所属技术领域
[0001] 本
发明涉及一种小分子干扰核糖核酸(siRNA)，具体为涉及一种抑制ALCAM基因表达的siRNA及其在制备抗
肿瘤药物中的应用。
背景技术
[0002] 癌症对人类健康造成了巨大的威胁，全世界每年约700万人死于癌症，我国每年癌症死亡约130万人，在各类死因中高居第二位。攻克癌症、减轻病人痛苦一直是一个难题。肿瘤的发生、演进、侵袭和转移是一个多基因参与的渐进和积累的过程，涉及众多基因调控、表达、突变等变化。利用分子
生物学技术
治疗癌症的病理根源是为临床提供有效诊治手段的有效途径。
[0003] siRNA由于强
力有的特异性RNA干扰作用，现已成为一种理想的细胞
水平敲除手段。siRNA的出现在
哺乳动物细胞中产生特异的基因表达抑制，使得siRNA为人类
疾病的治疗开创了新的天地。自2001年RNA干扰现象被发现以来，RNA干扰技术的研究、开发和应用得到了迅速发展，2006发明此技术的两位美国科学家Andrew Fire和Craig Mello因此获得了诺贝尔奖。与常规的反义核苷酸技术相比，siRNA抑制基因的表达不但高效特异，而且效应持久、操作简便。人类的许多疾病如肿瘤、传染性疾病等与人体的某些基因大量表达或外来的病毒、细菌基因的表达有密切的因果关系，因此，可以通过向肿瘤细胞或感染细胞中引入siRNA特异性沉默与疾病发生相关的基因，从而达到治疗疾病的目的。美国Sirna Therapeutics，Inc公司获得了血管内皮生长因子(VEGF)的siRNA
专利，这种siRNA能压抑VEGF基因表达，而VEGF基因会刺激老年性黄斑变性患者
视网膜上血管的生长分子，将VEGF的siRNA直接注射到眼部，用以治疗年龄相关的黄斑退化症(UK Patent No.GB2406569，United StatesPatent7022828)。据不完全统计，美国的Alnylam Pharmaceuticals，SirnaTherapeutics，Acuity Pharmaceuticals，Bentitec等生物药物公司已研制治疗
呼吸道疾病、肌肉萎缩、
艾滋病、
肝炎、脑神经退化等多种疾病的siRNA类药物，目前已有多个进入临床前或临床试验。因此，siRNA在治疗和
预防肿瘤发生中机制研究中显示了光明前景。
[0004] ALCAM(活化白细胞粘附分子，Gene ID：214，Location：3q13.1)基因是近年来发现的新基因，它与多种肿瘤的恶性程度相关，有望成为肿瘤检测的新标志物和肿瘤治疗的新靶点。本
发明人发明出一种抑制ALACM基因表达的siRNA序列，并试验证明其有效性。
发明内容
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种特异性抑制ALCAM基因表达的siRNA。
[0006] 本发明提供的抑制ALCAM基因表达的siRNA，包含siRNA1、siRNA2及siRNA3，所述siRNA1、siRNA2及siRNA3的
碱基序列如下：
[0007] siRNA1：正义链5’-GCTAGTGACCGAGGACAAT-3’
[0008] 反义链5’-ATTGTCCTCGGTCACTAGC-3’
[0009] siRNA2：正义链5’-GCATTTCAAGAGACAGTTA-3’
[0010] 反义链5’-TAACTGTCTCTTGAAATGC-3’
[0011] siRNA3：正义链5’-CCATCACAGTTCACTACTT-3’
[0012] 反义链5’-AAGTAGTGAACTGTGATGG-3’
[0013] 抑制ALCAM基因表达的siRNA通过人工合成，可通过载体表达。
[0014] 所述的抑制ALCAM基因表达的siRNA及其表达载体在肿瘤生物治疗中的应用，如肿瘤靶向
基因治疗。
[0015] 本发明提供的siRNA可以特异性抑制ALCAM基因的表达。rt-RCR实验表明本发明的si-RNA可以特异性的抑制ALCAM基因的转录。免疫组化实验表明本发明的si-RNA可以特异性的抑制ALCAM基因在细胞膜的表达。裸鼠肿瘤模型表明siRNA可抑制肝癌细胞的增殖、并能促进肝癌细胞的凋亡。重要的是实验表明本发明设计的siRNA对正常组织及生理活动没有杀伤及影响作用，却能有效抑制ALCAM基因高表达的肝癌细胞，为预防和治疗肝癌及其他肿瘤提供了一个有效途径和重要可能。
附图说明
[0016] 图1是本发明的si-RNA干扰抑制人肝癌细胞(HepG2细胞)Alcam基因后RT-PCR检测结果图。
[0017] 图2是本发明的si-RNA干扰抑制人肝癌细胞Alcam基因后，免疫组织化学检测Alcam蛋白表达水平变化图。
[0018] 图3是本发明的si-RNA干扰抑制人肝癌细胞并移植于裸鼠体内，肝癌肿
块生长情况图。
具体实施方式
[0019] 下面结合
实施例，对本发明做进一步地详细说明。
[0020] 实施例1：根据生物信息学方法在genebank获取ALCAM的mRNA序列，采用RNA strcture分析
软件对ALCAM mRNA序列的二级结构进行预测，根据siRNA设计原则，综合分析其GC含量、两端自由能大小、mRNA作用位点的二级结构、siRNA对碱基偏爱性等要求。采用NCBI GenBank(美国国立医学图书馆和美国国立卫生研究院编写)提供的BLAST软件，对选择的靶序列进行同源分析，排除siRNA非特异性地抑制其他基因
片段的可能。通过AdEasy将本发明的si-RNA重组于含有红色
荧光蛋白基因的腺病毒。
[0021] 实施例2：本发明的si-RNA干扰人肝癌细胞(HepG2细胞)后RT-PCR检测其ALCAM mRNA表达。取人肝癌细胞，细胞处理及
转染方法如上述，本发明的ALCAM siRNA1、siRNA2、siRNA3浓度均为50nmol/L。转染48h后，TRIZOL(Invitrogen)法常规提取细胞总RNA，ReverTra Dash TMRT-PCR
试剂盒(Toyobo Co.Japan code no.PCR400美津生物公司)反转录为cDNA，PCR条件设置为94℃预变性5min后，94℃持续30s，56℃持续30s，72℃持续1min，共30个循环，72℃后延伸5min。ALCAM扩增引物序列为：P15’agg aca gcc tga agg cat aa3’；P25’ccc cac ttg ggt tta agg at3’，同时扩增GAPDH作为内参，引物序列为P1’5’aac agc ctc aag atc atc agc 3’，P2’5’gga tga tgt tot gga gag cc 3’，扩增产物经琼脂糖
电泳后拍照(图2)，s7-9代表RNA干扰抑制Alcam基因。实验结果表明本发明的si-RNA干扰Alcam基因序列能有效抑制Alcam基因的表达。
[0022] 实施例3：免疫细胞化学法检测本发明的si-RNA干扰人肝癌细胞后其ALCAM蛋白表达。将经过处理的盖玻片置入24孔板，每孔加入1mL5×104/mL浓度的人肝癌细胞，24h后按上述方法进行转染，48h取出玻片，中性缓冲福尔
马林固定，0.3％的Triton-X-100透膜处理，3％甲醇双
氧水(A液)阻断内源性过氧化物酶，血清封闭后加入鼠抗人PCNA单克隆
抗体，37℃孵育2h后，依次加入生物素标记的二抗，
链霉素抗生物素蛋白-过氧化物的三抗，DAB(二
氨基联苯胺)显色，梯度酒精脱水，二
甲苯透明，中性树胶封片。如图2所示，A：正常对照HepG2胞，ALCAM阳性表达于细胞膜(褐色)；B：50nmol/LsiRNA转染后48h HepG2细胞膜ALCAM表达明显降低。
[0023] 实施例4：本发明的si-RNA干扰抑制人肝癌细胞并移植于裸鼠体内，观察肝癌肿块生长情况。人肝癌细胞在37℃，含50mL·L-1CO2
[0024] 孵箱内培养，于含100mL·L-1小
牛血清的RPMI-1640培养液中贴壁生长，以2.5g·L-1胰酶消化液消化传代培养。按上述方法进行转染肝癌细胞。6只4周龄的BALB/cnu/nu裸鼠(雌性)，随机分为两组，第一组每只予以未经si-RNA干扰的0.1mL肝癌细胞悬液注入裸鼠右大腿背侧皮下；第二组每只予以经本发明的si-RNA干扰的0.1mL肝癌细胞悬液注入裸鼠右大腿背侧皮下。22d处死裸鼠后取出瘤体用精密卡尺测量瘤体横径和长径，第一组瘤体平均直径(肿瘤长径和横径之和的均值)为1.83cm，第二组瘤体平均直径为
1.12。
[0025] 综上所述，本发明筛选出的ALCAM siRNA1、siRNA2、siRNA3能够通过高效抑制细胞内ALCAM基因的表达。转染肿瘤细胞，可阻断肿瘤细胞的增殖途径而显著抑制
细胞增殖，明显阻滞细胞周期，并高效诱导肿瘤细胞的凋亡，为ALCAMiRNA应用于
恶性肿瘤的基因治疗奠定了重要的实验
基础。同时，筛选出的ALCAM siRNA序列能高效沉默细胞内ALCAM基因的表达，为ALCAM基因功能的进一步研究奠定基础。
