双峰驼PPARγ蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法
阅读：4发布：2021-11-29
专利汇可以提供双峰驼PPARγ蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼PPARγ蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法；该基因具有SEQIDNO.1中从核苷酸第33-2276位的核苷酸序列。本发明双峰驼PPARγ蛋白是一种具有多种 生物 学功能的 蛋白质 ，它不仅在糖代谢和 脂肪酸 代谢中有着关键的调控作用,因此,通过对PPARγ从基因、蛋白质、酶活性和 抑制剂 等多方面的研究,必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、糖尿病等 疾病 的 预防 和 治疗 带来新的希望，因此本发明具有很大的应用价值。，下面是双峰驼PPARγ蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法专利的具体信息内容。
1.一种双峰驼PPARγ蛋白基因，其特征在于该基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第
33-2276位的核苷酸序列；其同牛、人、鼠、猪PPARγ基因编码蛋白序列同源性为95.00%，编码氨基酸序列同源性为86.00%。
2.一种根据权利要求1所述的双峰驼PPARγ蛋白基因的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
4.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
6.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
7.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼PPARγ蛋白中得到双峰驼PPARγ蛋白基因，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 （正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：
SEQ ID NO.3 （正向）：5’- ATGGCGTGGGACATGTGC-3’，
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
8.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼PPARγ蛋白中得到双峰驼PPARγ蛋白基因，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 （正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：
SEQ ID NO.3 （正向）：5’- ATGGCGTGGGACATGTGC-3’，
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
9.根据权利要求5或6所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼PPARγ蛋白中得到双峰驼PPARγ蛋白基因，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 （正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：
SEQ ID NO.3 （正向）：5’- ATGGCGTGGGACATGTGC-3’，
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
10.一种根据权利要求1所述的双峰驼PPARγ蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行：
第一步，组织分离(Isolation)；第二步，总RNA的分离(Total RNA isolation)，总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 （正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：
SEQ ID NO.3 （正向）：5’- ATGGCGTGGGACATGTGC-3’，
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
双峰驼PPARγ蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼PPARγ蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。
背景技术
[0002] 过氧化物 酶体增殖 物激活受 体(peroxisome proliferatorac-tivated receptor, PPAR)因为能够使小鼠受到异种刺激后引起肝脏过氧化物酶体降低而被命名，是一种核受体，同时本身也是配体激活转录因子，属于激素核受体家族。能够被一些降脂药物和脂肪酸类物质激活，与配体结合后被激活，然后与视黄醇类受体形成二聚体，再与所调节基因上游的过氧化物酶体增物反应元件(peroxiome proliferator respon-civa alamant, PPRE)结合而发挥转录调节作用，激活某些与脂肪代谢相关的蛋白或酶基因，PPARs 调控多种在脂类代谢不同途径的基因，包括脂肪酸转运、细胞吸收、细胞内结合以及分解（β 氧化和 ω 氧化）和储存；参与脂肪细胞的生成和转化；不仅能促进前脂肪细胞的分化，而且也能促进非脂肪细胞系细胞分化成脂肪细胞，促进脂肪沉积。PPAR 基因在不同物种中存在 α，β 和 γ 3 种亚型，它们由不同的基因编码，结构、功能及在不同组织的表达量都有较大差异，其中对脂肪代谢有影响的主要是 PPARα 和 PPARγ。
[0003] PPARγ 协同 C/EBP（CCAAT）转录因子影响脂肪酸在脂肪组织中的贮存，能诱导脂肪前体细胞成熟为脂肪细胞，是脂肪细胞分化的一部分。并且，大多数 PPARγ 目的基因直接参与脂肪合成途径。PPARγ 可以激活脂肪酸转运蛋白和脂肪酸转运酶，完成脂肪酸向肝脏的转运；PPARγ 能上调长链脂肪酸基因的表达，形成酯酰辅酶 A。PPARγ 诱导小脂肪细胞的形成，调控脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)、脂肪型脂肪酸结合蛋白(adlipocyte fatty acid-binding proteins, A-FABP)、乙酰辅酶 A 合成酶(acetyl coenzyme A synzyme, ACAS)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase, FAS)与脂肪酸转运蛋白(fatty acid transport protein, FATP)等的表达，抑制瘦素(leptin)的表达，能防止高脂饮食诱导的肥胖。PPARγ 在脂肪、肌肉、肝脏等多种与胰岛素作用有关的组织中表达，激活后可调控与葡萄糖的产生、转运、利用及脂肪代谢的调节相关的基因的表达。在人 PPARγ 基因多态性研究方面，发现了 Pro12Ala 多态位点，血清载脂蛋白 B 在不同基因型个体间差异显著，该位点得到了广泛的研究，认为其与脂肪代谢异常、增强胰岛素敏感性及降低糖尿病的发生密切相关。
[0004] PPARγ在脂肪酸代谢中有着关键的调控作用,因此, 通过对PPARγ从基因、蛋白质、酶活性和抑制剂等多方面的研究, 必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望。
发明内容
[0006] 本发明提供了一种双峰驼PPARγ蛋白基因，该基因是一种影响脂肪酸在脂肪组织中的贮存和转运，能诱导脂肪前体细胞成熟为脂肪细胞，并且直接参与脂肪合成途径，与机体组织对糖的利用、胰岛素敏感性、脂质合成和能量平衡等密切相关的基因，其核苷酸序列与马的PPARγ蛋白核酸序列XM_001499929.2具有95%的相似性。
[0007] 本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种双峰驼PPARγ蛋白基因，该基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第33-2276位的核苷酸序列；其同牛、人、鼠、猪PPARγ基因编码蛋白序列同源性为95.00%，编码氨基酸序列同源性为86.00%。
[0008] 本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种双峰驼PPARγ蛋白基因的重组蛋白。
[0009] 下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：上述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
[0011] 上述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0012] 上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼PPARγ蛋白中得到双峰驼PPARγ蛋白基因，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 （正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：SEQ ID NO.3 （正向）：5’- ATGGCGTGGGACATGTGC-3’，
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
[0013] 本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种双峰驼PPARγ蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行：第一步，组织分离(Isolation)；第二步，总RNA的分离(Total RNA isolation)，总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 （正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：SEQ ID NO.3 （正向）：5’- ATGGCGTGGGACATGTGC-3’，
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
[0014] 本发明双峰驼PPARγ蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它不仅在糖代谢和脂肪酸代谢中有着关键的调控作用,因此, 通过对PPARγ从基因、蛋白质、酶活性和抑制剂等多方面的研究, 必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，因此本发明具有很大的应用价值。附图说明
[0015] 附图1为本发明双峰驼PPARγ蛋白基因RT-PCR产物电泳图。
[0016] 附图2为为双峰驼和牛、人、鼠、猪等14种动物用Clustal X 中对齐的PPARγ蛋白氨基酸序列同源性比较结果图。
[0017] 附图3为本发明双峰驼PPARγ蛋白氨基酸序列和牛、人、鼠、猪等14种动物PPARγ蛋白氨基酸序列构建的系统进化树图。
具体实施方式
[0018] 本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
[0019] 实施例1：一种双峰驼PPARγ蛋白基因，该基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第33-2276位的核苷酸序列；其同牛、人、鼠、猪PPARγ基因编码蛋白序列同源性为95.00%，编码氨基酸序列同源性为86.00%。
[0020] 实施例2：一种双峰驼PPARγ蛋白基因的重组蛋白。
[0021] 实施例3：重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
[0022] 实施例4：重组蛋白具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
[0023] 实施例5：重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0024] 实施例6：重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼PPARγ蛋白中得到双峰驼PPARγ蛋白基因，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 （正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：SEQ ID NO.3 （正向）：5’- ATGGCGTGGGACATGTGC-3’，
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
[0025] 实施例7：一种双峰驼PPARγ蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行：第一步，组织分离(Isolation)；第二步，总RNA的分离(Total RNA isolation)，总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 （正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：SEQ ID NO.3 （正向）：5’- ATGGCGTGGGACATGTGC-3’，
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。
[0026] 双峰驼PPARγ蛋白基因cDNA序列的克隆1.组织分离(Isolation)
从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于-70℃保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。
从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于-70℃保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。
[0027] 2.总RNA的分离(Total RNA isolation)(1) 提取RNA的准备工作
玻璃制品用0.1mol/L的NaOH浸泡过夜,用自来水反复冲洗,再用蒸馏水冲洗2
遍,180℃烘烤4小时。
玻璃制品用0.1mol/L的NaOH浸泡过夜,用自来水反复冲洗,再用蒸馏水冲洗2
遍,180℃烘烤4小时。
[0028] 匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20分钟至30分钟，再用0.1%的DEPC水冲洗.由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响,可用0.5%的SDS处理。
[0029] Tip头、EP管用0.1%的DEPC水浸泡过夜,高压灭菌使DEPC失活。
[0030] 双蒸水和溶液用DEPC处理,即每100ml水或溶液加0.1mlDEPC液,室温放置过夜,高压灭菌30分钟DEPC失活。
[0031] （2）组织总RNA提取取100mg在液氮中冻存的组织样放入有1ml Trizol（trizal reagent, invitrogen BRL, USA）的匀浆器管中匀浆。4℃、12000g离心10分钟；吸取上清液，15℃至30℃温育5分钟；加0.2ml氯仿,盖上盖子,用手剧烈震荡15秒，15℃至30℃温育2分钟至3分钟；
4℃、12000g离心15分钟，吸取上清液，加0.8ml异丙醇,混合均匀；15℃至30℃温育10分钟, 4℃、12000g离心10分钟,离心管底部白色沉淀即为RNA；倒掉上清,加1ml 75%乙醇洗涤RNA, 4℃ 7500g离心10分钟；自然干燥或真空干燥RNA.溶于水（RNase free）中分装，-70℃保存。
4℃、12000g离心15分钟，吸取上清液，加0.8ml异丙醇,混合均匀；15℃至30℃温育10分钟, 4℃、12000g离心10分钟,离心管底部白色沉淀即为RNA；倒掉上清,加1ml 75%乙醇洗涤RNA, 4℃ 7500g离心10分钟；自然干燥或真空干燥RNA.溶于水（RNase free）中分装，-70℃保存。
[0032] （3）组织总RNA的鉴定通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下：电泳槽用RNA清洗液（100mM NaOH,1mM EDTA）浸泡4小时至5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入1×TBE待用；琼脂糖凝胶用1×TBE配制；在10ul上样缓冲液（2×TBE，
13%菲可，0.1%溴酚兰，7M 尿素）中加入1ul以上组织总RNA，65℃变性10分钟后立即放入冰水中2分钟至3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。
13%菲可，0.1%溴酚兰，7M 尿素）中加入1ul以上组织总RNA，65℃变性10分钟后立即放入冰水中2分钟至3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。
[0033] 3.全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)（1）引物设计及合成
根 据 GenBanK 发 表 的 牛（Accession No: AB106107.1）、人（Accession No: AF159714.1）、鼠（Accession No: BC066868.1）等物种的PPARγ蛋白基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼PPARγ蛋白cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼PPARγ蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 （正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：
SEQ ID NO.3 （正向）：5’- ATGGCGTGGGACATGTGC-3’
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT
（2）RT-PCR扩增
按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录；反转录反应液组成：10ul 2×Bca 1st Buffer，4ul 25Mm MgSO4，1ul dNTP Mixtur，0.5ul Rnase Inhibitor (40U/ul)，1ul BcaBEST Polymerase(22U/ul)，1ul Oligo dT Primer，1ul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH2O，总体系为20 ul。反转录反应条件：65℃1分钟，30℃5分钟（15分钟至30分钟内匀速升温），65℃25分钟，98℃5分钟，5℃5分钟。PCR扩增条件：
97℃ 变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃ 1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸
10分钟，4℃保存。
根 据 GenBanK 发 表 的 牛（Accession No: AB106107.1）、人（Accession No: AF159714.1）、鼠（Accession No: BC066868.1）等物种的PPARγ蛋白基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼PPARγ蛋白cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼PPARγ蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3 （正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：
SEQ ID NO.3 （正向）：5’- ATGGCGTGGGACATGTGC-3’
SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT
（2）RT-PCR扩增
按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录；反转录反应液组成：10ul 2×Bca 1st Buffer，4ul 25Mm MgSO4，1ul dNTP Mixtur，0.5ul Rnase Inhibitor (40U/ul)，1ul BcaBEST Polymerase(22U/ul)，1ul Oligo dT Primer，1ul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH2O，总体系为20 ul。反转录反应条件：65℃1分钟，30℃5分钟（15分钟至30分钟内匀速升温），65℃25分钟，98℃5分钟，5℃5分钟。PCR扩增条件：
97℃ 变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃ 1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸
10分钟，4℃保存。
[0034] （3）克隆和测序PCR扩增片段的回收：片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下： 尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5mlEP管中，按每100mg琼脂糖加入
300ulS1液的比例加S1液, 50℃水浴10分钟；将溶化的琼脂糖液移入吸附柱, 10000g离心1分钟,倒掉管中液体；在吸附柱中加入500ul W1液, 10000g离心15秒, 倒掉管中液体；在吸附柱中加入500ul W1液,静置1分钟后, 10000g离心15秒, 倒掉管中液体，离心1分钟；将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中,在吸附膜中央加入30ulT1液, 静置1分钟后, 10000g离心1分钟， EP管中液体即为回收的DNA。
300ulS1液的比例加S1液, 50℃水浴10分钟；将溶化的琼脂糖液移入吸附柱, 10000g离心1分钟,倒掉管中液体；在吸附柱中加入500ul W1液, 10000g离心15秒, 倒掉管中液体；在吸附柱中加入500ul W1液,静置1分钟后, 10000g离心15秒, 倒掉管中液体，离心1分钟；将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中,在吸附膜中央加入30ulT1液, 静置1分钟后, 10000g离心1分钟， EP管中液体即为回收的DNA。
[0035] 回收片段同T载体的连接：连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒, 操作过程如下，在EP管中制备下列连接反应液:pMD 18-T Vector(50ng/ul) 0.5ul，DNA 20-40ng，Solution 1 5ul，加dH2O至10ul；将上述反应液在16℃反应30分钟(过夜也可以),产物用于转化感受态细胞。
[0036] 质粒的转化：从-70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶；100ul感受态细胞加入10ul连接产物，冰浴30分钟；42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟；加400ul液体LB培养基，37℃复活50分钟；取100ul铺于LB平板上,平板含0.1%(V/V)的氨苄青霉Amp (100mg/ml)；37℃恒温培养10-15小时。
[0037] 转化菌落的PCR鉴定与培养：用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落；将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的EP管中晃动，使单菌落充当模板；用获得该片段的PCR条件进行扩增；PCR产物同Marker一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1%(V/V)的青霉素钠(100mg/ml),37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收。
[0038] 质粒的回收：质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下：将转化培养的菌液加入1.5mlEP管中,4000转/分钟离心,倒掉液体获细菌沉淀，细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心；在细菌沉淀中加入250ulP1液,振荡悬浮，加入250ulP2液,温和摇匀,室温静置4分钟；加入350ulP3液, 温和摇匀，离心10分钟,将上清液小心移入吸附柱,离心15秒,倒掉液体；在吸附柱中加入500ulW1,离心15秒,倒掉液体；在吸附柱中加入500ulW1, 静置1分钟,离心15秒,倒掉液体，离心1分钟；将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中,在吸附膜中央加入25-30ulT1液, 静置1分钟后, 离心1分钟，EP管中液体即为回收的质粒。
[0039] 质粒的酶切鉴定：为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒,采用双酶切法鉴定，本研究具体操作如下：根据TaKaRa pMD18-T Vector图,选择内切酶Bam HⅠ和Hin d Ⅲ，保证目的片段中无这两种酶的切点；组成如下酶切反应体系：Bam HⅠ1ul，Hin d Ⅲ 1ul，10×K Buffer 2ul，DNA ≤1ul，加dH2O至 20ul，30℃反应3小时，琼脂糖凝胶电泳检测。
[0040] 重组质粒的测序： 取20ul重组质粒于EP管中,封口膜密封,交生物技术公司测序。
[0041] 双峰驼PPARγ蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建1、双峰驼PPARγ蛋白基因编码序列同源性比较
在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠、猪等14种动物的PPARγ蛋白基因编码蛋白序列，将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较见附图2。比较结果显示，其同牛、人、鼠、猪PPARγ基因编码蛋白序列同源性为95.00%，编码氨基酸序列同源性为86.00%。
在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠、猪等14种动物的PPARγ蛋白基因编码蛋白序列，将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较见附图2。比较结果显示，其同牛、人、鼠、猪PPARγ基因编码蛋白序列同源性为95.00%，编码氨基酸序列同源性为86.00%。
[0042] 2、PPARγ蛋白基因编码序列系统发生树构建在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠等14种物种的14条PPARγ蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO.2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树见附图3。结果显示，双峰驼PPARγ蛋白基因同猪的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼 PPARγ蛋白基因。
[0043] 本发明在提供了双峰驼PPARγ蛋白基因的cDNA序列和蛋白编码序列基础上；将牛、人、鼠、猪等不同物种PPARγ蛋白基因的CDS序列和氨基酸序列进行同源性比较；对包括双峰驼在内的14个物种的14个PPARγ蛋白基因的CDS序列构建了系统发生树。
[0044] 本发明中的双峰驼PPARγ蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板，参考牛、人、鼠等物种的PPARγ蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼PPARγ蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼PPARγ蛋白基因cDNA序列中的编码序列（CDS）按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO.2。
[0045] 本发明在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为2283bp，电泳结果见附图1， 其中33-35位为起始密码子ATG，2274-2276位为终止密码子TAA，33-2276位为编码蛋白质区域（CDS）。在SEQ ID NO.1，双峰驼PPARγ蛋白基因编码747个氨基酸。双峰驼和猪、人、鼠、牛等动物用Clustal X 中对齐的PPARγ蛋白基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图
2。对包括SEQ ID NO.1在内的14个物种的14条PPARγ蛋白基因的CDS序列构建了系统发生树,结果发现：双峰驼PPARγ蛋白同猪和牛的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼PPARγ蛋白基因。
2。对包括SEQ ID NO.1在内的14个物种的14条PPARγ蛋白基因的CDS序列构建了系统发生树,结果发现：双峰驼PPARγ蛋白同猪和牛的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼PPARγ蛋白基因。
[0046] 本发明参考其它物种PPARγ基因序列，克隆测序获得双峰驼PPARγ基因的cDNA序列，并对不同物种PPARγ基因的CDS序列进行同源性比较，旨在了解和验证PPARγ基因的结构特点，为今后研究PPARγ基因与双峰驼脂类代谢的关系提供基础资料。
[0047] 以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
[0048] 序 列 表<110> 新疆旺源驼奶实业有限公司
<120> 双峰驼PPARγ蛋白的蛋白编码序列
<160> 4
<210> 1
<211> 2128
<212> DNA
<213> 阿拉善盟双峰驼
<400> 1
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Oligo dT
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