一种靶向survivin基因的siRNA的结构及其抗肿瘤用途
阅读：3发布：2022-11-08
专利汇可以提供一种靶向survivin基因的siRNA的结构及其抗肿瘤用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种靶向凋亡抑制基因survivin的小分子干扰RNA(siRNA)的结构及其抗 肿瘤 用途。该siRNA(命名为CPUsiRNA2)是针对survivin基因的开放阅读框(ORF)的功能保守区设计的双链siRNA，具有广谱的siRNA抗肿瘤作用，对 肺 癌、肝癌、白血病、胃癌、 宫颈 癌 、 口腔 上皮癌等在体外都有良好的抑制作用，尤其是对肺癌、肝癌和白血病细胞。CPUsiRNA2的正义链与survivin基因的mRNA结合，干扰它的转录后翻译，从而诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、降低肿瘤的细胞的耐药性、抑制肿瘤血管的生成，达到 治疗 肿瘤的目的。，下面是一种靶向survivin基因的siRNA的结构及其抗肿瘤用途专利的具体信息内容。
技术领域
本发明涉及小分子干扰RNA(siRNA)的结构及其用途。具体地说涉及凋亡抑制基因 survivin的siRNA的结构及其抗肿瘤的用途。
背景技术
肿瘤分子生物学研究表明，肿瘤是由于基因异常引起的疾病，致病机理包括癌基因的激 活何抑癌基因的失活以及细胞周期的异常，肿瘤发病分子机理的进一步阐明为肿瘤基因治疗 提供了可靠的理论依据。RNA干扰技术是近几年兴起的生物技术，用小分子干扰RNA干扰 特定基因的表达是基因治疗的重要组成部分。
凋亡抑制基因survivin是1997年发现的一种重要的肿瘤相关基因，该基因是Ambrosini 等(.Nature Med，1997，3(8)：917-921)在人类基因组文库中筛选克隆到的，它定位于17q25， 该基因具有两个突出的特点：①几乎在所有种类的肿瘤组织中特异性地表达，而正常组织几乎 没有表达；②具有抗肿瘤细胞凋亡、促进有丝分裂、调节细胞周期、参与血管形成和放化疗 耐受多种功能于一体，而引起了国内外学者的广泛关注，成为IAP家族中最令人瞩目的一员。 有研究者(.Lab Invest，1999，79(11)：1327-1333；Am J Pathol，1998，152(1)：43-49)对正常增殖 细胞中survivin基因的潜在分布进行研究发现：包括皮肤表面的角化细胞、肠道的上皮细胞 和正常的骨髓细胞在内，在各种有丝分裂细胞系中均没有检测到survivin基因的表达；成人 体内只有胸腺、生殖腺中有微量表达，但在14-21wk的胎儿不同部位组织中均可以明显检测 到survivin表达。当这些组织发育成熟后，就很难检测到survivin的表达。这表明survivin参 与了正常胚胎组织的发育过程，具体的机制目前尚不明确。同时也充分证实，在绝大多数正 常成人组织中survivin基因并不表达。因此，针对survivin基因的靶向性治疗的毒副作用也可 能降到最低。
有研究证实(.Lab Invest，1999，79(11)：1327-1333；Cancer Res，1998，58(23)：5315-5320)， survivin基因是肿瘤组织中表达上调最为普遍的基因之一。在大多数肿瘤组织中，如肺癌、肝 癌、白血病、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌和50％以上的高分化淋巴瘤中survivin 基因的表达水平异常升高，且与个体发育和组织分化平衡有关(Cell Death Differ，2002，9(12)： 1334-1342；Arch Pathol Lab Med，2004，128(1)：39-43；Acta Neuro pathol(Berl)，2002，104 (1)：105-109；J Cancer Res Clin Oncol，2002，128(6)：302-306)。这些现象显示survivin基因在 癌症中可能处于失控的表达状态。
体外实验表明，(1)survivin可以通过其唯一的BIR结构域与细胞凋亡效应蛋白酶 caspase-3和caspase-7结合，抑制他们的活性，并抑制由Fas，Bax、抗癌药物诱导的细胞凋亡 (Cancer Res，1998，58(23)：5315-5320)。survivin抑制细胞凋亡的另一作用机制可能是：survivin 在细胞核内与Cdk4形成复合物，使p21在Rb蛋白磷酸化过程中释放出来，释放出来的p21 易位到线粒体内，并以N—末端的氨基酸序列与caspase-3前体形成复合物，使caspase-3前 体不能活化，从而抑制由Fas介导的细胞凋亡(Oncogene，2000，19(10)：1346-1353)。(2)BIR 结构可以直接同线粒体活化因子Smac/DIABLO相作用间接抑制Caspases的级联反应，阻断 线粒体依赖的凋亡途径(Cell，2000，102(1)：33-42)。(3)Cdc2可以使survivin磷酸化后再同微 管与纺锤体结合，抑制Caspase-9的活化和Caspase-3对微管结构蛋白的水解，维持了微管与 纺锤体结构的稳定性(Cell，2000，102(1)：33-42；Nature，1998，396(6711)：580-584)。(4)由线粒 体释放出来的凋亡诱导因子AIF可以直接进入细胞核中，导致染色体浓缩、断裂，其作用不 依赖caspase。survivin可以抑制AIF的核转位，从而抑制AIF的促凋亡作用(Oncogene，2004，23 (1)：39-48)。(5)survivin可以通过抑制Caspase对Mdm2的剪切在翻译后水平调节Mdm2，使 其降解减少，从而使Mdm2对p53的降解相对增加(Oncogene，2004，23(49)：8146-8153)。因此， survivin可以负向调节p53的表达，也是其抗凋亡的机理之一。
survivin在G2/M期通过细胞周期调控的方式表达并可能抑制有丝分裂期细胞的凋亡。免 疫荧光显示survivin在γ-tubulin周围形成短放射状的“壳”，着色于中心体旁，与γ-tubulin 共定位于纺锤体中心(Nat Struct Biol，2000，7(7)：602-608)。在体外分别将HeLa细胞阻断在G1 期、S期、G2/M期，检测细胞内源性survivin mRNA的表达，发现在G1期检测不到survivin 的表达，在S期增加6～7倍，在G2/M期，其表达上调40倍(Nature，1998，396(6711)：580-584)。 Skoufias等(Cell Biol，2000，10(7)：1575-1582)在质粒转染的HeLa细胞系中发现，survivin参与 了有丝分裂，调控微管组织中心及纺锤体的形成，是调控细胞增殖与死亡之间平衡的重要分 子。有丝分裂初期，在微管动力作用下，survivin与纺锤体中的微管相结合而抑制凋亡，与微 管分离可使其抗凋亡作用丧失，并增强caspase-3的活性，这是有丝分裂时细胞死亡的机制。 survivin在癌细胞中的过表达可以克服这些凋亡关卡，使细胞加快向S期转换，抑制G1期静 止，从而促进细胞增殖。研究表明，无survivin表达的细胞可形成卵裂沟和收缩环，但不能 完成正常的细胞质流动过程，因此导致多核细胞的形成。survivin和INCEN(inner centromere protein在微管组装、卵裂沟的形成、细胞质流动等协同事件中有重要作用；并可通过与 CDK4/p16(INK4a)和CDK2/cycline E复合体活化的竞争性作用，导致Rb蛋白磷酸化，以启 动细胞有丝分裂(Oncogene，2000，19(29)：3225-3234)。
血管形成过程取决于血管内皮细胞生存和凋亡的平衡。正常情况下，血管内皮细胞中很 难检测到survivin。在血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的刺激下， 静止的血管内皮表达survivin的能力约可增强4倍，VEGF的许多抗凋亡活性都是通过诱导内 皮细胞表达survivin来实现的(Am J Pathol，2001，158(5)：1757-1765)。血管生成素— 1(angiopoietin-1，Ang-1)是胚胎血管形成过程中维持血管稳定性和管腔形成的关键因子。它没 有促进内皮细胞生长，而只促进了血管网的稳定和分枝血管的形成。研究发现，Ang-1可以 促进内皮细胞中survivin表达，通过Akt(或蛋白激酶B)途径激活survivin的抗凋亡活性，从 而阻止内皮细胞凋亡，在体内血管形成过程中稳定血管结构(J Biol Chem， 2000，275(3)：9102-9105)。新血管生成是肿瘤生长和转移的必要因素，因此抑制survivin的表达 可能对防止肿瘤细胞的浸润、迁移起重要作用。己有多项动物实验证明，反义survivin RNA 或survivin突变体可以有效抑制实体瘤的血管形成和肿瘤的侵袭增殖。
肿瘤的难治还在于肿瘤的天然耐药以及后期治疗时产生的耐受。肿瘤本身高表达survivin 能保护化疗药和放射线对肿瘤的杀伤：相反，不足量的化疗药或放射线也能诱导survivin的表 达，产生对治疗的继发耐受。研究表明，survivin能抑制某些化疗药物、IL-3，TNF-a，X射线 诱导的Fas，Caspase，Bax等参与的凋亡信号通路(Cancer Res，1998，58(23)：5315-5320；J Cancer Res，2000，91(11)：1204-1209)。但假如其唯一的BIR区发生C84A的突变，survivin也就丧失 对抗化疗药物Taxol诱导的凋亡的抵抗作用。
因此以survivin基因为靶点的抗肿瘤治疗可以同时从抑制细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、 抑制肿瘤血管的形成、降低肿瘤对放化疗的耐受等几方面提高肿瘤治疗的效果。
RNA干扰技术(RNAi)是近几年发展起来的被认为是研究功能基因组最有力工具之一。这 种新兴的生物技术为肿瘤分子水平的基因治疗提供了新的技术和方法。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)dsRNA)介导的转录后的基因 沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)现象。通过在多种生物细胞内导入外源或内源的 dsRNA可以使内源性mRNA发生特异性降解，从而引起相应基因转录的阻抑。RNAi已作为 一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗 的研究中。最早的针对survivin的RNAi研究报导于2003年，Carvalho等用小分子干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)转染HeLa细胞，60h后蛋白印迹结果显示治疗组中己检测不到 survivin的表达，细胞增殖明显受抑，部分细胞有丝分裂受到阻滞，出现凋亡(J Cell Sci，2003， 116(14)：2987-2998)。随着RNAi技术的不断完善，由原来直接导入外源的siRNA，发展到真 核表达载体转录产生siRNA，以及用于RNAi的病毒载体的出现，大大提高了转染效率和干 扰效率。Cheng等用靶向survivin基因的RNAi真核载体转染肝细胞癌HepG2细胞，发现转 染细胞中几乎没有survivin基因的表达，转染细胞自发的凋亡增加，G2/M期细胞比例减少， 细胞增殖减慢(World J Gastroenterol 2005，11(5)：756-759)。目前针对survivin的RNAi研究进展 迅速，体外实验显示了良好的效果，相信不远的将来会有更为丰富和完善的研究结果出现。
应用RNA干扰技术，以小分子RNA作为靶向药物，有针对性地对survivin基因的转录 后表达进行干扰，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血 管形成和降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，多层次，多途径对肿瘤进行抑制，这可能成为了一 种新的肿瘤治疗策略。而且survivin基因选择性地表达在几乎所有种类的肿瘤组织中，而正 常组织几乎不表达，则可使这种基因治疗对正常组织和细胞的毒副作用降到最低，应用RNAi 特异地抑制survivin等肿瘤相关基因的表达有望成为一种新的肿瘤基因治疗方式。
凋亡抑制基因survivin是1997年发现的一种重要的肿瘤相关基因，该基因是Ambrosini 等(.Nature Med，1997，3(8)：917-921)在人类基因组文库中筛选克隆到的，它定位于17q25， 该基因具有两个突出的特点：①几乎在所有种类的肿瘤组织中特异性地表达，而正常组织几乎 没有表达；②具有抗肿瘤细胞凋亡、促进有丝分裂、调节细胞周期、参与血管形成和放化疗 耐受多种功能于一体，而引起了国内外学者的广泛关注，成为IAP家族中最令人瞩目的一员。 有研究者(.Lab Invest，1999，79(11)：1327-1333；Am J Pathol，1998，152(1)：43-49)对正常增殖 细胞中survivin基因的潜在分布进行研究发现：包括皮肤表面的角化细胞、肠道的上皮细胞 和正常的骨髓细胞在内，在各种有丝分裂细胞系中均没有检测到survivin基因的表达；成人 体内只有胸腺、生殖腺中有微量表达，但在14-21wk的胎儿不同部位组织中均可以明显检测 到survivin表达。当这些组织发育成熟后，就很难检测到survivin的表达。这表明survivin参 与了正常胚胎组织的发育过程，具体的机制目前尚不明确。同时也充分证实，在绝大多数正 常成人组织中survivin基因并不表达。因此，针对survivin基因的靶向性治疗的毒副作用也可 能降到最低。
有研究证实(.Lab Invest，1999，79(11)：1327-1333；Cancer Res，1998，58(23)：5315-5320)， survivin基因是肿瘤组织中表达上调最为普遍的基因之一。在大多数肿瘤组织中，如肺癌、肝 癌、白血病、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌和50％以上的高分化淋巴瘤中survivin 基因的表达水平异常升高，且与个体发育和组织分化平衡有关(Cell Death Differ，2002，9(12)： 1334-1342；Arch Pathol Lab Med，2004，128(1)：39-43；Acta Neuro pathol(Berl)，2002，104 (1)：105-109；J Cancer Res Clin Oncol，2002，128(6)：302-306)。这些现象显示survivin基因在 癌症中可能处于失控的表达状态。
体外实验表明，(1)survivin可以通过其唯一的BIR结构域与细胞凋亡效应蛋白酶 caspase-3和caspase-7结合，抑制他们的活性，并抑制由Fas，Bax、抗癌药物诱导的细胞凋亡 (Cancer Res，1998，58(23)：5315-5320)。survivin抑制细胞凋亡的另一作用机制可能是：survivin 在细胞核内与Cdk4形成复合物，使p21在Rb蛋白磷酸化过程中释放出来，释放出来的p21 易位到线粒体内，并以N—末端的氨基酸序列与caspase-3前体形成复合物，使caspase-3前 体不能活化，从而抑制由Fas介导的细胞凋亡(Oncogene，2000，19(10)：1346-1353)。(2)BIR 结构可以直接同线粒体活化因子Smac/DIABLO相作用间接抑制Caspases的级联反应，阻断 线粒体依赖的凋亡途径(Cell，2000，102(1)：33-42)。(3)Cdc2可以使survivin磷酸化后再同微 管与纺锤体结合，抑制Caspase-9的活化和Caspase-3对微管结构蛋白的水解，维持了微管与 纺锤体结构的稳定性(Cell，2000，102(1)：33-42；Nature，1998，396(6711)：580-584)。(4)由线粒 体释放出来的凋亡诱导因子AIF可以直接进入细胞核中，导致染色体浓缩、断裂，其作用不 依赖caspase。survivin可以抑制AIF的核转位，从而抑制AIF的促凋亡作用(Oncogene，2004，23 (1)：39-48)。(5)survivin可以通过抑制Caspase对Mdm2的剪切在翻译后水平调节Mdm2，使 其降解减少，从而使Mdm2对p53的降解相对增加(Oncogene，2004，23(49)：8146-8153)。因此， survivin可以负向调节p53的表达，也是其抗凋亡的机理之一。
survivin在G2/M期通过细胞周期调控的方式表达并可能抑制有丝分裂期细胞的凋亡。免 疫荧光显示survivin在γ-tubulin周围形成短放射状的“壳”，着色于中心体旁，与γ-tubulin 共定位于纺锤体中心(Nat Struct Biol，2000，7(7)：602-608)。在体外分别将HeLa细胞阻断在G1 期、S期、G2/M期，检测细胞内源性survivin mRNA的表达，发现在G1期检测不到survivin 的表达，在S期增加6～7倍，在G2/M期，其表达上调40倍(Nature，1998，396(6711)：580-584)。 Skoufias等(Cell Biol，2000，10(7)：1575-1582)在质粒转染的HeLa细胞系中发现，survivin参与 了有丝分裂，调控微管组织中心及纺锤体的形成，是调控细胞增殖与死亡之间平衡的重要分 子。有丝分裂初期，在微管动力作用下，survivin与纺锤体中的微管相结合而抑制凋亡，与微 管分离可使其抗凋亡作用丧失，并增强caspase-3的活性，这是有丝分裂时细胞死亡的机制。 survivin在癌细胞中的过表达可以克服这些凋亡关卡，使细胞加快向S期转换，抑制G1期静 止，从而促进细胞增殖。研究表明，无survivin表达的细胞可形成卵裂沟和收缩环，但不能 完成正常的细胞质流动过程，因此导致多核细胞的形成。survivin和INCEN(inner centromere protein在微管组装、卵裂沟的形成、细胞质流动等协同事件中有重要作用；并可通过与 CDK4/p16(INK4a)和CDK2/cycline E复合体活化的竞争性作用，导致Rb蛋白磷酸化，以启 动细胞有丝分裂(Oncogene，2000，19(29)：3225-3234)。
血管形成过程取决于血管内皮细胞生存和凋亡的平衡。正常情况下，血管内皮细胞中很 难检测到survivin。在血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的刺激下， 静止的血管内皮表达survivin的能力约可增强4倍，VEGF的许多抗凋亡活性都是通过诱导内 皮细胞表达survivin来实现的(Am J Pathol，2001，158(5)：1757-1765)。血管生成素— 1(angiopoietin-1，Ang-1)是胚胎血管形成过程中维持血管稳定性和管腔形成的关键因子。它没 有促进内皮细胞生长，而只促进了血管网的稳定和分枝血管的形成。研究发现，Ang-1可以 促进内皮细胞中survivin表达，通过Akt(或蛋白激酶B)途径激活survivin的抗凋亡活性，从 而阻止内皮细胞凋亡，在体内血管形成过程中稳定血管结构(J Biol Chem， 2000，275(3)：9102-9105)。新血管生成是肿瘤生长和转移的必要因素，因此抑制survivin的表达 可能对防止肿瘤细胞的浸润、迁移起重要作用。己有多项动物实验证明，反义survivin RNA 或survivin突变体可以有效抑制实体瘤的血管形成和肿瘤的侵袭增殖。
肿瘤的难治还在于肿瘤的天然耐药以及后期治疗时产生的耐受。肿瘤本身高表达survivin 能保护化疗药和放射线对肿瘤的杀伤：相反，不足量的化疗药或放射线也能诱导survivin的表 达，产生对治疗的继发耐受。研究表明，survivin能抑制某些化疗药物、IL-3，TNF-a，X射线 诱导的Fas，Caspase，Bax等参与的凋亡信号通路(Cancer Res，1998，58(23)：5315-5320；J Cancer Res，2000，91(11)：1204-1209)。但假如其唯一的BIR区发生C84A的突变，survivin也就丧失 对抗化疗药物Taxol诱导的凋亡的抵抗作用。
因此以survivin基因为靶点的抗肿瘤治疗可以同时从抑制细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、 抑制肿瘤血管的形成、降低肿瘤对放化疗的耐受等几方面提高肿瘤治疗的效果。
RNA干扰技术(RNAi)是近几年发展起来的被认为是研究功能基因组最有力工具之一。这 种新兴的生物技术为肿瘤分子水平的基因治疗提供了新的技术和方法。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)dsRNA)介导的转录后的基因 沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)现象。通过在多种生物细胞内导入外源或内源的 dsRNA可以使内源性mRNA发生特异性降解，从而引起相应基因转录的阻抑。RNAi已作为 一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗 的研究中。最早的针对survivin的RNAi研究报导于2003年，Carvalho等用小分子干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)转染HeLa细胞，60h后蛋白印迹结果显示治疗组中己检测不到 survivin的表达，细胞增殖明显受抑，部分细胞有丝分裂受到阻滞，出现凋亡(J Cell Sci，2003， 116(14)：2987-2998)。随着RNAi技术的不断完善，由原来直接导入外源的siRNA，发展到真 核表达载体转录产生siRNA，以及用于RNAi的病毒载体的出现，大大提高了转染效率和干 扰效率。Cheng等用靶向survivin基因的RNAi真核载体转染肝细胞癌HepG2细胞，发现转 染细胞中几乎没有survivin基因的表达，转染细胞自发的凋亡增加，G2/M期细胞比例减少， 细胞增殖减慢(World J Gastroenterol 2005，11(5)：756-759)。目前针对survivin的RNAi研究进展 迅速，体外实验显示了良好的效果，相信不远的将来会有更为丰富和完善的研究结果出现。
应用RNA干扰技术，以小分子RNA作为靶向药物，有针对性地对survivin基因的转录 后表达进行干扰，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血 管形成和降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，多层次，多途径对肿瘤进行抑制，这可能成为了一 种新的肿瘤治疗策略。而且survivin基因选择性地表达在几乎所有种类的肿瘤组织中，而正 常组织几乎不表达，则可使这种基因治疗对正常组织和细胞的毒副作用降到最低，应用RNAi 特异地抑制survivin等肿瘤相关基因的表达有望成为一种新的肿瘤基因治疗方式。
发明内容
本发明公开了一种高效的针对survivin基因的广谱的小分子干扰RNA(siRNA)抗肿瘤 药物，由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成：
正义链 5′-GAAUUUGAGGAAACUGCGAX-3′，
反义链 3′-XCUUAAACUCCUUUGACGCU-5′
其中X代表tt、TT或UU。t代表脱氧胸腺嘧啶dT。
X优选代表tt。
本发明的小分子干扰RNA是主要针对survivin基因开放阅读框(ORF)的功能保守区设 计的双链siRNA，药理试验证明本发明的小分子干扰RNA具有广谱的抗肿瘤作用，对肺癌、 肝癌、白血病、胃癌、宫颈癌、口腔上皮癌等在体外均有抑制作用，该序列的正义链与survivin 基因的mRNA结合，干扰survivin基因mRNA的翻译，从而诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细 胞分裂、降低肿瘤的细胞的耐药性、抑制肿瘤血管的生成，达到治疗肿瘤的目的。本发明是 一种全新作用机制的抗肿瘤新型药物，可能为肿瘤的治疗带来了新的希望。
本发明所述的肿瘤疾病包括肺癌、肝癌、白血病、胃癌、宫颈癌、口腔上皮癌、结直肠 癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等，其中优选肺癌、肝癌和白血病。
在临床使用中，可以将本发明小分子干扰RNA(简称CPUsiRNA2)溶于不含RNA酶 的无菌水中，轻轻混匀，CPUsiRNA2为10微克/微升。取适量CPUsiRNA2与小分子干扰RNA 转染试剂RNAi-Mate混合，在室温温育30分钟，以形成CPUsiRNA2-RNAi-Mate复合物。将 制备好的CPUsiRNA2-RNAi-Mate复合物按5-500nmol/kg静脉给药，一天一次，20天左右一 个疗程。
附图说明
图1是本发明小分子干扰RNA作用后的肺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和白血病细胞 株HL60图
图2是MTT法测得本发明小分子干扰RNA对癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和白血病 细胞株HL60的抑制率
图3是MTT法测得顺铂对肺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和白血病细胞株HL60的抑 制率
图4是PCR检测本发明小分子干扰RNA对肺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和白血病 细胞株HL60survivin基因的mRNA水平的抑制
图5是Western blot检测本发明小分子干扰RNA对肺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和 白血病细胞株HL60的Survivin蛋白质的抑制
图6是流式细胞仪检测本发明小分子干扰RNA对肺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和白 血病细胞株HL60的诱导细胞凋亡
正义链 5′-GAAUUUGAGGAAACUGCGAX-3′，
反义链 3′-XCUUAAACUCCUUUGACGCU-5′
其中X代表tt、TT或UU。t代表脱氧胸腺嘧啶dT。
X优选代表tt。
本发明的小分子干扰RNA是主要针对survivin基因开放阅读框(ORF)的功能保守区设 计的双链siRNA，药理试验证明本发明的小分子干扰RNA具有广谱的抗肿瘤作用，对肺癌、 肝癌、白血病、胃癌、宫颈癌、口腔上皮癌等在体外均有抑制作用，该序列的正义链与survivin 基因的mRNA结合，干扰survivin基因mRNA的翻译，从而诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细 胞分裂、降低肿瘤的细胞的耐药性、抑制肿瘤血管的生成，达到治疗肿瘤的目的。本发明是 一种全新作用机制的抗肿瘤新型药物，可能为肿瘤的治疗带来了新的希望。
本发明所述的肿瘤疾病包括肺癌、肝癌、白血病、胃癌、宫颈癌、口腔上皮癌、结直肠 癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等，其中优选肺癌、肝癌和白血病。
在临床使用中，可以将本发明小分子干扰RNA(简称CPUsiRNA2)溶于不含RNA酶 的无菌水中，轻轻混匀，CPUsiRNA2为10微克/微升。取适量CPUsiRNA2与小分子干扰RNA 转染试剂RNAi-Mate混合，在室温温育30分钟，以形成CPUsiRNA2-RNAi-Mate复合物。将 制备好的CPUsiRNA2-RNAi-Mate复合物按5-500nmol/kg静脉给药，一天一次，20天左右一 个疗程。
附图说明
图1是本发明小分子干扰RNA作用后的肺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和白血病细胞 株HL60图
图2是MTT法测得本发明小分子干扰RNA对癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和白血病 细胞株HL60的抑制率
图3是MTT法测得顺铂对肺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和白血病细胞株HL60的抑 制率
图4是PCR检测本发明小分子干扰RNA对肺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和白血病 细胞株HL60survivin基因的mRNA水平的抑制
图5是Western blot检测本发明小分子干扰RNA对肺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和 白血病细胞株HL60的Survivin蛋白质的抑制
图6是流式细胞仪检测本发明小分子干扰RNA对肺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2和白 血病细胞株HL60的诱导细胞凋亡
具体实施方式
实施例1
siRNA的设计与合成
仪器OligoPilot II DNA/RNA Synthesizer(瑞典Pharmacia公司)，HP-1100型高效液 相色谱仪(美国惠普公司)，DU 2640紫外分光光度计(美国Backman公司)。
材料和试剂合成柱(6.3mL)，分子筛(3A Sigma)，30HL载体(批号256723)，RNA Pac PA 100分析柱(美国Dionex公司)，5种核苷酸单体(A，U，C，G，dT)，乙腈，二氯乙酸，四唑，N2 甲基咪唑，除注明厂家外，其余为瑞典Pharmacia公司产品。
siRNA的设计根据survivin基因开放阅读框(ORF)的序列，设计小分子干扰RNA CPUsiRNA2和1对负对照siRNA，将他们的序列在人类EST数据库中比对，确定没有与他 们相同的其它基因序列。CPUsiRNA2正义链：5’-GAAUUUGAGGAAACUGCGAdTdT-3’，反 义链：5’-UCGCAGUUUCCUAACUUACdTdT-3’。负对照siRNA的正义链：5’-UUCUCCGAAC GUGUCACGUdTdT-3’，反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’。siRNA的设计后 送上海吉马公司合成。
siRNA的化学合成用乙腈将5种单体(A，U，C，G，dT)配制成0.2mol/L溶液，分别将5 种单体、乙腈、二氯乙酸、四唑安装到合成仪相应位置，其中单体、乙腈、四唑应加入适当 分子筛。合成步骤：(1)利用二氯乙酸处理结合于固相载体的核苷酸或寡核苷酸，脱去其5’羟 基官能团上的二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团，露出反应性的5’端；(2)偶联反应由四唑 催化完成，形成3’→5’磷酸酯链；(3)封闭反应将未反应5’羟基在N2甲基咪唑催化下由乙酸 酐来完成。RNA合成仪按照设计好的程序合成出CPUsiRNA2和负对照siRNA的单链RNA。 应用紫外分光光度计检测D 260nm值，并计算产量。
合成粗产品的HPLC色谱分析色谱柱：DNA 2Pac PA 21000(4mm×250mm)；样品：20 OD/mL，进样的量20μL；流动相A：25mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，10％乙腈，pH8；流动 相B：25mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，3mol/L NH4Cl，pH8；洗脱梯度：流动相B在40min 内从10％到70％；流速：1mL/min；检测波长：260nm；柱温：50℃。
合成的单链RNA的正义链和反义链后，退火成双链的CPUsiRNA2和负对照siRNA，之 后进行HPLC纯化的纯度大于97％的双链CPUsiRNA2和负对照siRNA。
实施例2
抗肿瘤药效学试验
材料和方法：
肿瘤细胞株A549、HepG2和HL60由本实验室保存，转染试剂Lipofectamin TM 2000购自 Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶，dNTP、DNA Marker和蛋白质Marker购于Takara公司。 Survivin蛋白的兔抗人抗体，HRP-羊抗兔IgG抗体、DAB显色试剂盒购于武汉博士德公司。
细胞培养肿瘤细胞株A549、HepG2和HL60在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，37 ℃，5％CO2的培养箱中培养。
MTT法将2.5×106/L细胞接种于96孔板，每孔180μl，每组平行3孔，并设立空白， 阴性药对照。44h后，弃去上清，每孔加20μL新配制的5g/L MTT，孵育4h，弃去上清液， 加150μL DMSO溶解，混匀后用Bio-Rad型号的酶标仪490nm波长测定。
RT-PCR：按Trizol说明书进行培养细胞总RNA抽提RT采用说明书M-MLV逆转录酶体 系，PCR扩增采用20μL反应体系。PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退 火30s，72℃延伸1min，25个循环。
Western blot检测干扰效应转染后48h取出六孔板，吸干RPMI-1640培养液，加入500 μL胰酶的溶液，待细胞消化后加入1mL PBS溶液，反复吹打将细胞冲下来，把细胞悬液 转入1.5mL EP管中，1000r/min离心5min收集细胞沉淀，加入60μL预冷的细胞裂解液， 反复吹打将细胞充分混匀，冰浴中放置40min，10000r/min 4℃离心10min，取上清置于-70℃ 保存。蛋白的分离采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，12％的分离胶和5％的浓缩 胶，细胞蛋白采用稀释的5×蛋白质的上样缓冲溶液，经100℃ 4min变性后加样，上样量均 为20μL，恒压120V至溴酚蓝迁移至凝胶底部，取下凝胶，置转膜缓冲液中平衡10min，覆 盖经处理的PVDF膜，采用半干转移系统，按1毫安/每平方厘米恒流转移3h将蛋白转移至膜 上，将PVDF膜置于含10％小牛血清的1×PBS溶液中4℃封闭1小时，取出PVDF膜后在适 当位置剪开(根据目的蛋白和对照蛋白大致的电泳位置)，分别加入用含0.1％小牛血清白蛋白 1×PBST溶液作1∶1000稀释Survivin蛋白的一抗室温振荡孵育10h，用大量的PBST溶液洗 涤三次，每次10min，再加入用含10％小牛血清的1×PBST溶液作1∶1000稀释的Survivin蛋 白的二抗，室温振荡孵育1h，用大量的PBST洗涤三次，每次10min。吸干膜上的溶液，加 入DAB显色液，显色5min。
流式细胞术检测细胞凋亡转染方法同前，转染干扰载体48h后，细胞用胰蛋白酶消化 后1min，PBS洗两遍，加入1mL乙醇固定过夜，去乙醇，PBS洗两遍，加入100μL浓度 为10μg/mL的P I，混匀后室温避光孵育30min，在反应管中加400μL PBS，上机检测细胞 凋亡。
统计学处理统计结果以.x±s表示，用SPSS13.0统计学软件进行分析，数据两两比较 采用配对资料t检验，多组之间比较用ANOVA进行。
结果：
细胞形态：
本发明的siRNA作用后的肿瘤细胞株A549、HepG2和HL60形态发生明显变化，表现 为：细胞体积变小、形态不规则、细胞皱缩、核固缩，而在各对照组中细胞形态基本正常， 贴壁生长良好，见图1，图1中1是正常的肺癌A549细胞的图；2是加了200nM负对照siRNA 的肺癌细胞A549的图；3，4，5，6是分别加了50nM，100nM，150nM，200nM的本发明小分子 干扰RNA(以下简称CPUsiRNA2)的肺癌细胞A549的图；7是正常的肝癌细胞HepG2的 图；8是加了200nM负对照siRNA的肝癌细胞HepG2图；9，10，11，12是分别加了50nM，100nM， 150nM，200nM的CPUsiRNA2的肝癌细胞HepG2的图；13是正常的白血病细胞HL60的图； 14是加了200nM负对照siRNA的白血病细胞HL60的图；15，16，17，18是分别加了50nM， 100nM，150nM，200nM的CPUsiRNA2的白血病细胞HL60的图。
细胞的增殖：
本发明的小分子干扰RNA作用后的肿瘤细胞株A549、HepG2和HL60的分裂明显减少、细 胞的生长也受到明显抑制，小分子干扰RNA CPUsiRNA2在12.5nM至400nM对肿瘤细胞株 A549、HepG2和HL60的抑制作用逐渐增强，CPUsiRNA2作用48小时后，MTT法检测的对肿 瘤细胞的抑制率结果，见图2。用临床上常用的抗肿瘤的药物——顺铂作为CPUsiRNA2的药 效对照药物，顺铂在5μM至80μM对肿瘤细胞株A549、HepG2和HL60的抑制作用逐渐增强， 作用48小时后，MTT法检测的对肿瘤细胞的抑制率结果，见图3。
RT-PCR检测survivin基因的mRNA的转录：
见图4，图中第1，3，5泳道分别是没加药的肿瘤A549、HepG2和HL60细胞的RT-PCR检 测结果，第2，4，6泳道是分别是加了有效的本发明的小分干扰RNA siRNA1 100nM 48小时的 肿瘤A549、HepG2和HL60细胞的RT-PCR检测结果。虽然它们都能扩增出450bp survivin 基因的带，但2，4，6泳道的条带明显更淡，这表明survivin基因在mRNA的转录受到了一定 的抑制。
Western blot检测小分干扰RNA对survivin表达的抑制情况：
见图5，图中第1，3，5泳道分别是没加药的肿瘤A549、HepG2和HL60细胞的Western blot 检测结果，第2，4，6泳道是分别是加了本发明小分干扰RNA siRNA1 100nM 48小时的肿瘤 A549、HepG2和HL60细胞的Western blot检测结果。虽然它们都能印出Survivin蛋白的带， 但2，4，6泳道的条带明显更淡，这表明survivin基因在蛋白质的翻译受到了一定的抑制。
流式细胞仪检测细胞凋亡的实验结果：
图6中，1，3，5分别是没加药的肿瘤A549、HepG2和HL60细胞的流式细胞仪检测细胞凋亡 的实验结果，2，4，6泳道是分别是加了本发明的小分干扰RNA siRNA1 100nM 48小时的肿瘤 A549、HepG2和HL60细胞的流式细胞仪检测细胞凋亡的实验结果。转染的小分干扰RNA CPUsiRNA2 100nM 48小时后，用流式细胞仪检测细胞凋亡明显发生了凋亡。
序列表
<110>申请人姓名：中国药科大学
<120>发明名称：一种靶向survivin基因的siRNA的结构及其抗肿瘤用途
<160>序列表中序列的个数：6
<210>序列相对应的序列标识符：1
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：1
<210>序列相对应的序列标识符：2
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：2
<210>序列相对应的序列标识符：3
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：3
<210>序列相对应的序列标识符：4
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：4
<210>序列相对应的序列标识符：5
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：5
<210>序列相对应的序列标识符：6
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：6
siRNA的设计与合成
仪器OligoPilot II DNA/RNA Synthesizer(瑞典Pharmacia公司)，HP-1100型高效液 相色谱仪(美国惠普公司)，DU 2640紫外分光光度计(美国Backman公司)。
材料和试剂合成柱(6.3mL)，分子筛(3A Sigma)，30HL载体(批号256723)，RNA Pac PA 100分析柱(美国Dionex公司)，5种核苷酸单体(A，U，C，G，dT)，乙腈，二氯乙酸，四唑，N2 甲基咪唑，除注明厂家外，其余为瑞典Pharmacia公司产品。
siRNA的设计根据survivin基因开放阅读框(ORF)的序列，设计小分子干扰RNA CPUsiRNA2和1对负对照siRNA，将他们的序列在人类EST数据库中比对，确定没有与他 们相同的其它基因序列。CPUsiRNA2正义链：5’-GAAUUUGAGGAAACUGCGAdTdT-3’，反 义链：5’-UCGCAGUUUCCUAACUUACdTdT-3’。负对照siRNA的正义链：5’-UUCUCCGAAC GUGUCACGUdTdT-3’，反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’。siRNA的设计后 送上海吉马公司合成。
siRNA的化学合成用乙腈将5种单体(A，U，C，G，dT)配制成0.2mol/L溶液，分别将5 种单体、乙腈、二氯乙酸、四唑安装到合成仪相应位置，其中单体、乙腈、四唑应加入适当 分子筛。合成步骤：(1)利用二氯乙酸处理结合于固相载体的核苷酸或寡核苷酸，脱去其5’羟 基官能团上的二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团，露出反应性的5’端；(2)偶联反应由四唑 催化完成，形成3’→5’磷酸酯链；(3)封闭反应将未反应5’羟基在N2甲基咪唑催化下由乙酸 酐来完成。RNA合成仪按照设计好的程序合成出CPUsiRNA2和负对照siRNA的单链RNA。 应用紫外分光光度计检测D 260nm值，并计算产量。
合成粗产品的HPLC色谱分析色谱柱：DNA 2Pac PA 21000(4mm×250mm)；样品：20 OD/mL，进样的量20μL；流动相A：25mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，10％乙腈，pH8；流动 相B：25mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，3mol/L NH4Cl，pH8；洗脱梯度：流动相B在40min 内从10％到70％；流速：1mL/min；检测波长：260nm；柱温：50℃。
合成的单链RNA的正义链和反义链后，退火成双链的CPUsiRNA2和负对照siRNA，之 后进行HPLC纯化的纯度大于97％的双链CPUsiRNA2和负对照siRNA。
实施例2
抗肿瘤药效学试验
材料和方法：
肿瘤细胞株A549、HepG2和HL60由本实验室保存，转染试剂Lipofectamin TM 2000购自 Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶，dNTP、DNA Marker和蛋白质Marker购于Takara公司。 Survivin蛋白的兔抗人抗体，HRP-羊抗兔IgG抗体、DAB显色试剂盒购于武汉博士德公司。
细胞培养肿瘤细胞株A549、HepG2和HL60在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，37 ℃，5％CO2的培养箱中培养。
MTT法将2.5×106/L细胞接种于96孔板，每孔180μl，每组平行3孔，并设立空白， 阴性药对照。44h后，弃去上清，每孔加20μL新配制的5g/L MTT，孵育4h，弃去上清液， 加150μL DMSO溶解，混匀后用Bio-Rad型号的酶标仪490nm波长测定。
RT-PCR：按Trizol说明书进行培养细胞总RNA抽提RT采用说明书M-MLV逆转录酶体 系，PCR扩增采用20μL反应体系。PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退 火30s，72℃延伸1min，25个循环。
Western blot检测干扰效应转染后48h取出六孔板，吸干RPMI-1640培养液，加入500 μL胰酶的溶液，待细胞消化后加入1mL PBS溶液，反复吹打将细胞冲下来，把细胞悬液 转入1.5mL EP管中，1000r/min离心5min收集细胞沉淀，加入60μL预冷的细胞裂解液， 反复吹打将细胞充分混匀，冰浴中放置40min，10000r/min 4℃离心10min，取上清置于-70℃ 保存。蛋白的分离采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，12％的分离胶和5％的浓缩 胶，细胞蛋白采用稀释的5×蛋白质的上样缓冲溶液，经100℃ 4min变性后加样，上样量均 为20μL，恒压120V至溴酚蓝迁移至凝胶底部，取下凝胶，置转膜缓冲液中平衡10min，覆 盖经处理的PVDF膜，采用半干转移系统，按1毫安/每平方厘米恒流转移3h将蛋白转移至膜 上，将PVDF膜置于含10％小牛血清的1×PBS溶液中4℃封闭1小时，取出PVDF膜后在适 当位置剪开(根据目的蛋白和对照蛋白大致的电泳位置)，分别加入用含0.1％小牛血清白蛋白 1×PBST溶液作1∶1000稀释Survivin蛋白的一抗室温振荡孵育10h，用大量的PBST溶液洗 涤三次，每次10min，再加入用含10％小牛血清的1×PBST溶液作1∶1000稀释的Survivin蛋 白的二抗，室温振荡孵育1h，用大量的PBST洗涤三次，每次10min。吸干膜上的溶液，加 入DAB显色液，显色5min。
流式细胞术检测细胞凋亡转染方法同前，转染干扰载体48h后，细胞用胰蛋白酶消化 后1min，PBS洗两遍，加入1mL乙醇固定过夜，去乙醇，PBS洗两遍，加入100μL浓度 为10μg/mL的P I，混匀后室温避光孵育30min，在反应管中加400μL PBS，上机检测细胞 凋亡。
统计学处理统计结果以.x±s表示，用SPSS13.0统计学软件进行分析，数据两两比较 采用配对资料t检验，多组之间比较用ANOVA进行。
结果：
细胞形态：
本发明的siRNA作用后的肿瘤细胞株A549、HepG2和HL60形态发生明显变化，表现 为：细胞体积变小、形态不规则、细胞皱缩、核固缩，而在各对照组中细胞形态基本正常， 贴壁生长良好，见图1，图1中1是正常的肺癌A549细胞的图；2是加了200nM负对照siRNA 的肺癌细胞A549的图；3，4，5，6是分别加了50nM，100nM，150nM，200nM的本发明小分子 干扰RNA(以下简称CPUsiRNA2)的肺癌细胞A549的图；7是正常的肝癌细胞HepG2的 图；8是加了200nM负对照siRNA的肝癌细胞HepG2图；9，10，11，12是分别加了50nM，100nM， 150nM，200nM的CPUsiRNA2的肝癌细胞HepG2的图；13是正常的白血病细胞HL60的图； 14是加了200nM负对照siRNA的白血病细胞HL60的图；15，16，17，18是分别加了50nM， 100nM，150nM，200nM的CPUsiRNA2的白血病细胞HL60的图。
细胞的增殖：
本发明的小分子干扰RNA作用后的肿瘤细胞株A549、HepG2和HL60的分裂明显减少、细 胞的生长也受到明显抑制，小分子干扰RNA CPUsiRNA2在12.5nM至400nM对肿瘤细胞株 A549、HepG2和HL60的抑制作用逐渐增强，CPUsiRNA2作用48小时后，MTT法检测的对肿 瘤细胞的抑制率结果，见图2。用临床上常用的抗肿瘤的药物——顺铂作为CPUsiRNA2的药 效对照药物，顺铂在5μM至80μM对肿瘤细胞株A549、HepG2和HL60的抑制作用逐渐增强， 作用48小时后，MTT法检测的对肿瘤细胞的抑制率结果，见图3。
RT-PCR检测survivin基因的mRNA的转录：
见图4，图中第1，3，5泳道分别是没加药的肿瘤A549、HepG2和HL60细胞的RT-PCR检 测结果，第2，4，6泳道是分别是加了有效的本发明的小分干扰RNA siRNA1 100nM 48小时的 肿瘤A549、HepG2和HL60细胞的RT-PCR检测结果。虽然它们都能扩增出450bp survivin 基因的带，但2，4，6泳道的条带明显更淡，这表明survivin基因在mRNA的转录受到了一定 的抑制。
Western blot检测小分干扰RNA对survivin表达的抑制情况：
见图5，图中第1，3，5泳道分别是没加药的肿瘤A549、HepG2和HL60细胞的Western blot 检测结果，第2，4，6泳道是分别是加了本发明小分干扰RNA siRNA1 100nM 48小时的肿瘤 A549、HepG2和HL60细胞的Western blot检测结果。虽然它们都能印出Survivin蛋白的带， 但2，4，6泳道的条带明显更淡，这表明survivin基因在蛋白质的翻译受到了一定的抑制。
流式细胞仪检测细胞凋亡的实验结果：
图6中，1，3，5分别是没加药的肿瘤A549、HepG2和HL60细胞的流式细胞仪检测细胞凋亡 的实验结果，2，4，6泳道是分别是加了本发明的小分干扰RNA siRNA1 100nM 48小时的肿瘤 A549、HepG2和HL60细胞的流式细胞仪检测细胞凋亡的实验结果。转染的小分干扰RNA CPUsiRNA2 100nM 48小时后，用流式细胞仪检测细胞凋亡明显发生了凋亡。
序列表
<110>申请人姓名：中国药科大学
<120>发明名称：一种靶向survivin基因的siRNA的结构及其抗肿瘤用途
<160>序列表中序列的个数：6
<210>序列相对应的序列标识符：1
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：1
<210>序列相对应的序列标识符：2
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：2
<210>序列相对应的序列标识符：3
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：3
<210>序列相对应的序列标识符：4
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：4
<210>序列相对应的序列标识符：5
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：5
<210>序列相对应的序列标识符：6
<211>序列长度：21
<212>序列的类型：RNA
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：6
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