用于原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估的检测PBLD基因表达的引物及其应用
阅读：1035发布：2020-07-16
专利汇可以提供用于原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估的检测PBLD基因表达的引物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用于原发性 肝细胞 癌 治疗 方案 选择和/或 预后 评估的检测PBLD基因表达的引物及其应用，包括上游引物5'-GGGTCTGCACACGCTGTTC-3'，和下游引物5'-TAATGTCAACCCTTCCGTCT-3'。本发明通过特异性引物及其制备的 试剂 盒 原发性肝细胞癌患者或活检组织做PBLD检测，依据PBLD基因表达量，可以准确评估预后，避免繁琐的统计学分析，而且还可以根据检测结果为临床医生和患者提供准确的疗效评估，用于判断患者适合何种治疗方案，知道医生选择有效的临床治疗方案，提高患者的治疗效果，实现个体化治疗。，下面是用于原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估的检测PBLD基因表达的引物及其应用专利的具体信息内容。
1.用于原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估的检测PBLD基因表达的引物，包括上游引物5'- GGGTCTGCACACGCTGTTC-3'，和下游引物5'- TAATGTCAACCCTTCCGTCT -3'。
2.如权利要求1所述引物在制备原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估试剂中的应用。
3.含有如权利要求1所述引物的原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估的诊断试剂盒。
4.根据权利要求3所述的诊断试剂盒，其特征在于，还包括由荧光定量PCR技术常用的试剂以及标准品和/或对照品。
5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR技术常用的试剂包括缓冲液、逆转录酶、DEPC水、dNTPs、MgCl2、DEPC、Taq酶和荧光探针。
用于原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估的检测
PBLD基因表达的引物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种引物，尤其涉及用于原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估的检测PBLD基因表达的引物，本发明还涉及该引物的应用。
背景技术
[0002] 人类PBLD基因全长2575bp，位于人类10号染色体上，广泛表达于脑、心脏、肺、肝、胰腺等组织中。目前，在肝癌基因表达谱的基因组学研究中发现PBLD的表达较癌旁正常肝组织降低或者缺失。但是，PBLD在肝癌组织中的这种异常表达在临床预后中的意义未见报道。原发性肝癌(Primary hepatocellular carcinoma, HCC)是目前人类最常见的恶性肿瘤之一， 具有恶性程度高，易转移复发等特点。肝癌是全球第六大高发肿瘤和第三大致死肿瘤，每年有约 75 万的新发病例和接近 70 万的死亡病例。在全世界的新发病例中，中国所占比例高达55%，居中国恶性肿瘤死亡率的第 2 位。
[0003] 由于HCC发病隐匿，只有10%~15%的患者在发现时可进行手术治疗，而且，即使经过手术切除，其复发率也较高。因此，肝癌预后不良，目前尚缺乏较为有效的治疗手段。
[0004] 目前，临床还没有高效、特异的分子标志物可对肝癌的预后进行判断。而早期判断肝癌患者预后可指导临床医生对患者进行个体化治疗，提高肝癌患者生存率。因此，寻找影响肝癌患者预后的指标对改善患者预后意义重大。
发明内容
[0005] 本发明的目的之一在于提供用于原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估的检测PBLD基因表达的引物。
[0006] 发明人通过实时荧光定量PCR技术检测了108例肝癌患者肝癌组织中PBLD mRNA水平的表达情况，并与其相应的癌旁正常肝组织进行了对比，同时，按照PBLD mRNA表达水平将肝癌患者分为PBLD高表达组及PBLD低表达组。将所得结果与肝癌患者临床特征、生存及复发时间进行结合，分析PBLD在肝癌组织中的表达谱特点及不同表达水平的PBLD对肝癌患者预后的影响。研究发现，PBLD在肝癌组织中的表达水平较癌旁正常肝组织明显降低，其表达水平与患者生存时间及复发显著相关：在PBLD高表达组，肝癌患者1年、3年生存率分别为80.5%和68.6%，而PBLD低表达组肝癌患者的1年、3年生存率仅有75.6%和26.3%，PBLD表达水平越高，其患者生存时间越长；同时，PBLD高表达组肝癌患者的1年、3年无瘤生存率也显著高于PBLD低表达组(33.3% vs 61.1%, 16.7% vs 33.3%)，PBLD的表达水平越高，其患者复发率越低。因此，PBLD mRNA的表达水平可作为判断肝癌患者预后的指标，指导临床肝癌患者的个体化治疗。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：用于原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估的检测PBLD基因表达的引物，包括上游引物5'- GGGTCTGCACACGCTGTTC-3'，和下游引物5'- TAATGTCAACCCTTCCGTCT -3'。
[0008] 本发明目的之二在于提供上述引物的用途，具体地，所述用途是指所述引物在制备原发性肝细胞癌治疗方案选择和/或预后评估试剂中的应用。
[0010] 具体地，所述诊断试剂盒中包括上游引物5'- GGGTCTGCACACGCTGTTC-3'，和下游引物5'- TAATGTCAACCCTTCCGTCT -3'。
[0011] 所述诊断试剂盒还可以包括由荧光定量PCR技术常用的试剂，如缓冲液、逆转录酶、DEPC水、dNTPs、MgCl2、DEPC、Taq酶和荧光探针等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0012] 本发明的优点：本发明通过特异性引物及其制备的试剂盒原发性肝细胞癌患者或活检组织做PBLD检测，依据PBLD基因表达量，可以准确评估预后，避免繁琐的统计学分析，而且还可以根据检测结果为临床医生和患者提供准确的疗效评估，用于判断患者适合何种治疗方案，指导医生选择有效的临床治疗方案，提高患者的治疗效果，实现个体化治疗。
附图说明
附图说明
[0013] 图1是PBLD mRNA在肝癌及癌旁组织中表达水平的对比。
[0014] 图2是PBLD基因表达水平与肝癌患者生存时间的关系图。
[0015] 图3是PBLD基因表达水平与肝癌患者术后复发情况的关系图。
[0016] 图4是基因PCR的电泳图，图中M为标记带，1为内参GAPDH的PCR产物条带，2为的PBLD产物条带。
[0017] 图5是cDNA的相对浓度与∆Ct关系图；其中，横坐标是相对浓度，纵坐标是∆Ct。
具体实施方式
[0018] 收集肝胆外科手术切除的肝癌和相应的癌旁肝组织（距肿瘤切缘大于2cm）108共对，且临床表现，影像学及术后病理均符合原发性肝细胞癌诊断。108例肝癌患者临床特征如表1，其中，24例患者失访，故纳入生存分析的患者数共84例。随访时间跨度为12至62个月，中位随访时间为44个月，TNM分期依据为美国癌症联合委员会（AJCC）第七版癌症分期手册。
[0019] 表1108例肝癌患者临床特征统计：依据实时荧光定量PCR的检测结果，将PBLD mRNA在肝癌组织中的表达水平高于总体中位数的患者归为PBLD高表达组，反之，则归为PBLD低表达组。
[0020] 总生存时间定义为患者从手术日算起至发生死亡的时间间隔，复发时间定义为患者从手术日算起至第一次发现发病新生灶的时间间隔。
[0021] 复发的诊断标准为影像学检查（B超、CT或磁共振）具有典型的肝癌影像特点，同时伴随AFP的升高。
[0022] 使用SPSS13.0软件进行统计分析，选取的模型为： 两组间比较：Student’s t 检验，PBLD表达与临床特征之间的相关分析：Pearson x2检验，生存分析：Kaplan–Meier曲线，单因素及多因素分析：Cox Regression。P值小于0.05认为差异有统计学意义。
[0023] 通过实时荧光定量PCR计算PBLD表达量，计算公式=2-∆∆Ct，式中，∆∆Ct=（CtPBLD-CtGAPDH）癌旁肝组织-（CtPBLD-CtGAPDH）肝癌组织。
[0024] 实验结果：PBLD在原发性肝癌组织中的表达量均数为0.399，相应的癌旁肝组织PBLD的表达量均数为1.612，其在肝癌组织中的表达水平显著降低，P值<0.001，见图1。
[0025] PBLD在肝癌组织中的表达水平与肿瘤分化程度及TNM分期显著相关，PBLD表达水平越高，肿瘤分化程度越高，分期越早，具体结果如下表：在获得随访资料的84例肝癌患者中，其PBLD mRNA的表达量的中位数为0.134，以
0.134为界，将82例肝癌患者分为PBLD高表达组（41例）和PBLD低表达组（41例）进行预后生存分析。在PBLD高表达组，肝癌患者的1年、3年生存率分别为80.5%和68.6%，而PBLD低表达组肝癌患者的1年、3年生存率仅有75.6%和26.3%，PBLD表达水平越高，其患者生存时间越长，见图2；同时，PBLD高表达组肝癌患者的1年、3年无瘤生存率也显著高于PBLD低表达组(33.3% vs 61.1%, 16.7% vs 33.3%)，PBLD的表达水平越高，其患者复发率越低见图3。单因素和多因素回归分析发现，PBLD表达水平为肝癌患者生存及复发时间长短的独立预测指标。
0.134为界，将82例肝癌患者分为PBLD高表达组（41例）和PBLD低表达组（41例）进行预后生存分析。在PBLD高表达组，肝癌患者的1年、3年生存率分别为80.5%和68.6%，而PBLD低表达组肝癌患者的1年、3年生存率仅有75.6%和26.3%，PBLD表达水平越高，其患者生存时间越长，见图2；同时，PBLD高表达组肝癌患者的1年、3年无瘤生存率也显著高于PBLD低表达组(33.3% vs 61.1%, 16.7% vs 33.3%)，PBLD的表达水平越高，其患者复发率越低见图3。单因素和多因素回归分析发现，PBLD表达水平为肝癌患者生存及复发时间长短的独立预测指标。
[0026] 以上数据表明，PBLD基因的表达量可以作为判断肝癌患者预后的有效指标，其表达量越低，预后越差，为肝癌的个体化治疗提供理论依据。
[0027] 基因表达量的一种检测方法为：提取肝癌患者手术切除的肝癌及癌旁标本中的总RNA，逆转录为cDNA，设计PCR引物，应用实时荧光定量PCR的方法检测肝癌患者PBLD基因mRNA的表达水平。
[0028] 本实验方案中，具体实施步骤为：1.提取肝癌及癌旁组织总ＲＮＡ
１）将100mg超低温冻结的组织迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，直至研成粉末状，然后加入1mlTRizol，再用研杵研磨至裂解液呈透明状。
１）将100mg超低温冻结的组织迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，直至研成粉末状，然后加入1mlTRizol，再用研杵研磨至裂解液呈透明状。
[0029] 2）裂解液转移至1.5mlEP管，颠倒混匀10下，室温静置5分钟。12000g，4℃离心5分钟。小心吸取上清液，移入新的离心管中。
[0030] 3）加氯仿1/5体积，振荡混匀30s，待溶液充分乳化后，室温静置5分钟 。12000g，4℃离心，15分钟。
[0031] 4）上层水相400μl转于另一1.5mlEP管中 ，加等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟。12000g，4℃离心，10分钟。
[0032] 5）弃上清 ，沿管壁缓慢加入1ml预冷的75%乙醇，12000g，4℃离心，5分钟 。
[0033] 6）弃上清，空气干燥5-10分钟，沉淀溶于20μl DEPC水中，取2μl测OD260/OD280及浓度。
[0035] 反应体系如下(冰上配制反应试剂)：逆转录反应条件，37℃水浴15min，85℃水浴5sec，将获得的逆转录产物-20℃保存。
[0036] 3.测定PBLD基因表达量1）取上述相同体积cDNA分别与PBLD引物：上游5'- GGGTCTGCACACGCTGTTC-3'，下游5'-TAATGTCAACCCTTCCGTCT-3'和GAPDH引物：上游5'- GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3' ，下游
5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'置于PCR管内进行PCR扩增。在PCR管内依次配制PCR反应体系：Takara premix Ex Taq 5ul、模板cDNA 1ul、上游引物 0.4ul、下游引物 0.4ul、加灭菌双蒸水3.2ul至总体积10ul。PCR扩增反应条件：预变性95℃ 5min、变性 95℃30s、退火62℃30s、扩增72℃1min、反应30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物立即进行琼脂糖凝胶电泳。
5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'置于PCR管内进行PCR扩增。在PCR管内依次配制PCR反应体系：Takara premix Ex Taq 5ul、模板cDNA 1ul、上游引物 0.4ul、下游引物 0.4ul、加灭菌双蒸水3.2ul至总体积10ul。PCR扩增反应条件：预变性95℃ 5min、变性 95℃30s、退火62℃30s、扩增72℃1min、反应30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物立即进行琼脂糖凝胶电泳。
[0037] 2）同样以上述cDNA为模板，加入PBLD引物（序列同上所述）进行实时荧光定量PCR扩增，扩增片段133 bp，选用GAPDH作为内参（引物序列同上所述）同时进行实时荧光定量PCR扩增，扩增片段为226bp。反应条件为. 95 °C 15 秒预变性, 60°C 20 秒预变性，60°C 20秒退火延伸，共40个循环。
[0038] 3）计算基因表达量，计算公式为2-∆∆Ct基因PCR产物的电泳如图4所示。图中，M为标记带，1为内参GAPDH产物带，2为PBLD产物带。由电泳图可见，除目的条带外无杂带出现，表明引物特异性良好。
[0039] 验证实验：将逆转录好的cDNA稀释为不同的几个浓度梯度，利用实时荧光定量PCR技术对稀释后的每一个样本同时进行目的基因和内参基因GAPDH的扩增，并计算各基因与内参基因的平均CT值以及∆Ct值，以cDNA的相对浓度梯度对∆Ct值作图，其结果如图5所示。图中直线斜率绝对值接近于0，表明目的基因和内参基因的∆CT值几乎不随模板浓度变化而变化，目的基因和内参基因的扩增效率基本一致。
[0040] 可见，通过检测PBLD mRNA的表达量，判断原发性肝细胞癌患者的病情发展或预后，可预测肝癌患者手术切除后的复发及生存时间，指导临床患者个体化治疗，提高肝癌患者的治疗效果。
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