涉及突变的KRAS或BRAF基因的癌症的治疗
阅读：1036发布：2020-05-21
专利汇可以提供涉及突变的KRAS或BRAF基因的癌症的治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供在受试者中 治疗 癌症的方法，其中癌症包括突变的KRAS或BRAF基因。本方法包括向受试者施用有效量的 抗体 或其 抗原 结合 片段 ，其中抗体或其抗原结合片段与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205。，下面是涉及突变的KRAS或BRAF基因的癌症的治疗专利的具体信息内容。
1.一种抗体在用于制备用来在受试者中治疗癌症的药物中的用途，其中抗体与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205，
其中所述抗体的轻链序列是SEQ ID NO：7和重链序列是SEQ ID NO：50；
其中所述癌症包括突变的KRAS或BRAF基因，癌症选自结肠癌、胰腺癌和胃癌；
其中测试所述癌症中突变的KRAS或BRAF基因的存在。
2.一种抗体在用于制备用来在受试者中治疗癌症的药物中的用途，其中抗体与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205，
其中所述抗体的轻链序列是SEQ ID NO：7和重链序列是SEQ ID NO：25或94；或所述抗体的轻链序列是SEQ ID NO：8和重链序列是SEQ ID NO：26或38；
其中所述癌症包括突变的KRAS或BRAF基因，癌症是结肠癌；
其中测试所述癌症中突变的KRAS或BRAF基因的存在。
涉及突变的KRAS或BRAF基因的癌症的治疗
[0001] 提交数据
[0002] 本申请与2009年11月5日提交的美国专利申请no.61/258518和2010年9月13日提交的澳大利亚专利申请no.2010904107有关，且主张这些专利申请的优先权，这些申请各自的全部内容并入此处作为参考。
技术领域
[0003] 本发明涉及在受试者中治疗癌症的方法，其中癌症包括突变的KRAS或BRAF基因。本方法涉及向受试者施用抗体或其抗原结合片段。本发明还涉及癌症治疗方法，其涉及确定患者的KRAS或BRAF状态。
背景技术
[0004] 碳水化合物结构可以是肿瘤-特异性的或肿瘤-相关性的抗原，且因此成为许多抗体-产生的免疫策略的焦点。然而，由于抗-碳水化合物特异性抗体可能缺乏特异性、亲和性或仅为IgM类型，所以产生这些抗体是一项具有挑战性的任务(Christensen等人，2009)。此外，产生具有杀灭癌细胞能力的人源化抗-碳水化合物抗体是一项具有挑战性的任务，所反映出的事实在于这种抗体的报道极少。抗-糖脂抗体中仅有一个实例已被成功人源化；该抗体识别神经节苷脂GM2且可在体外或体内杀灭人肿瘤细胞(美国专利
6,423,511和6,872,392)。尽管未经人源化，但碳水化合物-结合抗体中有两个其它实例已经工程改造而用于人的施用。第一，抗-碳水化合物抗体RAV-12是嵌合小鼠-人IgG1，其显示体外和体内对抗人结肠癌细胞的功效(Loo等人，2007)。第二，抗-碳水化合物抗体HMMC-1已显示体外对抗人卵巢癌的功效。HMMC-I为由转染色体KM小鼠产生的全人抗体(Nozawa等人，2004)。
6,423,511和6,872,392)。尽管未经人源化，但碳水化合物-结合抗体中有两个其它实例已经工程改造而用于人的施用。第一，抗-碳水化合物抗体RAV-12是嵌合小鼠-人IgG1，其显示体外和体内对抗人结肠癌细胞的功效(Loo等人，2007)。第二，抗-碳水化合物抗体HMMC-1已显示体外对抗人卵巢癌的功效。HMMC-I为由转染色体KM小鼠产生的全人抗体(Nozawa等人，2004)。
[0005] 国际专利申请No.WO 2005/108430公开了抗-癌小鼠单克隆抗体，其被命名为SC104。该抗体的CDR序列显示于表1中。本申请的公开内容并入此处作为参考。SC104所结合的抗原的确切性质尚不明确，但WO 2005/108430表明该抗原为唾液酸四糖基碳水化合物(sialyltetraosyl carbohydrate)。其还公开了SC104能够直接诱导细胞死亡，而无需免疫效应细胞。如在共同-待决的国际专利申请No.WO2010/105290中所述，已开发出SC104的许多人源化形式。该申请的公开内容并入此处作为参考。
[0006] 人癌症的治疗性治疗具有挑战性且可在一些情况下通过使分子生物标志物和治疗结果相关联来增强。例如，基因KRAS(或称为ki-ras或k-ras)或BRAF的突变在肿瘤细胞中产生信号传导特性有改变的蛋白质。已知这些生物标志物的突变与使用靶向表皮生长因子受体的治疗抗体(例如西妥昔单抗或帕尼单抗)在癌症治疗中的失败结果有关(Amado，Wolf等 人，2008；Karapetis，Khambata-Ford 等人，2008；Di Nicolantonio，Martini等人，2008；Loupakis，Ruzzo等人，2009；Lievre，Bachet等人，2006)。KRAS突变由于在35％-45％的结肠直肠癌患者中出现而具有特定的医学重要性；BRAF突变在15％以内的结肠直肠癌患者中出现(Siena，Sartore-Bianchi等人，2009)。此外，KRAS突变发现于70％-95％的胰腺癌组织中(Saif等人，2007)。
发明内容
[0007] 在第一方面中，本发明提供在受试者中治疗癌症的方法，其中癌症包括突变的KRAS或BRAF基因，本方法包括向受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205。
[0008] 在第二方面中，本发明提供在受试者中治疗癌症的方法，方法包括测试癌症中突变的KRAS或BRAF基因的存在，且向所患的癌症包括突变的KRAS或BRAF基因的受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205。
[0009] 在第三方面中，本发明提供可与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205的抗体或其抗原结合片段在用于制备用来在受试者中治疗癌症的药物中的用途，其中癌症包括突变的KRAS或BRAF基因。
[0011] 图1-人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50)结合至具有突变的KRAS基因和野生型KRAS基因的人胃肠癌。图1中显示对于一组供体肿瘤样本(n＝供体数目)的个体和平均免疫组织化学结合强度；如通过曼-惠特尼测试(Mann-Whitney test)所确定的，各肿瘤类型的野生型组或突变组之间的染色强度不存在统计学显著差异。
[0012] 图2-如通过免疫组织化学所确定的，人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：94)结合至具有突变的KRAS基因和野生型KRAS基因的人结肠癌细胞。
[0013] 图3-如通过LDH释放分析使用SC104抗原阳性人结肠癌细胞系C170所确定的，并入1U6A框架的人源化SC104抗体变体(VL/VH SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：25)以及并入1QLR框架的人源化SC104抗体变体(VL/VH SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：26)具有有效力的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：2)显示作为比较者，以及人IgG1同种型用作阴性对照。各点代表三个重复样本的平均值±SD。
[0014] 图4-如通过细胞存活力分析使用SC104抗原阳性人结肠癌细胞系Colo205所确定的，并入1U6A框架的人源化SC104抗体变体(VL/VH SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：25)以及并入1QLR框架的人源化SC104抗体变体(VL/VH SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：26)具有有效力的补体-依赖性细胞毒性。
嵌合SC104抗体(SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：2)显示作为比较者，以及人IgG1同种型用作阴性对照。各点代表三个重复样本的平均值±SD。
嵌合SC104抗体(SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：2)显示作为比较者，以及人IgG1同种型用作阴性对照。各点代表三个重复样本的平均值±SD。
[0015] 图5-如通过由LDH释放分析所评估的，人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50)具有有效力的针对人结肠癌细胞系DLD-1(KRAS突变的)的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性。人IgG1同种型用作阴性对照。各点代表三个重复样本的平均值±SD。
[0016] 图6-如通过由LDH释放分析所评估的，人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50)具有有效力的针对人结肠癌细胞系Colo201(A)、Colo205(B)、WiDr(C)和HT-29(BRAF突变的)(D)的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性。人IgG1同种型用作Colo201的阴性对照。各点代表三个重复样本的平均值±SD。
[0017] 图7-如通过由LDH释放分析使用SC104抗原阳性WiDr人结肠癌细胞系所评估的，几夫碱(Kifunensin)-处理的人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50)和未经处理的抗体相比具有更高的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性。各点代表三个重复样本的平均值±SD。
[0018] 图8-用人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50)处理携带HT29异种移植肿瘤的小鼠，与载体对照处理相比，导致肿瘤负荷显著减小。A：各组(每组6-10只小鼠)的平均值±SEM肿瘤体积。星号表示处理组之间的显著差异，p＜0.05曼-惠特尼测试。B：研究结束时的平均和个体肿瘤重量。P值是通过曼-惠特尼测试来确定的。
[0019] 图9-如通过由流式细胞术使用抗原阳性细胞系Colo205所评估的，竞争抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50(-▲-))而非人同种型对照抗体(-○-)明显降低荧光-标记的小鼠SC104抗体的结合(A-1ug/ml；B-10ug/ml)。
具体实施方式
[0020] 本发明涉及治疗癌症的方法，其中癌症包括KRAS或BRAF基因中的突变。方法涉及使用与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205的抗体或其抗原结合片段。在各个具体实施方式中，本发明涉及在癌症治疗中使用SC104、SC104嵌合体、人源化SC104、去免疫的SC104或其抗原结合片段，其中癌症包括KRAS或BRAF基因中的突变。抗体优选不是SC104。
[0021] 在第一方面中，本发明提供在受试者中治疗癌症的方法，其中癌症包括突变的KRAS或BRAF基因，方法包括向受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205。
[0022] 在第二方面中，本发明提供在受试者中治疗癌症的方法，方法包括测试癌症中突变的KRAS或BRAF基因的存在，且向所患的癌症包括突变的KRAS或BRAF基因的受试者施用有效量的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205。
[0023] 在第三方面中，本发明提供与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205的抗体或其抗原结合片段在用于制备用来在受试者中治疗癌症的药物中的用途，其中癌症包括突变的KRAS或BRAF基因。
[0024] 在第四方面中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其在受试者癌症治疗中与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205，其中癌症包括突变的KRAS或BRAF基因。
[0025] 如此处所用“竞争”表示抗体或其抗原结合片段在以与SC104相同的浓度使用时SC104与人结肠癌细胞系Colo205的结合减少至少10％。SC104与Colo205的结合水平可由本领域技术人员已知的基于-流式细胞术的结合分析中评估。在这种分析中，在各种竞争抗体稀释存在下测量荧光染料-标记的SC104抗体和Colo205的结合信号。SC104的荧光染料标记可通过直接结合或通过间接检测方法来实现，比如检测SC104而非竞争抗体的SC104生物素/链霉亲和素-荧光染料或荧光染料-偶联的二抗。
[0026] 应了解，优选在治疗前确定癌症的KRAS和/或BRAF状态。确定细胞是否包括突变的KRAS或BRAF基因的方法在本领域是已知的。这些方法包括(Lievre，Bachet等人，2006)和(Seth，Crook等人，2009)中所述的那些。
[0027] 在本发明的各种形式中，抗体为小鼠SC104(可变区列于SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：1)或SC104嵌合体。应了解，嵌合体为鼠恒定区已置换为人或灵长类恒定区的抗体。这种嵌合体的实例显示于SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：2中。如上所述，优选抗体不是SC104，以免在人当中产生人抗鼠抗体(HAMA)反应。
[0028] 在本发明的其它形式中，抗体为SC104或其抗原结合片段的去免疫化型。抗体的去免疫化为本领域中熟知的一种方法。例如，通过去免疫化降低比如鼠抗体的抗体的免疫原性已经描述于WO 00/34317、WO 98/52976、WO 02/079415、WO 02/012899和WO02/069232中(其公开内容通过交叉引用并入此处)。去免疫化一般需要在潜在T细胞表位内进行氨基酸取代。以这种方式，使给定序列将在细胞内蛋白质加工中产生T细胞表位的可能性减小。此外，WO 92/10755描述一种工程改造蛋白质上的抗原决定簇的方法。具体而言，对蛋白质进行表位定位(map)并通过遗传工程改造改变其氨基酸序列。
[0029] 在其它实施方式中，抗体为SC104的人源化形式。人源化一般需要用相应的人序列取代非-人抗体序列。例如用CDR-嫁接的情况。这种方法的实例描述于WO 91/09968以及美国专利No.6,407,213中。如上所述，已开发出许多与SC104竞争来结合至人结肠癌细胞系Colo205的SC104的人源化形式。这些人源化抗体描述于共同-待决的国际专利申请No.WO 2010/105290中。
[0030] 就此而言，本发明的一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括选自如下的至少一个序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：
43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：
82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91和SEQ ID NO：94。
43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：
82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91和SEQ ID NO：94。
[0031] 在另一个优选实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括选自如下的轻链和重链组合：SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：38。
[0032] 将了解，本发明中所述的序列可使用本领域已知的方法来修饰，以便通过由例如亲和性成熟来增加结合，或通过移除预测的MHC II类-结合基序来降低免疫原性。已经开发的且此处所述的序列的治疗效用可通过调节其功能特征来进一步增强，其功能特征比如抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)、补体-依赖性细胞毒性(CDC)、血清半衰期、生物分布以及和Fc受体的结合、或任何这些功能特征的组合。这种调节可通过蛋白质-工程改造、糖基化-工程改造或化学方法来实现。根据治疗性应用所需，提高或降低任何这些活性可以是有利的。
[0033] 如Shinkawa T.等人，2003(J Biol Chem 278：3466-73)中所述，糖基化工程改造的一个实例使用 方法。人源化抗体变体的可变轻链和重链区表达为标准恒定区主链(backbone)上的IgG1。恒定重链的序列是GenBank登录号P01857.1，且恒定轻链序列为NCBI登录号P01834。
[0034] 许多抗体亲和性成熟方法在本领域中是已知的。这些方法中有许多是基于通过突变然后选择和/或筛选改进的亲和性来产生变体蛋白质的组或文库的一般策略。致突变通常在DNA水平上进行，例如通过易错PCR(Thie，Voedisch等人，2009)、通过基因改组(gene shuffling)(Kolkman和Stemmer 2001)、通过使用致突变化学剂或辐射、通过使用具有易错复制机制“突变体(mutator)”株(Greener1996)或通过利用天然的亲和性成熟基质的体细胞超突变法(Peled，Kuang等人，2008)。致突变还可在RNA水平上进行，例如通过使用Qβ复制酶(Kopsidas，Roberts等人，2006)。允许筛选出改进的变体蛋白质的基于文库的方法可基于各种展示技术，比如噬菌体、酵母、核糖体、细菌或哺乳动物细胞，且在本领域中是熟知的(Benhar 2007)。亲和性成熟可通过由更多定向/预测性方法实现，例如通过由3D蛋白质模型化结果所指导的定点突变或基因合成(参见例如Queen，Schneider 等人，1989或US专利6,180,370或US专利5,225,539)。
[0035] 增加ADCC的方法已由以下文献所述：Ferrara，Brunker等人，2006；Li，Sethuraman等人，2006；Stavenhagen，Gorlatov等人，2007；Shields，Namenuk等人，2001；Shinkawa，Nakamura等人，2003和WO 2008/006554。
[0036] 增加CDC的方法已由以下文献所述：Idusogie，Wong等人，2001；Dall′Acqua，Cook等人，2006；Michaelsen，Aase等人，1990；Brekke，Bremnes等人，1993；Tan，Shopes等人，1990和Norderhaug，Brekke等人，1991。
[0037] 描述增加ADCC和CDC的方法的参考文献包括Natsume，In等人，2008。这些参考文献各自的公开内容是以交叉引用的方式并入此处。
[0038] 调节抗体血清半衰期和生物分布的许多方法是基于改进抗体与新生儿Fc受体(FcRn)(即，在保护IgG免于分解代谢和维持高血清抗体浓度方面具有关键作用的受体)之间的相互作用。Dall’Acqua等人描述：IgG1的Fc区中的取代增强对FcRn的结合亲和性，从而增加血清半衰期(Dall’Acqua，Woods等人，2002)，且进一步证明M252Y/S254T/T256E的三元取代增强生物利用度及ADCC活性的调节(Dall’Acqua，Kiener等人，2006)。还参见美国专利No.6,277,375；No.6,821,505；和No.7,083,784。Hinton等人已描述位置250和428处的恒定结构域氨基酸取代增加体内半衰期(Hinton，Johlfs等人，2004)。(Hilton，Xiong等人，2006)。还参见美国专利No.7,217,797。Petkova等人已描述位置307、380和
434处的恒定结构域氨基酸取代增加体内半衰期(Petkova，Akilesh等人，2006)。还参见Shields等人，2001及WO 2000/42072。调节与Fc受体的结合及由这些受体所介导的后续功能(包括FcRn结合及血清半衰期)的恒定结构域氨基酸取代的其它实例描述于美国专利申请No.20090142340、20090068175及20090092599中。
434处的恒定结构域氨基酸取代增加体内半衰期(Petkova，Akilesh等人，2006)。还参见Shields等人，2001及WO 2000/42072。调节与Fc受体的结合及由这些受体所介导的后续功能(包括FcRn结合及血清半衰期)的恒定结构域氨基酸取代的其它实例描述于美国专利申请No.20090142340、20090068175及20090092599中。
[0039] 已知连接于抗体分子的聚糖影响抗体和Fc受体以及聚糖受体的相互作用且从而影响抗体活性，包括血清半衰期(Kaneko，Nimmerjahn等人，2006；Jones，Papac等人，2007；和Kanda，Yamada等人，2007)。因此，调节所需抗体活性的某些糖型(glycoform)可赋予治疗性益处。产生经工程改造的糖型的方法在本领域中是已知的且包括但不限于美国专利No.6,602,684、7,326,681、7,388,081及WO 2008/006554中所述的方法。
[0040] 如，例如由Fishburn 2008所综述，通过添加聚乙二醇(PEG)来延长半衰期已被广泛用于延长蛋白质的血清半衰期。
[0042] H、R及K；
[0043] D、E、N及Q；
[0044] V、I及L；
[0045] C及M；
[0046] S、T、P、A及G；以及
[0047] F、Y及W。
[0048] 贯穿本说明书，用词“包括(comprise)”或比如“包含(comprises)”或“含有(comprising)”的变化形式应理解为意指包括所陈述的要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的群，但不排除任何其它要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的群。
[0049] 本说明书中提及的所有公开案并入此处作为参考。对已包括于本说明书中的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅用于提供本发明的背景的目的。其不应被理解为因为其已在本申请的各项权利要求的优先权日期之前存在于澳大利亚或其它地方而承认任何或所有这些内容构成公知技术基础的一部分或为本发明相关领域内的一般常识。
[0050] 为了可更好地理解本发明的性质，现将参考以下实施例来描述其优选形式。
[0051] 实施例1
[0052] 免疫组织化学操作规程：
[0053] 使用免疫组织化学筛选与生物素化人源化SC104抗体变体结合的含有一系列来自不同供体的肿瘤类型的样品的多肿瘤人组织微阵列。生物素化的人IgG1同种型用于阴性对照染色。通过目视检查以四阶等级基于阳性细胞的染色强度和百分比对抗体免疫反应性评分。
[0054] 人源化SC104抗体变体结合各种人癌症类型
[0055] 分析与人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50)结合的来自不同人患者的许多不同癌症类型。人源化SC104抗体而非人同种型对照物结合人结肠癌组织，这证明所用结合条件的特异性(数据未显示)。表2概括在多达75％的结肠癌中发现阳性膜染色。令人惊奇的是，在多达95％的胰腺癌中发现高频率阳性染色，而在其它实体肿瘤中程度则较低。相比之下，对胃肠基质肿瘤未观察到染色。这些结果表明人源化SC104抗体适用于结肠直肠、胰腺，卵巢和肺恶性病的适应症的肿瘤诊断。另外，可设想人源化SC104抗体适用于在人中治疗性治疗结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌及肺癌。可在小鼠肿瘤异种移植模型中评估其体内抗-肿瘤功效。
[0056] 另一组织微阵列由已在裸鼠中作为异种移植物传代的原发性人结肠肿瘤及胃肿瘤构建。使用抗体预复合方法和HRP显示(visualisation)筛选与人源化SC104抗体结合的肿瘤样品。使人源化SC104抗体与抗-人Fab-FITC预复合，用过量人IgG封闭，且随后将这种复合物用作一抗试剂，其在组织微阵列上孵育。在阴性对照染色中，用人IgG1同种型对照物交换人源化SC104抗体。通过目视检查以5阶等级对抗体免疫反应性评分：0＝无染色、1＝很少的染色点、2＝成团块状的阳性染色、3＝＞50％阳性染色、4＝饱和染色。染色数据以三个区域的平均值表示并显示于图1中。
[0057] KRAS基因状态分析
[0058] 已作为小鼠异种移植物传代的原发性人肿瘤的基因组DNA在KRAS基因的外显子1和外显子2中分析。核苷酸测序分析揭示外显子是否编码KRAS蛋白质的正常或激活突变。大部分突变的KRAS样本为杂合的。
[0059] 使用免疫组织化学分析显示，人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50)结合于具有突变和正常KRAS基因状态的人胃肠癌组织(图1)。
[0060] 还通过组织化学显示人源化的和 -工程改造的SC104抗体(SEQID NO：7/SEQ ID NO：94)结合具有突变的或野生型KRAS基因的人结肠癌细胞(图2)。
[0061] 实施例2
[0062] 基于流式细胞术的结合分析
[0063] 在冰上，在黑暗中，将活肿瘤细胞及对照细胞(2×105，通过锥虫蓝排除法(trypan blue exclusion)确定)以一式三份与在100μl缓冲液(PBS加上1％FCS)中各种浓度的小鼠SC104、嵌合SC104或人源化变体、和人IgG1同种型 在96V-孔板(Eppendorf)中孵育20分钟。用缓冲液洗涤细胞两次，随后分别在含有羊抗-人IgG(Fc-特异性， 与FITC偶联)或羊抗-小鼠IgG(Fc特异性， 与FITC
偶联)的100μl缓冲液中孵育20分钟，来检测嵌合抗体或小鼠抗体。在洗涤后，使细胞TM
重悬于缓冲液中，并通过流式细胞术在Cell Lab Quanta SC MPL(Beckman Coulter)上使用电子容量(EV)、侧向散射及FL-1门控来分析抗体结合；在获取数据期间，通过下置冷却填料(Eppendorf)来冷却96-孔板中的细胞。结果以平均萤光强度(MFI)表示；通过软件使用非线性回归分析计算曲线斜率值。
偶联)的100μl缓冲液中孵育20分钟，来检测嵌合抗体或小鼠抗体。在洗涤后，使细胞TM
重悬于缓冲液中，并通过流式细胞术在Cell Lab Quanta SC MPL(Beckman Coulter)上使用电子容量(EV)、侧向散射及FL-1门控来分析抗体结合；在获取数据期间，通过下置冷却填料(Eppendorf)来冷却96-孔板中的细胞。结果以平均萤光强度(MFI)表示；通过软件使用非线性回归分析计算曲线斜率值。
[0064] 抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)分析
[0065] 根据制造商操作规程(Axis-Shield PoC AS)使用Lymphoprep TM从来自正常人供体(由澳大利亚红十字会血液服务机构(Australian Red Cross Blood Services)提供)的血沉棕黄层制备物纯化出效应(外周血液单核)细胞。在37℃及10％CO2下，将活效应6
细胞(5×10 个/ml)于RPMI 1640 加上10％FCS中孵育过夜。在PBS中随后在
培养基(RPMI 1640w/o酚红， 加上0.5％FCS)中洗涤肿瘤标靶细胞和效应细胞，使其重悬浮于培养基中且以一式三份与各种浓度的抗体(嵌合SC104、人源化SC104或人IgG1同种型， #I5154)在96-孔U孔板 中在由以下最终浓度组成的
5 6
200μL分析液中孵育：标靶细胞，1×10 个细胞/毫升；效应细胞，2.5×10 个细胞/毫升；
抗体范围为10至0.001ug/mL。在对照组中，在不存在(最小标靶)或存在(最大标靶)1％的情况下仅孵育标靶细胞，且在不存在抗体的情况下孵育标
靶细胞及效应细胞(背景)。以160×g离心孔板2分钟且在37℃的湿润CO2氛围中孵育4小时。使用乳酸脱氢酶释放分析测量细胞死亡。简言之，以250×g离心孔板5分钟，且使用细胞毒性检测试剂盒(Roche)根据制造商指南分析100μL细胞上清的乳酸脱氢酶释放。
TM
为使污染细胞残留减至最少，经96-孔0.2微米AcroPrep 板(Pall)过滤上清液。通过在
492nm下读取吸光度来定量LDH释放且使用下式计算细胞毒性百分比：100×[样品-平均(背景)]/平均(最大标靶-最小标靶)；通过 软件使用非线性回归分析
计算EC50值。
细胞(5×10 个/ml)于RPMI 1640 加上10％FCS中孵育过夜。在PBS中随后在
培养基(RPMI 1640w/o酚红， 加上0.5％FCS)中洗涤肿瘤标靶细胞和效应细胞，使其重悬浮于培养基中且以一式三份与各种浓度的抗体(嵌合SC104、人源化SC104或人IgG1同种型， #I5154)在96-孔U孔板 中在由以下最终浓度组成的
5 6
200μL分析液中孵育：标靶细胞，1×10 个细胞/毫升；效应细胞，2.5×10 个细胞/毫升；
抗体范围为10至0.001ug/mL。在对照组中，在不存在(最小标靶)或存在(最大标靶)1％的情况下仅孵育标靶细胞，且在不存在抗体的情况下孵育标
靶细胞及效应细胞(背景)。以160×g离心孔板2分钟且在37℃的湿润CO2氛围中孵育4小时。使用乳酸脱氢酶释放分析测量细胞死亡。简言之，以250×g离心孔板5分钟，且使用细胞毒性检测试剂盒(Roche)根据制造商指南分析100μL细胞上清的乳酸脱氢酶释放。
TM
为使污染细胞残留减至最少，经96-孔0.2微米AcroPrep 板(Pall)过滤上清液。通过在
492nm下读取吸光度来定量LDH释放且使用下式计算细胞毒性百分比：100×[样品-平均(背景)]/平均(最大标靶-最小标靶)；通过 软件使用非线性回归分析
计算EC50值。
[0066] 补体-依赖性细胞毒性(CDC)分析
[0067] 将活肿瘤标靶细胞以一式三份在96-孔扁平孔板 中与人补体血清及各种浓度的抗体(嵌合SC104、人源化SC104或人IgG1同种型、
#I5154)一起，在培养基(RPMI 1640w/o酚红， 加上5％FCS)中，
4
在由以下最终浓度组成的150μL分析液中孵育：标靶细胞，13.3×10 个细胞/毫升；补体，15％；抗体范围为10至0.01ug/mL。在对照组中，在不存在(标靶背景)或存在(标靶&补体背景)补体的情况下仅孵育标靶细胞，且仅在培养基中孵育补体(补体背景)。以
160×g离心孔板2分钟且在37℃的湿润CO2氛围中孵育2-3小时。使用 试剂盒
根据制造商指南(包括额外3-4小时的孵育期)测量细胞死亡。通过在492nm下
读取吸光度来定量死亡标靶细胞且使用下式计算细胞毒性百分比：100×[样品-平均(标靶&补体背景)]/[平均(补体背景)-平均(标靶&补体背景)]；通过GraphPad
软件使用非线性回归分析计算EC50值。
#I5154)一起，在培养基(RPMI 1640w/o酚红， 加上5％FCS)中，
4
在由以下最终浓度组成的150μL分析液中孵育：标靶细胞，13.3×10 个细胞/毫升；补体，15％；抗体范围为10至0.01ug/mL。在对照组中，在不存在(标靶背景)或存在(标靶&补体背景)补体的情况下仅孵育标靶细胞，且仅在培养基中孵育补体(补体背景)。以
160×g离心孔板2分钟且在37℃的湿润CO2氛围中孵育2-3小时。使用 试剂盒
根据制造商指南(包括额外3-4小时的孵育期)测量细胞死亡。通过在492nm下
读取吸光度来定量死亡标靶细胞且使用下式计算细胞毒性百分比：100×[样品-平均(标靶&补体背景)]/[平均(补体背景)-平均(标靶&补体背景)]；通过GraphPad
软件使用非线性回归分析计算EC50值。
[0068] 新型人源化SC104抗体变体具有有效力的针对人结肠肿瘤细胞的细胞毒性[0069] 在抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性及补体依赖型细胞毒性分析中测试人源化SC104变体针对结肠肿瘤细胞的细胞毒性。使用正常人供体的外周血液单核细胞得知，人源化SC104抗体变体及嵌合SC104抗体具有有效力的针对C170肿瘤细胞的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性，但人同种型对照物没有(图3)。使用来自其它人供体的外周血液单核细胞获得类似结果(数据未显示)。图4显示使用人补体得知，同组的人源化SC104抗体变体及嵌合SC104抗体具有有效力的针对Colo205肿瘤细胞的补体-依赖的细胞毒性，但人同种型对照物没有。人源化SC104抗体变体的结合和杀灭活性概括于表3中。
[0070] 实施例3
[0071] 基于流式细胞术的直接杀灭分析
[0072] 在室温下，于黑暗中，将活肿瘤细胞(2×105个，通过锥虫蓝排除法判断)以一式三份与80μL缓冲液(PBS加上1％FCS)中各种浓度的小鼠SC104、嵌合SC104或人源化变体、及人IgG1同种型 一起在96V-孔板(Eppendorf)中孵育2.5至3小时。向各孔添加0.15g的7AAD于20μL缓冲液中 细胞再孵育20分钟，随后
TM
通过流式细胞术在Cell Lab Quanta SC MPL(Beckman Coulter)上使用电子容量(EV)、侧向散射及FL-3门控来分析细胞存活力；在获取数据期间，通过下置冷却填料(Eppendorf)+
来冷却96-孔板中的细胞。结果以7AAD 细胞的百分比表示；通过 软件使
用非线性回归分析计算曲线斜率值。
TM
通过流式细胞术在Cell Lab Quanta SC MPL(Beckman Coulter)上使用电子容量(EV)、侧向散射及FL-3门控来分析细胞存活力；在获取数据期间，通过下置冷却填料(Eppendorf)+
来冷却96-孔板中的细胞。结果以7AAD 细胞的百分比表示；通过 软件使
用非线性回归分析计算曲线斜率值。
[0073] 针对人胰腺细胞系的结合和杀灭活性
[0074] 如流式细胞术分析中所测量的，人源化及 工程改造的SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：94)结合且直接杀灭具有或不具有KRAS突变的人胰腺肿瘤细胞系。
[0075]胰腺肿瘤细胞系 KRAS状态 结合活性 直接杀灭活性
BxPC-3 野生型 ++ +
Su.86.86 突变体 +++ +++
Capan-2 突变体 ++ ++
CFPAC-1 突变体 + +
Panc-1 突变体 - -
BxPC-3 野生型 ++ +
Su.86.86 突变体 +++ +++
Capan-2 突变体 ++ ++
CFPAC-1 突变体 + +
Panc-1 突变体 - -
[0076] 附注：KRAS状态描述于Konishi等人，2007Cancer Research 67：8460-8467及Song等人，2000 Neoplasia 2：261-272中。如下定性活性：-，＜0.1％；+，0.1％-24％；++，25％-49％；+++，＞50％阳性细胞。
[0077] 实施例4
[0078] 用于分析的人结肠癌细胞系
[0079] DLD-1(ATCC登录号CCL-221；KRAS突变体；BRAF野生型)、Colo201(ATCC登录号CCL-224；KRAS野生型；BRAF突变体)、Colo205(ATCC登录号CCL-222；KRAS野生型；BRAF突变体)、WiDr(ATCC登录号CCL-218；KRAS野生型；BRAF突变体)及HT-29(ATCC登录号HTB-38；KRAS野生型；BRAF突变体)。已知这些细胞系在其KRAS或BRAF基因中携带突变((Seth，Crook等人，2009)；(Davies，Logie等人，2007))。
[0080] 人源化SC104抗体针对在KRAS或BRAF基因中携带突变的人结肠肿瘤细胞具有有效力的杀灭活性
[0081] 使用正常人供体的外周血液单核细胞得知，人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50)针对一组携带KRAS或BRAF突变的人结肠癌细胞系具有有效力的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性，但人同种型对照物没有。图5描述已知携带突变的KRAS，而不是野生型BRAF基因的细胞系DLD-1的杀灭情况。图6描述已知携带突变的BRAF，而不是野生型KRAS基因的细胞系Colo201、Colo205、WiDr及HT-29的杀灭。使用这些细胞系及来源于其它人供体的外周血液单核细胞获得类似结果。如实施例2中所述，测量ADCC功能。
[0082] 实施例5
[0083] SC104抗体的效应功能增强
[0084] 可通过增加抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性或补体-依赖性细胞毒性或通过组合抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性和补体-依赖性细胞毒性来增强抗体的效应功能。
[0085] ADCC增强
[0086] 对抗体Fc区使用标准修饰来工程改造SC104抗体变体及嵌合SC104，以增强抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)活性。标准方法包括例如抗体Fc区的蛋白质-工程改造或糖基化-工程改造。
[0087] 作为糖基化-工程改造的一个实例，根据Zhou等人(Zhou，Shankara等人，2008)将产生人源化SC104抗体变体或嵌合SC104抗体的CHO细胞与几夫碱(0.25μg/ml)孵育8至10天。随后纯化抗体，且如实施例2中所述，测量ADCC功能。
[0088] 作为蛋白质工程改造的一个实例，如Lazar等人，2006(Lazar，Dang等人，2006)所述产生恒定重链序列中的突变。特别地，将S122D、S181A、I215E突变引入Fc序列SEQ ID NO：52中而形成SEQ ID NO：53。在CHO细胞中表达且通过蛋白质A层析纯化后，在ADCC分析中测试具有增强型Fc-区SEQ ID NO：53的许多人源化抗体以及嵌合抗体。如实施例2中所述，测量ADCC功能。
[0089] 如在Shinkawa T.等人，2003(J Biol Chem 278：3466-73)中所述，糖基化-工程改造的另一实例使用 方法。人源化抗体变体的可变轻链和重链区表达为标准恒定区主链上的IgG1。恒定重链序列为GenBank P01857.1且恒定轻链序列为NCBI登录号P01834。如实例2中所述，测量ADCC功能。
[0090] 效应增强型SC104人源化抗体变体和嵌合SC104抗体具有增加的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性
[0091] 在一系列实验中，蛋白质-工程改造或糖基化-工程改造被用于增加嵌合SC104抗体和SC104人源化抗体变体的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性。与未修饰的抗体相比，Fc-工程改造(SEQ ID NO：53)或经几夫碱-处理的SC104人源化抗体变体及嵌合SC104抗体显示出针对Colo205肿瘤细胞的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性增加。图7显示经几夫碱处理的人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50)明显增加对人结肠癌细胞WiDr(ATCC登录号CCL-218)的杀灭的实施例。
[0092] 实施例6
[0093] 小鼠异种移植肿瘤模型
[0094] 对雌性BALB/c裸鼠皮下接种2×106个人结肠癌HT-29细胞(ATCC登录号HTB-38)。在与肿瘤细胞接种相同之日(第0日)基于体重将小鼠随机分为两个处理组(每组n＝10)。用载体对照物(PBS，10ml/kg)或人源化SC104抗体(10mg/kg)经腹膜内处理各组。每周两次施用载体对照物及人源化SC104抗体，持续四周。使用下式每周三次计算
3 2
肿瘤体积：体积(mm)＝长度×直径 ×π/6。
3 2
肿瘤体积：体积(mm)＝长度×直径 ×π/6。
[0095] 在研究期间，一些小鼠由于体重过度减轻而必须被淘汰，从而使得载体对照物处理组(n＝6)及抗体处理组(n＝9)的小鼠数目减少。在研究结束(第27日)时，在所有小鼠死后切下肿瘤，清洁表皮并称重。
[0096] 人源化SC104抗体在活体内有效力的抗肿瘤功效
[0097] 与载体对照物处理相比，用人源化SC104抗体(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50)处理携带肿瘤的小鼠使得肿瘤体积及肿瘤重量显著减小(图8)。可设想人源化SC104抗体变体适用于以单一-疗法或与其它治疗性抗-肿瘤剂(例如，化学治疗剂、小分子或生物制剂)组合的形式在人当中治疗结肠直肠癌。可在小鼠肿瘤异种移植模型中评估这种组合疗法的体内功效。
[0098] 实施例7
[0099] 竞争分析
[0100] 将SC104抗原-阳性结肠癌细胞(Colo205；经甲醛固定的细胞)在各种浓度下与竞争抗体(人源化SC104变体SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：50或对照人IgG1同种型)孵育，随后与固定浓度(1ug/ml，上图；10μg/ml，下图)的FITC偶联的小鼠SC104抗体孵育；随后通过流式细胞术进行信号分析。
[0101] 如图9中所示，与竞争抗体孵育以剂量依赖性方式(相对于与对照同种型抗体一起孵育)特异性降低小鼠SC104的结合；在相等浓度水平的小鼠及竞争抗体下，与同种型对照抗体相比，使小鼠SC104的结合减少约23％(上图)或约32％(下图)。各点表示三个重复样品的平均值±SD。
[0102] 表1.SC104的CDR序列
[0103]可变区 CDR编号 CDR序列
VH 1 SGYSWH(Kabat)GYSITSGYSWH(AbM)
VH 2 HIHFSGRPTYNPSLSS
VH 3 KGKGSDDGLNY
VL 1 SASSSLSYIH
VL 2 DTSNLAS
VL 3 FQGSEYPLT
VH 1 SGYSWH(Kabat)GYSITSGYSWH(AbM)
VH 2 HIHFSGRPTYNPSLSS
VH 3 KGKGSDDGLNY
VL 1 SASSSLSYIH
VL 2 DTSNLAS
VL 3 FQGSEYPLT
[0104] 表2.人源化SC104抗体结合各种人肿瘤类型
[0105]
[0106] 表3.人源化SC104抗体变体显示有效力的抗体-依赖细胞-介导的细胞毒性(ADCC)及补体-依赖的细胞毒性(CDC)活性
[0107]
[0108] 以相对于嵌合SC104的活性百分比表示；nd，未测定；在其它实验中测试时获得类似数据。
[0109] 文献
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[0153] SEQ ID NO：1：鼠SC104重链可变区的氨基酸序列。
[0154] SEQ IDNO：2：具有小鼠可变区及人IgG1主链(人IgG1重链CH1、铰链、CH2及CH3结构域)的嵌合SC104重链的氨基酸序列。
[0155] SEQ IDNO：3：鼠类SC104轻链可变区的氨基酸序列。
[0156] SEQ ID NO：4：具有小鼠可变区及人轻链恒定区的嵌合SC104轻链的氨基酸序列。
[0157] SEQ IDNO：5：重链信号序列。
[0158] SEQ IDNO：6：轻链信号序列。
[0159] SEQ ID NO：7：合并有取代A15P的基于1U6A的SC104轻链多肽序列。
[0160] SEQ IDNO：8：基于1QLR的SC104轻链。
[0161] SEQ ID NO：9：Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0162] SEQ ID NO：10：Kabat接枝的基于1QLR的SC104重链多肽序列。
[0163] SEQ IDNO：11：基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0164] SEQ ID NO：12：基于1QLR的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0165] SEQ ID NO：13：合并有六个取代的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0166] SEQ ID NO：14：合并有八个取代的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0167] SEQ ID NO：15：合并有六个取代的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0168] SEQ ID NO：16：合并有三个取代的基于1U6A的SC104轻链多肽序列。
[0169] SEQ ID NO：17：合并有四个取代的Kabat接枝的基于1QLR的SC104重链多肽序列。
[0170] SEQ ID NO：18：合并有三个取代的基于1QLR的SC104轻链多肽序列。
[0171] SEQ ID NO：19：合并有取代Q1E及Q46E的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0172] SEQ ID NO：20：合并有取代Q1E及I48M的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0173] SEQ ID NO：21：合并有取代Q1E及V67I的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0174] SEQ ID NO：22：合并有取代Q1E及T68S的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0175] SEQ ID NO：23：合并有取代Q1E及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0176] SEQ ID NO：24：合并有取代Q1E及E72D的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0177] SEQ ID NO：25：合并有取代V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0178] SEQ ID NO：26：合并有取代V71R的基于1QLR的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0179] SEQ ID NO：27：合并有取代V71R的Kabat接枝的基于1QLR的SC104重链多肽序列。
[0180] SEQ ID NO：28：合并有取代V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0181] SEQ ID NO：29：合并有取代G27Y及V71R的Kabat接枝的基于1QLR的SC104重链多肽序列。
[0182] SEQ IDNO：30：具有小鼠可变区及人IgG1主链(人IgG1重链CH1、铰链、CH2及CH3结构域)且合并有CDR-H2取代F53W的嵌合SC104重链氨基酸序列。
[0183] SEQ IDNO：31：具有小鼠可变区及人IgG1主链(人IgG1重链CH1、铰链、CH2及CH3结构域)且合并有CDR-H2取代F53Y的嵌合SC104重链氨基酸序列。
[0184] SEQ IDNO：32：具有小鼠可变区及人IgG1主链(人IgG1重链CH1、铰链、CH2及CH3结构域)且合并有CDR-H2取代F53P的嵌合SC104重链氨基酸序列。
[0185] SEQ ID NO：33：合并有取代S64K及V71R的基于1QLR的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0186] SEQ ID NO：34：合并有取代S64L及V71R的基于1QLR的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0187] SEQ ID NO：35：合并有取代S64H及V71R的基于1QLR的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0188] SEQ ID NO：36：合并有取代S64F及V71R的基于1QLR的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0189] SEQ ID NO：37：合并有取代S64R及V71R的基于1QLR的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0190] SEQ ID NO：38：合并有取代G27Y、F29I、T30S、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1QLR的SC104重链多肽序列。
[0191] SEQ ID NO：39：合并有取代S64K及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0192] SEQ ID NO：40：合并有取代S64L及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0193] SEQ IDNO：41：合并有取代S64H及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0194] SEQ ID NO：42：合并有取代S64F及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0195] SEQ ID NO：43：合并有取代S64R及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0196] SEQ ID NO：44：合并有取代S40P及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0197] SEQ ID NO：45：合并有取代S40P、S64K及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0198] SEQ ID NO：46：合并有取代S40P、S64L及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0199] SEQ ID NO：47：合并有取代S40P、S64H及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0200] SEQ ID NO：48：合并有取代S40P、S64F及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0201] SEQ ID NO：49：合并有取代S40P、S64R及V71R的基于1U6A的SC104重链多肽序列的AbM接枝的CDR-H1、Kabat界定的CDR-H2及CDR-H3。
[0202] SEQ ID NO：50：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0203] SEQ IDNO：51：具有小鼠可变区及人IgG1主链(人IgG1重链CH1、铰链、CH2及CH3结构域)且合并有取代N60D的嵌合SC104重链氨基酸序列。
[0204] SEQ ID NO：52：合并有铰链、CH1、CH2及CH3结构域的重链恒定区。
[0205] SEQ ID NO：53：合并有铰链、CH1、CH2及CH3结构域且合并有氨基酸取代S122D、S181A、I215E的重链恒定区。
[0206] SEQ ID NO：54：合并有取代G27Y、I29A、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0207] SEQ ID NO：55：合并有取代G27Y、I29C、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0208] SEQ ID NO：56：合并有取代G27Y、I29D、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0209] SEQ ID NO：57：合并有取代G27Y、I29E、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0210] SEQ ID NO：58：合并有取代G27Y、I29F、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0211] SEQ ID NO：59：合并有取代G27Y、I29G、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0212] SEQ ID NO：60：合并有取代G27Y、I29H、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0213] SEQ ID NO：61：合并有取代G27Y、I29K、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0214] SEQ ID NO：62：合并有取代G27Y、I29L、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0215] SEQ ID NO：63：合并有取代G27Y、I29M、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0216] SEQ ID NO：64：合并有取代G27Y、I29N、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0217] SEQ ID NO：65：合并有取代G27Y、I29P、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0218] SEQ ID NO：66：合并有取代G27Y、I29Q、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0219] SEQ ID NO：67：合并有取代G27Y、I29R、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0220] SEQ ID NO：68：合并有取代G27Y、I29S、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0221] SEQ ID NO：69：合并有取代G27Y、I29T、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0222] SEQ ID NO：70：合并有取代G27Y、I29V、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0223] SEQ ID NO：71：合并有取代G27Y、I29W、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0224] SEQ ID NO：72：合并有取代G27Y、I29Y、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0225] SEQ ID NO：73：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71A的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0226] SEQ ID NO：74：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71C的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0227] SEQ ID NO：75：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71D的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0228] SEQ ID NO：76：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71E的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0229] SEQ ID NO：77：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71F的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0230] SEQ ID NO：78：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71G的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0231] SEQ ID NO：79：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71H的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0232] SEQ ID NO：80：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71I的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0233] SEQ ID NO：81：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71K的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0234] SEQ ID NO：82：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71L的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0235] SEQ ID NO：83：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71M的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0236] SEQ ID NO：84：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71N的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0237] SEQ ID NO：85：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71P的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0238] SEQ ID NO：86：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71Q的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0239] SEQ ID NO：87：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71S的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0240] SEQ ID NO：88：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71T的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0241] SEQ ID NO：89：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71V的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0242] SEQ ID NO：90：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71W的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0243] SEQ ID NO：91：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71Y的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
[0244] SEQ ID NO：92：合并有铰链、CH1、CH2及CH3结构域的重链恒定区。
[0245] SEQ ID NO：93：轻链恒定区。
[0246] SEQ ID NO：94：合并有取代G27Y、T30S、S40P、S64K及V71R的Kabat接枝的基于1U6A的SC104重链多肽序列。
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