早老综合征所致ALT肿瘤的特有p53突变蛋白-p53N236S及其应用
阅读：3发布：2022-02-02
专利汇可以提供早老综合征所致ALT肿瘤的特有p53突变蛋白-p53N236S及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 肿瘤 抑制基因p53的点突变导致的突变基因p53A1243G，其编码的蛋白p53N236S及其功能，以及其在肿瘤诊断中的应用。首次揭示了p53N236S在早老综合征导致的ALT肿瘤中的重要功能。以p53N236S为靶分子的肿瘤诊断、抗肿瘤药物的筛选及肿瘤 治疗 策略，对于防治衰老导致的肿瘤发生有重要意义。，下面是早老综合征所致ALT肿瘤的特有p53突变蛋白-p53N236S及其应用专利的具体信息内容。
1.早老综合征所致ALT肿瘤的特有的小鼠p53基因突变A1243G，具有图3所示的序列。
2.早老综合征所致ALT肿瘤的特有的小鼠p53基因突变A1243G编码的p53突变蛋白p53N236S，具有图2C所示的三维空间结构，突变蛋白p53N236S丧失了转录激活p21、Cyclin G、PUMA及Bax的能力。
3.突变的p53基因A1243G在制备诊断肿瘤药物中的应用。
4.突变的p53基因A1243G在制备治疗肿瘤药物中的应用。
5.小鼠p53突变蛋白p53N236S在制备诊断和治疗肿瘤药物中的应用。
6.小鼠p53突变蛋白p53N236S在制备以p53N236S为靶分子的肿瘤诊断药物中的应用。
7.以建立突变的p53基因A1243G为目的的小鼠体细胞在制备筛选诊断和治疗肿瘤的药物中的应用。
技术领域
本发明具体地，涉及一种肿瘤抑制基因p53的点突变导致的突变蛋白p53N236S及其功能，该突变蛋白功能的发现可应用于肿瘤诊断、抗肿瘤药物的筛选及肿瘤治疗策略的制定，属于生物技术领域。
背景技术
人类的早老综合症(Werner Syndrome，WS)是一种常染色体隐性突变遗传病，表现为明显的提早衰老(premature aging)及寿命缩短，平均存活年龄只有46-48岁。常见病症还包括软组织骨肉瘤(soft tissue sarcoma)、早发性动脉粥样硬化、出血性心脏病、骨质疏松、白内障、二型糖尿病等(Epstein，Martin et al.1966)。Salk等分离出WS病人的成纤维母细胞，发现这些细胞的染色体极其不稳定，呈现所说的马赛克染色体(translocation mosaicism)(Salk，Au et al.1981)。进一步的研究发现，WS是由于Wrn基因突变引起的。Wrn基因编码的WRN蛋白属于DNA解旋酶RecQ家族，参与DNA复制、重组及DNA损伤修复，因此在维持染色体的稳定性方面起着关键作用。在人类疾病中，RecQ家族基因突变导致肿瘤易感性(cancer predisposition)，如Bloom氏综合症(Bloom’s Syndrome)。很重要的是，只有WS表现出明显的提早衰老的症状。因此，WS是人类研究人类衰老与染色体不稳定性、肿瘤发生的相关性的很好的模型。
为了建立早老综合症的小鼠模型，两个不同的实验室的研究者试图在小鼠中敲除Wrn基因。然而，单独敲除Wrn基因的小鼠(Wrn-/-)并不表现早衰的症状(Lebeland Leder 1998；Lombard，Beard et al.2000)。进一步的研究发现，WS病人的成纤维母细胞的端粒缩短(telomere erosion)较快，过量表达端粒酶的蛋白组分TERT可以缓解端粒缩短，并且缓解细胞的衰老(senescence)(Wyllie，Jones et al.2000)。这一发现提示了端粒缩短引发的端粒功能异常是导致WS病人早老病症的关键。同时，这一发现也提示了单独敲除Wrn基因的小鼠不表现早衰症状的原因。人的体细胞端粒酶活性低于检测水平，同时，人的体细胞端粒长度也较短(12-20kb)。与人类不同，小鼠体细胞仍然保持端粒酶的活性，且端粒长度在15-80kb，不会导致端粒功能异常，因而Wrn-/-小鼠不表现出早衰的症状。基于这一假说，Dr.SandyChang在世界上首次成功地建立了WS的小鼠模型。该模型双重基因敲除了端粒酶的RNA组分mTerc与Wrn基因(mTR-/-Wrn-/-)，忠实地再现了人类早老综合症的症状，如端粒快速缩短，毛发变白、脱落，白内障、二型糖尿病、骨质疏松，缺血性心脏病，骨肉瘤等等。由于小鼠体细胞端粒长度在15-80kb左右，敲除端粒酶活性的小鼠仍然需要繁殖到第4-6代(G4-G6)才表现出早老综合症的症状，进一步证实了端粒功能异常是导致早老综合症的关键。在这一模型中，端粒酶基因被敲除，所以该模型产生的肿瘤是ALT(Alternative Lengthening of Telomeres)肿瘤(Chang，Multani et al.2004)。
由于遗传背景复杂，人类ALT肿瘤发生机理与信号传导通路尚不清楚。目前只知道与ALT肿瘤相关的特征有端粒长度分布不均一(hetergenous telomere length)(Bryan，Englezou et al.1995)，形成ALT相关的PML小体(promyelocytic leukemiabodies)(Yeager，Neumann et al.1999)，端粒的同源重组增加，表现为端粒姐妹染色体交换(telomere sister chromosome exchange，T-SCE)增加(Londono-Vallejo，Der-Sarkissian et al.2004；Laud，Multani et al.2005)，端粒环的形成(telomeric circle formation)等等(Wang，Smogorzewska et al.2004)。ALT肿瘤的研究对于了解衰老与肿瘤的发生的辩证关系极为重要。同时，在大量采用的针对端粒酶的肿瘤治疗策略中，肿瘤细胞会被迫选择激活ALT，以求保持其生长。因此，研究ALT肿瘤的发生机制，对于协同针对端粒酶的肿瘤治疗也极为重要。
从1982年首次被发现以来，p53是研究者一直关注的非常经典的抑癌基因，p53新的重要功能不断被发现(Reich and Levine 1982；Lane 1984；Hu，Feng et al.2007；Ventura，Kirsch et al.2007；Xue，Zender et al.2007)。p53的各种点突变使其丧失了抑制肿瘤发生的功能(Nigro，Baker et al.1989)。近来研究发现，p53的各种点突变导致的突变蛋白除了丧失野生型p53的功能外，还获得了新的功能，这些新的功能可能促进肿瘤的发生(Lang，Iwakuma et al.2004；Olive，Tuveson et al.2004；Johnson，Hammond et al.2005)。
基于p53的各种点突变在肿瘤发生中的重要作用，世界卫生组织的下属机构IARC(The International Agency for Research on Cancer)专门建立了p53基因突变数据库(http://www-p53.iarc.fr/)来收集各种p53基因突变及其相关研究数据和流行病学信息(Petitjean，Mathe et al.2007)。对人类p53突变热点的分析表明，大部分突变发生在p53蛋白的DNA结合区域，其中，p53N239S是突变热点之一(Walker，Bond et al.1999)。然而，对p53N239S突变蛋白的功能研究甚少，多数为在酵母中进行的众多p53突变点的功能预测(Robert，Michel et al.2000；Kato，Han et al.2003；Dearth，Qian et al.2007)。
发明内容：
本发明的目的在于提供p53N236S突变蛋白的新结构与新功能，p53N236S突变在肿瘤诊断与治疗的应用，进一步揭示抗肿瘤药物筛选及肿瘤治疗策略。
本发明的上述目的是用下述的技术方案达到的：
早老综合征所致ALT肿瘤的特有的小鼠p53基因突变A1243G，具有图3所示的序列。
早老综合征所致ALT肿瘤的特有的小鼠p53基因突变A1243G编码的p53突变蛋白p53N236S，具有图2C所示的三维空间结构，突变蛋白p53N236S丧失了转录激活p21、Cyclin G、PUMA及Bax的能力。
突变的p53基因A1243G在制备诊断肿瘤药物中的应用。如图1、2所示，突变的p53基因A1243G只在肿瘤中被检出。
突变的p53基因A1243G在制备治疗肿瘤药物中的应用。如图5所示，突变的p53基因A1243G可以协同癌基因Ras的作用，加速肿瘤发生；如图6所示，突变的p53基因A1243G可以协同Ras负显性抑制野生型p53的功能，直接导致早老综合症的ALT肿瘤发生；抑制突变的p53基因A1243G的功能可直接抑制肿瘤的发生。
小鼠p53突变蛋白p53N236S在制备诊断和治疗肿瘤药物中的应用。
小鼠p53突变蛋白p53N236S在制备以p53N236S为靶分子的肿瘤诊断药物中的应用。
以建立突变的p53基因A1243G为目的的小鼠体细胞在制备筛选诊断和治疗肿瘤的药物中的应用。
附图说明：
图1细胞逃逸衰老产生的两类永生化细胞株：右边三株细胞在小鼠体内可以产生ALT肿瘤，左边四株细胞在小鼠体内不能产生ALT肿瘤。
图2在产生ALT肿瘤的细胞中发现的p53点突变及其结构与功能的改变。2A产生ALT肿瘤的永生化细胞株中p53N236S突变导致p21表达水平下调；2B对产生ALT肿瘤的永生化细胞中的p53基因cDNA序列测定表明其发生了p53A1243G点突变，相应其编码的蛋白突变为p53N236S；2C p53A1243G点突变导致突变蛋白p53N236S的空间构象明显改变：左：突变氨基酸N236S对临近氨基酸的影响；右：p53N236S突变蛋白与野生型p53蛋白DNA结合区空间构象的比较。
图3突变的p53cDNA及蛋白序列与NCBI收录的野生型p53cDNA及蛋白序列比较。Query为突变序列，Sbjct为野生型序列。
图4p53N236S丧失了转录调控激活p21，cyclin G，PUMA，Bax的功能。
图5p53N236S与Ras协同作用，快速产生巨大肿瘤。黑色箭头所指为皮下植入细胞后，肿瘤生长的位置，左图为p53N236S与Ras协同作用下产生的巨大肿瘤；中图为没有p53N236S，仅有Ras产生的肿瘤；右图为手术剥离后两种肿瘤的比较。
图6p53N236S与Ras协同作用可负显性抑制野生型p53的作用而形成ALT肿瘤。6A黑色箭头所指为皮下植入p53N236S与Ras协同作用的细胞后导致肿瘤；白色箭头所指为皮下植入没有p53N236S、仅有Ras的细胞后，在野生型p53的作用下不能产生肿瘤。6B上述产生的肿瘤经Western blotting鉴定其中Ras与p53N236S的表达情况；6C上述产生的肿瘤经TRF-Southern杂交鉴定其ALT肿瘤特性。
具体实施方式：
实施例1：
仅在可产生ALT肿瘤的细胞中检测到p53A1243G突变，表明该突变与ALT肿瘤发生密切相关。
从早老综合征G5mTR-/-Wrn-/-小鼠胚胎培养出的成纤维母细胞(mouse embryofibroblast，MEF)也表现出WS病人的成纤维母细胞的特征，体外培养的细胞很快进入衰老。然而，这种衰老细胞易于逃离衰老，形成永生化细胞克隆，部分永生化细胞克隆可以在重症免疫缺陷小鼠(SCID mouse)体内形成肿瘤(Laud，Multani etal.2005)。
G5mTR-/-Wrn-/-小鼠为ALT肿瘤研究提供了一个遗传背景清楚的模型。为了研究WS细胞从衰老，到逃逸衰老而永生化，到ALT肿瘤化的进程中分子调控机理，本发明比较研究了三株产生ALT肿瘤(ALT tumorigenic)的永生化细胞(3B-1，3B-2，9B-1)与四株不产生ALT肿瘤(Non-ALT tumorigenic)的永生化细胞(7A-1，7A-2，7A-3，6B-1)(见附图1)。细胞株在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为3％O2，5％CO2，37℃。用于Western blotting的抗体有：phospho-ATM(Ser1981)(1∶1000，Cell Signaling，MA)，Chk2(1∶500，BD TransductionLaboratories，CA)，cMyc(9E10)(1∶500，Santa Cruz，CA)，p16INK4a(M-156)(1∶500，Santa Cruz，CA)，p21(F-5)(1∶500，Santa Cruz，CA)，p53Ab-1(clonePAb240)(1∶250，Neomarker，CA)，phospho-p53(Ser15)(1∶500，Cell Signaling，MA)，γ-tubulin(1∶5000，Sigma，MO).
Western blotting检测发现，在所有的产生ALT肿瘤的永生化细胞株(3B-1，3B-2，9B-1)中，p53的表达水平异常增高，相反，p21表达异常下调，从而导致细胞的ALT肿瘤发生(请见附图2A，突变蛋白p53N236S的过量表达与p21的表达下调)。异常增高的p53与降低的p21表达水平同时提示了此处的p53发生了突变。
为进行RT-PCR和p53cDNA序列测定，本发明使用RNeasy试剂盒(Qiagen，CA)抽提永生化细胞或肿瘤细胞RNA，随后用AMV first-strand cDNA合成试剂盒(Invitrogen，CA)合成cDNA。以此cDNA为模板，使用特异引物扩增p53cDNA并克隆到TA载体(Invitrogen，CA)，测序检查p53序列。每株细胞至少测定3个不同的p53cDNA克隆。
RT-PCR及cDNA测序结果表明，在三株互相独立的产生ALT肿瘤的永生化细胞中，p53的DNA结合区(DNA binding domain)发生了同一个错义点突变A1243G，导致了一个氨基酸的改变N236S。而在四株不产生ALT肿瘤的永生化细胞中，p53保持野生型(请见附图2B)，提示了p53N236S可能是启动早老综合症的ALT肿瘤发生的关键。我们利用人类p53突变数据库进行了p53N236S的3D结构预测，结果表明，p53N236S突变显著改变了DNA结合区的空间构象，可能因此影响突变蛋白的DNA结合能力及转录激活功能(见附图2C)。
突变的p53cDNA及蛋白序列与NCBI收录的野生型p53cDNA及蛋白序列比较请见附图3，突变部位为基因序列A1243G，蛋白序列N236S。
实施例2：
p53A1243G突变导致突变蛋白p53N236S丧失了野生型p53具有的抑制肿瘤生长的功能，因而导致肿瘤发生。
为建立稳定表达p53N236S的细胞株用于研究突变蛋白的功能变化，用空载体PQCXIP或表达p53N236S的载体转染p53-/-MEF细胞。加入抗生素puromycin筛选1-2月后，用Western blotting和免疫荧光染色筛选稳定表达p53N236S的细胞克隆。
对上述建立的表达或不表达突变蛋白p53N236S的细胞进行10Gy电离辐射处理，抽提细胞RNA，随后用AMV first-strand cDNA合成试剂盒(Invitrogen，CA)合成cDNA。Real-time PCR测定辐照前后p21(Forward primer：5’CCA GGC CAAGAT GGT GTC TT 3’，Reverse primer：5’TGA GAA AGG ATC AGC CAT TGC 3’)，CyclinG(Forward primer：5’CTTTGACACGGAGACATTTTCCC 3’，Reverse primer：5’CAGCTCAGTCCAACACACCC 3’)，Bax(Forward primer：5’GTT TCA TCC AGG ATC GAGCAG 3’，Reverse primer：5’CCC CAG TTG AAG TTG CCA TC 3’)，Puma(Forwardprimer：5′GTA CGG GCG GCG GAG ACG AG 3’，Reverse primer：5′GCA CCT AGTTGG GCT CCA TTT CTG 3’)，GAPDH(Forward primer：5’TCA CCA CCA TGG AGA AGGC 3’，Reverse primer：5’GCT AAG CAG TTG GTG GTG CA 3’)的表达水平。Real-timePCR体系为Syber Green(Applied Biosystems，CA)。
实时荧光定量PCR检测发现，与野生型p53相比(WT细胞)，p53N236S丧失了应电离辐射而激活p21、CyclinG、PUMA及Bax的能力(见附图4)，提示p53N236S突变丧失了诱导细胞周期抑制与细胞凋亡的功能，从而导致其丧失了野生型p53具有的抑制肿瘤生长的功能。
实施例3：
突变蛋白p53N236S获得了新功能，可与Ras协同作用促进肿瘤的发生。
值得关注的是，p53N236S并不仅仅是失去p53的功能，在p53-/-细胞中引入p53N236S，导致该细胞对Ras癌基因的诱导高度敏感，快速形成巨大肿瘤。具体方法如下：用空载体PQCXIP或表达p53N236S的载体，联合癌基因Ras表达载体共同转染p53-/-MEF细胞。加入抗生素puromycin筛选1-2月后，用Western blotting筛选稳定表达p53N236S与Ras蛋白的细胞克隆。扩大培养稳定表达p53N236S与Ras蛋白的p53-/-MEF细胞株(图5中的p53-/-+S+Ras)，或单独表达Ras蛋白的p53-/-MEF细胞株(图5中的p53-/-+vector+Ras)，分别取1x106细胞/注射点，皮下注射到6只SCID小鼠(24个注射位点)，观察注射点的肿瘤形成。在肿瘤形成后，手术剥离肿瘤组织比较两种细胞形成肿瘤的速度与肿瘤大小。
与Ras单独诱导的p53-/-细胞形成的肿瘤相比，p53N236S与Ras协同在极短期内在重症免疫缺陷小鼠体内形成巨大肿瘤(图5)，提示p53N236S协同Ras作用有利于肿瘤的发生，表明p53N236S不仅仅是丧失了野生型p53的功能，还获得了促进肿瘤生长的新功能(gain of function)。
实施例4：
Ras与p53N236S协同，可以抑制野生型p53的功能，导致肿瘤发生
另外，当本发明将Ras与p53N236S同时引入具有内源性野生型p53的G5mTR-/-Wrn-/-细胞中，Ras与p53N236S协同作用，抑制了细胞内源性野生型p53的功能，导致肿瘤发生(见附图6A，黑箭头所指注射部位)，而单独引入Ras，没有引入p53N236S的细胞则由于内源性野生型p53的功能而抑制了肿瘤生长，不能产生肿瘤(见附图6A，白箭头所指注射部位)。产生的肿瘤经鉴定为ALT肿瘤(见附图6C)。具体方法如下：用空载体PQCXIP或表达p53N236S的载体，联合癌基因Ras表达载体共同转染G5mTR-/-Wrn-/-细胞。加入抗生素puromycin筛选1-2月后，用Westernblotting筛选稳定表达p53N236S与Ras蛋白的细胞克隆。扩大培养稳定表达p53N236S与Ras蛋白的G5mTR-/-Wrn-/-细胞株，或单独表达Ras蛋白的G5mTR-/-Wrn-/-细胞株。分别取1x106细胞/注射点，皮下注射到8只SCID小鼠(32个注射位点)，观察注射点的肿瘤形成(见附图6A)。
在肿瘤形成后，手术剥离肿瘤组织，用于TRF-Southern杂交，鉴定其ALT肿瘤特性，具体方法如下：用基因组DNA提取试剂盒(Qiagen，CA)从肿瘤组织中提取基因组DNA，用内切酶Hinf I、Rsa I消化40μg基因组DNA。将消化后的DNA用脉冲场凝胶电泳技术分离出端粒片段。凝胶干燥后用32p标记的端粒序列特异探针TTAGGG进行胶内Southern杂交。得到从大到小的弥散型端粒长度的分布图(如附图6C所示)，则表明此肿瘤为ALT肿瘤。
取三株不同的细胞克隆产生的三个肿瘤的组织，用Western blotting鉴定其中Ras与p53N236S的表达(附图6B)。
上述数据表明，Ras与p53N236S协同，可以抑制野生型p53的功能，导致肿瘤发生。不是所有的突变型p53都能抑制野生型p53的功能，抑制功能显示了p53N236S突变蛋白有较强的致瘤性。
SEQUENCE LISTING
<110>昆明理工大学
<120>早老综合征所致ALT肿瘤的特有p53突变蛋白-p53N236S及其应用
<130>
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<212>DNA
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<221>CDS
<222>(1)..(1173)
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atg act gcc atg gag gag tca cag tcg gat atc agc ctc gag ctc cct 48
Met Thr Ala Met Glu Glu Ser Gln Ser Asp Ile Ser Leu Glu Leu Pro
1 5 10 15
ctg agc cag gag aca ttt tca ggc tta tgg aaa cta ctt cct cca gaa 96
Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Gly Leu Trp Lys Leu Leu Pro Pro Glu
20 25 30
gat atc ctg cca tca cct cac tgc atg gac gat ctg ttg ctg ccc cag 144
Asp Ile Leu Pro Ser Pro His Cys Met Asp Asp Leu Leu Leu Pro Gln
35 40 45
gat gtt gag gag ttt ttt gaa ggc cca agt gaa gcc ctc cga gtg tca 192
Asp Val Glu Glu Phe Phe Glu Gly Pro Ser Glu Ala Leu Arg Val Ser
50 55 60
gga gct cct gca gca cag gac cct gtc acc gag acc cct ggg cca gtg 240
Gly Ala Pro Ala Ala Gln Asp Pro Val Thr Glu Thr Pro Gly Pro Val
65 70 75 80
gcc cct gcc cca gcc act cca tgg ccc ctg tca tct ttt gtc cct tct 288
Ala Pro Ala Pro Ala Thr Pro Trp Pro Leu Ser Ser Phe Val Pro Ser
85 90 95
caa aaa act tac cag ggc aac tat ggc ttc cac ctg ggc ttc ctg cag 336
Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Asn Tyr Gly Phe His Leu Gly Phe Leu Gln
100 105 110
tct ggg aca gcc aag tct gtt atg tgc acg tac tct cct ccc ctc aat 384
Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Met Cys Thr Tyr Ser Pro Pro Leu Asn
115 120 125
aag cta ttc tgc cag ctg gcg aag acg tgc cct gtg cag ttg tgg gtc 432
Lys Leu Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val
130 135 140
agc gcc aca cct cca gct ggg agc cgt gtc cgc gcc atg gcc atc tac 480
Ser Ala Thr Pro Pro Ala Gly Ser Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr
145 150 155 160
aag aag tca cag cac atg acg gag gtc gtg aga cgc tgc ccc cac cat 528
Lys Lys Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His
165 170 175
gag cgc tgc tcc gat ggt gat ggc ctg gct cct ccc cag cat ctt atc 576
Glu Arg Cys Ser Asp Gly Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile
180 185 190
cgg gtg gaa gga aat ttg tat ccc gag tat ctg gaa gac agg cag act 624
Arg Val Glu Gly Asn Leu Tyr Pro Glu Tyr Leu Glu Asp Arg Gln Thr
195 200 205
ttt cgc cac agc gtg gtg gta cct tat gag cca ccc gag gcc ggc tct 672
Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Ala Gly Ser
210 215 220
gag tat acc acc atc cac tac aag tac atg tgt agt agc tcc tgc atg 720
Glu Tyr Thr Thr Ile His Tyr Lys Tyr Met Cys Ser Ser Ser Cys Met
225 230 235 240
ggg ggc atg aac cgc cga cct atc ctt acc atc atc aca ctg gaa gac 768
Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp
245 250 255
tcc agt ggg aac ctt ctg ggacgg gac agc ttt gag gtt cgt gtttgt 816
Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asp Ser Phe Glu Val Arg Val Cys
260 265 270
gcc tgc cct ggg aga gac cgc cgt aca gaa gaa gaa aat ttc cgc aaa 864
Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Phe Arg Lys
275 280 285
aag gaa gtc ctt tgc cct gaa ctg ccc cca ggg agc gca aag aga gcg 912
Lys Glu Val Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Gly Ser Ala Lys Arg Ala
290 295 300
ctg ccc acc tgc aca agc gcc tct ccc ccg caa aag aaa aaa cca ctt 960
Leu Pro Thr Cys Thr Ser Ala Ser Pro Pro Gln Lys Lys Lys Pro Leu
305 310 315 320
gat gga gag tat ttc acc ctc aag atc cgc ggg cgt aaa cgc ttc gag 1008
Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Lys Ile Arg Gly Arg Lys Arg Phe Glu
325 330 335
atg ttc cgg gag ctg aat gag gcc tta gag tta aag gat gcc cat gct 1056
Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala His Ala
340 345 350
aca gag gag tct gga gac agc agg gct cac tcc agc tac ctg aag acc 1104
Thr Glu Glu Ser Gly Asp Ser Arg Ala His Ser Ser Tyr Leu Lys Thr
355 360 365
aag aag ggc cag tct act tcc cgc cat aaa aaa aca atg gtc aag aaa 1152
Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Thr Met Val Lys Lys
370 375 380
gtg ggg cct gac tca gac tga 1173
Val Gly Pro Asp Ser Asp
385 390
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<213>Mus musculus
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Asp Ile Leu Pro Ser Pro His Cys Met Asp Asp Leu Leu Leu Pro Gln
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Asp Val Glu Glu Phe Phe Glu Gly Pro Ser Glu Ala Leu Arg Val Ser
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Gly Ala Pro Ala Ala Gln Asp Pro Val Thr Glu Thr Pro Gly Pro Val
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Ala Pro Ala Pro Ala Thr Pro Trp Pro Leu Ser Ser Phe Val Pro Ser
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Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Asn Tyr Gly Phe His Leu Gly Phe Leu Gln
100 105 110
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Lys Leu Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val
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Ser Ala Thr Pro Pro Ala Gly Ser Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp
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Val Gly Pro Asp Ser Asp
385 390
为了建立早老综合症的小鼠模型，两个不同的实验室的研究者试图在小鼠中敲除Wrn基因。然而，单独敲除Wrn基因的小鼠(Wrn-/-)并不表现早衰的症状(Lebeland Leder 1998；Lombard，Beard et al.2000)。进一步的研究发现，WS病人的成纤维母细胞的端粒缩短(telomere erosion)较快，过量表达端粒酶的蛋白组分TERT可以缓解端粒缩短，并且缓解细胞的衰老(senescence)(Wyllie，Jones et al.2000)。这一发现提示了端粒缩短引发的端粒功能异常是导致WS病人早老病症的关键。同时，这一发现也提示了单独敲除Wrn基因的小鼠不表现早衰症状的原因。人的体细胞端粒酶活性低于检测水平，同时，人的体细胞端粒长度也较短(12-20kb)。与人类不同，小鼠体细胞仍然保持端粒酶的活性，且端粒长度在15-80kb，不会导致端粒功能异常，因而Wrn-/-小鼠不表现出早衰的症状。基于这一假说，Dr.SandyChang在世界上首次成功地建立了WS的小鼠模型。该模型双重基因敲除了端粒酶的RNA组分mTerc与Wrn基因(mTR-/-Wrn-/-)，忠实地再现了人类早老综合症的症状，如端粒快速缩短，毛发变白、脱落，白内障、二型糖尿病、骨质疏松，缺血性心脏病，骨肉瘤等等。由于小鼠体细胞端粒长度在15-80kb左右，敲除端粒酶活性的小鼠仍然需要繁殖到第4-6代(G4-G6)才表现出早老综合症的症状，进一步证实了端粒功能异常是导致早老综合症的关键。在这一模型中，端粒酶基因被敲除，所以该模型产生的肿瘤是ALT(Alternative Lengthening of Telomeres)肿瘤(Chang，Multani et al.2004)。
由于遗传背景复杂，人类ALT肿瘤发生机理与信号传导通路尚不清楚。目前只知道与ALT肿瘤相关的特征有端粒长度分布不均一(hetergenous telomere length)(Bryan，Englezou et al.1995)，形成ALT相关的PML小体(promyelocytic leukemiabodies)(Yeager，Neumann et al.1999)，端粒的同源重组增加，表现为端粒姐妹染色体交换(telomere sister chromosome exchange，T-SCE)增加(Londono-Vallejo，Der-Sarkissian et al.2004；Laud，Multani et al.2005)，端粒环的形成(telomeric circle formation)等等(Wang，Smogorzewska et al.2004)。ALT肿瘤的研究对于了解衰老与肿瘤的发生的辩证关系极为重要。同时，在大量采用的针对端粒酶的肿瘤治疗策略中，肿瘤细胞会被迫选择激活ALT，以求保持其生长。因此，研究ALT肿瘤的发生机制，对于协同针对端粒酶的肿瘤治疗也极为重要。
从1982年首次被发现以来，p53是研究者一直关注的非常经典的抑癌基因，p53新的重要功能不断被发现(Reich and Levine 1982；Lane 1984；Hu，Feng et al.2007；Ventura，Kirsch et al.2007；Xue，Zender et al.2007)。p53的各种点突变使其丧失了抑制肿瘤发生的功能(Nigro，Baker et al.1989)。近来研究发现，p53的各种点突变导致的突变蛋白除了丧失野生型p53的功能外，还获得了新的功能，这些新的功能可能促进肿瘤的发生(Lang，Iwakuma et al.2004；Olive，Tuveson et al.2004；Johnson，Hammond et al.2005)。
基于p53的各种点突变在肿瘤发生中的重要作用，世界卫生组织的下属机构IARC(The International Agency for Research on Cancer)专门建立了p53基因突变数据库(http://www-p53.iarc.fr/)来收集各种p53基因突变及其相关研究数据和流行病学信息(Petitjean，Mathe et al.2007)。对人类p53突变热点的分析表明，大部分突变发生在p53蛋白的DNA结合区域，其中，p53N239S是突变热点之一(Walker，Bond et al.1999)。然而，对p53N239S突变蛋白的功能研究甚少，多数为在酵母中进行的众多p53突变点的功能预测(Robert，Michel et al.2000；Kato，Han et al.2003；Dearth，Qian et al.2007)。
发明内容：
本发明的目的在于提供p53N236S突变蛋白的新结构与新功能，p53N236S突变在肿瘤诊断与治疗的应用，进一步揭示抗肿瘤药物筛选及肿瘤治疗策略。
本发明的上述目的是用下述的技术方案达到的：
早老综合征所致ALT肿瘤的特有的小鼠p53基因突变A1243G，具有图3所示的序列。
早老综合征所致ALT肿瘤的特有的小鼠p53基因突变A1243G编码的p53突变蛋白p53N236S，具有图2C所示的三维空间结构，突变蛋白p53N236S丧失了转录激活p21、Cyclin G、PUMA及Bax的能力。
突变的p53基因A1243G在制备诊断肿瘤药物中的应用。如图1、2所示，突变的p53基因A1243G只在肿瘤中被检出。
突变的p53基因A1243G在制备治疗肿瘤药物中的应用。如图5所示，突变的p53基因A1243G可以协同癌基因Ras的作用，加速肿瘤发生；如图6所示，突变的p53基因A1243G可以协同Ras负显性抑制野生型p53的功能，直接导致早老综合症的ALT肿瘤发生；抑制突变的p53基因A1243G的功能可直接抑制肿瘤的发生。
小鼠p53突变蛋白p53N236S在制备诊断和治疗肿瘤药物中的应用。
小鼠p53突变蛋白p53N236S在制备以p53N236S为靶分子的肿瘤诊断药物中的应用。
以建立突变的p53基因A1243G为目的的小鼠体细胞在制备筛选诊断和治疗肿瘤的药物中的应用。
附图说明：
图1细胞逃逸衰老产生的两类永生化细胞株：右边三株细胞在小鼠体内可以产生ALT肿瘤，左边四株细胞在小鼠体内不能产生ALT肿瘤。
图2在产生ALT肿瘤的细胞中发现的p53点突变及其结构与功能的改变。2A产生ALT肿瘤的永生化细胞株中p53N236S突变导致p21表达水平下调；2B对产生ALT肿瘤的永生化细胞中的p53基因cDNA序列测定表明其发生了p53A1243G点突变，相应其编码的蛋白突变为p53N236S；2C p53A1243G点突变导致突变蛋白p53N236S的空间构象明显改变：左：突变氨基酸N236S对临近氨基酸的影响；右：p53N236S突变蛋白与野生型p53蛋白DNA结合区空间构象的比较。
图3突变的p53cDNA及蛋白序列与NCBI收录的野生型p53cDNA及蛋白序列比较。Query为突变序列，Sbjct为野生型序列。
图4p53N236S丧失了转录调控激活p21，cyclin G，PUMA，Bax的功能。
图5p53N236S与Ras协同作用，快速产生巨大肿瘤。黑色箭头所指为皮下植入细胞后，肿瘤生长的位置，左图为p53N236S与Ras协同作用下产生的巨大肿瘤；中图为没有p53N236S，仅有Ras产生的肿瘤；右图为手术剥离后两种肿瘤的比较。
图6p53N236S与Ras协同作用可负显性抑制野生型p53的作用而形成ALT肿瘤。6A黑色箭头所指为皮下植入p53N236S与Ras协同作用的细胞后导致肿瘤；白色箭头所指为皮下植入没有p53N236S、仅有Ras的细胞后，在野生型p53的作用下不能产生肿瘤。6B上述产生的肿瘤经Western blotting鉴定其中Ras与p53N236S的表达情况；6C上述产生的肿瘤经TRF-Southern杂交鉴定其ALT肿瘤特性。
具体实施方式：
实施例1：
仅在可产生ALT肿瘤的细胞中检测到p53A1243G突变，表明该突变与ALT肿瘤发生密切相关。
从早老综合征G5mTR-/-Wrn-/-小鼠胚胎培养出的成纤维母细胞(mouse embryofibroblast，MEF)也表现出WS病人的成纤维母细胞的特征，体外培养的细胞很快进入衰老。然而，这种衰老细胞易于逃离衰老，形成永生化细胞克隆，部分永生化细胞克隆可以在重症免疫缺陷小鼠(SCID mouse)体内形成肿瘤(Laud，Multani etal.2005)。
G5mTR-/-Wrn-/-小鼠为ALT肿瘤研究提供了一个遗传背景清楚的模型。为了研究WS细胞从衰老，到逃逸衰老而永生化，到ALT肿瘤化的进程中分子调控机理，本发明比较研究了三株产生ALT肿瘤(ALT tumorigenic)的永生化细胞(3B-1，3B-2，9B-1)与四株不产生ALT肿瘤(Non-ALT tumorigenic)的永生化细胞(7A-1，7A-2，7A-3，6B-1)(见附图1)。细胞株在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为3％O2，5％CO2，37℃。用于Western blotting的抗体有：phospho-ATM(Ser1981)(1∶1000，Cell Signaling，MA)，Chk2(1∶500，BD TransductionLaboratories，CA)，cMyc(9E10)(1∶500，Santa Cruz，CA)，p16INK4a(M-156)(1∶500，Santa Cruz，CA)，p21(F-5)(1∶500，Santa Cruz，CA)，p53Ab-1(clonePAb240)(1∶250，Neomarker，CA)，phospho-p53(Ser15)(1∶500，Cell Signaling，MA)，γ-tubulin(1∶5000，Sigma，MO).
Western blotting检测发现，在所有的产生ALT肿瘤的永生化细胞株(3B-1，3B-2，9B-1)中，p53的表达水平异常增高，相反，p21表达异常下调，从而导致细胞的ALT肿瘤发生(请见附图2A，突变蛋白p53N236S的过量表达与p21的表达下调)。异常增高的p53与降低的p21表达水平同时提示了此处的p53发生了突变。
为进行RT-PCR和p53cDNA序列测定，本发明使用RNeasy试剂盒(Qiagen，CA)抽提永生化细胞或肿瘤细胞RNA，随后用AMV first-strand cDNA合成试剂盒(Invitrogen，CA)合成cDNA。以此cDNA为模板，使用特异引物扩增p53cDNA并克隆到TA载体(Invitrogen，CA)，测序检查p53序列。每株细胞至少测定3个不同的p53cDNA克隆。
RT-PCR及cDNA测序结果表明，在三株互相独立的产生ALT肿瘤的永生化细胞中，p53的DNA结合区(DNA binding domain)发生了同一个错义点突变A1243G，导致了一个氨基酸的改变N236S。而在四株不产生ALT肿瘤的永生化细胞中，p53保持野生型(请见附图2B)，提示了p53N236S可能是启动早老综合症的ALT肿瘤发生的关键。我们利用人类p53突变数据库进行了p53N236S的3D结构预测，结果表明，p53N236S突变显著改变了DNA结合区的空间构象，可能因此影响突变蛋白的DNA结合能力及转录激活功能(见附图2C)。
突变的p53cDNA及蛋白序列与NCBI收录的野生型p53cDNA及蛋白序列比较请见附图3，突变部位为基因序列A1243G，蛋白序列N236S。
实施例2：
p53A1243G突变导致突变蛋白p53N236S丧失了野生型p53具有的抑制肿瘤生长的功能，因而导致肿瘤发生。
为建立稳定表达p53N236S的细胞株用于研究突变蛋白的功能变化，用空载体PQCXIP或表达p53N236S的载体转染p53-/-MEF细胞。加入抗生素puromycin筛选1-2月后，用Western blotting和免疫荧光染色筛选稳定表达p53N236S的细胞克隆。
对上述建立的表达或不表达突变蛋白p53N236S的细胞进行10Gy电离辐射处理，抽提细胞RNA，随后用AMV first-strand cDNA合成试剂盒(Invitrogen，CA)合成cDNA。Real-time PCR测定辐照前后p21(Forward primer：5’CCA GGC CAAGAT GGT GTC TT 3’，Reverse primer：5’TGA GAA AGG ATC AGC CAT TGC 3’)，CyclinG(Forward primer：5’CTTTGACACGGAGACATTTTCCC 3’，Reverse primer：5’CAGCTCAGTCCAACACACCC 3’)，Bax(Forward primer：5’GTT TCA TCC AGG ATC GAGCAG 3’，Reverse primer：5’CCC CAG TTG AAG TTG CCA TC 3’)，Puma(Forwardprimer：5′GTA CGG GCG GCG GAG ACG AG 3’，Reverse primer：5′GCA CCT AGTTGG GCT CCA TTT CTG 3’)，GAPDH(Forward primer：5’TCA CCA CCA TGG AGA AGGC 3’，Reverse primer：5’GCT AAG CAG TTG GTG GTG CA 3’)的表达水平。Real-timePCR体系为Syber Green(Applied Biosystems，CA)。
实时荧光定量PCR检测发现，与野生型p53相比(WT细胞)，p53N236S丧失了应电离辐射而激活p21、CyclinG、PUMA及Bax的能力(见附图4)，提示p53N236S突变丧失了诱导细胞周期抑制与细胞凋亡的功能，从而导致其丧失了野生型p53具有的抑制肿瘤生长的功能。
实施例3：
突变蛋白p53N236S获得了新功能，可与Ras协同作用促进肿瘤的发生。
值得关注的是，p53N236S并不仅仅是失去p53的功能，在p53-/-细胞中引入p53N236S，导致该细胞对Ras癌基因的诱导高度敏感，快速形成巨大肿瘤。具体方法如下：用空载体PQCXIP或表达p53N236S的载体，联合癌基因Ras表达载体共同转染p53-/-MEF细胞。加入抗生素puromycin筛选1-2月后，用Western blotting筛选稳定表达p53N236S与Ras蛋白的细胞克隆。扩大培养稳定表达p53N236S与Ras蛋白的p53-/-MEF细胞株(图5中的p53-/-+S+Ras)，或单独表达Ras蛋白的p53-/-MEF细胞株(图5中的p53-/-+vector+Ras)，分别取1x106细胞/注射点，皮下注射到6只SCID小鼠(24个注射位点)，观察注射点的肿瘤形成。在肿瘤形成后，手术剥离肿瘤组织比较两种细胞形成肿瘤的速度与肿瘤大小。
与Ras单独诱导的p53-/-细胞形成的肿瘤相比，p53N236S与Ras协同在极短期内在重症免疫缺陷小鼠体内形成巨大肿瘤(图5)，提示p53N236S协同Ras作用有利于肿瘤的发生，表明p53N236S不仅仅是丧失了野生型p53的功能，还获得了促进肿瘤生长的新功能(gain of function)。
实施例4：
Ras与p53N236S协同，可以抑制野生型p53的功能，导致肿瘤发生
另外，当本发明将Ras与p53N236S同时引入具有内源性野生型p53的G5mTR-/-Wrn-/-细胞中，Ras与p53N236S协同作用，抑制了细胞内源性野生型p53的功能，导致肿瘤发生(见附图6A，黑箭头所指注射部位)，而单独引入Ras，没有引入p53N236S的细胞则由于内源性野生型p53的功能而抑制了肿瘤生长，不能产生肿瘤(见附图6A，白箭头所指注射部位)。产生的肿瘤经鉴定为ALT肿瘤(见附图6C)。具体方法如下：用空载体PQCXIP或表达p53N236S的载体，联合癌基因Ras表达载体共同转染G5mTR-/-Wrn-/-细胞。加入抗生素puromycin筛选1-2月后，用Westernblotting筛选稳定表达p53N236S与Ras蛋白的细胞克隆。扩大培养稳定表达p53N236S与Ras蛋白的G5mTR-/-Wrn-/-细胞株，或单独表达Ras蛋白的G5mTR-/-Wrn-/-细胞株。分别取1x106细胞/注射点，皮下注射到8只SCID小鼠(32个注射位点)，观察注射点的肿瘤形成(见附图6A)。
在肿瘤形成后，手术剥离肿瘤组织，用于TRF-Southern杂交，鉴定其ALT肿瘤特性，具体方法如下：用基因组DNA提取试剂盒(Qiagen，CA)从肿瘤组织中提取基因组DNA，用内切酶Hinf I、Rsa I消化40μg基因组DNA。将消化后的DNA用脉冲场凝胶电泳技术分离出端粒片段。凝胶干燥后用32p标记的端粒序列特异探针TTAGGG进行胶内Southern杂交。得到从大到小的弥散型端粒长度的分布图(如附图6C所示)，则表明此肿瘤为ALT肿瘤。
取三株不同的细胞克隆产生的三个肿瘤的组织，用Western blotting鉴定其中Ras与p53N236S的表达(附图6B)。
上述数据表明，Ras与p53N236S协同，可以抑制野生型p53的功能，导致肿瘤发生。不是所有的突变型p53都能抑制野生型p53的功能，抑制功能显示了p53N236S突变蛋白有较强的致瘤性。
SEQUENCE LISTING
<110>昆明理工大学
<120>早老综合征所致ALT肿瘤的特有p53突变蛋白-p53N236S及其应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1173
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1173)
<400>1
atg act gcc atg gag gag tca cag tcg gat atc agc ctc gag ctc cct 48
Met Thr Ala Met Glu Glu Ser Gln Ser Asp Ile Ser Leu Glu Leu Pro
1 5 10 15
ctg agc cag gag aca ttt tca ggc tta tgg aaa cta ctt cct cca gaa 96
Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Gly Leu Trp Lys Leu Leu Pro Pro Glu
20 25 30
gat atc ctg cca tca cct cac tgc atg gac gat ctg ttg ctg ccc cag 144
Asp Ile Leu Pro Ser Pro His Cys Met Asp Asp Leu Leu Leu Pro Gln
35 40 45
gat gtt gag gag ttt ttt gaa ggc cca agt gaa gcc ctc cga gtg tca 192
Asp Val Glu Glu Phe Phe Glu Gly Pro Ser Glu Ala Leu Arg Val Ser
50 55 60
gga gct cct gca gca cag gac cct gtc acc gag acc cct ggg cca gtg 240
Gly Ala Pro Ala Ala Gln Asp Pro Val Thr Glu Thr Pro Gly Pro Val
65 70 75 80
gcc cct gcc cca gcc act cca tgg ccc ctg tca tct ttt gtc cct tct 288
Ala Pro Ala Pro Ala Thr Pro Trp Pro Leu Ser Ser Phe Val Pro Ser
85 90 95
caa aaa act tac cag ggc aac tat ggc ttc cac ctg ggc ttc ctg cag 336
Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Asn Tyr Gly Phe His Leu Gly Phe Leu Gln
100 105 110
tct ggg aca gcc aag tct gtt atg tgc acg tac tct cct ccc ctc aat 384
Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Met Cys Thr Tyr Ser Pro Pro Leu Asn
115 120 125
aag cta ttc tgc cag ctg gcg aag acg tgc cct gtg cag ttg tgg gtc 432
Lys Leu Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val
130 135 140
agc gcc aca cct cca gct ggg agc cgt gtc cgc gcc atg gcc atc tac 480
Ser Ala Thr Pro Pro Ala Gly Ser Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr
145 150 155 160
aag aag tca cag cac atg acg gag gtc gtg aga cgc tgc ccc cac cat 528
Lys Lys Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His
165 170 175
gag cgc tgc tcc gat ggt gat ggc ctg gct cct ccc cag cat ctt atc 576
Glu Arg Cys Ser Asp Gly Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile
180 185 190
cgg gtg gaa gga aat ttg tat ccc gag tat ctg gaa gac agg cag act 624
Arg Val Glu Gly Asn Leu Tyr Pro Glu Tyr Leu Glu Asp Arg Gln Thr
195 200 205
ttt cgc cac agc gtg gtg gta cct tat gag cca ccc gag gcc ggc tct 672
Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Ala Gly Ser
210 215 220
gag tat acc acc atc cac tac aag tac atg tgt agt agc tcc tgc atg 720
Glu Tyr Thr Thr Ile His Tyr Lys Tyr Met Cys Ser Ser Ser Cys Met
225 230 235 240
ggg ggc atg aac cgc cga cct atc ctt acc atc atc aca ctg gaa gac 768
Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp
245 250 255
tcc agt ggg aac ctt ctg ggacgg gac agc ttt gag gtt cgt gtttgt 816
Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asp Ser Phe Glu Val Arg Val Cys
260 265 270
gcc tgc cct ggg aga gac cgc cgt aca gaa gaa gaa aat ttc cgc aaa 864
Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Phe Arg Lys
275 280 285
aag gaa gtc ctt tgc cct gaa ctg ccc cca ggg agc gca aag aga gcg 912
Lys Glu Val Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Gly Ser Ala Lys Arg Ala
290 295 300
ctg ccc acc tgc aca agc gcc tct ccc ccg caa aag aaa aaa cca ctt 960
Leu Pro Thr Cys Thr Ser Ala Ser Pro Pro Gln Lys Lys Lys Pro Leu
305 310 315 320
gat gga gag tat ttc acc ctc aag atc cgc ggg cgt aaa cgc ttc gag 1008
Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Lys Ile Arg Gly Arg Lys Arg Phe Glu
325 330 335
atg ttc cgg gag ctg aat gag gcc tta gag tta aag gat gcc cat gct 1056
Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala His Ala
340 345 350
aca gag gag tct gga gac agc agg gct cac tcc agc tac ctg aag acc 1104
Thr Glu Glu Ser Gly Asp Ser Arg Ala His Ser Ser Tyr Leu Lys Thr
355 360 365
aag aag ggc cag tct act tcc cgc cat aaa aaa aca atg gtc aag aaa 1152
Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Thr Met Val Lys Lys
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gtg ggg cct gac tca gac tga 1173
Val Gly Pro Asp Ser Asp
385 390
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85 90 95
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Lys Leu Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val
130 135 140
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275 280 285
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290 295 300
Leu Pro Thr Cys Thr Ser Ala Ser Pro Pro Gln Lys Lys Lys Pro Leu
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355 360 365
Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Thr Met Val Lys Lys
370 375 380
Val Gly Pro Asp Ser Asp
385 390
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