ZIBC基因及其编码的蛋白和应用
阅读：1042发布：2020-07-26
专利汇可以提供ZIBC基因及其编码的蛋白和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及ZIBC(Zinc finger protein Implicated in BreastCarcinogenesis)基因，该基因编码的蛋白，含有该基因的表达载体及其在 肿瘤 治疗 中的应用。，下面是ZIBC基因及其编码的蛋白和应用专利的具体信息内容。
1、可促进肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，该蛋白的氨基酸序列 如序列表中序列2所示。
2、编码权利要求1的蛋白的基因，其DNA序列如序列1所示。
3、含有权利要求2的基因或者编码权利要求1的蛋白的基因的 表达载体。
4、由权利要求3的表达载体转化的宿主细胞。
5、生产权利要求1的蛋白的方法，该方法包括下列步骤：
培养权利要求4的转化的宿主细胞，使转化细胞产生权利要求1 的蛋白；和从培养物中分离出蛋白。
6、针对权利要求1的蛋白的抗体，它是使用所述蛋白作为免疫 原而产生的特异性抗体。
7、检测权利要求1的蛋白的试剂盒，它含有权利要求6的特异 性抗体。
8、以乳腺cDNA文库作为模板进行PCR扩增的引物，该引物如下 所示：
P1：gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc t
P2：gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc。
9、权利要求1的蛋白或权利要求2的基因在制备治疗肿瘤的 药物中的应用。
发明领域
本发明涉及ZIBC(Zinc finger protein Implicated in Breast Carcinogenesis)基因，该基因编码的蛋白，含有该基因的表达载体 及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
肿瘤细胞的生长和增殖与许多蛋白有关，发现新的肿瘤基因及其 编码的蛋白，抑制肿瘤基因表达这些蛋白，可有效阻止肿瘤细胞的生 长和增殖，从而达到治疗肿瘤的效果。
发明内容
本发明发现了一种与乳腺癌等的癌细胞的生长和增殖有关的蛋 白，克隆了编码该蛋白的基因，构建了含有该基因的表达载体和含有 该表达载体的宿主细胞，并且发现该蛋白可促进乳腺癌、子宫癌、肝 癌等肿瘤细胞的生长和增殖，基于以上发现，完成了本发明。
因此，在一个方面，本发明提供了可促进肿瘤细胞的生长和增殖 的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序 列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或 增加而得到的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了编码上述蛋白的基因，它是具有序 列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。
在另一个方面，本发明提供了含有上述基因或者编码上述蛋白的 基因的表达载体。
在又一个方面，本发明提供了由上述表达载体转化的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了生产本发明的重组蛋白的方法，该 方法包括下列步骤：
培养上述转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白； 和
从培养物中分离出重组蛋白。
在另一个方面，本发明提供了针对上述蛋白的抗体，它是使用所 述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。它可以是单克隆或多克 隆抗体。
在另一个方面，本发明提供了检测所述蛋白的试剂盒，它含有上 述特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列2所示 的蛋白。
此外，本发明提供了用于检测序列1所示的核苷酸序列的探针诊 断试剂盒，它含有与核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸 序列。
本发明还提供了以乳腺cDNA文库作为模板进行PCR扩增的引物， 该引物如下所示：
P1：gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc t
P2：gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc。
本发明还提供了上述基因、蛋白或抗体在制备治疗肿瘤的药物中 的应用。
附图简述
图1是本发明蛋白的结构示意图。
图2是ZIBC的原核表达图。
图3是ZIBC对肿瘤细胞生长增值的影响，左侧方柱为媒介物， 右侧方柱为ZIBC。
以下是本发明的详细描述。
基因获取方式：
根据基因芯片检测所获EST序列，再通过生物信息学分析数据， 设计了上下游引物，以乳腺cDNA文库作为模板进行PCR扩增，获取 了该基因的ORF。引物设计如下：
P1：gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc t
P2：gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc
此基因命名为ZIBC(Zinc finger protein Implicated in Breast Carcinogenesis)。
真核表达载体的构建：
以下列序列为引物，经过PCR扩增，克隆到pcDNA3.1(-) (Invitrogen)载体中，经转化DH5α(Invitrogen)菌株，得到ZIBC 的真核表达载体。
ups 5’-GGAATTCGCCACCATGGAGATCTCCTCTCATC-3’
downs 5’-CGGGATCCACCCTAATGTTGGGCTTAATT-3’
原核表达载体的构建：
以下列序列为引物，经过PCR扩增，克隆到pGEX-4T-3(Amersham) 载体中，经转化BL21(Invitrogen)菌株，得到ZIBC的原核表达载 体。
ups 5’-GGAATTCCATGGAGATCTCCTCTCATC-3’
downs5’-
AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCTACCTAATGTTGGGCTTAATT-3’
此基因定位与染色体1p35.1，全长为1882bp。表达蛋白约50kD。 ORF序列：(1326bp)。
编码蛋白的开放阅读框架编码一个441个氨基酸的蛋白质。根据 生物信息学预测，这个蛋白质含有两个个主要的结构域，第一个是从 第25至第121个氨基酸的BTB/POZ结构域，第二个是从第340至第 419个氨基酸的未知保守结构域。图1是该基因的结构示意图。
同源序列：
H.sapiens ZBTB8 zinc finger and BTB domain containing
M.musculus Zbtb8 zinc finger and BTB domain containing
8
对该蛋白进行生物信息学分析，发现其广谱表达。
cDNA sources：膀胱，骨，脑，眼睛，心脏，肾，肝脏，肺，乳 腺，肌肉，周围神经系统，前列腺，皮肤，小肠，胃，舌，睾丸，子 宫，胚胎，成人。
通过使用本发明的蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗 体，抗体用于所述蛋白的检测和纯化。可以利用本发明的蛋白或其部 分氨基酸序列作为免疫原来产生抗体。可以通过将抗体接种给宿主动 物并回收血清的常规方法产生多克隆抗体。还可以通过常规杂交瘤方 法产生单克隆抗体。
利用MTT法检测不同浓度的ZIBC对MCF-7和T47-D(乳腺癌细 胞)、ECC-1和Ishikawa(子宫癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)细 胞等肿瘤细胞增殖的影响，结果发现，ZIBC有促进肿瘤细胞增殖的 作用。
通过抑制所述蛋白表达，或通过利用针对所述蛋白的抗体，可以 抑制肿瘤细胞的生长和增殖，从而可以达到治疗肿瘤的目的。
实施例
实施例1：用PCR方法从人乳腺癌文库克隆编码ZIBC蛋白的基因
用乳腺癌文库(Clontech公司)为模板，用下列引物进行PCR扩 增：
Primer1：5’-gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc t-3’
Primer2：5’-gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc-3’
扩增反应条件：在50μl的反应体系中含有50mmol/L KCL， 10mmol/L Tris-Cl(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/LdNTP，20pmol 引物，1U的Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)。在PTC-100 型PCR仪(MJR公司)上按下列条件反应25个周期：94℃ 30sec； 55℃1min；72℃2min。扩增产物用QIAGEN公司的PCR纯化试剂盒 纯化，用DNA限制性内切酶NotI和BamHI(NEB公司)进行切割(37 ℃12Hours)。由博亚公司进行测序得到一1326bp序列。
实施例2：ZIBC在原核细胞中的表达及纯化
pGEX-4T-3-ZIBC可以在大肠杆菌BL21菌株中30℃诱导表达 GST-ZIBC的融合蛋白，首先制备BL21的感受态细胞：挑取单克隆 到适量培养基中，37℃250rpm培养至A600 0.4-0.5，2500g离心15 分钟，备用。将1-50ng pGEX-4T-3-ZIBC转化到上述制备的感受态细 胞中，用Glutathione Sepharose 4B进行纯化，纯化的步骤如下：
(1)取单克隆到2-3mL 2YTA培养基中培养4-5小时。转接到100 mL 的锥形瓶中生长过夜。
(2)转接到500mL的锥形瓶中培养3-5小时。
(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培养3-6小时。
(4)3000rpm 10分钟离心收集细胞。
(5)用25mLPBS重悬细胞。超声10分钟。
(6)加1.25mL 20％Triton X-100，混匀1小时。
(7)1000rpm 10分钟离心，加入0.5mL 50％slurry of Glutathione Sepharose 4B，室温30分钟。
(8)1000rpm 5分钟离心，PBS洗三遍。
(9)用0.5mL洗脱Buffer洗脱，短暂离心后收集上清。 电泳结果如图2所示。
实施例3：MTT法检测不同浓度的ZIBC对肿瘤细胞增殖的影响 MTT(四甲基偶氮唑兰)可被细胞摄取，并被活细胞内线粒 体脱氢酶还原成一种不溶于水的蓝紫色产物甲瓒，并沉淀于细胞 中，而死细胞没有这种功能。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)， 溶液在570nm处有最大吸收。故该波段处吸收值越大代表存活 细胞量越多。MTT法广泛应用于细胞毒性实验、细胞生长测定 等。本实验利用MTT法观察ZIBC对MCF-7生长的影响。具体 操作方法如下：
将培养到对数生长期的MCF-7和T47-D(乳腺癌细胞)、 ECC-1和Ishikawa(子宫癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)细胞接 种于96孔板中，每孔接种细胞数为1×104个。次日按照浓度梯 度加入ZIBC(100ng)，每浓度作用6孔细胞，37℃，5％CO2 进行培养。分别培养1d、2d、3d、4d后，在每个细胞培养孔内 加入50μlL1mg/mL的MTT溶液，同样培养条件下作用4小时 后取出，小心吸出每孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150μL， 轻微振荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚砜中。用 自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。结果如图 3所示，说明本发明的蛋白有促进肿瘤细胞增殖的作用。
ZIBC序~1
SEQUENCE LISTING
<110>北京大学
<120>ZIBC基因及其编码的蛋白和应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1326
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1323)
<223>
<400>1
atg gag atc tcc tct cat cag tct cac ctc ctg cag caa ctg aac gag 48
Met Glu Ile Ser Ser His Gln Ser His Leu Leu Gln Gln Leu Asn Glu
1 5 10 15
cag cgc agg caa gat gta ttt tgt gac tgc agt att cta gtt gaa ggg 96
Gln Arg Arg Gln Asp Val Phe Cys Asp Cys Ser Ile Leu Val Glu Gly
20 25 30
aag gtc ttc aaa gca cat cga aat gta tta ttc gct agt agc ggc tac 144
Lys Val Phe Lys Ala His Arg Asn Val Leu Phe Ala Ser Ser Gly Tyr
35 40 45
ttt aaa atg ctt ctt tct cag aat tca aag gag acg agt cag cca acc 192
Phe Lys Met Leu Leu Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Ser Gln Pro Thr
50 55 60
aca gct aca ttt cag gct ttc tcc cct gac act ttt aca gtt atc ttg 240
Thr Ala Thr Phe Gln Ala Phe Ser Pro Asp Thr Phe Thr Val Ile Leu
65 70 75 80
gac ttc gta tat tct ggc aaa ctg tct ctt act ggt cag aat gtc ata 288
Asp Phe Val Tyr Ser Gly Lys Leu Ser Leu Thr Gly Gln Asn Val Ile
85 90 95
gaa gtg atg tcg gct gct agc ttc ctt cag atg act gat gtc ata agt 336
Glu Val Met Ser Ala Ala Ser Phe Leu Gln Met Thr Asp Val Ile Ser
100 105 110
gta tgt aag act ttt att aaa tct tcc tta gac att agt gag aaa gaa 384
Val Cys Lys Thr Phe Ile Lys Ser Ser Leu Asp Ile Ser Glu Lys Glu
115 120 125
aaa gat cgc tat ttc agt ctc tca gat aaa gat gcc aat tct aat ggt 432
Lys Asp Arg Tyr Phe Ser Leu Ser Asp Lys Asp Ala Asn Ser Asn Gly
130 135 140
gta gaa cgt tcc tct ttt tat agt ggt ggc tgg caa gaa gga agc agt 480
Val Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Gly Gly Trp Gln Glu Gly Ser Ser
145 150 155 160
tct cca cgt tct cac cta agc cca gag caa gga aca ggt ata ata agt 528
Ser Pro Arg Ser His Leu Ser Pro Glu Gln Gly Thr Gly Ile Ile Ser
165 170 175
gga aaa tct tgg aat aag tat aat tat cat cca gcc tcc cag aag aat 576
Gly Lys Ser Trp Asn Lys Tyr Asn Tyr His Pro Ala Ser Gln Lys Asn
180 185 190
act caa caa ccc ttg gcc aag cat gaa cca agg aaa gag tcc att aaa 624
Thr Gln Gln Pro Leu Ala Lys His Glu Pro Arg Lys Glu Ser Ile Lys
195 200 205
aag acc aaa cat ttg aga ttg tca cag cct tct gaa gtt act cat tat 672
Lys Thr Lys His Leu Arg Leu Ser Gln Pro Ser Glu Val Thr His Tyr
210 215 220
aag tca agc aaa cga gaa gta cga aca tct gat tct tcc agc cat gtt 720
Lys Ser Ser Lys Arg Glu Val Arg Thr Ser Asp Ser Ser Ser His Val
225 230 235 240
tcc cag tct gaa gaa caa gca cag att gat gct gaa atg gac tct act 768
Ser Gln Ser Glu Glu Gln Ala Gln Ile Asp Ala Glu Met Asp Ser Thr
245 250 255
cct gtt ggc tat cag tac ggt caa gga tct gat gtc aca tcc aaa agc 816
Pro Val Gly Tyr Gln Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Val Thr Ser Lys Ser
260 265 270
ttt cca gat gat ctg cct cgg atg cga ttc aag tgc ccg tac tgc aca 864
Phe Pro Asp Asp Leu Pro Arg Met Arg Phe Lys Cys Pro Tyr Cys Thr
275 280 285
cat gtg gtg aag cgg aag gca gac cta aag cgc cac ctt cgt tgt cat 912
His Val Val Lys Arg Lys Ala Asp Leu Lys Arg His Leu Arg Cys His
290 295 300
aca gga gaa agg ccc tat cca tgt caa gct tgt gga aaa aga ttt agc 960
Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Pro Cys Gln Ala Cys Gly Lys Arg Phe Ser
305 310 315 320
agg cta gac cat cta agt agc cat ttt cga aca att cac cag gca tgt 1008
Arg Leu Asp His Leu Ser Ser His Phe Arg Thr Ile His Gln Ala Cys
325 330 335
aaa ctc atc tgc aga aaa tgt aaa cgt cat gtg aca gat cta aca ggg 1056
Lys Leu Ile Cys Arg Lys Cys Lys Arg His Val Thr Asp Leu Thr Gly
340 345 350
caa gtg gta cag gag gga acc agg cgc tac aga ctg tgt aat gag tgt 1104
Gln Val Val Gln Glu Gly Thr Arg Arg Tyr Arg Leu Cys Asn Glu Cys
355 360 365
ctt gca gaa ttt ggc ata gac agc ctc ccc att gac ttg gaa gct gaa 1152
Leu Ala Glu Phe Gly Ile Asp Ser Leu Pro Ile Asp Leu Glu Ala Glu
370 375 380
caa cat ctt atg tcc cca tca gat gga gat aag gat tcc aga tgg cac 1200
Gln His Leu Met Ser Pro Ser Asp Gly Asp Lys Asp Ser Arg Trp His
385 390 395 400
ttg agt gaa gat gag aat aga tcc tat gtg gag att gta gaa gat ggg 1248
Leu Ser Glu Asp Glu Asn Arg Ser Tyr Val Glu Ile Val Glu Asp Gly
405 410 415
tct gct gat ctg gtc atc caa cag gtt gat gat agt gaa gaa gaa gaa 1296
Ser Ala Asp Leu Val Ile Gln Gln Val Asp Asp Ser Glu Glu Glu Glu
420 425 430
gaa aaa gaa att aag ccc aac att agg tag 1326
Glu Lys Glu Ile Lys Pro Asn Ile Arg
435 440
<210>2
<211>441
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Glu Ile Ser Ser His Gln Ser His Leu Leu Gln Gln Leu Asn Glu
1 5 10 15
Gln Arg Arg Gln Asp Val Phe Cys Asp Cys Ser Ile Leu Val Glu Gly
20 25 30
Lys Val Phe Lys Ala His Arg Asn Val Leu Phe Ala Ser Ser Gly Tyr
35 40 45
Phe Lys Met Leu Leu Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Ser Gln Pro Thr
50 55 60
Thr Ala Thr Phe Gln Ala Phe Ser Pro Asp Thr Phe Thr Val Ile Leu
65 70 75 80
Asp Phe Val Tyr Ser Gly Lys Leu Ser Leu Thr Gly Gln Asn Val Ile
85 90 95
Glu Val Met Ser Ala Ala Ser Phe Leu Gln Met Thr Asp Val Ile Ser
100 105 110
Val Cys Lys Thr Phe Ile Lys Ser Ser Leu Asp Ile Ser Glu Lys Glu
115 120 125
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Pro Val Gly Tyr Gln Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Val Thr Ser Lys Ser
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因此，在一个方面，本发明提供了可促进肿瘤细胞的生长和增殖 的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序 列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或 增加而得到的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了编码上述蛋白的基因，它是具有序 列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。
在另一个方面，本发明提供了含有上述基因或者编码上述蛋白的 基因的表达载体。
在又一个方面，本发明提供了由上述表达载体转化的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了生产本发明的重组蛋白的方法，该 方法包括下列步骤：
培养上述转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白； 和
从培养物中分离出重组蛋白。
在另一个方面，本发明提供了针对上述蛋白的抗体，它是使用所 述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。它可以是单克隆或多克 隆抗体。
在另一个方面，本发明提供了检测所述蛋白的试剂盒，它含有上 述特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列2所示 的蛋白。
此外，本发明提供了用于检测序列1所示的核苷酸序列的探针诊 断试剂盒，它含有与核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸 序列。
本发明还提供了以乳腺cDNA文库作为模板进行PCR扩增的引物， 该引物如下所示：
P1：gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc t
P2：gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc。
本发明还提供了上述基因、蛋白或抗体在制备治疗肿瘤的药物中 的应用。
附图简述
图1是本发明蛋白的结构示意图。
图2是ZIBC的原核表达图。
图3是ZIBC对肿瘤细胞生长增值的影响，左侧方柱为媒介物， 右侧方柱为ZIBC。
以下是本发明的详细描述。
基因获取方式：
根据基因芯片检测所获EST序列，再通过生物信息学分析数据， 设计了上下游引物，以乳腺cDNA文库作为模板进行PCR扩增，获取 了该基因的ORF。引物设计如下：
P1：gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc t
P2：gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc
此基因命名为ZIBC(Zinc finger protein Implicated in Breast Carcinogenesis)。
真核表达载体的构建：
以下列序列为引物，经过PCR扩增，克隆到pcDNA3.1(-) (Invitrogen)载体中，经转化DH5α(Invitrogen)菌株，得到ZIBC 的真核表达载体。
ups 5’-GGAATTCGCCACCATGGAGATCTCCTCTCATC-3’
downs 5’-CGGGATCCACCCTAATGTTGGGCTTAATT-3’
原核表达载体的构建：
以下列序列为引物，经过PCR扩增，克隆到pGEX-4T-3(Amersham) 载体中，经转化BL21(Invitrogen)菌株，得到ZIBC的原核表达载 体。
ups 5’-GGAATTCCATGGAGATCTCCTCTCATC-3’
downs5’-
AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCTACCTAATGTTGGGCTTAATT-3’
此基因定位与染色体1p35.1，全长为1882bp。表达蛋白约50kD。 ORF序列：(1326bp)。
编码蛋白的开放阅读框架编码一个441个氨基酸的蛋白质。根据 生物信息学预测，这个蛋白质含有两个个主要的结构域，第一个是从 第25至第121个氨基酸的BTB/POZ结构域，第二个是从第340至第 419个氨基酸的未知保守结构域。图1是该基因的结构示意图。
同源序列：
H.sapiens ZBTB8 zinc finger and BTB domain containing
M.musculus Zbtb8 zinc finger and BTB domain containing
8
对该蛋白进行生物信息学分析，发现其广谱表达。
cDNA sources：膀胱，骨，脑，眼睛，心脏，肾，肝脏，肺，乳 腺，肌肉，周围神经系统，前列腺，皮肤，小肠，胃，舌，睾丸，子 宫，胚胎，成人。
通过使用本发明的蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗 体，抗体用于所述蛋白的检测和纯化。可以利用本发明的蛋白或其部 分氨基酸序列作为免疫原来产生抗体。可以通过将抗体接种给宿主动 物并回收血清的常规方法产生多克隆抗体。还可以通过常规杂交瘤方 法产生单克隆抗体。
利用MTT法检测不同浓度的ZIBC对MCF-7和T47-D(乳腺癌细 胞)、ECC-1和Ishikawa(子宫癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)细 胞等肿瘤细胞增殖的影响，结果发现，ZIBC有促进肿瘤细胞增殖的 作用。
通过抑制所述蛋白表达，或通过利用针对所述蛋白的抗体，可以 抑制肿瘤细胞的生长和增殖，从而可以达到治疗肿瘤的目的。
实施例
实施例1：用PCR方法从人乳腺癌文库克隆编码ZIBC蛋白的基因
用乳腺癌文库(Clontech公司)为模板，用下列引物进行PCR扩 增：
Primer1：5’-gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc t-3’
Primer2：5’-gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc-3’
扩增反应条件：在50μl的反应体系中含有50mmol/L KCL， 10mmol/L Tris-Cl(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/LdNTP，20pmol 引物，1U的Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)。在PTC-100 型PCR仪(MJR公司)上按下列条件反应25个周期：94℃ 30sec； 55℃1min；72℃2min。扩增产物用QIAGEN公司的PCR纯化试剂盒 纯化，用DNA限制性内切酶NotI和BamHI(NEB公司)进行切割(37 ℃12Hours)。由博亚公司进行测序得到一1326bp序列。
实施例2：ZIBC在原核细胞中的表达及纯化
pGEX-4T-3-ZIBC可以在大肠杆菌BL21菌株中30℃诱导表达 GST-ZIBC的融合蛋白，首先制备BL21的感受态细胞：挑取单克隆 到适量培养基中，37℃250rpm培养至A600 0.4-0.5，2500g离心15 分钟，备用。将1-50ng pGEX-4T-3-ZIBC转化到上述制备的感受态细 胞中，用Glutathione Sepharose 4B进行纯化，纯化的步骤如下：
(1)取单克隆到2-3mL 2YTA培养基中培养4-5小时。转接到100 mL 的锥形瓶中生长过夜。
(2)转接到500mL的锥形瓶中培养3-5小时。
(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培养3-6小时。
(4)3000rpm 10分钟离心收集细胞。
(5)用25mLPBS重悬细胞。超声10分钟。
(6)加1.25mL 20％Triton X-100，混匀1小时。
(7)1000rpm 10分钟离心，加入0.5mL 50％slurry of Glutathione Sepharose 4B，室温30分钟。
(8)1000rpm 5分钟离心，PBS洗三遍。
(9)用0.5mL洗脱Buffer洗脱，短暂离心后收集上清。 电泳结果如图2所示。
实施例3：MTT法检测不同浓度的ZIBC对肿瘤细胞增殖的影响 MTT(四甲基偶氮唑兰)可被细胞摄取，并被活细胞内线粒 体脱氢酶还原成一种不溶于水的蓝紫色产物甲瓒，并沉淀于细胞 中，而死细胞没有这种功能。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)， 溶液在570nm处有最大吸收。故该波段处吸收值越大代表存活 细胞量越多。MTT法广泛应用于细胞毒性实验、细胞生长测定 等。本实验利用MTT法观察ZIBC对MCF-7生长的影响。具体 操作方法如下：
将培养到对数生长期的MCF-7和T47-D(乳腺癌细胞)、 ECC-1和Ishikawa(子宫癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)细胞接 种于96孔板中，每孔接种细胞数为1×104个。次日按照浓度梯 度加入ZIBC(100ng)，每浓度作用6孔细胞，37℃，5％CO2 进行培养。分别培养1d、2d、3d、4d后，在每个细胞培养孔内 加入50μlL1mg/mL的MTT溶液，同样培养条件下作用4小时 后取出，小心吸出每孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150μL， 轻微振荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚砜中。用 自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。结果如图 3所示，说明本发明的蛋白有促进肿瘤细胞增殖的作用。
ZIBC序~1
SEQUENCE LISTING
<110>北京大学
<120>ZIBC基因及其编码的蛋白和应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1326
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1323)
<223>
<400>1
atg gag atc tcc tct cat cag tct cac ctc ctg cag caa ctg aac gag 48
Met Glu Ile Ser Ser His Gln Ser His Leu Leu Gln Gln Leu Asn Glu
1 5 10 15
cag cgc agg caa gat gta ttt tgt gac tgc agt att cta gtt gaa ggg 96
Gln Arg Arg Gln Asp Val Phe Cys Asp Cys Ser Ile Leu Val Glu Gly
20 25 30
aag gtc ttc aaa gca cat cga aat gta tta ttc gct agt agc ggc tac 144
Lys Val Phe Lys Ala His Arg Asn Val Leu Phe Ala Ser Ser Gly Tyr
35 40 45
ttt aaa atg ctt ctt tct cag aat tca aag gag acg agt cag cca acc 192
Phe Lys Met Leu Leu Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Ser Gln Pro Thr
50 55 60
aca gct aca ttt cag gct ttc tcc cct gac act ttt aca gtt atc ttg 240
Thr Ala Thr Phe Gln Ala Phe Ser Pro Asp Thr Phe Thr Val Ile Leu
65 70 75 80
gac ttc gta tat tct ggc aaa ctg tct ctt act ggt cag aat gtc ata 288
Asp Phe Val Tyr Ser Gly Lys Leu Ser Leu Thr Gly Gln Asn Val Ile
85 90 95
gaa gtg atg tcg gct gct agc ttc ctt cag atg act gat gtc ata agt 336
Glu Val Met Ser Ala Ala Ser Phe Leu Gln Met Thr Asp Val Ile Ser
100 105 110
gta tgt aag act ttt att aaa tct tcc tta gac att agt gag aaa gaa 384
Val Cys Lys Thr Phe Ile Lys Ser Ser Leu Asp Ile Ser Glu Lys Glu
115 120 125
aaa gat cgc tat ttc agt ctc tca gat aaa gat gcc aat tct aat ggt 432
Lys Asp Arg Tyr Phe Ser Leu Ser Asp Lys Asp Ala Asn Ser Asn Gly
130 135 140
gta gaa cgt tcc tct ttt tat agt ggt ggc tgg caa gaa gga agc agt 480
Val Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Gly Gly Trp Gln Glu Gly Ser Ser
145 150 155 160
tct cca cgt tct cac cta agc cca gag caa gga aca ggt ata ata agt 528
Ser Pro Arg Ser His Leu Ser Pro Glu Gln Gly Thr Gly Ile Ile Ser
165 170 175
gga aaa tct tgg aat aag tat aat tat cat cca gcc tcc cag aag aat 576
Gly Lys Ser Trp Asn Lys Tyr Asn Tyr His Pro Ala Ser Gln Lys Asn
180 185 190
act caa caa ccc ttg gcc aag cat gaa cca agg aaa gag tcc att aaa 624
Thr Gln Gln Pro Leu Ala Lys His Glu Pro Arg Lys Glu Ser Ile Lys
195 200 205
aag acc aaa cat ttg aga ttg tca cag cct tct gaa gtt act cat tat 672
Lys Thr Lys His Leu Arg Leu Ser Gln Pro Ser Glu Val Thr His Tyr
210 215 220
aag tca agc aaa cga gaa gta cga aca tct gat tct tcc agc cat gtt 720
Lys Ser Ser Lys Arg Glu Val Arg Thr Ser Asp Ser Ser Ser His Val
225 230 235 240
tcc cag tct gaa gaa caa gca cag att gat gct gaa atg gac tct act 768
Ser Gln Ser Glu Glu Gln Ala Gln Ile Asp Ala Glu Met Asp Ser Thr
245 250 255
cct gtt ggc tat cag tac ggt caa gga tct gat gtc aca tcc aaa agc 816
Pro Val Gly Tyr Gln Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Val Thr Ser Lys Ser
260 265 270
ttt cca gat gat ctg cct cgg atg cga ttc aag tgc ccg tac tgc aca 864
Phe Pro Asp Asp Leu Pro Arg Met Arg Phe Lys Cys Pro Tyr Cys Thr
275 280 285
cat gtg gtg aag cgg aag gca gac cta aag cgc cac ctt cgt tgt cat 912
His Val Val Lys Arg Lys Ala Asp Leu Lys Arg His Leu Arg Cys His
290 295 300
aca gga gaa agg ccc tat cca tgt caa gct tgt gga aaa aga ttt agc 960
Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Pro Cys Gln Ala Cys Gly Lys Arg Phe Ser
305 310 315 320
agg cta gac cat cta agt agc cat ttt cga aca att cac cag gca tgt 1008
Arg Leu Asp His Leu Ser Ser His Phe Arg Thr Ile His Gln Ala Cys
325 330 335
aaa ctc atc tgc aga aaa tgt aaa cgt cat gtg aca gat cta aca ggg 1056
Lys Leu Ile Cys Arg Lys Cys Lys Arg His Val Thr Asp Leu Thr Gly
340 345 350
caa gtg gta cag gag gga acc agg cgc tac aga ctg tgt aat gag tgt 1104
Gln Val Val Gln Glu Gly Thr Arg Arg Tyr Arg Leu Cys Asn Glu Cys
355 360 365
ctt gca gaa ttt ggc ata gac agc ctc ccc att gac ttg gaa gct gaa 1152
Leu Ala Glu Phe Gly Ile Asp Ser Leu Pro Ile Asp Leu Glu Ala Glu
370 375 380
caa cat ctt atg tcc cca tca gat gga gat aag gat tcc aga tgg cac 1200
Gln His Leu Met Ser Pro Ser Asp Gly Asp Lys Asp Ser Arg Trp His
385 390 395 400
ttg agt gaa gat gag aat aga tcc tat gtg gag att gta gaa gat ggg 1248
Leu Ser Glu Asp Glu Asn Arg Ser Tyr Val Glu Ile Val Glu Asp Gly
405 410 415
tct gct gat ctg gtc atc caa cag gtt gat gat agt gaa gaa gaa gaa 1296
Ser Ala Asp Leu Val Ile Gln Gln Val Asp Asp Ser Glu Glu Glu Glu
420 425 430
gaa aaa gaa att aag ccc aac att agg tag 1326
Glu Lys Glu Ile Lys Pro Asn Ile Arg
435 440
<210>2
<211>441
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Glu Ile Ser Ser His Gln Ser His Leu Leu Gln Gln Leu Asn Glu
1 5 10 15
Gln Arg Arg Gln Asp Val Phe Cys Asp Cys Ser Ile Leu Val Glu Gly
20 25 30
Lys Val Phe Lys Ala His Arg Asn Val Leu Phe Ala Ser Ser Gly Tyr
35 40 45
Phe Lys Met Leu Leu Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Ser Gln Pro Thr
50 55 60
Thr Ala Thr Phe Gln Ala Phe Ser Pro Asp Thr Phe Thr Val Ile Leu
65 70 75 80
Asp Phe Val Tyr Ser Gly Lys Leu Ser Leu Thr Gly Gln Asn Val Ile
85 90 95
Glu Val Met Ser Ala Ala Ser Phe Leu Gln Met Thr Asp Val Ile Ser
100 105 110
Val Cys Lys Thr Phe Ile Lys Ser Ser Leu Asp Ile Ser Glu Lys Glu
115 120 125
Lys Asp Arg Tyr Phe Ser Leu Ser Asp Lys Asp Ala Asn Ser Asn Gly
130 135 140
Val Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Gly Gly Trp Gln Glu Gly Ser Ser
145 150 155 160
Ser Pro Arg Ser His Leu Ser Pro Glu Gln Gly Thr Gly Ile Ile Ser
165 170 175
Gly Lys Ser Trp Asn Lys Tyr Asn Tyr His Pro Ala Ser Gln Lys Asn
180 185 190
Thr Gln Gln Pro Leu Ala Lys His Glu Pro Arg Lys Glu Ser Ile Lys
195 200 205
Lys Thr Lys His Leu Arg Leu Ser Gln Pro Ser Glu Val Thr His Tyr
210 215 220
Lys Ser Ser Lys Arg Glu Val Arg Thr Ser Asp Ser Ser Ser His Val
225 230 235 240
Ser Gln Ser Glu Glu Gln Ala Gln Ile Asp Ala Glu Met Asp Ser Thr
245 250 255
Pro Val Gly Tyr Gln Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Val Thr Ser Lys Ser
260 265 270
Phe Pro Asp Asp Leu Pro Arg Met Arg Phe Lys Cys Pro Tyr Cys Thr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Arg Leu Asp His Leu Ser Ser His Phe Arg Thr Ile His Gln Ala Cys
325 330 335
Lys Leu Ile Cys Arg Lys Cys Lys Arg His Val Thr Asp Leu Thr Gly
340 345 350
Gln Val Val Gln Glu Gly Thr Arg Arg Tyr Arg Leu Cys Asn Glu Cys
355 360 365
Leu Ala Glu Phe Gly Ile Asp Ser Leu Pro Ile Asp Leu Glu Ala Glu
370 375 380
Gln His Leu Met Ser Pro Ser Asp Gly Asp Lys Asp Ser Arg Trp His
385 390 395 400
Leu Ser Glu Asp Glu Asn Arg Ser Tyr Val Glu Ile Val Glu Asp Gly
405 410 415
Ser Ala Asp Leu Val Ile Gln Gln Val Asp Asp Ser Glu Glu Glu Glu
420 425 430
Glu Lys Glu Ile Lys Pro Asn Ile Arg
435 440
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