一种糖尿病药物治疗相关基因突变的检测方法及其专用芯片和试剂盒
阅读：1033发布：2020-07-07
专利汇可以提供一种糖尿病药物治疗相关基因突变的检测方法及其专用芯片和试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种对糖尿病药物 治疗 相关基因突变进行检测的方法及其专用芯片和 试剂 盒 。该方法是以待检测的来自于人体组织的基因组为模板，用针对特定突变位点设计的引物组和没有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重PCR扩增，然后将得到的PCR产物与 基因芯片 上的等位基因特异性探针进行杂交，根据杂交结果确定各糖尿病药物治疗相关基因的突变类型；本发明可以全面、系统、高通量地检测已知的与糖尿病治疗药物反应个体差异密切相关的基因突变，极大地提高了芯片检测的准确性和特异性。，下面是一种糖尿病药物治疗相关基因突变的检测方法及其专用芯片和试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种基因芯片，包括基底和固定于所述基底上的探针，其特征是所述探针为可分别与15种糖尿病药物治疗相关基因突变位点所在的核酸片段进行杂交的寡核苷酸片段，针对每个基因突变位点的探针包括一对等位基因特异性短探针，包括野生型等位基因特异性短探针和突变型等位基因特异性短探针；和一对等位基因特异性长探针，包括野生型等位基因特异性长探针和突变型等位基因特异性长探针；
所述的等位基因特异性短探针由15对单链核苷酸片段上的包括基因突变位点在内的任意连续14-25个碱基组成，具体序列为序列表中的SEQ ID NO.92至121；对应地，所述来自同一突变位点的等位基因特异性长探针为下述15对单链核苷酸片段，所述
15对单链核苷酸片段的碱基序列分别是序列表中的SEQ ID NO.62至91。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述固定于基底上的探针还包括阴性参照探针和阳性参照探针。
3.一种试剂盒，包括引物组和基因芯片；
所述引物组包括针对糖尿病药物治疗相关基因突变位点设计的15对延伸方向相反的等位基因特异性内引物和对应的两条外引物以及一条共用的特异性扩增辅助引物；
所述等位基因特异性内引物的碱基序列是序列表中的SEQ ID NO.1至30；
所述特异性扩增辅助引物的碱基序列是序列表中的SEQ ID NO.31；
所述基因芯片如权利要求1中所述。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括没有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述等位基因特异性内引物引入人工错配碱基；所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物；所述类似物为尿嘧啶(U)、肽核酸或锁定核酸。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的共用特异性扩增辅助引物带有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子。
一种糖尿病药物治疗相关基因突变的检测方法及其专用芯
片和试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 糖尿病作为困扰人类身心健康的一类重大疾病，已成为全球性的公共卫生问题。世界卫生组织指出，2025年全世界将出现3.8亿名糖尿病患者。在我国糖尿病发病率已达到2％，确诊的糖尿病患者已经达到4000万人，患者总数已跻身世界第二位，并以每年100万的速度递增。对于确诊的糖尿病患者，目前最有效的治疗方法就是药物降糖治疗。 [0003] 目前临床上常用的糖尿病治疗药物如下表所示：
[0004] 表1
[0005]类别 代表药物
磺脲类药物 甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、格列本脲、格列吡嗪、格列 齐特
双胍类药物 二甲双胍
胰岛素增敏剂 曲格列酮、罗格列酮
促胰岛素分泌剂 瑞格列奈、那格列奈
α-葡萄糖苷酶抑制剂 阿卡波糖、伏格列波糖
其他 胰岛素、中成药
磺脲类药物 甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、格列本脲、格列吡嗪、格列 齐特
双胍类药物 二甲双胍
胰岛素增敏剂 曲格列酮、罗格列酮
促胰岛素分泌剂 瑞格列奈、那格列奈
α-葡萄糖苷酶抑制剂 阿卡波糖、伏格列波糖
其他 胰岛素、中成药
[0006] 在糖尿病的药物治疗过程中，经常会出现药物反应的个体差异现象，表现为对同一种类和同一剂量的降糖药物，有的人服用后效果很好，对有的人却根本没有作用，有的甚至还会出现毒副作用，这直接导致了大约有30％的糖尿病患者没有获得预期的药物治疗效果，给他们的生命健康带来了不同程度的危害，增加不必要的经济负担。 [0007] 药物反应个体差异是临床上极其普遍的现象，产生这种差异的原因有许多，包括性别、年龄、体重、疾病状况在内的多种因素都可以导致不同病人对同一种药物的反应出现量与质的差别，然而近20多年来的遗传药理学研究结果表明其中最重要、最根本的因素是遗传因素，即药物代谢酶、转运体和受体(药物作用靶点)的基因多态性导致了其编码蛋白的功能改变，进一步使血药浓度和药物敏感性显著不同，也就是说，遗传变异导致了药物 反应的个体差异。遗传变异中最常见的类型是基因突变，经过长期的观察与研究，目前已发现有许多基因突变与人体对糖尿病治疗药物的反应性有关，这些发生突变的基因称为糖尿病药物治疗相关基因，基因突变的发生频率和功能意义在不同的种族间存在着较大的差异，目前已发现的在亚洲人中常见的糖尿病药物治疗相关基因突变及其相关药物概括如下：
[0008] 表2
[0009]突变编号 所在基因 突变类型 发生频率 相关药物
rs1057910 CYP2C9 A＞C 3.5％ 磺脲类降糖药、那格列奈
rs3758581 CYP2C19 A＞G 10.2％ 甲苯磺丁脲、格列本脲
rs17878459 CYP2C19 G＞C 2.3％ 甲苯磺丁脲、格列本脲
rs4986893 CYP2C19 G＞A 7.4％ 甲苯磺丁脲、格列本脲
rs4149056 SLCO1B1 T＞C 14％ 那格列奈、瑞格列奈
rs4646277 SLC22A1 C＞T 2％ 二甲双胍
rs2282143 SLC22A1 C＞T 12％ 二甲双胍
rs628031 SLC22A1 A＞G 19.3％ 二甲双胍
rs316019 SLC22A2 G＞T 13.3％ 二甲双胍
rs1801278 IRS-1 G＞A 8％ 磺脲类降糖药
rs1805192 PPARG C＞G 10％ 噻唑啉二酮类降糖药
rs2241766 ADIPOQ T＞G 31.3％ 罗格列酮、阿卡波糖
rs1501299 ADIPOQ G＞T 28.3％ 罗格列酮、阿卡波糖
rs5219 KCNJ11 G＞A 50％ 磺脲类降糖药、二甲双胍
rs12255372 TCF7L2 G＞T 2％ 磺脲类降糖药、二甲双胍
rs1057910 CYP2C9 A＞C 3.5％ 磺脲类降糖药、那格列奈
rs3758581 CYP2C19 A＞G 10.2％ 甲苯磺丁脲、格列本脲
rs17878459 CYP2C19 G＞C 2.3％ 甲苯磺丁脲、格列本脲
rs4986893 CYP2C19 G＞A 7.4％ 甲苯磺丁脲、格列本脲
rs4149056 SLCO1B1 T＞C 14％ 那格列奈、瑞格列奈
rs4646277 SLC22A1 C＞T 2％ 二甲双胍
rs2282143 SLC22A1 C＞T 12％ 二甲双胍
rs628031 SLC22A1 A＞G 19.3％ 二甲双胍
rs316019 SLC22A2 G＞T 13.3％ 二甲双胍
rs1801278 IRS-1 G＞A 8％ 磺脲类降糖药
rs1805192 PPARG C＞G 10％ 噻唑啉二酮类降糖药
rs2241766 ADIPOQ T＞G 31.3％ 罗格列酮、阿卡波糖
rs1501299 ADIPOQ G＞T 28.3％ 罗格列酮、阿卡波糖
rs5219 KCNJ11 G＞A 50％ 磺脲类降糖药、二甲双胍
rs12255372 TCF7L2 G＞T 2％ 磺脲类降糖药、二甲双胍
[0010] 在传统的诊疗模式下，临床医师开处方通常只能凭借他的个人经验，对症选择某种药物并估计大致的用药剂量，但是药物的种类和剂量是否适合每个不同的患者则不为可知。利用各种基因分型技术对上述基因突变进行检测，临床医生可以根据糖尿病患者的上述基因型资料选择合适的给药方案，从而提高药物的疗效和降低药物的毒副反应，同时减轻病人的痛苦和经济负担。
[0011] 目前对基因型进行检测的方法有很多，最常用的有聚合酶链式反应一限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP法)、序列特异性PCR、手工或自动测序等方法，这些方法不仅操作繁琐、检测周期长、无法做到高通量，而且影响检测结果的因素众多，不易控制，难以满足临床实际检测的要求，目前只在科研领域进行。
[0012] 要在临床进行大样本高通量的基因检测，目前最理想的方法是基因芯片技术，与其他技术相比较，基因芯片具有体积小、重量轻、成本低，便于携带，防污染，分析过程高通量、高度自动化和速度快，所需样品和试剂少等诸多优点，近年来该种技术得到了人们的极大关注并取得了迅速发展，并有多个基于基因芯片技术进行基因突变检测的产品问世。 [0013] 目前用于突变检测的大多是序列特异性探针杂交法(SSOP)基因芯片技术，该种技术利用寡核苷酸基因芯片的高通量和高度并行性的特点，对发生突变的众多基因设计序列特异性的寡核苷酸探针，将这些探针固定于同一张基片上，将待测的包含突变位点的基因片段进行体外扩增后与芯片杂交，根据杂交的信号判断突变位点的基因型。这种方法的基本原理是与基因特定序列互补的一段序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)对基因序列的特异性识别。当探针的序列与基因序列完全匹配时所形成的杂交体热稳定性高于含有错配碱基的杂交体，据此通过控制杂交温度和其他杂交条件可以使完全匹配的杂交体与含有错配碱基的杂交体区分开来，从而达到基因分型的目的。
[0014] 上述芯片技术尽管从理论上可以利用含有错配碱基的探针和目标基因形成的杂合体稳定性差的现象对基因序列上的碱基变化进行检测，但是往往由于碱基错配形式不同、基因序列不同、基因高级结构的差异等因素造成实际情况比理论情况要复杂得多，为了提高探针对单个碱基变化的检测准确率，一般倾向于把探针设计的较短，但是为了保证探针对基因识别的特异性和维持较高的杂交信号强度又不能使探针过短，而且即使是相同长度的探针也会由于其GC含量不同、所检测的突变碱基在探针上的相对位置不同等原因使得这 种基于探针杂交的过程变得十分复杂，短探针与靶序列的杂交特异性问题这时候就变得非常突出，具体的表现就是野生型探针和突变型探针在杂交时都会出现非特异性的杂交信号，无法做到检测信号的“全或无”，必须严格控制杂交条件并反复摸索才能够准确地区分基因型。
发明内容
[0015] 本发明的目的在于针对上述基因突变检测中存在的问题，提供一种利用基因芯片技术对糖尿病药物治疗相关基因突变进行快速、敏感、特异性检测的方法及其专用芯片和试剂盒。
[0016] 本发明所提供的对糖尿病药物治疗相关基因突变进行检测的方法，是以待检测的来自于人体组织的基因组为模板，用针对特定突变位点设计的引物组和没有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重PCR扩增，然后将得到的PCR产物与基因芯片上的等位基因特异性探针进行杂交，根据杂交结果确定各糖尿病药物治疗相关基因的突变类型。 [0017] 所述的多重PCR扩增可以在一管中进行，也可以分为多管进行多管多重PCR反应。 [0018] 本 发 明 所 涉 及 的 糖 尿 病 药 物 治 疗 相 关 基 因 突 变 位 点 包括 ：CYP2C9*3-I359L(rs1057910)、CYP2C19*2a-I331V(rs3758581)、CYP2C19*2b-E92D(rs17878459)、CYP2C19*3-W212X(rs4986893)、
SLCO1B1-V174A(rs4149056)、SLCO22A1-P283L(rs4646277)、SLCO22A1-P341L(rs2282143)、SLCO22A1-M408V(rs628031)、SLC22A2-A270S(rs316019)、IRS-1-G972A(rs1801278)、PPARG-P12A(rs1805192)、ADIPOQ(rs2241766)、ADIPOQ(+276G/T)、TCF7L2(rs12255372)、KCNJ11-G15G(rs2241766)。
SLCO1B1-V174A(rs4149056)、SLCO22A1-P283L(rs4646277)、SLCO22A1-P341L(rs2282143)、SLCO22A1-M408V(rs628031)、SLC22A2-A270S(rs316019)、IRS-1-G972A(rs1801278)、PPARG-P12A(rs1805192)、ADIPOQ(rs2241766)、ADIPOQ(+276G/T)、TCF7L2(rs12255372)、KCNJ11-G15G(rs2241766)。
[0019] 针对上述每一突变位点设计的引物组包括一对等位基因特异性内引物(位于不同的DNA链上)和对应的两条外引物，以及各个突变位点共用的一条特异性扩增辅助引物。所述等位基因特异性外引物可根据相应的等位基因特异性内引物和待扩增的基因片段设计并合成，本领域的一般技术人员均可以掌握，详细操作步骤可参考《分子克隆实验指南》([美]J.萨姆布鲁克著，科学出版社)。
[0020] 所述等位基因特异性内引物的结构如下：靠近其5’端的是一段长度为8-15nt的由G和C组成的与模板DNA不匹配的序列；靠近其3’端的是一段包括14-25个碱基的序列，且3’端最后一个碱基恰好位于糖尿病药物治疗相关基因的一个突变位点上，与该位点的突变型或野生型碱基匹配，其余碱基与突变位点前的相应片段完全匹配。拥有该结构的每条等位基因特异性内引物和与其对应的外引物组成的引物对能够扩增出包括糖尿病药物 治疗相关基因的一个突变位点的突变型或野生型碱基在内的核苷酸片段。
[0021] 所述各个位点共用的特异性扩增辅助引物(GC-primer)是一段由G和C组成的寡核苷酸序列，用于在反应体系中促进特异性扩增反应的进行，故名。GC-primer的序列与所述等位基因特异性内引物的靠近5’端部分完全相同，用于提高特异性扩增片段的产量。 [0022] 所述的共用特异性扩增辅助引物的5’端标记有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子，这些分子包括：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等，这些标记及其标记方法以及各标记物的检测方法都已是本领域众所周知的常规技术。本发明优选对共用特异性扩增辅助引物的5’端进行Cy5标记，使得生成的等位基因特异性扩增产物的5′端带有荧光标记，以便在后继的扫描过程中读取结果。 [0023] 本发明所述各个突变位点的等位基因特异性内引物的序列(靠近3’端的序列)以及各个突变位点共用的特异性扩增辅助引物的序列如下：
[0024] 表3
[0025]
[0026]
[0027] 上表中，针对每一糖尿病药物治疗相关基因的突变位点设计了一条野生型等位基因内引物(inner P-W)序列和一条突变型等位基因内引物(inner P-M)序列，在实际使用中，可选择一个或多个突变位点的两个序列的3’端任意连续17-30个碱基(包括3’端的野生型或突变型碱基在内)作为内引物的序列。另外，为了提高等位基因特异性扩增的效率，可以在靠近内引物的3’端引入一个人工错配的碱基，一般是在3’端的倒数第2或第3位上引入，所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物，所述类似物包括尿嘧啶(U)、肽核酸(PNA)和锁定核酸(LNA)，这属于本领域技术人员熟知的方法。 [0028] 本发明所述的基因芯片包括固相支持物和有序固定在固相支持物上的若干种寡核苷酸探针。
[0029] 所述的固相支持物可采用基因芯片领域常用的各种材料，如但不限于经活性基团修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片、各种纤维膜、尼龙膜等，用于修饰的活性基团如但不限于醛基、氨基、巯基、羧基等，本发明优选醛基化修饰的玻片。
[0030] 所述固定于固相支持物上的寡核苷酸探针针对各糖尿病药物治疗相关基因突变位点设计，每个糖尿病药物治疗相关基因突变位点对应两组寡核苷酸探针，分别对应于野生型等位基因和突变型等位基因，每组探针又包括一条等位基因特异性短探针和一条等位基因 特异性长探针。
[0031] 所述的每个突变位点的野生型等位基因特异性探针(包括短探针和长探针)和突变型等位基因特异性探针(包括短探针和长探针)分别与待检测扩增片段的两条链上的相应序列匹配。
[0032] 所述的等位基因特异性短探针和与其相应的等位基因特异性长探针与同一段待检测基因片段的同一条链上的相应序列匹配；所述的等位基因特异性短探针与其中包括糖尿病药物治疗相关基因突变位点的一段序列匹配，探针的长度为14-25nt；所述的等位基因特异性长探针与该基因突变位点下游且不包含该突变位点的一段序列匹配，探针的长度为50-70nt。
[0033] 本发明所述基因芯片的等位基因特异性短探针的序列来自下述15对单链核苷酸片段中的一对或任意多对，由所述15对单链核苷酸片段上的包括基因突变位点(方框内的碱基)在内的任意连续14-25个碱基组成，所述15对单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是下表中的序列32至序列61。
[0034] 表4
[0035]
[0036]
[0037]
[0038] 本发明所述基因芯片的等位基因特异性长探针根据每个基因突变位点的序列特点设计并优化，本发明优选的长探针序列为下述15对单链核苷酸片段中的一对或任意多对，所述15对单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是序列表中的序列63至序列93。 [0039] 表5
[0040]
[0041]
[0042]
[0043] 在上述设计的各探针序列的基础上，为了控制杂交过程中各种因素对杂交信号值的干扰和对杂交过程进行评估，本领域技术人员还可通过本领域熟知的方法设计并合成芯片质控对照、阴性对照、阳性对照、空白对照等质控探针。
[0044] 在上述设计的各探针序列的基础上，本领域技术人员可通过本领域熟知的方法进行探针合成，并通过对探针3’端或5’端增加间隔臂(如：聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，来增加杂交容量；以及对其3’端或5’端进行化学集团修饰(比如氨基化修饰)，使探针能通过化学键结合到相应的固相支持物上(如醛基化玻片)；本发明优选对探针的3′端进行氨基修饰，其相较5′端修饰的探针具有更好的杂交效果。
[0045] 根据本发明的另一方面，提供一种用于检测上述糖尿病药物治疗相关基因突变的试剂盒，其至少包括本发明的上述引物(包括内引物、外引物和/或特异性扩增辅助引物，不 同位点的上述引物可以分开放置，也可以组成引物混合物)和基因芯片(包括固相支持物和寡核苷酸探针，探针可以固定在固相支持物上，也可不固定在固相支持物上)，本发明的试剂盒还可以进一步包含下述试剂中的一种或几种：从待检样本中提取DNA的样本处理试剂；PCR扩增试剂；杂交试剂；显色试剂。
[0046] 上述样本处理试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂以及显色试剂均可以使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂，这些试剂必要时可以包括在试剂盒中，也可以将其配方列明在试剂盒的说明书中由使用者按照说明书中的指示自行配制。 [0047] 本发明的试剂盒中还可以包括相应的阴性对照和/或阳性对照样本。 [0048] 本发明的引物(包括内引物、外引物和/或特异性扩增辅助引物)、芯片(包括固相支持物、短探针、长探针、各种指控探针)及其试剂盒(包括引物、芯片和/或其他试剂)可以针对表2中的一个基因突变进行设计，也可以组合用于检测多个基因突变。 [0049] 用上述引物组进行的等位基因特异性PCR扩增的原理如下(参见图1)： [0050] 1)野生型等位基因内引物和突变型等位基因内引物分别与模板DNA双链的两条单链互补，且3’端正好与SNP位点重合，而引物的3’端是否与模板匹配决定了引物的延伸反应是否可以进行下去；只有当野生型等位基因存在时(即基因型为野生型纯合子或突变杂合子)，野生型等位基因内引物(Inner primer-W)和与之对应的野生型等位基因外引物(Outer primer-W)才可以扩增出包括相应待检测基因突变位点的野生型碱基在内的核苷酸片段；只有当突变型等位基因存在时(即基因型为突变型纯合子或突变杂合子)，突变型等位基因内引物(Inner primer-M)和与之对应的突变型等位基因外引物(Outer primer-M)才可以扩增出包括相应待检测基因突变位点的突变型碱基在内的核苷酸片段。 [0051] 2)在引物的3’端倒数第2或第3位处引入一个人工错配的碱基，可以提高上述延伸反应的特异性。
[0052] 3)所述各个位点共用的特异性扩增辅助引物(GC-primer)的序列与内引物的5’端部分完全一致，在PCR反应的最初循环，该引物不起作用，一旦内引物中的任一条或两条同时与模板结合并延伸，与之相对应的外引物向其5’端方向延伸，就形成了一段可以与GC序列完全互补的序列，在以下的循环延伸反应中，将以此片段为模板，在GC-primer和外引物的作用下进行PCR扩增反应，这样可以使特异性延伸产物的量增加。
[0053] 对GC-primer进行5’端标记，可以使生成的等位基因特异性扩增产物的5′端也带有标记，可以被用来方便地对扩增产物进行检测，避免了对每个待检测基因突变位点的每 条引物都进行标记的麻烦。
[0054] 常见的组合包括：
[0055] 1、以SEQ ID NO.1-8、SEQ ID NO.19-20和SEQ ID NO.27-30所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ ID NO.32-39、SEQ ID NO.50-51和SEQ ID NO.58-61所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQ ID NO.62-69、SEQID NO.80-81和SEQ IDNO.88-91所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测与磺脲类降糖药(甲苯磺丁脲、格列本脲等)的反应性密切相关的rs1057910、rs3758581、rs17878459、rs4986893、rs1801278、rs5219、rs12255372这7种基因突变，确定患者对磺脲类降糖药的个体反应性。
[0056] 2、以SEQ ID NO.11-18和SEQ ID NO.27-30所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ ID NO.42-49和SEQ ID NO.58-61所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQ ID NO.72-79和SEQID NO.88-91所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测与双胍类降糖药(二甲双胍)的反应性密切相关的rs4646277、rs2282143、rs628031、rs316019、rs5219、rs12255372这6种基因突变，确定患者对双胍类降糖药的个体反应性；
[0057] 3、以SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.9-10所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ ID NO.32-33和SEQID NO.40-41所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQ ID NO.62-63和SEQ ID NO.70-71所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测与氯苯茴酸类降糖药(瑞格列奈、那格列奈)的反应性密切相关的rs1057910、rs4149056这2种基因突变，确定患者对氯苯茴酸类降糖药的个体反应性；
[0058] 4、以SEQ ID NO.21-26所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ ID NO.52-57所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQ ID NO.82-87所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测与噻唑啉二酮类类降糖药(罗格列酮等)的反应性密切相关的rs1805192、rs2241766、rs1501299这3种基因突变，确定患者对噻唑啉二酮类类降糖药的个体反应性；
[0059] 较为优选的实施方案为，以SEQ ID NO.1-30所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ ID NO.32-61所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQ ID NO.62-91所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测与上述各类降糖药的反应性密切相关的rs1057910、rs3758581、rs17878459、rs4986893、rs4149056、rs4646277、rs2282143、rs628031、rs316019、rs1801278、rs1805192、 rs2241766、rs1501299、rs5219、rs12255372
[0060] 这15种基因突变，确定患者对各类常见降糖药的个体反应性。
[0061] 本发明的基因芯片可以根据点样区域的数目分为1人份、2人份和多人份不等，本发明根据实际应用的需要优选2人份的设计方案，即在基片上设置2个点样区域，分别点上所需的探针，一次可检测2份生物样品。
[0062] 本发明的优点包括：
[0063] 1、可以全面、系统、高通量地检测已知的与糖尿病治疗药物反应个体差异密切相关的基因突变，并可针对不同药物制定出相应的调整方案。
[0064] 2、与PCR-RFLP和测序法相比较，本发明环境污染轻，操作简单快捷。 [0065] 3、与常用的SSOP芯片相比较，本发明通过等位基因特异性扩增和设置两对等位基因特异性探针(短探针和长探针)，极大的提高了探针杂交的特异性，可以克服SSOP芯片检测中不可避免的非特异性杂交现象，实现野生型探针与突变型探针检测的“全或无”，极大地提高了芯片检测的准确性和特异性。
[0066] 4、另外，本发明没有在每个等位基因特异性引物上设置标记，而是将标记统一设置在特异性扩增辅助引物上，一次标记就可以满足各种等位基因特异性扩增的需要，减少了芯片检测的成本。
[0068] 图1本发明技术路线图；
[0069] 图2为实施例1双探针基因突变检测芯片平面图；
[0070] 图3为实施例2芯片扫描图；
[0071] 图4为糖尿病药物治疗相关基因突变芯片检测系统的流程图；
[0072] 具体实施方式
[0073] 下面，结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。本实施例中的探针和引物的设计与合成、芯片制备等均是本领域一般技术人员熟练掌握的技能，详细操作步骤可参阅《分子克隆试验指南》(([美]J.萨姆布鲁克著，科学出版社) [0074] 【实施例1】基于等位基因特异性扩增的双探针糖尿病药物治疗相关基因突变芯片检测系统的制备。
[0075] 1、制备流程
[0076] 见附图4。
[0077] 2、制备所需的主要原辅材料及仪器设备
[0078] 表6
[0079]试剂和仪器设备 产地 试剂纯度/浓度
空白超平片 上海百傲科技有限公司 /
氨基硅烷试剂 Acros(美国) 99wt.％
戊二醛 Acros(美国) 25wt.％
95％乙醇 上海化工厂 分析纯
冰乙酸 上海化工厂 分析纯
NaBH4 上海化工厂 分析纯
Na2HPO4 上海化工厂 分析纯
KH2PO4 上海化工厂 分析纯
Na2CO3 上海化工厂 分析纯
NaHCO3 上海化工厂 分析纯
氨基修饰寡核苷酸探针 上海Invitrogen公司 ≥99％
Cy5荧光标记引物 上海Invitrogen公司 ≥99％
普通引物 上海Invitrogen公司 ≥95％
rTaq DNA多聚酶 大连宝生物工程有限公司 5u/μl
dNTPs 大连宝生物工程有限公司 ＞98％2.5mM
dUTP Promega ＞98％100mM
尿嘧啶糖基化酶(UNG) Promega ＞98％1u/μl
DNA纯化试剂盒 Promega /
PCR仪 德国Biometra T1 Thermocycle /
DNA合成仪 ABI公司EXPEDITE8909 /
点样仪 德国GeSIM公司Nano-plotter 1.2 /
扫描仪 Axon GenePix4100A /
台式离心机 德国Heraeus Legent Mach 1.6R /
低温恒温槽 上海精宏公司DKB-2015型 /
纯水仪 台湾艾科浦AML-1-10-S /
空白超平片 上海百傲科技有限公司 /
氨基硅烷试剂 Acros(美国) 99wt.％
戊二醛 Acros(美国) 25wt.％
95％乙醇 上海化工厂 分析纯
冰乙酸 上海化工厂 分析纯
NaBH4 上海化工厂 分析纯
Na2HPO4 上海化工厂 分析纯
KH2PO4 上海化工厂 分析纯
Na2CO3 上海化工厂 分析纯
NaHCO3 上海化工厂 分析纯
氨基修饰寡核苷酸探针 上海Invitrogen公司 ≥99％
Cy5荧光标记引物 上海Invitrogen公司 ≥99％
普通引物 上海Invitrogen公司 ≥95％
rTaq DNA多聚酶 大连宝生物工程有限公司 5u/μl
dNTPs 大连宝生物工程有限公司 ＞98％2.5mM
dUTP Promega ＞98％100mM
尿嘧啶糖基化酶(UNG) Promega ＞98％1u/μl
DNA纯化试剂盒 Promega /
PCR仪 德国Biometra T1 Thermocycle /
DNA合成仪 ABI公司EXPEDITE8909 /
点样仪 德国GeSIM公司Nano-plotter 1.2 /
扫描仪 Axon GenePix4100A /
台式离心机 德国Heraeus Legent Mach 1.6R /
低温恒温槽 上海精宏公司DKB-2015型 /
纯水仪 台湾艾科浦AML-1-10-S /
[0080] 3、详细制备过程
[0081] 3.1芯片检测位点的选取
[0082] 选 取 表 2 中 的 rs1057910、rs3758581、rs17878459、rs4986893、rs4149056、rs4646277、rs2282143、rs628031、rs316019、rs1801278、rs1805192、rs2241766、rs1501299、rs5219、rs12255372这15种基因突变作为本实施例的目标检测位点。 [0083] 3.2寡核苷酸探针的设计与合成
[0084] 根据表4的序列，结合实验条件优化选取包括基因突变位点(方框内的碱基)在内的连续14-25个碱基组成本实施例的等位基因特异性短探针，具体序列如下： [0085] 表7
[0086]
[0087]
[0088] 本实施例的等位基因特异性长探针序列如图5所示。
[0089] 上述等位基因特异性短探针和长探针在确定序列构成后委托上海Invitrogen公司合成。
[0090] 3.3芯片制备
[0091] 第一步：处理基片——选用76mm×25mm×1mm超平片，将超平片浸于新配的重铬酸钾洗液中，放置7天后，用去离子水清洗，晾干；配制氨基硅烷的乙醇溶液，浓度分别为2％，将玻片浸入上述溶液中分别作用15分钟，取出用去离子水洗净，晾干；将上述氨基化处理的超平片分别浸入5％的戊二醛PBS(0.2mol/lM，pH8.0)溶液中，分别作用30分钟，PBS溶液清洗晾干。
[0092] 第二步：设置点样区域——按图2所示的糖尿病药物治疗相关基因突变检测芯片平面结构图，在一块玻璃介质的基片上划分为两个基因探针点样区域，每个点样区域的面积为10mm*12mm，在每个点样区域内如表8所示呈阵列式分布以下基因探针，其中W-短探针、W-长探针、M-短探针、M-长探针分别代表每个基因突变位点的野生型等位基因短探针、野生型等位基因长探针、突变型等位基因短探针、突变型等位基因长探针。 [0093] 表8
[0094]行数 位点 1-5点 6-10点 11-15点 16-20点
1 rs1057910 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
2 rs3758581 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
3 rs17878459 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
4 rs4986893 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
5 rs4149056 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
6 rs4646277 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
7 rs2282143 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
8 rs628031 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
9 rs316019 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
10 rs1801278 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
11 rs1805192 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
12 rs2241766 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
13 rs1501299 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
14 rs5219 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
15 rs12255372 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
1 rs1057910 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
2 rs3758581 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
3 rs17878459 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
4 rs4986893 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
5 rs4149056 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
6 rs4646277 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
7 rs2282143 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
8 rs628031 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
9 rs316019 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
10 rs1801278 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
11 rs1805192 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
12 rs2241766 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
13 rs1501299 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
14 rs5219 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
15 rs12255372 W-短探针 W-长探针 M-短探针 M-长探针
[0095]
[0096] 第三步：点样与点样后处理——探针溶液各取2μl，用点样仪按上述格式打印到处理过的基片上；室温干燥放置18小时；干燥后立即使用或贮存于4℃备用。 [0097] 3.4引物的设计与合成
[0098] 根据表3的序列，结合实验条件优化选取每个位点的inner P-W和inner P-M两个序列的3’端连续17-30个碱基(包括3’端的野生型或突变型碱基在内)作为该位点野生型等位基因内引物和突变型等位基因内引物的序列，为提高等位基因特异性扩增的特异性，在每个序列的3’端倒数第3个碱基处引入一个人工错配的碱基。其具体序列如下表所示。
[0099] 表9
[0100]
[0101]
[0102] 相应的野生型等位基因外引物和突变型等位基因外引物利用本领域技术人员熟知的设计方法确定其序列。
[0103] 特异性扩增辅助引物的序列如SEQ ID N0：31所示。
[0104] 上述确定了序列的引物委托上海Invitrogen公司合成，所有等位基因特异性内引物的5’端均连接上了与特异性扩增辅助引物完全相同的一段GC序列，特异性扩增辅助引物的5’端用荧光分子Cy5进行标记。
[0105] 3.5基于等位基因特异性扩增的双探针糖尿病药物治疗相关基因突变芯片检测系统的构成。
[0106] 检测系统主要由寡核苷酸芯片、杂交液、洗涤母液、各检测基因位点的PCR反应液(包括引物、dNTP、buffer等)、没有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶和阳性参照DNA标本等组分构成，寡核苷酸芯片4℃冷藏保存，其他组分于-20℃冷冻保存，其中PCR反应液需避光。
[0107] 【实施例2】用实施例1的芯片检测系统检测已知基因型的临床样本的糖尿病药物治疗相关基因突变。
[0108] 1、临床样本的处理
[0109] 采集某已知基因型(用金标准测序法确定)的待检测个体的外周静脉血2ml，使用Promega DNA抽提试剂盒抽提DNA，也可用自配的DNA抽提试剂进行抽提，两种方法均为本领域技术人员所公知。DNA浓度应大200ng/ul，用紫外分光光度计检测A260/A280比值，此比值应介于1.60～1.80之间。
[0110] 经测序检测，该样本的15个糖尿病药物治疗相关基因突变的基因型为：rs1057910-WW、rs3758581-WM、rs17878459-WW、rs4986893-WW、rs4149056-MM、rs4646277-WW、rs2282143-WM、rs628031-MM、rs316019-WW、rs1801278-WM、rs1805192-WW、rs2241766-WW、rs1501299-WM、rs5219-WW、rs122553722-WW。
[0111] 2、PCR扩增
[0112] 针对每个突变位点的PCR反应体系为：模板DNA 50ng；野生型等位基因外引物0.4μmol/L；突变型等位基因外引物0.4μmol/L；野生型等位基因内引物0.7μmol/L；突变型等位基因内引物0.7μmol/L；特异性扩增辅助引物0.7μmol/L；Hotstar Taq DNA聚合酶0.375U，2.5mmol/L的dNTP混合物1.2ul；10倍浓度的PCR Bufer 1.5ul；灭菌蒸馏水(使最终体积为20ul)。PCR反应程序为：95℃预变性6min，热循环40次(95℃，30S；56℃，
30s；72℃，40s)，72℃延伸10min，4℃保存。本实施例共扩增对应15个基因检测位点的15管PCR产物。
30s；72℃，40s)，72℃延伸10min，4℃保存。本实施例共扩增对应15个基因检测位点的15管PCR产物。
[0113] 用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域的公知技术，其中的关键在于引物设计，利用本发明公布的引物序列，本领域的技术人员可根据经验或有关文献确定反应体系和扩增程序，独立完成该操作步骤。
[0114] 3、芯片杂交
[0115] 取经43℃预热的杂交液7.5μL，加入15管PCR产物各3μL，混匀，全部吸取混合液转移到芯片的点样区域；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进43℃水浴保温2小时。
[0116] 本发明扩增产物与基因芯片之间的杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般技术人员依照经验可以确定有关缓冲液、样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。
[0117] 4、洗片
[0118] 打开杂交舱，取出芯片，用洗涤液漂洗30秒，再置于去离子水中于室温洗涤30秒，取 出，在离心机上瞬时离心30秒，甩去芯片上残留液体。
[0119] 5、扫描
[0120] 将干燥后的芯片立即用GenePix4100A扫描仪扫描，PMT设置为600，激光波长为635nm；扫描图像用扫描仪自带的图像分析软件GenePix 6.0对扫描结果进行定量分析，并保存分析结果。
[0121] 通过芯片扫描仪得到的扫描图谱为一矩阵图谱，探针分布如表8所示，当某一位点的野生型短探针和长探针同时出现信号时该位点为野生型，当该位点的突变型短探针和长探针同时出现信号时该位点为突变型，当四个探针同时出现信号时为杂合子。 [0122] 芯片扫描结果如下：
[0123]行数 位点 1-5点 6-10点 11-15点 16-20点
1 rs1057910 有信号 有信号 无信号 无信号
2 rs3758581 有信号 有信号 有信号 有信号
3 rs17878459 有信号 有信号 无信号 无信号
4 rs4986893 有信号 有信号 无信号 无信号
5 rs4149056 无信号 无信号 有信号 有信号
6 rs4646277 有信号 有信号 无信号 无信号
7 rs2282143 有信号 有信号 有信号 有信号
8 rs628031 无信号 无信号 有信号 有信号
9 rs316019 有信号 有信号 无信号 无信号
10 rs1801278 有信号 有信号 有信号 有信号
11 rs1805192 有信号 有信号 无信号 无信号
12 rs2241766 有信号 有信号 无信号 无信号
13 rs1501299 有信号 有信号 有信号 有信号
14 rs5219 有信号 有信号 无信号 无信号
15 rs12255372 有信号 有信号 无信号 无信号
1 rs1057910 有信号 有信号 无信号 无信号
2 rs3758581 有信号 有信号 有信号 有信号
3 rs17878459 有信号 有信号 无信号 无信号
4 rs4986893 有信号 有信号 无信号 无信号
5 rs4149056 无信号 无信号 有信号 有信号
6 rs4646277 有信号 有信号 无信号 无信号
7 rs2282143 有信号 有信号 有信号 有信号
8 rs628031 无信号 无信号 有信号 有信号
9 rs316019 有信号 有信号 无信号 无信号
10 rs1801278 有信号 有信号 有信号 有信号
11 rs1805192 有信号 有信号 无信号 无信号
12 rs2241766 有信号 有信号 无信号 无信号
13 rs1501299 有信号 有信号 有信号 有信号
14 rs5219 有信号 有信号 无信号 无信号
15 rs12255372 有信号 有信号 无信号 无信号
[0124] 由扫描图可知本发明的基于等位基因特异性扩增的双探针芯片检测系统在进行检测时无非特异性杂交现象出现。
[0125] 6、分析确定基因型
[0126] 利用与芯片检测系统配套的结果分析软件进行结果分析与整理，由上述杂交图扫描结果可确定各位点的基因型如下：rs1057910-WW、rs3758581-WM、rs17878459-WW、 rs4986893-WW、rs4149056-MM、rs4646277-WW、rs2282143-WM、rs628031-MM、rs316019-WW、rs1801278-WM、rs1805192-WW、rs2241766-WW、rs1501299-WM、rs5219-WW、rs122553722-WW。 [0127] 与测序结果相对照，所有位点的检测结果均准确无误。
[0130] <110>中南大学
[0131] <120>一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒
[0132] <160>151
[0133] <170>PatentIn version 3.5
[0134] <210>1
[0135] <211>30
[0136] <212>DNA
[0137] <213>人工序列
[0138] <400>1
[0139] atgctgtggt gcacgaggtc cagagataca 30
[0140] <210>2
[0141] <211>30
[0142] <212>DNA
[0143] <213>人工序列
[0144] <400>2
[0145] atggggcagg ctggtgggga gaaggtcaag 30
[0146] <210>3
[0147] <211>30
[0148] <212>DNA
[0149] <213>人工序列
[0150] <400>3
[0151] ctaaagtcca ggaagagatt gaacgtgtca 30
[0152] <210>4
[0153] <211>30
[0154] <212>DNA
[0155] <213>人工序列
[0156] <400>4
[0157] ctgcatgcag gggctccggt ttctgccaac 30
[0158] <210>5
[0159] <211>30
[0160] <212>DNA
[0161] <213>人工序列
[0162] <400>5
[0163] gtgaaggaag ccctgattga tcttggagag 30
[0164] <210>6
[0165] <211>30
[0166] <212>DNA
[0167] <213>人工序列
[0168] <400>6
[0169] agtgggaaat ggcctcttcc agaaaactcg 30
[0170] <210>7
[0171] <211>30
[0172] <212>DNA
[0173] <213>人工序列
[0174] <400>7
[0175] tgaaaacatc aggattgtaa gcaccccctg 30
[0176] <210>8
[0177] <211>30
[0178] <212>DNA
[0179] <213>人工序列
[0180] <400>8
[0181] gaagcaaaaa acttggcctt acctggatct 30
[0182] <210>9
[0183] <211>30
[0184] <212>DNA
[0185] <213>人工序列
[0186] <400>9
[0187] ggaatctggg tcatacatgt ggatatatgt 30
[0188] <210>10
[0189] <211>30
[0190] <212>DNA
[0191] <213>人工序列
[0192] <400>10
[0193] ctattccacg aagcatatta cccatgaacg 30
[0194] <210>11
[0195] <211>30
[0196] <212>DNA
[0197] <213>人工序列
[0198] <400>11
[0199] agtgatgagt ggtgttcgca ggtgtgtgcc 30
[0200] <210>12
[0201] <211>30
[0202] <212>DNA
[0203] <213>人工序列
[0204] <400>12
[0205] tttgtgataa cagccaccga ggggactcca 30
[0206] <210>13
[0207] <211>30
[0208] <212>DNA
[0209] <213>人工序列
[0210] <400>13
[0211] cccttcattt gcagacctgt tccgcacgcc 30
[0212] <210>14
[0213] <211>30
[0214] <212>DNA
[0215] <213>人工序列
[0216] <400>14
[0217] tcaggatgaa ggtgcgcttc ctcaggcgca 30
[0218] <210>15
[0219] <211>30
[0220] <212>DNA
[0221] <213>人工序列
[0222] <400>15
[0223] accgcgtggg ccgcatctac cccatggcca 30
[0224] <210>16
[0225] <211>30
[0226] <212>DNA
[0227] <213>人工序列
[0228] <400>16
[0229] gcaggctgcc cccgccaaca aatttgacac 30
[0230] <210>17
[0231] <211>30
[0232] <212>DNA
[0233] <213>人工序列
[0234] <400>17
[0235] ctcactggag gtggttgcag ttcacagttg 30
[0236] <210>18
[0237] <211>30
[0238] <212>DNA
[0239] <213>人工序列
[0240] <400>18
[0241] atagagcaag aagaagaagt tgggcagaga 30
[0242] <210>19
[0243] <211>30
[0244] <212>DNA
[0245] <213>人工序列
[0246] <400>19
[0247] agatgggcag actgggccct gcacctcccg 30
[0248] <210>20
[0249] <211>30
[0250] <212>DNA
[0251] <213>人工序列
[0252] <400>20
[0253] ccgggtaggc ctgcaaatgc tagcagccct 30
[0254] <210>21
[0255] <211>30
[0256] <212>DNA
[0257] <213>人工序列
[0258] <400>21
[0259] ccatggttga cacagagatg ccattctggc 30
[0260] <210>22
[0261] <211>30
[0262] <212>DNA
[0263] <213>人工序列
[0264] <400>22
[0265] atccacggag ctgatcccaa agttggtggc 30
[0266] <210>23
[0267] <211>30
[0268] <212>DNA
[0269] <213>人工序列
[0270] <400>24
[0271] gctgttctac tgctattagc tctgcccggt 30
[0272] <210>23
[0273] <211>30
[0274] <212>DNA
[0275] <213>人工序列
[0276] <400>24
[0277] ggcccttgag tcgtggtttc ctggtcatgc 30
[0278] <210>25
[0279] <211>30
[0280] <212>DNA
[0281] <213>人工序列
[0282] <400>25
[0283] cctcctacac tgatataaac tatatgaagg 30
[0284] <210>26
[0285] <211>30
[0286] <212>DNA
[0287] <213>人工序列
[0288] <400>26
[0289] tgtgtctagg ccttagttaa taatgaatga 30
[0290] <210>27
[0291] <211>30
[0292] <212>DNA
[0293] <213>人工序列
[0294] <400>27
[0295] tgctgacacg cctggcagag gaccctgccg 30
[0296] <210>28
[0297] <211>30
[0298] <212>DNA
[0299] <213>人工序列
[0300] <400>28
[0301] cctccgctgg cgggcacggt acctgggctt 30
[0302] <210>29
[0303] <211>30
[0304] <212>DNA
[0305] <213>人工序列
[0306] <400>29
[0307] gagctgccca ggaatatcca ggcaagaatg 30
[0308] <210>30
[0309] <211>30
[0310] <212>DNA
[0311] <213>人工序列
[0312] <400>30
[0313] agaggcctga gtaattatca gaatatggta 30
[0314] <210>31
[0315] <211>11
[0316] <212>DNA
[0317] <213>人工序列
[0318] <400>31
[0319] gcgggcggcg c 11
[0320] <210>32
[0321] <211>41
[0322] <212>DNA
[0323] <213>人工序列
[0324] <400>32
[0325] gctggtgggg agaaggtcaa tgtatctctg gacctcgtgc a 41
[0326] <210>33
[0327] <211>41
[0328] <212>DNA
[0329] <213>人工序列
[0330] <400>33
[0331] tgcacgaggt ccagagatac cttgaccttc tccccaccag c 41
[0332] <210>34
[0333] <211>41
[0334] <212>DNA
[0335] <213>人工序列
[0336] <400>34
[0337] ggggctccgg tttctgccaa tgacacgttc aatctcttcc t 41
[0338] <210>35
[0339] <211>41
[0340] <212>DNA
[0341] <213>人工序列
[0342] <400>35
[0343] aggaagagat tgaacgtgtc gttggcagaa accggagccc c 41
[0344] <210>36
[0345] <211>41
[0346] <212>DNA
[0347] <213>人工序列
[0348] <400>36
[0349] tggcctcttc cagaaaactc ctctccaaga tcaatcaggg c 41
[0350] <210>37
[0351] <211>41
[0352] <212>DNA
[0353] <213>人工序列
[0354] <400>37
[0355] gccctgattg atcttggaga cgagttttct ggaagaggcc a 41
[0356] <210>38
[0357] <211>41
[0358] <212>DNA
[0359] <213>人工序列
[0360] <400>38
[0361] aacttggcct tacctggatc cagggggtgc ttacaatcct g 41
[0362] <210>39
[0363] <211>41
[0364] <212>DNA
[0365] <213>人工序列
[0366] <400>39
[0367] caggattgta agcaccccct agatccaggt aaggccaagt t 41
[0368] <210>40
[0369] <211>41
[0370] <212>DNA
[0371] <213>人工序列
[0372] <400>40
[0373] gaagcatatt acccatgaac acatatatcc acatgtatga c 41
[0374] <210>41
[0375] <211>41
[0376] <212>DNA
[0377] <213>人工序列
[0378] <400>41
[0379] gtcatacatg tggatatatg cgttcatggg taatatgctt c 41
[0380] <210>42
[0381] <211>41
[0382] <212>DNA
[0383] <213>人工序列
[0384] <400>42
[0385] acagccaccg aggggactcc ggcacacacc tgcgaacacc a 41
[0386] <210>43
[0387] <211>41
[0388] <212>DNA
[0389] <213>人工序列
[0390] <400>43
[0391] tggtgttcgc aggtgtgtgc tggagtcccc tcggtggctg t 41
[0392] <210>44
[0393] <211>41
[0394] <212>DNA
[0395] <213>人工序列
[0396] <400>44
[0397] aggtgcgctt cctcaggcgc ggcgtgcgga acaggtctgc a 41
[0398] <210>45
[0399] <211>41
[0400] <212>DNA
[0401] <213>人工序列
[0402] <400>45
[0403] tgcagacctg ttccgcacgc tgcgcctgag gaagcgcacc t 41
[0404] <210>46
[0405] <211>41
[0406] <212>DNA
[0407] <213>人工序列
[0408] <400>46
[0409] ccccgccaac aaatttgaca tggccatggg gtagatgcgg c 41
[0410] <210>47
[0411] <211>41
[0412] <212>DNA
[0413] <213>人工序列
[0414] <400>47
[0415] gccgcatcta ccccatggcc gtgtcaaatt tgttggcggg g 41
[0416] <210>48
[0417] <211>41
[0418] <212>DNA
[0419] <213>人工序列
[0420] <400>48
[0421] gaagaagaag ttgggcagag caactgtgaa ctgcaaccac c 41
[0422] <210>49
[0423] <211>41
[0424] <212>DNA
[0425] <213>人工序列
[0426] <400>49
[0427] ggtggttgca gttcacagtt tctctgccca acttcttctt c 41
[0428] <210>50
[0429] <211>41
[0430] <212>DNA
[0431] <213>人工序列
[0432] <400>50
[0433] cctgcaaatg ctagcagccc cgggaggtgc agggcccagt c 41
[0434] <210>51
[0435] <211>41
[0436] <212>DNA
[0437] <213>人工序列
[0438] <400>51
[0439] gactgggccc tgcacctccc agggctgcta gcatttgcag g 41
[0440] <210>52
[0441] <211>41
[0442] <212>DNA
[0443] <213>人工序列
[0444] <400>52
[0445] gctgatccca aagttggtgg gccagaatgg catctctgtg t 41
[0446] <210>53
[0447] <211>41
[0448] <212>DNA
[0449] <213>人工序列
[0450] <400>53
[0451] acacagagat gccattctgg gccaccaact ttgggatcag c 41
[0452] <210>54
[0453] <211>41
[0454] <212>DNA
[0455] <213>人工序列
[0456] <400>54
[0457] gtcgtggttt cctggtcatg accgggcaga gctaatagca g 41
[0458] <210>55
[0459] <211>41
[0460] <212>DNA
[0461] <213>人工序列
[0462] <400>55
[0463] ctgctattag ctctgcccgg gcatgaccag gaaaccacga c 41
[0464] <210>56
[0465] <211>41
[0466] <212>DNA
[0467] <213>人工序列
[0468] <400>56
[0469] gccttagtta ataatgaatg ccttcatata gtttatatca g 41
[0470] <210>57
[0471] <211>41
[0472] <212>DNA
[0473] <213>人工序列
[0474] <400>57
[0475] ctgatataaa ctatatgaag tcattcatta ttaactaagg c 41
[0476] <210>58
[0477] <211>41
[0478] <212>DNA
[0479] <213>人工序列
[0480] <400>58
[0481] gcgggcacgg tacctgggct cggcagggtc ctctgccagg c 41
[0482] <210>59
[0483] <211>41
[0484] <212>DNA
[0485] <213>人工序列
[0486] <400>59
[0487] gcctggcaga ggaccctgcc aagcccaggt accgtgcccg c 41
[0488] <210>60
[0489] <211>41
[0490] <212>DNA
[0491] <213>人工序列
[0492] <400>60
[0493] agtaattatc agaatatggt cattcttgcc tggatattcc t 41 [0494] <210>61
[0495] <211>41
[0496] <212>DNA
[0497] <213>人工序列
[0498] <400>61
[0499] aggaatatcc aggcaagaat taccatattc tgataattac t 41 [0500] <210>62
[0501] <211>60
[0502] <212>DNA
[0503] <213>人工序列
[0504] <400>62
[0505] ctcacattag gaaacatttc ttgcatagtt ttataaggct ggcataatct taatatcaaa 60 [0506] <210>63
[0507] <211>50
[0508] <212>DNA
[0509] <213>人工序列
[0510] <400>63
[0511] tatcagctaa agtccaggaa gagattgaac gtgtgattgg cagaaaccgg 50 [0512] <210>64
[0513] <211>60
[0514] <212>DNA
[0515] <213>人工序列
[0516] <400>64
[0517] cagtgtactg ttcacagaaa ttccaatgaa tctagagata aattatgaat agtgattagt 60 [0518] <210>65
[0519] <211>50
[0520] <212>DNA
[0521] <213>人工序列
[0522] <400>65
[0523] ttatcatcaa ttgtcatatt ctttgtctct tcttacagtt ttcgtcttga 50 [0524] <210>66
[0525] <211>50
[0526] <212>DNA
[0527] <213>人工序列
[0528] <400>66
[0529] agacaatttg acttcctctc atcctatttc aataccattt atttctttct 50 [0530] <210>67
[0531] <211>53
[0532] <212>DNA
[0533] <213>人工序列
[0534] <400>67
[0535] gcctgtgtga ctgaataaaa gcatacaaat acaatgaaaa tatgaatcta agt 53 [0536] <210>68
[0537] <211>50
[0538] <212>DNA
[0539] <213>人工序列
[0540] <400>68
[0541] agtaaacaca aaactagtca atgaatcaca aatacgcaag cagtcacata 50 [0542] <210>69
[0543] <211>50
[0544] <212>DNA
[0545] <213>人工序列
[0546] <400>69
[0547] gttaattcga gattaatgta aaagtgatgt gttgatttta tgcatgccaa 50 [0548] <210>70
[0549] <211>50
[0550] <212>DNA
[0551] <213>人工序列
[0552] <400>70
[0553] atcaaaagga ggaatatagg gaatacagtg gggttggagg taaggtgatg 50 [0554] <210>71
[0555] <211>68
[0556] <212>DNA
[0557] <213>人工序列
[0558] <400>71
[0559] gcagcataag aatggactaa tacaccatat tgtcaaagtt tgcaaagtga atataaatta60
[0560] cttgtact 68 [0561] <210>72
[0562] <211>50
[0563] <212>DNA
[0564] <213>人工序列
[0565] <400>72
[0566] ccagaaccca gccccagatt cagtgatgtg agatacccct tcctagattt 50 [0567] <210>73
[0568] <211>50
[0569] <212>DNA
[0570] <213>人工序列
[0571] <400>73
[0572] agtctttgag ttgtaccctc ctcgtcccat ttgaaatcct ggtgtcatcg 50 [0573] <210>74
[0574] <211>50
[0575] <212>DNA
[0576] <213>人工序列
[0577] <400>74
[0578] ttgctttatg agctgtgtca ccttgaggaa gttaactaac ctctctgggg 50 [0579] <210>75
[0580] <211>50
[0581] <212>DNA
[0582] <213>人工序列
[0583] <400>75
[0584] gtgaaatcta ggaaggggta tctcacatca ctgaatctgg ggctgggttc 50 [0585] <210>76
[0586] <211>51
[0587] <212>DNA
[0588] <213>人工序列
[0589] <400>76
[0590] tggactgtaa aactttgaat aatgacaccc agcttataga tcaacattag a 51 [0591] <210>77
[0592] <211>50
[0593] <212>DNA
[0594] <213>人工序列
[0595] <400>77
[0596] ttgctctagg gcattctaaa cccagtgatt catgctcttt ctccatctgc 50 [0597] <210>78
[0598] <211>50
[0599] <212>DNA
[0600] <213>人工序列
[0601] <400>78
[0602] tgattgattg gtatggtctg tctggagtgt catgttggcc ttatctgtga 50 [0603] <210>79
[0604] <211>50
[0605] <212>DNA
[0606] <213>人工序列
[0607] <400>79
[0608] cctattcctt agtagccaga gttacagtta agttccatat actataagag 50 [0609] <210>80
[0610] <211>50
[0611] <212>DNA
[0612] <213>人工序列
[0613] <400>80
[0614] tgcttctgga aactgatgct ggcataggcg cttaaatcct cacttgagcg 50 [0615] <210>81
[0616] <211>50
[0617] <212>DNA
[0618] <213>人工序列
[0619] <400>81
[0620] atgcaggtgg atgactctgt ggtggcccag aacatgcacg agaccatcct 50 [0621] <210>82
[0622] <211>50
[0623] <212>DNA
[0624] <213>人工序列
[0625] <400>82
[0626] gtcatacttg taatctgcaa ccactggatc tgttcttgtg aatggaatgt 50 [0627] <210>83
[0628] <211>50
[0629] <212>DNA
[0630] <213>人工序列
[0631] <400>83
[0632] tatcacaaaa cagcctagac agcactaata aggtggttat gttcttttct 50 [0633] <210>84
[0634] <211>50
[0635] <212>DNA
[0636] <213>人工序列
[0637] <400>84
[0638] ctgtgatgaa agaggccaga aacattctta cctggatctc ctttctcacc 50 [0639] <210>85
[0640] <211>50
[0641] <212>DNA
[0642] <213>人工序列
[0643] <400>85
[0644] tgggaaaatt agaggagtgt catctgtgca atcactgaat tcataatctt 50 [0645] <210>86
[0646] <211>50
[0647] <212>DNA
[0648] <213>人工序列
[0649] <400>86
[0650] gaatcagaat atgaatgtac tgggaatagg gatgagggtg aagatgggaa 50 [0651] <210>87
[0652] <211>50
[0653] <212>DNA
[0654] <213>人工序列
[0655] <400>87
[0656] agagattaga caggggagga ggggcagcta aagatggctc aggcaaacaa 50 [0657] <210>88
[0658] <211>50
[0659] <212>DNA
[0660] <213>人工序列
[0661] <400>88
[0662] gttctgcacg atgaggatca ggatggccag tgggcactcc tcagtcacca 50 [0663] <210>89
[0664] <211>50
[0665] <212>DNA
[0666] <213>人工序列
[0667] <400>89
[0668] gaagtgaagt gggacccagg tggaggtaag gaagagtctg gtggggagtt 50 [0669] <210>90
[0670] <211>50
[0671] <212>DNA
[0672] <213>人工序列
[0673] <400>90
[0674] tgggatgggc tgatgggttg aatgtggggt atgaaagaaa agagcaatcg 50 [0675] <210>91
[0676] <211>50
[0677] <212>DNA
[0678] <213>人工序列
[0679] <400>91
[0680] catttgatga ttgttttgtt aatggcttgc aggtcagatt ttcatctttt 50 [0681] <210>92
[0682] <211>18
[0683] <212>DNA
[0684] <213>人工序列
[0685] <400>92
[0686] aggtcaatgt atctctgg 18 [0687] <210>93
[0688] <211>18
[0689] <212>DNA
[0690] <213>人工序列
[0691] <400>93
[0692] gagatacctt gaccttct 18
[0693] <210>94
[0694] <211>17
[0695] <212>DNA
[0696] <213>人工序列
[0697] <400>94
[0698] ctgccaatga cacgttc 17
[0699] <210>95
[0700] <211>17
[0701] <212>DNA
[0702] <213>人工序列
[0703] <400>95
[0704] acgtgtcgtt ggcagaa 17
[0705] <210>96
[0706] <211>21
[0707] <212>DNA
[0708] <213>人工序列
[0709] <400>96
[0710] cagaaaactc ctctccaaga t 21
[0711] <210>97
[0712] <211>21
[0713] <212>DNA
[0714] <213>人工序列
[0715] <400>97
[0716] atcttggaga cgagttttct g 21
[0717] <210>98
[0718] <211>21
[0719] <212>DNA
[0720] <213>人工序列
[0721] <400>98
[0722] ttacctggat ccagggggtg c 21
[0723] <210>99
[0724] <211>13
[0725] <212>DNA
[0726] <213>人工序列
[0727] <400>99
[0728] caccccctag atc 13
[0729] <210>100
[0730] <211>13
[0731] <212>DNA
[0732] <213>人工序列
[0733] <400>100
[0734] ccatgaacac ata 13
[0735] <210>101
[0736] <211>14
[0737] <212>DNA
[0738] <213>人工序列
[0739] <400>101
[0740] tatatgcgtt catg 14
[0741] <210>102
[0742] <211>14
[0743] <212>DNA
[0744] <213>人工序列
[0745] <400>102
[0746] gactccggca caca 14
[0747] <210>103
[0748] <211>16
[0749] <212>DNA
[0750] <213>人工序列
[0751] <400>103
[0752] aggtgtgtgc tggagt 16
[0753] <210>104
[0754] <211>16
[0755] <212>DNA
[0756] <213>人工序列
[0757] <400>104
[0758] caggcgcggc gtgcgg 16
[0759] <210>105
[0760] <211>16
[0761] <212>DNA
[0762] <213>人工序列
[0763] <400>105
[0764] cgcacgctgc gcctga 16
[0765] <210>106
[0766] <211>16
[0767] <212>DNA
[0768] <213>人工序列
[0769] <400>106
[0770] atttgacatg gccatg 16
[0771] <210>107
[0772] <211>16
[0773] <212>DNA
[0774] <213>人工序列
[0775] <400>107
[0776] ccatggccgt gtcaaa 16
[0777] <210>108
[0778] <211>15
[0779] <212>DNA
[0780] <213>人工序列
[0781] <400>108
[0782] tgggcagagc aactg 15
[0783] <210>109
[0784] <211>15
[0785] <212>DNA
[0786] <213>人工序列
[0787] <400>109
[0788] ttcacagttt ctctg 15
[0789] <210>110
[0790] <211>13
[0791] <212>DNA
[0792] <213>人工序列
[0793] <400>110
[0794] gcagccccgg gag 13
[0795] <210>111
[0796] <211>13
[0797] <212>DNA
[0798] <213>人工序列
[0799] <400>111
[0800] acctcccagg gct 13
[0801] <210>112
[0802] <211>15
[0803] <212>DNA
[0804] <213>人工序列
[0805] <400>112
[0806] tggtgggcca gaatg 15
[0807] <210>113
[0808] <211>15
[0809] <212>DNA
[0810] <213>人工序列
[0811] <400>113
[0812] ttctgggcca ccaac 15
[0813] <210>114
[0814] <211>15
[0815] <212>DNA
[0816] <213>人工序列
[0817] <400>114
[0818] tggtcatgac cgggc 15
[0819] <210>115
[0820] <211>15
[0821] <212>DNA
[0822] <213>人工序列
[0823] <400>115
[0824] ctgcccgggc atgac 15
[0825] <210>116
[0826] <211>16
[0827] <212>DNA
[0828] <213>人工序列
[0829] <400>116
[0830] taatgaatgc cttcat 16
[0831] <210>117
[0832] <211>16
[0833] <212>DNA
[0834] <213>人工序列
[0835] <400>117
[0836] tatatgaagt cattca 16
[0837] <210>118
[0838] <211>14
[0839] <212>DNA
[0840] <213>人工序列
[0841] <400>118
[0842] ctgggctcgg cagg 14
[0843] <210>119
[0844] <211>14
[0845] <212>DNA
[0846] <213>人工序列
[0847] <400>119
[0848] ccctgccaag ccca 14
[0849] <210>120
[0850] <211>17
[0851] <212>DNA
[0852] <213>人工序列
[0853] <400>120
[0854] aatatggtca ttcttgc 17
[0855] <210>121
[0856] <211>17
[0857] <212>DNA
[0858] <213>人工序列
[0859] <400>121
[0860] gcaagaatta ccatatt 17
[0861] <210>122
[0862] <211>20
[0863] <212>DNA
[0864] <213>人工序列
[0865] <400>122
[0866] gcacgaggtc cagagattca 20
[0867] <210>123
[0868] <211>24
[0869] <212>DNA
[0870] <213>人工序列
[0871] <400>123
[0872] caggctggtg gggagaaggt ctag 24
[0873] <210>124
[0874] <211>23
[0875] <212>DNA
[0876] <213>人工序列
[0877] <400>124
[0878] ccaggaagag attgaacgtg cca 23
[0879] <210>125
[0880] <211>23
[0881] <212>DNA
[0882] <213>人工序列
[0883] <400>125
[0884] caggggctcc ggtttctgcc tac 23
[0885] <210>126
[0886] <211>22
[0887] <212>DNA
[0888] <213>人工序列
[0889] <400>126
[0890] agccctgatt gatcttggac ag 22
[0891] <210>127
[0892] <211>22
[0893] <212>DNA
[0894] <213>人工序列
[0895] <400>127
[0896] atggcctctt ccagaaaaca cg 22
[0897] <210>128
[0898] <211>21
[0899] <212>DNA
[0900] <213>人工序列
[0901] <400>128
[0902] caggattgta agcaccccat g 21
[0903] <210>129
[0904] <211>20
[0905] <212>DNA
[0906] <213>人工序列
[0907] <400>129
[0908] acttggcctt acctggacct 20
[0909] <210>130
[0910] <211>24
[0911] <212>DNA
[0912] <213>人工序列
[0913] <400>130
[0914] tgggtcatac atgtggatat aagt 24
[0915] <210>131
[0916] <211>23
[0917] <212>DNA
[0918] <213>人工序列
[0919] <400>131
[0920] acgaagcata ttacccatga tcg 23
[0921] <210>132
[0922] <211>21
[0923] <212>DNA
[0924] <213>人工序列
[0925] <400>132
[0926] tggtgttcgc aggtgtgtac c 21
[0927] <210>133
[0928] <211>24
[0929] <212>DNA
[0930] <213>人工序列
[0931] <400>133
[0932] ataacagcca ccgaggggac ttca 24
[0933] <210>134
[0934] <211>24
[0935] <212>DNA
[0936] <213>人工序列
[0937] <400>134
[0938] atttgcagac ctgttccgca cacc 24
[0939] <210>135
[0940] <211>24
[0941] <212>DNA
[0942] <213>人工序列
[0943] <400>135
[0944] tgaaggtgcg cttcctcagg ctca 24
[0945] <210>136
[0946] <211>24
[0947] <212>DNA
[0948] <213>人工序列
[0949] <400>136
[0950] tgggccgcat ctaccccatg gaca 24
[0951] <210>137
[0952] <211>24
[0953] <212>DNA
[0954] <213>人工序列
[0955] <400>137
[0956] tgcccccgcc aacaaatttg atac 24
[0957] <210>138
[0958] <211>25
[0959] <212>DNA
[0960] <213>人工序列
[0961] <400>138
[0962] tggaggtggt tgcagttcac agatg 25
[0963] <210>139
[0964] <211>22
[0965] <212>DNA
[0966] <213>人工序列
[0967] <400>139
[0968] agaagaagaa gttgggcagt ga 22
[0969] <210>140
[0970] <211>22
[0971] <212>DNA
[0972] <213>人工序列
[0973] <400>140
[0974] agactgggcc ctgcacctct cg 22
[0975] <210>141
[0976] <211>21
[0977] <212>DNA
[0978] <213>人工序列
[0979] <400>141
[0980] taggcctgca aatgctagca gcact 25
[0981] <210>142
[0982] <211>21
[0983] <212>DNA
[0984] <213>人工序列
[0985] <400>142
[0986] ttgacacaga gatgccattc tcgc 24
[0987] <210>143
[0988] <211>26
[0989] <212>DNA
[0990] <213>人工序列
[0991] <400>143
[0992] acggagctga tcccaaagtt ggttgc 26
[0993] <210>144
[0994] <211>25
[0995] <212>DNA
[0996] <213>人工序列
[0997] <400>144
[0998] tctactgcta ttagctctgc ccagt 25
[0999] <210>145
[1000] <211>25
[1001] <212>DNA
[1002] <213>人工序列
[1003] <400>145
[1004] ttgagtcgtg gtttcctggt cacgc 25
[1005] <210>146
[1006] <211>22
[1007] <212>DNA
[1008] <213>人工序列
[1009] <400>146
[1010] actgatataa actatatgat gg 22
[1011] <210>147
[1012] <211>24
[1013] <212>DNA
[1014] <213>人工序列
[1015] <400>147
[1016] taggccttag ttaataatga ttga 24
[1017] <210>148
[1018] <211>23
[1019] <212>DNA
[1020] <213>人工序列
[1021] <400>148
[1022] acgcctggca gaggaccctg acg 23
[1023] <210>149
[1024] <211>23
[1025] <212>DNA
[1026] <213>人工序列
[1027] <400>149
[1028] tggcgggcac ggtacctggg ttt 23
[1029] <210>150
[1030] <211>26
[1031] <212>DNA
[1032] <213>人工序列
[1033] <400>150
[1034] tgcccaggaa tatccaggca agactg 26
[1035] <210>151
[1036] <211>23
[1037] <212>DNA
[1038] <213>人工序列
[1039] <400>151
[1040] tgagtaatta tcagaatatg tta 23
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于在体基因治疗的基因编辑组合物或试剂盒 | 2020-05-13 | 6 |
| 治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法 | 2021-02-04 | 6 |
| 一种监测溶瘤性腺病毒体内复制情况和范围的方法 | 2020-10-17 | 5 |
| 细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒 | 2020-08-12 | 1 |
| PCDH17基因的应用 | 2020-07-30 | 6 |
| 基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法 | 2021-09-22 | 0 |
| 一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法 | 2021-10-18 | 0 |
| 一种CpG寡核苷酸及其应用 | 2020-08-28 | 2 |
| 一种端粒酶启动基因表达方法及其应用 | 2021-11-22 | 5 |
| 一种靶向survivin基因的siRNA的结构及其抗肿瘤用途 | 2022-11-08 | 3 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈