441]

[0442] 表15(续)

[0443]

[0444] 表15(续)

[0445]

[0446] 表15(续)

[0447]

[0448] 表15(续)

[0449]

[0450] 表15(续)

[0451]

[0452] 表15(续)

[0453]

[0454] 表15(续)

[0455]

[0456] 表15(续)

[0457]

[0458] 表16.用于巢式PCR以鉴定Pten-NOLC1断裂点的引物序列(SEQ ID NO:230-250，按顺序)

[0459]

[0460] 表17

[0461] Taqman定量PCR的引物和探针序列(SEQ ID NO:251-271，按从左到右顺序)

[0462]

[0463] 7.5参考文献

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[0490] 本文中引用了多篇参考文献，通过引用其全文方式将其纳入本文。

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