Immt基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途
阅读：1025发布：2020-10-03
专利汇可以提供Immt基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及Immt基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途，尤其是Immt基因敲除鼠模型的培育方法及Immt基因敲除鼠作为神经退行性 疾病 发病研究的模型鼠的用途，并为寻找 治疗 神经退行性疾病药物提供模型。，下面是Immt基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途专利的具体信息内容。
1.Immt基因敲除鼠的培育方法，成年后杂合子小鼠显现神经退行性变的行为，其特征在于，包含下述步骤：
在小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上培养胚胎干细胞，
收集通过Immt突变所产生的Immt基因敲除的胚胎干细胞，
制备小鼠供体囊胚，
将Immt基因敲除的胚胎干细胞注入所述的小鼠供体囊胚，
将含有Immt敲除胚胎干细胞的囊胚形成的胚胎移植到小鼠的子宫，该胚胎在小鼠子宫内生长成小鼠，
获得进入种系的嵌合体小鼠，
得到进入种系的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠回交后得到杂合子仔鼠。
2.根据权利要求1所述的Immt基因敲除鼠的培育方法，其特征在于所述的胚胎干细胞是AW0256株胚胎干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的Immt基因敲除鼠的培育方法，其特征在于将12-15个Immt基因敲除的胚胎干细胞注入囊胚腔。
4.根据权利要求1或2所述的Immt基因敲除鼠的培育方法，其特征在于所述的胚胎干细胞显示Gene-Trap载体是插入在Immt基因的第三内含子的第2834个碱基后。
5.根据权利要求1或2所述的Immt基因敲除鼠的培育方法，其特征在于将Immt突变的胚胎干细胞注入到受体胚胎中，得到进入种系的嵌合体。
6.如权利要求1所述的Immt基因敲除鼠作为神经退行性疾病发病研究的模型鼠的用途。
Immt基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途
技术领域：
[0001] 本发明涉及Immt基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途，尤其是Immt基因敲除鼠模型的培育方法及Immt基因敲除鼠作为神经退行性疾病发病研究的模型鼠的用途，并为寻找治疗神经退行性疾病药物提供模型。
背景技术
[0002] 随着后基因组时代的来临，对基因功能特别是基因体内功能和作用机理的研究越来越重要。基因打靶这一技术的发明和应用为基因功能的研究翻开了革命性一页，2007年10月8日，美国科学家Mario R.Capecchi和Oliver Smithies英国科学家Martin J.Evans因为基因打靶技术的建立，分享了2007年诺贝尔生理学和医学奖。基因诱捕是一种高通量的基因打靶技术。运用这种技术可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体和筛选ES克隆的工作及费用，可以更有效、更快捷地进行小鼠基因功能分析。线粒体是细胞内重要的亚细胞器，不仅是细胞的“能量工厂”，为机体提供ATP，而且细胞内90％以上的活性氧(ROS)来自于线粒体，在细胞的钙稳态中发挥重要的作用。线粒体在神经组织中扮演重要角色，ATP生成降低，ROS生成增多，钙稳态失衡，都会引起神经退行性变。神经退行性变疾病给人们的生产生活带来很大的灾难。目前对神经退行性变疾病发病原因及其发病机制还不是很清楚。因而，在科学研究中，需要提供一种神经退行性疾病发病机制的研究的小鼠动物模型。IMMT(InnerMembrane Protein of Mitochondria(IMMT))是线粒体内膜蛋白，现有技术中，小鼠Immt基因位于6号染色体，基因组长44kb，有15个外显子，其转录本为2.7kb，编码758个氨基酸。目前Immt基因敲除鼠还没有文献报道。
发明内容
[0003] 本发明的技术方案是：
[0004] Immt基因敲除鼠的培育方法，成年后杂合子小鼠显现神经退行性变的行为，其特征在于，包含下述步骤：
[0006] 收集Immt突变的产生Immt基因敲除的胚胎干细胞(ES)，
[0007] 制备小鼠供体囊胚，
[0008] 将Immt基因敲除的胚胎干细胞注入所述的小鼠供体囊胚，
[0009] 将含有Immt敲除胚胎干细胞的囊胚形成的胚胎移植到小鼠的子宫，[0010] 该胚胎在小鼠子宫内生长成小鼠，
[0011] 小鼠随机进入种系的嵌合体小鼠，
[0012] 得到进入种系的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠回交后得到杂合子仔鼠。
[0013] 在本发明所述的Immt基因敲除鼠的培育方法的实施方案中，所述的胚胎干细胞优选是AW0256株胚胎干细胞。
[0014] 在本发明所述的Immt基因敲除鼠的培育方法实施方案中，优选将12-15个Immt基因敲除的胚胎干细胞注入囊胚腔。
[0015] 在本发明所述的Immt基因敲除鼠的培育方法实施方案中，优选所述的胚胎干细胞显示Gene-Trap载体是插入在Immt基因的第三内含子的第2834个碱基后。
[0016] 本发明还提供一种Immt基因敲除鼠作为神经退行性疾病发病研究的模型鼠的用途。
[0017] 换言之，本发明人从Wellcome Trust Sanger Institute的Gene Trap胚胎干细胞(ES)库中选取AW0256株细胞，通过5′RACE对Immt基因诱捕突变ES株进行鉴定，确认其插入位点在第三内含子内，诱捕后Immt基因后12个外显子均无转录本。通过囊胚注射，将Immt突变的胚胎干细胞(ES)注入到受体胚胎中，得到进入种系的嵌合体。将得到进入种系+/-的嵌合体，与C57BL/6J回交后得到仔鼠，通过PCR初筛，Immt 杂合子通过5′RACE实验再次证明载体插在第三内含子，再结合PCR分段扩增测序，获知载体插入的具体位置，根据此来分别设计引物，一对与诱捕载体插入位置的基因退火，另一对与Immt基因退火，PCR的鉴定结果再进一步通过Southern blot确认，在mRNA水平验证其诱捕效率，结果证明E7.5-/-
天的Immt 纯合子，Immt转录终止在第三外显子，IMMT失去了后面大部分有活性的区域。
观察八月至12月龄Immt杂合子的步态，利用Morris水迷宫检测杂合子的学习与记忆能力，结果发现，部分缺失IMMT会导致其步态不稳，学习记忆能力下降，并且随着与C57BL/6J回交代数的增多，即遗传背景的纯化，出现上述症状的鼠龄提前。
附图说明
天的Immt 纯合子，Immt转录终止在第三外显子，IMMT失去了后面大部分有活性的区域。
观察八月至12月龄Immt杂合子的步态，利用Morris水迷宫检测杂合子的学习与记忆能力，结果发现，部分缺失IMMT会导致其步态不稳，学习记忆能力下降，并且随着与C57BL/6J回交代数的增多，即遗传背景的纯化，出现上述症状的鼠龄提前。
附图说明
[0018] 图1：显示5′RACE设计方案
[0019] 图1A显示了5′RACE第一轮PCR结果
[0020] 图1B显示了5′RACE第二轮PCR结果
[0021] 图1C、D、E、F测序结果显示Immt Gene-Trap载体是插入在Immt基因的第三内含子的第2834个碱基后
[0022] 图2：显示了Immt基因敲除鼠Southern印记鉴定引物的设计
[0023] 图3：显示了Immt基因敲除鼠在转录水平鉴定的引物设计。
[0024] 图4：显示Immt基因敲除鼠基因组PCR鉴定结果(图4A)，转录水平鉴定结果(图4B)，Southern印记鉴定结果(图4C)，及蛋白水平鉴定结果(图4D)。
[0025] 图5：显示Immt有表型的杂合子异常的步态。
[0026] 图6：显示Immt有表型的杂合子异常的游泳轨迹及与同窝野生型比较减退的学习记忆能力。
具体实施方式
[0027] 以下将结合附图，进一步说明本发明，通过参考下述的一些具体实施例可进一步理解本发明，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明做出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
[0028] 实施例1小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备及培养
[0029] 滋养层细胞培养液成分
[0031] 细胞冻存液：30％胎牛血清，63％DMEM，7％DMSO，现用现配并且预冷。
[0032] 上述所有试剂均购自美国GIBCO公司。
[0033] 小鼠原代胚胎成纤维细胞制备
[0034] 引颈处死妊娠13.5d的雌鼠(什么种类的小鼠？)。75％酒精喷湿消毒，在超净台打开腹腔，取出有胚胎的雌鼠子宫；在无菌PBS中分离胚胎，去除卵黄囊、羊膜和胎盘；将胎鼠移入另一装有无菌PBS的培养皿中，去除内脏、头；在无菌PBS中洗净，用无菌的眼科剪将胎鼠剪碎后移入15mL离心管中，加2mL PBS，1000rpm离心，2min，弃上清。
[0035] 加入5mL 0.25％胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，37℃消化15min后，加入适量滋养层细胞培养液终止反应，1000rpm离心，2min，弃上清。
[0036] 加入适量培养液，吹打成细胞悬液，转移到10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养。一般在第3天细胞长满培养皿，经传4代后，此细胞即原代小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)。
[0037] 小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备
[0038] 将丝裂霉素C(Roche公司)按0.1mg/ml的浓度添加到培养的MEF细胞中，37℃继续培养2～3h，MEF细胞停止增殖，此时即可用作ES细胞培养的滋养层。经丝裂霉素C处理得到的滋养层细胞也可冻存备用。
[0039] 实施例2ES细胞的培养
[0040] ES细胞培养液
[0041] DMEM高糖培养基，添加15％胎牛血清，1000u/ml的LIF，2mM的L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，lmM丙酮酸钠，1000×β-巯基乙醇。
[0042] ES细胞的复苏及传代培养
[0043] 本领域技术人员都可以直接从Wellcome Trust Sanger Institute的Gene Trap胚胎干细胞(ES)库中获得AW0256细胞株。购买网站http://mmrrc.compmed.ucdavis.edu/index.py？_action_＝baygen
[0044] 取出冻存的ES细胞，即胚胎干细胞AW0256株，将其迅速置于37℃水浴中，使细胞悬液尽快融化；将融化的细胞悬液吸到已预先加入5mL ES细胞培养液的无菌离心管中，吹打混匀，1000rpm，2min，弃上清。
[0045] 加入ES细胞培养液，吹打成细胞悬液，移入已预先铺好经实施例1得到滋养层细胞的100mm培养皿中，补加适量的培养液至总体积约为10mL，将培养皿放入37℃，5％CO2培养。
[0046] ES细胞的传代，吸去原培养液，加入10mL PBS洗涤2次。加入2mL 0.25％胰蛋白酶，37℃消化5min；加入5mL ES细胞培养液终止消化，用吸管轻轻吹打，移入无菌离心管中，1000rpm，2min，弃上清。
[0047] 加入ES细胞培养液，吹打成细胞悬液。按1∶3或1∶6的比例移入已预先铺好滋养层细胞的10cm培养皿中，补加适量的培养液至总体积约为10ml将培养皿放入37℃，5％CO2培养，每天更换新鲜的ES细胞培养液。
[0048] ES细胞的冻存
[0049] 在冻存前2～3h给ES细胞更换新鲜的培养液。按现有技术ES细胞传代培养的步骤将细胞进行消化洗涤后，用冻存液(预冷)悬浮细胞，使细胞充分分散，将其转移至冻存管中。快速移到保温材料内(厚消毒脱脂棉)，-80℃保存，24h后移到液氮中。
[0050] 囊胚注射
[0051] 生长在滋养层上的ES细胞，从一个ES细胞，迅速生长为一个小集落，在倒置显微镜下，ES细胞集落呈岛状或巢状，向四周生长，细胞集落与周围滋养层细胞存在明显界限，集落内部细胞之间连接致密，相差显微镜下细胞表面有折光较强的脂状小滴，而单个细胞体积较小，细胞核大。ES细胞生长迅速，且易分化，隔天培养后即进行囊胚注射。
[0052] Gene-Trap方法获得的是高通量基因突变ES细胞，故注射前一定要将待注射的突变ES细胞再鉴定，首先通过5’RACE来确定所用的细胞株是否是Immt突变。
[0053] 结果显示，在AW0256ES突变细胞系中，Gene-Trap载体是插入在Immt基因第三外显子后，形成携带有前三个外显子及β-geo的融合蛋白。而在进一步的基因组的PCR及测序结果显示，Gene-Trap载体是插入在Immt基因的第三内含子的第2834个碱基后，基因组PCR的结果如图1所示。
[0054] 实施例3供体囊胚的制备
[0055] 很多因素都可以影响囊胚的数量，如小鼠的品系、小鼠的健康状况、适应性、超排卵和实验时所处的季节等等。本发明采用3～5周龄(12g～14g)，C57BL/6J的雌鼠。
[0056] 超排卵供体小鼠的准备：
[0057] 挑选12～14g的C57BL/6J的不动情雌鼠，在第一天下午，腹腔注射5IU的孕马血清(PMS)。距前次注射PMS的时间不超过48h，腹腔注射5IU的人绒膜促性腺激素(HCG)，并将雌鼠转移至有种雄鼠的笼中交配。
[0058] 第四天9:00前检查有阴栓者为供体雌鼠，单笼放置，此天记作0.5天。同天下午再挑选26-33g左右的昆明白动情雌鼠与输精管结扎的雄鼠交配。
[0059] 第五天9:00前检查有阴栓者为受体雌鼠，单笼放置。
[0060] 第七天，即在交配后的第四天，收集供体雌鼠子宫中的囊胚。
[0061] 囊胚的收集和培养
[0062] 引颈处死3.5dpc的超排卵供体C57BL/6J雌鼠，70％的酒精棉球消毒腹部，在腹中线处做一横向切口。
[0063] 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。
[0064] 将肠组织向上提到翻转的腹膜上，找到子宫，用剪刀将左右两侧子宫在输卵管与子宫角的衔接剪下，然后小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。
[0065] 再用剪刀分别在子宫头与子宫尾剪去输卵管及子宫角部分，使得两根单独的子宫通畅。
[0066] 用5ml的一次性注射器吸取足量的M2，套上5号针头，在体视解剖镜下插入子宫腔，推动注射针栓，正反方向冲洗子宫腔，子宫在冲洗时会轻度膨胀，小鼠胚胎将迅速沉至培养皿底部。
[0067] 取一个35mm的培养皿，滴上数滴Brinster’s BMOC-3培养液(Sigma)，每滴约200ul，上面覆盖上矿物油(Sigma)。
[0069] 囊胚注射操作步骤
[0070] 将持卵管、注射针的针管和操作平皿充满石蜡油。用显微镜的微调将其调至相同的聚焦平面。
[0071] 注射用的ES细胞应在数天前解冻，注射当天早晨换上新鲜的ES培养液，1-2小时后胰酶处理，做成单细胞悬液保存在Brinster’s BMOC-3培养液中。
[0072] 从35mm培养皿中挑选约10个形态饱满、边界清晰、囊胚腔较大的囊胚转移至安装好持卵管和注射针的注射槽内，用移卵管吸取少量的ES细胞放入其中。在10倍镜下用注射针吸取12～15枚小而圆的ES细胞。
[0073] 40倍镜下用持卵管吸附囊胚的一侧，将注射针调整至对准囊胚的中心并使他们处于同一水平面。
[0074] 转动注射针的操纵杆，使注射针快速刺破囊胚的壁，进入囊胚腔，推动注射泵使ES细胞(12-15个)顺序进入囊胚腔，小心拔出注射针。
[0075] 将注射过的囊胚放置在操作视野的另一侧，继续下一个囊胚的注射。
[0076] 旋至10倍镜下用移卵管吸取注射后的囊胚到大培养皿中，置于加了Brinster’sBMOC-3(Sigma)培养液滴里培养，做好标记，以备移植。
[0077] 实施例4胚胎的子宫移植
[0078] 将移卵管接上口控管，在体视解剖镜下依次小心吸入培养液、气泡、培养液、气泡、注射后的囊胚、气泡、少量培养液。
[0079] 麻醉受体雌鼠，用75％酒精消毒受体鼠背部，在右侧靠近第一腰锥的部位做一个1cm的横向切口。向两侧拉展直至可透过腹膜看见右侧卵巢及其脂肪垫。在腹膜上用尖镊撕一个3mm的小口。
[0080] 左手夹住脂肪垫向外拉出，子宫随之可见。用小号止血钳夹住少许脂肪垫稍作固定。
[0081] 左手持尖镊夹住在子宫和输卵管接口处附近2mm远的子宫壁，右手持一个4号注射器针头和移卵管。在解剖显微镜下.针头在紧挨尖镊处避开血管扎一个小孔，将移卵管的前端小心插入小孔中。将实施例3得到的胚胎缓慢吹入子宫中。
[0082] 子宫和肠系膜送回腹腔，封闭切口。如果移植手术成功，17天后可有幼鼠出生，数天后可从毛色上判断是否获得高嵌合度的嵌合体小鼠。其中获得进入种系的嵌合体与C57BL/6J交配，获得Immt杂合子。
[0083] 敲除鼠基因型(Genotype)鉴定
[0084] 实施例5利用PCR鉴定敲除鼠
[0085] 剪下经实施例4得到的Immt杂合子小鼠的耳(约3mm2)或脚趾于鼠耳消化液中，55℃消化至少4小时，煮沸5-10分钟，室温12，000rpm离心5分钟，上清即可作为PCR模板。
[0086] 鼠耳消化液成分：KCl 500mM，Tris-HCl 100mM，明胶0.1mg/ml，NP-400.45％，Tween200.45％，蛋白酶K(临用时加入)0.5mg/ml。
[0087] 用于鉴定Lac Z的引物：S：AAGCGGTGAAGTGCCTCTGG；
[0088] A：CGTTAGGGTCAATGCGGGTC
[0089] 片段大小为：422bp。
[0090] 反应条件：94℃5分钟，(94℃20秒，53℃20秒，72℃30秒)30循环，72℃10分钟。结果详见图4A。
[0091] 实施例6利用Southern杂交鉴定敲除鼠
[0092] 从Immt杂合子鼠组织中提取DNA
[0093] 在1.5ml Eppendorf(EP)管中，加入530μl鼠尾抽提缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.4，10mM NaCl，25mM EDTA)、70μl 10％SDS、40μl蛋白酶K(10mg/ml)，混匀。
[0094] 取实施例4得到的小鼠，剪取～2cm长鼠尾，以微火焰去毛，放入上述1中的EP管。鼠尾创口用烧烫的大镊子止血。
[0095] 以消毒过的手术剪剪碎鼠尾(15～30’)，至溶液浑浊、无明显大的组织块，55℃保温过夜，不时轻轻颠倒混匀。消化完全后，加入70μl 5MNaCl。
[0096] 加入20ul RNase A(10mg/ml)，37℃1h。冷却至室温，加等体积Tris饱和酚(pH8.0)，缓慢来回颠倒离心管10min形成乳浊液。12000～13000rpm，5～10min。
[0097] 将1ml枪头剪去枪尖，用火烤圆。用此枪头将粘稠的水相移至一洁净的1.5EP管中。再用酚抽提一次。
[0098] 用酚∶氯仿∶异丙醇(25∶24∶1)抽提2次。
[0099] 用氯仿抽提一次。水相不太粘稠后可用200ul枪头吸取，同样需剪去枪尖，用火烤圆。
[0100] 沉淀DNA：加1/20～1/10体积3M NaAc(pH5.2)，混匀。加2倍体积无水乙醇(或等体积异丙醇，如用异丙醇沉淀则不加NaAc)，缓慢来回颠倒离心管混匀，可见白色丝状沉淀生成。
[0101] 将200ul枪头剪去枪尖，用火烤圆。用此枪头将沉淀挑出或吸出，移入新管。70％乙醇洗涤沉淀两次：将沉淀悬起，缓慢来回颠倒离心管，12,000～13,000rpm，5～10min。
[0102] 用真空泵吸去液体，尽可能彻底除去70％乙醇，室温晾干至可见的痕量乙醇挥发殆尽。不要使DNA沉淀完全干燥，否则极难溶解。
[0103] 加100～400ul TE(pH8.0)充分溶解DNA：50～55℃水浴过夜。不时摇晃。溶液粘稠，成透明胶体状。
[0104] 测OD：测前55℃温育，稀释40倍，A260/A280应＞1.75，否则表明制备物中存留有显著的蛋白质，影响酶切；如太高，＞2.0表明制备物中存留有较多的RNA。计算DNA浓度，可稀释为1ug/ul。
[0106] 取15μg上述提取的细胞基因组DNA，在200μL反应体系中用150U EcoRI和Bgl II酶切24h(杂交目的片段为2.1kb和5kb)。酶切体系的配制要点是充分混匀。取1.5μL在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，观察是否完全酶解。如仍有主带，再加入30U酶切4h。
[0107] 向酶解样品中加入等体积的酚：氯仿，混匀10min后，12,000r/min离心10min，将上清转移到一个新的1.5mlEP管中，加入1/10体积的3mol/L NaAC，两倍体积的乙醇，混匀后-20℃放置2h，12,000r/min，4℃离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤一次，12,000r/min4℃离心10min，弃上清。
[0108] 晾干后，加入15μL TE溶解。取1μL稀释到80μL测量OD260nm值及OD280nm值，计算DNA浓度。取10μg酶切后的细胞基因组DNA，在1％琼脂糖凝胶上于1V/cm条件下电泳，待溴酚兰泳动至距点样孔约12cm处，停止电泳。电泳完毕，EB染色后紫外灯下观察电泳结果，呈现均一的弥散状，拍照后，估计条带所在的位置，切除多余的边缘。凝胶经变性、中和。将胶块倒置于水平玻璃上，胶下有纸桥与20×SSC相连，胶上依次覆盖有尼龙膜、Whatman 3M滤纸、普通新华滤纸或吸水纸及500g重物。室温下转移12～24h。
[0109] 转移完毕，检查硝酸纤维素膜上及胶上EB染料分布情况，判断转移效率。用滤纸吸去多余水分，室温晾干1h后进行紫外交联。将转移了DNA的尼龙膜在6×SSC中润湿后，放入杂交管中，加入适量的快速杂交液，42℃预杂交40min。在等待预杂交的过程中标记探针。
[0111] 在微量离心管中配置下列反应液，95℃加热3min后迅速置于冰中冷却，放置5min。
[0112]
[0113] 加入10×缓冲液，dNTP mixture各2.5μL，由于标记的dCTP 5μL.[0114] 加入1μL Exo-free Klenow Fragment，37℃反应10min。
[0115] 65℃加热5min使酶失活，95℃加热3min后迅速置于冰中冷却，放置5min。
[0116] 取适量的反应液作为探针。
[0117] 探针模板对应于Immt基因组DNA的第三内含子中，用PCR产物切胶回收的方法得到。PCR引物序列如下：
[0118] S：CCTAACTAGGCAGTTCATTCTCATAAG
[0119] A：GGTGGGAAGGGAAGCAAATC
[0120] 预杂交结束后加入标记好的探针，继续杂交1.5～2h。杂交结束后洗膜，放射自显影观察结果。探针设计及Southern引物设计见图2所示。Southern结果详见图4(C)[0121] 实施例7在转录水平鉴定Immt基因敲除鼠
[0122] 提取总RNA
[0123] 采用TRIZOL法提取胚胎组织的总RNA，具体方法如下：
[0124] 胚胎组织置于匀浆器中，加入TRIZOL 1mL，放置冰上匀浆，待样品充分破碎并溶于TRIZOL中，室温放置5min，用移液器将样品小心吸入1.5mLEP管中。加入200μL氯仿，用手猛烈震荡15s，室温静置2～3min，4℃15,000r/min离心15min，此时样品分为三层：下层为红色的酚-氯仿层，中层呈云雾状，上层为含RNA的透明水相。
[0125] 小心地将上清液转移至新的1.5mLEp管中，加入500μL异丙醇，此时可见管内有絮状RNA沉淀，摇匀，室温孵育10min，4℃15,000r/min离心10min，此时可见离心管底部和侧壁出现白色或浅黄色RNA沉淀。
[0126] 立即弃上清，加入75％乙醇1mL，涡旋震荡RNA沉淀，4℃10,000r/min离心10min。
[0128] RT-PCR
[0130] (1)RNA 2μg，
[0131] (2)Random Primer(100μmol/L)：1μl，
[0132] (3)dNTP(10mM)4ul，
[0133] (4)DEPC处理水到17.25μL。
[0134] 70℃孵育5min后立即放于冰上，使RNA和引物充分变性并解除RNA的二级结构。冰上操作依次加入：
[0135] (1)10×RT Buffer：2μl，
[0136] (2)RNase inhibitor：0.5ul，
[0137] (3)M-MLMV逆转录酶：0.25μl。
[0138] 反转录体系总体积20μl。轻轻摇匀瞬时离心后，42℃反应1h，94℃反应5min，反应结束后取0.5μl cDNA产物进行PCR扩增，其余于-20℃冰箱保存备用。转录水平鉴定的引物设计见图3所示。
[0139] 5′-RACE设计方案见图1所示
[0140] 利用特异性引物对鼠肝脏组织RNA进行反转录，获得cDNA。RNase H 37℃30min，去除冗余RNA。
[0141] 乙醇沉淀回收cDNA产物，24uL ddH2O重新溶解。
[0142] cDNA自环化：
[0143] 按NEB公司的RNA连接酶说明书配制，在溶有cDNA的管中依次加人：
[0144] (1)10×RNA(ssDNA)Ligation Buffer：4uL
[0145] (2)RNA连接酶：1uL
[0146] (3)40％PEG#6000：20uL
[0147] 40uL体系，37℃反应30m。65℃灭活连接酶，-20℃保存以备模板使用。
[0148] 第一轮PCR：按照Takara说明书配制，在PCR反应管中依次加入：
[0149] 模板：1uL
[0150] 10×LA PCR buffer：2ul
[0151] dNTP：1uL
[0152] 引物：各0.5uL
[0153] LA Taq酶：0.5uL
[0154] H2O：14.5uL
[0155] 反应条件：：94℃5min，(94℃20s，71℃20s，72℃2min)25循环，72℃10min。
[0156] 第二轮PCR，配制条件同前，选用第一轮PCR产物(结果见图1A)作为模板。
[0157] 结果见图1B
[0158] TA克隆后送交测序。结果见图1C、图1D、图1E、图1F
[0159] 实施例8在蛋白表达水平鉴定Immt敲除鼠
[0160] 蛋白提取缓冲液RIPA的成分
[0161] Tris-HCl：50mM，pH7.4，NP-40：1 ％，Na-deoxycholate：0.25 ％，NaCl：150mM，EDTA：1mM，PMSF：1mM，Aprotinin，leupeptin，pepstatin：1microgram/ml each，Na3VO4：1mM，NaF：1mM。其中PMSF、Aprotinin、leupeptin、Na3VO4和NaF在临用时加入。
[0162] 用RIPA缓冲液提取组织蛋白
[0163] 按组织块8～10倍体积加入裂解液，用玻璃匀浆器充分匀浆，置于冰上30-60min。颠倒混10秒。4℃12,000rpm离心30min。取上清入一新的Ep管。根据OD280或者BCA比色法定量，分装，置于-80℃保存(短期可保存-20℃)。
[0164] Western blot
[0165] 变性PAGE胶电泳
[0166] 灌胶和电泳
[0167] 分别配制12％的分离胶和5％积层胶，灌胶，插梳子，置30-45min，拔梳子，冲洗未聚合的丙烯酰胺，把凝胶固定于电泳装置，上下槽加入1×电泳缓冲液，排出凝胶底部两玻板间的气泡。
[0168] 样品加入5×上样缓冲液，和预染的蛋白Marker在100℃变性5min。甩离，上样。最外侧加等量样品缓冲液，避免边缘效应。上槽加满电泳缓冲液，正负极正确连接，[0169] 60v，30min左右，染料至积层胶底部，改120v，2h左右，至溴酚蓝到达凝胶底部为止。
[0170] 转膜
[0171] 在电泳快结束之前裁好转膜用的滤纸，PVDF膜，配制转膜缓冲液(现用现配)。膜用甲醇浸润10min，再用缓冲液浸泡。
[0172] 在一个托盘中，倒入转膜缓冲液，平放转膜夹子，在阳极放一张海绵垫片。在海绵垫片上放置2-3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，精确对齐在上面放硝酸纤维素膜，上述每一步都用玻璃移液管作滚筒以挤出所有气泡。电泳结束后，关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。卸下玻璃板，撬开一面，使凝胶暴露出来。把凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下，然后准确平放于硝酸纤维素滤膜上。把凝胶左下角置于硝酸纤维素滤膜的标记角上，戴手套排除所有气泡。切记：为避免发生短路，不要切去凝胶的左下角。丙烯酰胺凝胶放在硝酸纤维素滤膜上，要保证精确对齐，而且在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间并不留有气泡。(如果先放置凝胶，应放于阴极侧)把最后2-3张滤纸及海绵垫片放在凝胶上方，同样须确保精确对齐并不留气泡。
[0173] 连接电源。根据凝胶面积按300mA接通电流，电转移0.5～1.0h。
[0174] 断开电源并拔下插头，从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层。将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，以便检查蛋白质转移是否完全。在膜上剪口作好正面的标记。
[0175] 免疫反应
[0176] 将转好的膜置于5％牛奶(PBST配制)室温振摇封闭1-3h或过夜，PBST洗膜10min，3次。加一抗4℃孵育过夜，或室温4h。PBST洗膜10min，3次。加二抗37℃孵育1h，PBST洗膜10min，6-8次。
[0177] ECL反应
[0178] 在一个铝箔包裹的EP管中，等体积混合ECL反应试剂盒A，B液。将上述反应液0.3ml缓慢流过膜表面，重复数次，整张膜均匀流遍。用一张保鲜膜包裹贴于压片盒中。暗室中进行X光片曝光，洗片显影。
[0179] Immt+/-杂合子和Immt-/-纯合子基因型的鉴定
[0180] 得到了进入种系的嵌合体，发明人分别进行Genomic PCR、RT-PCR&LacZ染色、+/- -/-Southern Blot和Western Blot实验对Immt 鼠和Immt 胚胎从DNA、RNA、蛋白水平来进行基因型鉴定。
[0181] 首先根据载体插入的位置，设计两对引物，以Immt-/-、Immt+/-或是Immt+/+胚胎基因组DNA为模板进行Genomic PCR。
[0182] 根据打靶载体插入位置设计Southern Blot探针如图4所示，由探针设计位置可+/-知，基因组DNA经EcoRI和BglII酶切后，Immt 经Southern Blot得到5.1kb和2.1kb两-/- +/+
条带，Immt 只有2.1kb一条带，而Immt 只有5.1kb一条带。Southern Blot结果进一步证实打靶载体的插入。
条带，Immt 只有2.1kb一条带，而Immt 只有5.1kb一条带。Southern Blot结果进一步证实打靶载体的插入。
[0183] 另外以E7.5天Immt-/-、Immt+/-和Immt+/+胚胎cDNA为模板进行RT-PCR，结果见图-/-4B，显示在RNA水平，Immt 胚胎没有第三外显子后的转录本。
[0184] 本发明人取Immt+/-小鼠的骨骼肌进行Western Blot，结果显示，与同窝野生型比+/-较Immt 小鼠IMMT蛋白有效降低，结果见图4D。
[0185] 试剂来源
[0186] Random Primer DNA Labeling Kit Ver.随机引物标记试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒及PCR所用试剂为TaKaRa公司产品；T easy载体为Promega产品，丙烯酰胺及尿素为Serva公司产品；Hybond-N+尼龙膜为Amersham公司产品；快速杂交液为Clontech公司产品；Sephorose CL-4B为Pharamacia公司产品；PVDF膜购自Millipore公司，PMS、HCG、HEPES、BSA、购自Sigma公司，部分PMS、HCG为长春解放军农牧大学产品；其它试剂均为分析纯试剂。
[0187] 实施例9敲除鼠传代饲养
[0188] 小鼠饲养于SPF级动物房，清洁饮水，自由取食。环境采用十二小时明暗循环，早六点到晚六点照明，晚六点到次日早六点无照明。所有动物实验都按照中国医学科学院实验动物管理条例进行。鉴定得到的敲除鼠与C57BL/6J鼠(购自中国军事医学科学院动物中心)回交，回交7代，并且发现随着回交代数的增加，C57BL/6J背景的纯化，出现神经退行性变的鼠龄提前。得到的传代鼠用PCR法和Lac Z酶显色法鉴定，3周后子鼠断奶，雌雄分笼饲养，每笼不超过5只。小鼠专用饲料由中国军事医学科学院动物中心提供。
[0189] 实施例10敲除鼠行为学鉴定
[0190] 步态观察
[0191] 用水溶性无毒颜料涂抹四只爪底，蓝色涂双后爪，红色涂双前爪，自由行走留下的印记呈示出小鼠的步态。从图5可以看出与同窝野生型小鼠比较，经实施例4得到的Immt杂合子(小鼠)步态明显不稳。
[0192] Morris水迷宫由圆形水池、自动摄像和分析系统组成，图像自动采集和处理系统主要由摄像机、计算机和图像监视器组成，动物入水后启动监测装置，记录动物运动轨迹，实验完毕自动分析报告相关参数。
[0193] 为排除实验设计人员对小鼠的心理因素的影响，所有行为学观察由相同实验员完成，所有行为学指标通过摄像头由电脑自动记录Morris水迷宫学习记忆能力进行评估，隐蔽平台实验：主要测试动物的长时记忆能力，反向实验：主要测试动物的再学习能力，可视平台实验：排除感觉/视觉及运动功能方面的差异对实验造成的影响，以保证实验结果的可靠性，检测指标：①定位航行实验：利用Morris水迷宫对小鼠进行行为学训练和测试。水迷宫装置为一圆形水池(水池壁为黑色)，直径120cm，水深30cm，加入食用奶粉使水不透明，水温保持在22℃左右，将迷宫均分为4个象限，一黑色圆形平台(直径9cm)位于第二象限水面下1～2cm左右。测试时室内保持安静，室温恒定，室内环境包括物品的放置和光线保持一致。正式测试前一天将小鼠放入池中自由游泳90s，不放置平台。实验训练阶段为6d，每只小鼠每天接受3次训练，每次训练180s，两次训练间隔为30s，测试时将小鼠随机从
3个不同入水点(西北、东北、东南象限中点)面向池壁放入。每相邻2d的入水顺序不同。
如果小鼠在180s内上台，则允许其在平台停留30s；如果动物在180s内不能发现平台，则将其牵引至平台并使其停留30s(其潜伏期定为180s)。每日3次成绩的平均值为当日成绩，用摄像头跟踪并记录小鼠在水池中的游泳轨迹，并将数据输入计算机中计算小鼠达到平台的潜伏期及游泳距离。②空间搜索实验：用于测量学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力，实验5d撤除平台。分两次将小鼠从距离原平台位置(第二象限)较远的两个象限放入水中，记录并分析小鼠在第二象限内的时间百分比和游泳距离百分比。潜伏期：即小鼠找到站台所需的时间；游速以游程除以潜伏期时间表示，间接反映小鼠的肢体活动功能。
3个不同入水点(西北、东北、东南象限中点)面向池壁放入。每相邻2d的入水顺序不同。
如果小鼠在180s内上台，则允许其在平台停留30s；如果动物在180s内不能发现平台，则将其牵引至平台并使其停留30s(其潜伏期定为180s)。每日3次成绩的平均值为当日成绩，用摄像头跟踪并记录小鼠在水池中的游泳轨迹，并将数据输入计算机中计算小鼠达到平台的潜伏期及游泳距离。②空间搜索实验：用于测量学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力，实验5d撤除平台。分两次将小鼠从距离原平台位置(第二象限)较远的两个象限放入水中，记录并分析小鼠在第二象限内的时间百分比和游泳距离百分比。潜伏期：即小鼠找到站台所需的时间；游速以游程除以潜伏期时间表示，间接反映小鼠的肢体活动功能。
[0194] 图6呈示Immt同窝野生型和杂合子在Morris水迷宫中开始学习第一天，第三天，第七天的水内运动轨迹，从图中可以看出Immt杂合子异常的运动轨迹，野生型从第一天的茫然，第三天的目标汇聚，第七天下水立即找到潜台，而Immt杂合子从第一天的茫然，第三天的记错目标汇聚，第七天仍是错误目标的汇聚，但180s内仍没有找到潜台目标。
[0195] 可见，Immt基因敲除鼠能够作为神经退行性疾病发病研究的模型鼠。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于在体基因治疗的基因编辑组合物或试剂盒 | 2020-05-13 | 6 |
| 治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法 | 2021-02-04 | 6 |
| 一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法 | 2020-10-17 | 5 |
| 细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒 | 2020-08-12 | 1 |
| PCDH17基因的应用 | 2020-07-30 | 6 |
| 基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法 | 2021-09-22 | 0 |
| 一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法 | 2021-10-18 | 0 |
| 一种CpG寡核苷酸及其应用 | 2020-08-28 | 2 |
| 一种端粒酶启动基因表达方法及其应用 | 2021-11-22 | 5 |
| 一种靶向survivin基因的siRNA的结构及其抗肿瘤用途 | 2022-11-08 | 3 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈