[0001] 相关申请

[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年4月5日提交的题为“CEP290小基因治疗”的美国临时申请序列号62/481,727的申请日期的权益，其全部内容通过引用并入本文。

[0003] 政府支持

[0004] 本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号EY022372、NS076991、AI100263和HL131471的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

[0005] 背景

[0006] 纤毛疾病(ciliopathies)代表一组以异常纤毛形成或功能为特征的疾病和失调。例如眼纤毛病(ocular ciliopathies)可导致视网膜变性、视敏度下降和/或失明。与CEP290相关的利伯先天性黑朦症(LCA)是视网膜变性疾病中最常见和最严重的形式之一。
但是，目前不存在治疗或治愈方法。通常，纤毛相关基因(例如CEP290基因(～8kb))的巨大大小限制了使用常规腺相关病毒(AAV)载体介导的基因递送方法的成功治疗的发展。使用基因组编辑(例如CRISPR/Cas9方法)和反义寡核苷酸可能会产生脱靶效应，并且通常仅适用于纤毛相关基因中的一种突变类型。因此，需要用于治疗纤毛疾病的新的组合物和方法。

[0007] 本公开的方面涉及用于将小基因递送至受试者的组合物和方法。因此，本公开部分基于基因治疗载体(例如病毒(如rAAV)载体)，其包含一种或更多种编码治疗性基因产物(例如蛋白或肽)的基因片段(例如，小基因)，以及任选的一种或更多种抑制性核酸，其靶向与疾病或失调相关的内源基因变体(例如，突变体)(例如，与纤毛疾病相关的基因)。在一些实施方案中，一种或更多种抑制性核酸不沉默由小基因编码的基因产物的基因表达。在一些实施方案中，提供用于治疗纤毛疾病(例如，眼纤毛病)的方法，例如以纤毛相关基因(例如与利伯先天性黑朦症(LCA)相关的CEP290基因)的突变或缺失为特征的失调和疾病。

[0008] 因此，在一些方面，本公开涉及病毒载体，其包含表达盒，所述表达盒包含编码治疗性小基因的第一分离的核酸序列和编码一种或更多种抑制性核酸的第二分离的核酸序列，其中所述表达盒的侧翼为病毒复制序列，并且其中一种或更多种抑制性核酸不结合编码治疗性小基因的分离的核酸。

[0009] 本公开部分基于意外的发现：AAV介导的缺乏“M区”的CEP290基因片段(例如编码CEP290蛋白片段)递送至患有以CEP290基因的突变或缺失为特征的疾病或失调的受试者的细胞(例如眼细胞)恢复或改善纤毛长度并拯救或改善光感受器功能。鉴于先前的公开(例如US 2016/0185832)，该发现是令人惊讶的，US 2016/0185832描述了CEP290基因的“M区”对于介导微管定位和纤毛形成是必需的。在一些实施方案中，本公开的实施例部分描述了CEP290蛋白的结构域(例如，片段)，其在光感受器中保持功能并且可以使用常规的AAV载体递送。

[0010] 因此，在一些方面，本公开提供一种分离的核酸，其包含：第一区域，其包含第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)，或其变体；和第二区域，其包含编码CEP290蛋白片段的转基因，其中CEP290蛋白片段不包含SEQ ID NO：1的氨基酸位置1695至1966。

[0011] 在一些方面，本公开提供分离的核酸，其包含：第一区域，其包含第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)，或其变体；和第二区域，其包含编码CEP290蛋白片段的转基因，其中CEP290蛋白片段包含SEQ ID NO：1的至少500个的连续氨基酸。在一些实施方案中，至少500个连续氨基酸包含选自SEQ ID NO：2、3和4的序列，或由其组成。

[0012] 在一些实施方案中，第二区域不包含SEQ ID NO：1的氨基酸位置1695至1966。在一些实施方案中，转基因包含SEQ ID NO：1的不超过1120个连续氨基酸。

[0013] 在一些实施方案中，转基因包含SEQ ID NO：1的氨基酸位置580至1695。在一些实施方案中，由转基因编码的CEP290蛋白片段包含SEQ ID NO：2所示的序列。在一些实施方案中，由转基因编码的CEP290的蛋白片段包含SEQ ID NO：1的氨基酸位置580至1180，或SEQ ID NO：1的氨基酸位置1181至1695。在一些实施方案中，由转基因编码的CEP290蛋白片段包含SEQ ID NO：3或4所示的序列，或由其组成。

[0014] 在一些实施方案中，转基因包含选自SEQ ID NO：5、6和7的核酸序列，或由其组成。

[0015] 在一些实施方案中，转基因进一步包含一种或更多种抑制性核酸，例如dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、人工miRNA(amiRNA)等。在一些实施方案中，一种或更多种抑制性核酸抑制受试者中内源表达的CEP290的表达，但不抑制由转基因编码的CEP290蛋白片段的表达。

[0016] 在一些实施方案中，转基因进一步包含启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或组织特异性启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子是眼特异性启动子，任选地是视网膜劈裂蛋白(retinoschisin)启动子、K12启动子、视紫红质启动子、视杆细胞特异性启动子、视锥细胞特异性启动子、视紫红质激酶启动子(例如，GRK1启动子)或光感受器间类视黄醇结合蛋白近端(IRBP)启动子。在一些实施方案中，启动子是RNA pol II启动子或RNA pol III启动子。

[0017] 在一些实施方案中，分离的核酸进一步包含第三区域，所述第三区域包含第二腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)，或其变体。

[0018] 在一些实施方案中，第一区域和/或第三区域是AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV6.2 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAV11 ITR或其变体。在一些实施方案中，第一区域和/或第三区域是AAV2 ITR或其变体。

[0019] 在一些方面，本公开提供包含如本公开所述的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒。

[0020] 在一些方面，本公开提供宿主细胞，其包含如本公开所述的分离的核酸或载体。

[0021] 在一些方面，本公开提供重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：衣壳蛋白；和如本公开所述的分离的核酸。在一些实施方案中，衣壳蛋白是AAV8衣壳蛋白或AAV5衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含SEQ ID NO：9所示的序列。

[0022] 在一些实施方案中，rAAV是自互补AAV(scAAV)。

[0023] 在一些实施方案中，将rAAV进行配制以递送至眼睛。

[0024] 在一些方面，本公开提供包含如本公开所述的rAAV和药学上可接受的赋形剂的组合物。

[0025] 在一些方面，本公开提供治疗有此需要的受试者中疾病或失调(例如，单基因遗传病、纤毛疾病等)的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本公开所述的分离的核酸或rAAV施用于患有该疾病或失调(例如，单基因遗传病、纤毛疾病等)的受试者。

[0026] 在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用一种或更多种抑制性核酸(例如，一种或更多种编码一种或更多种抑制性核酸的表达构建体)的步骤。在一些实施方案中，一种或更多种抑制性核酸抑制与疾病或失调(例如，单基因遗传病、纤毛疾病等)相关的一种或更多种基因的表达。在一些实施方案中，一种或更多种抑制性核酸不抑制如本公开所述的由分离的核酸或rAAV编码的转基因的表达。

[0027] 在一些方面，本公开提供治疗有此需要的受试者中眼纤毛病的方法，该方法包括向患有眼纤毛病的受试者施用治疗有效量的如本公开所述的分离的核酸或rAAV。

[0028] 在一些实施方案中，眼纤毛病与受试者中CEP290基因的突变或受试者中CEP290基因的缺失相关。在一些实施方案中，CEP290基因的突变或缺失导致视网膜变性、光感受器变性、视网膜功能障碍和/或视力丧失。

[0029] 在一些实施方案中，眼纤毛病是利伯先天性黑朦症(LCA)、Joubert综合征、Bardet-Biedl综合征、Meckel综合征、Usher综合征、肾消耗病(Nephronophthisis)或综合征。在一些实施方案中，眼纤毛病是利伯先天性黑朦症(LCA)。

[0030] 在一些实施方案中，CEP290基因的突变是内含子突变、无义突变、移码突变、错义突变或其任何组合。

[0031] 在一些实施方案中，受试者是人，并且CEP290基因突变发生在位置c.2991+1655，任选地其中突变是A1655G。

[0032] 在一些实施方案中，施用导致将分离的核酸或rAAV递送至受试者的眼睛。在一些实施方案中，施用是通过注射，任选地通过视网膜下注射或玻璃体内注射。在一些实施方案中，施用是对受试者眼睛的局部施用。在一些实施方案中，将如本公开所述的分离的核酸或rAAV施用于受试者多于1次(例如2、3、4、5或更多次)。在一些实施方案中，施用的间隔超过4周。

[0033] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用一种或更多种抑制性核酸，其中所述一种或更多种抑制性核酸不结合编码SEQ ID NO：1的氨基酸残基580至1180或SEQ ID NO：1的氨基酸残基1181至1695的核酸序列。

[0034] 附图简要说明

[0035] 图1显示全长CEP290基因的示意图，其代表了不同蛋白相互作用结构域的位置。

[0036] 图2A显示与来自野生型(WT)和Cep290rd16小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的纤毛数目和长度有关的显微镜数据，所述小鼠血清饥饿24小时(用于纤毛生长)，然后用抗乙酰化α-微管蛋白抗体(纤毛标记物)染色。较低的图像表示纤毛的较高放大率。图2B显示突变MEF中纤毛长度的统计学上的显著减少。

[0037] 图3显示用编码GFP或GFP-CEP290的构建体转染，然后用ARL13b(纤毛标记物)和γ-微管蛋白染色的Cep290rd16 MEF。观察到表达全长CEP290的细胞的纤毛长度显著增加。编码GFP的构建体用作阴性对照。**：p＜0.001。

[0038] 图4A显示人CEP290蛋白和缺失变体的示意图。肌尾：肌球蛋白尾同源结构域。也未显示其他蛋白相互作用结构域。图4B显示使用抗GFP抗体用图4A中所述的构建体瞬时转染小鼠成纤维细胞的免疫印迹分析。检测到特定的蛋白条带(如箭头所示)，表明缺失变体在细胞中稳定表达。

[0039] 图5A显示用编码GFP融合全长(FL)CEP290和所示变体的质粒瞬时转染的Cep290rd16成纤维细胞用GFP、γ-微管蛋白、ARL13B抗体进行的免疫染色。细胞核用DAPI染色。较长的箭头指示蛋白的基体/纤毛体定位，而较短的箭头指示弥漫性染色。图5B显示图
5A中描述的细胞的纤毛长度，使用ImageJ进行定量(n＞200)。*：p＜0.001。ns：不显著。

[0040] 图6A显示使用抗GFP抗体进行的用单独编码GFP或GFP融合的所定变体的质粒瞬时rd16转染的Cep290 成纤维细胞的免疫印迹分析。箭头指向预期大小的蛋白产物。分子量标记以kDa显示。图6B显示使用GFP和ARL13B(纤毛标记物)抗体进行的细胞免疫染色。细胞核用DAPI染色。箭头指示蛋白的基体/纤毛体定位。图6C显示使用ImageJ定量的细胞纤毛长度(n＞200)。*：p＜0.001。

[0041] 图7A-7B显示miniCEP290580-1180的体内生理拯救潜力。图7A显示在P0/P1阶段视网膜下注射所示的miniCEP290或GFP并在注射后3周通过ERG进行分析的Cep290rd16小鼠。使用年龄匹配的未注射的WT或Cep290rd16(同窝仔)小鼠作为ERG的对照。用箭头表示ERG的a波，而用箭头头部表示b波。数据代表至少6只小鼠的分析。***：p＜0.0001；ns：不显著。图7B显示在P0/P1阶段视网膜下注射所示的miniCEP290或GFP并在注射后3周通过ERG进行分析的小鼠的暗视a波和b波振幅。

[0042] 图8A-8D显示miniCEP290580-1180对光感受器的体内形态学拯救。图8A显示用所示的miniCEP290580-1180或GFP注射并用DAPI染色的Cep290rd16视网膜。图8B显示用所示的miniCEP290580-1180或GFP注射并通过超薄切片评估的Cep290rd16视网膜。ONL(外核层)标有垂直线。显示WT视网膜切片以进行比较。INL：内核层。图8C显示注射miniCEP290580-1180的Cep290rd16小鼠中检测到的RDS的提高的表达。GFP染色标记注射的区域。图8D显示用所示的miniCEP290注射并用GFP(注射区域)、视紫红质(RHO；视杆细胞特异性；或M-视蛋白(MOP；视锥细胞特异性))抗体和DAPI(核)染色的Cep290rd16小鼠的视网膜冷冻切片。在注射miniCEP290580-1180的视网膜中检测到富含外部区段(OS)的视蛋白染色。在注射miniCEP2902037-2479的视网膜中检测到视蛋白表达急剧降低。ONL：外核层；INL：内核层；GCL：
神经节细胞层。

[0043] 图9显示CEP290小基因的其他实施方案。

[0044] 图10显示用单独编码GFP或GFP融合的所示变体的质粒瞬时转染并使用抗GFP抗体用ImageJ定量的Cep290rd16成纤维细胞的纤毛长度(n＞200)。

[0045] 图11显示在P0/P1阶段视网膜下注射所示的miniCEP290或GFP并在注射后3周通过ERG进行分析的Cep290rd16小鼠。使用年龄匹配的未注射的WT或Cep290rd16(同窝仔)小鼠作为ERG的对照。用箭头表示ERG的a波，而用箭头头部表示b波。数据代表至少6只小鼠的分析。***：p＜0.0001；ns：不显著。

[0046] 图12显示在P0/P1阶段视网膜下注射所示的miniCEP290或GFP并在注射后3周通过ERG分析的小鼠的暗视a波和b波振幅。显示在注射后4周和5周对注射的小鼠进行的暗视(a波和b波)和明视b波分析并与3周的ERG进行比较。使用年龄匹配的未注射WT和注射GFP的Cep290rd16小鼠作为对照。

[0047] 在一些方面，本公开涉及用于治疗某些遗传疾病(例如单基因遗传病、纤毛疾病等)的组合物和方法。单基因遗传病是由基因的单个等位基因的异常表达或功能引起的疾病。单基因遗传病的实例包括但不限于地中海贫血、镰状细胞性贫血、血友病、囊性纤维化、泰-萨克斯病(Tay Sachs disease)、脆性X综合征、亨廷顿氏病等。纤毛疾病是影响细胞纤毛表达或功能的遗传性失调。纤毛疾病的实例包括但不限于Alstrom综合征、Bardet-Biedl综合征、Joubert综合征、Merckel综合征、肾消耗病、口面指综合征、Senior-Locken综合征、多囊肾病、原发性纤毛运动障碍和内脏移位。

[0048] 本公开部分基于基因治疗载体，例如病毒(例如rAAV)载体，其包含一种或更多种编码治疗性基因产物(例如蛋白或肽)的基因片段(例如小基因)，并且任选地一种或更多种抑制性核酸，其靶向与疾病或失调相关的内源基因变体(例如突变体)(例如与纤毛疾病相关的基因)。

[0049] 基因治疗载体可以是病毒载体(例如，慢病毒载体、腺相关病毒载体等)、质粒、封闭式DNA(例如ceDNA)等。在一些实施方案中，基因治疗载体是病毒载体。在一些实施方案中，编码小基因的表达盒的侧翼是一个或更多个病毒复制序列，例如慢病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。

[0050] 如本文所用，“小基因”是指编码重组肽或蛋白的分离的核酸序列，其中编码天然存在的肽或蛋白的相应基因的一个或更多个非必需元件已被除去，并且其中由小基因编码的肽或蛋白保留了相应的天然存在的肽或蛋白的功能。“治疗性小基因”是指编码用于治疗遗传疾病的肽或蛋白(例如，肌营养不良蛋白、dysferlin、因子VIII、淀粉样前体蛋白(APP)、酪氨酸酶(Tyr)等)的小基因。小基因是本领域已知的，并描述于例如Karpati和Acsadi(1994)Clin Invest Med 17(5)：499-509；Plantier等(2001)Thromb Haemost.86(2)：596-603；和Xiao等(2007)World J.Gastroenterol.13(2)：244-9中。

[0051] 通常，编码小基因(例如治疗性小基因)的分离的核酸相对于编码相应的天然存在的野生型蛋白的核酸序列截短了约10％至约99％(例如，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约90％、约99％等)。例如，在一些实施方案中，与野生型CEP290基因相比，编码CEP290蛋白片段的小基因截短约76％(例如，含约24％的核酸序列)。

[0052] 在一些实施方案中，基因治疗载体进一步包含一种或更多种抑制性核酸，其不沉默由小基因编码的基因产物的基因表达，但沉默对应于野生型或由小基因编码的疾病相关蛋白变体的内源蛋白的基因表达。例如，在一些实施方案中，基因治疗载体包含编码CEP290蛋白片段的小基因和一种或更多种抑制内源表达的CEP290(例如，选自c.2991+1655A>G、c.2249T>G、c.7341dupA、c.2118_2122dupTCAGG、c.3814C>T、c.679_680delGA、c.265dupA、c.180+1G？T、c.1550delT、c.4115_4116delTA、c.4966G>T和c.5813_5817delCTTTA的CEP290突变体)的表达但不会抑制由小基因编码的CEP290片段的表达的抑制性核酸(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、amiRNA等)。技术人员还将理解，在一些实施方案中，可以将一种或更多种抑制内源表达的CEP290的表达但不抑制由小基因编码的CEP290片段的表达的抑制性核酸以脱离基因治疗构建体的方式施用于受试者。

[0053] 治疗眼纤毛病的方法

[0054] 本发明的方面涉及某些编码蛋白的转基因(例如，人CEP290的片段)，其在递送至受试者时可有效促进眼纤毛(例如，光感受器的纤毛)的生长并在受试者中恢复光感受器的结构和功能。因此，在一些实施方案中，本公开描述的方法和组合物用于治疗与CEP290基因的突变或缺失相关的眼纤毛病，例如利伯先天性黑朦症(LCA)、Joubert综合征、Bardet-Biedl综合征、Meckel综合征、Usher综合征和 综合征。

[0055] 本公开提供用于将转基因(例如，编码CEP290蛋白或其片段的基因)递送至受试者的方法。该方法通常包括向受试者施用有效量的编码CEP290蛋白片段的分离的核酸，或包含用于表达CEP290蛋白片段的核酸的rAAV。

[0056] 人CEP290基因由52个外显子组成，其编码～290kDa的蛋白(2479个氨基酸)。在一些实施方案中，人CEP290基因编码包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白，并如GenBank登录号(NP_079390.3)所述。在一些实施方案中，人CEP290基因(例如，NCBI参考序列：NM_025114.3)包含SEQ ID NO：8所示的序列。

[0057] CEP290是多结构域蛋白，并包含许多分布在该蛋白全长上的卷曲螺旋结构域。此外，CEP290蛋白包含膜和微管结合结构域以及肌球蛋白-尾同源结构域。通常，CEP290主要定位于原纤毛的中心体和过渡区以及光感受器的CC。先前的出版物已经观察到，将蛋白定位于中心体的CEP290结构域(例如，如US 2016/0185832中所述的CEP290基因的“M区”)对于介导微管定位和纤毛形成是必需的。在一些实施方案中，“M区”是指如US 2016/0185832中所述的人CEP290的氨基酸残基1695至1966。

[0058] 本公开的方面部分基于令人惊讶的发现，即当在有此需要的受试者中表达时，例如通过施用病毒载体(例如，rAAV)，缺少“M”区的某些CEP290片段介导纤毛形成的有效拯救和光感受器拯救。

[0059] 因此，在一些方面，本公开提供编码CEP290蛋白片段的转基因，其中所述CEP290蛋白片段不包含SEQ ID NO：1的氨基酸位置1695至1966(例如，包含“M”区的区域)。“CEP蛋白片段”是指CEP290蛋白的2至2479(例如，在2和2479之间的任何整数)氨基酸部分。在一些实施方案中，CEP蛋白片段包含CEP290(例如，SEQ ID NO：1)的连续氨基酸部分(例如，氨基酸580至1180)。在一些实施方案中，CEP蛋白片段包含CEP290(例如，SEQ ID NO：1)的一个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)间断的氨基酸部分(例如氨基酸1至10、580至1180和1967至2470)。

[0060] 在一些实施方案中，CEP290蛋白片段包含SEQ ID NO：1的至少500个连续氨基酸。例如，在一些实施方案中，CEP290蛋白片段包含(或由其组成)CEP290(例如，SEQ ID NO：1)的氨基酸580至1695，或氨基酸580至1180，或氨基酸1181至1695。在一些实施方案中，至少
500个连续氨基酸包含选自SEQ ID NO：2、3和4的序列，或由其组成。在一些实施方案中，本公开提供包含编码CEP290蛋白片段的核酸(例如，分离的核酸)的转基因。在一些实施方案中，转基因包含选自SEQ ID NO：5、6和7的核酸序列，或由其组成。

[0061] 在一些实施方案中，编码本公开描述的CEP290片段的转基因介导纤毛生长和光感受器拯救，并且因此用于治疗纤毛疾病，例如眼纤毛病。通常，“纤毛疾病”是指以导致受试者细胞中纤毛异常形成或功能异常的蛋白功能缺陷(或缺乏)为特征的疾病或失调。“眼纤毛病”是在受试者的眼细胞(例如视杆细胞、视锥细胞、光感受器细胞等)中发生纤毛的异常形成或功能异常的纤毛疾病，通常导致视网膜变性、视觉丧失和失明。纤毛疾病的实例包括但不限于早发性发育异常(earliest onset developmental anomaly)，例如Meckel Gruber综合征和Joubert综合征，和相对迟发疾病，例如Bardet-Biedl综合征、Senior-Loken综合征和Usher综合征。在一些实施方案中，视网膜营养不良(例如由于眼纤毛病引起)更通常以非综合征的方式出现。

[0062] 在一些实施方案中，眼纤毛病是利伯先天性黑朦症(LCA)。通常，LCA是一种临床和遗传异质性疾病，具有早发性严重视网膜变性，在出生或到5至7岁时开始发作。通常，CEP290中的一个或更多个突变占LCA的>26％(LCA10；OMIM 611755)。在一些实施方案中，LCA以受试者中CEP290基因的缺失为特征。通常，导致LCA的CEP290中的突变可以是内含子突变、无义突变、移码突变、错义突变或其任何组合。与LCA相关的CEP290基因突变的实例包括但不限于c.2991+1655A>G、c.2249T>G、c.7341dupA、c.2118_2122dupTCAGG、c.3814C>T、c.679_680delGA、c.265dupA、c.180+1G？T、c.1550delT、c.4115_4116delTA、c.4966G>T和c.5813_5817delCTTTA，例如如den Hollander等(2006)Am J Hum Genet.79(3)：556-561中所述。在一些实施方案中，CEP290中的突变是深内含子突变，例如在位置c.2991+1655A。在一些实施方案中，深内含子突变是c.2991+1655A>G。

[0063] 通过本领域已知的任何方法，可以从获自受试者的样品(例如DNA样品、RNA样品、血液样品或其他生物样品)鉴定受试者(例如患有或疑似患有与CEP290基因突变或缺失相关的纤毛疾病的受试者)中CEP290基因缺失和/或突变。例如，在一些实施方案中，从获自受试者的生物样品提取核酸(例如DNA、RNA或其组合)并进行核酸测序以鉴定CEP290基因中的突变。核酸测序技术的实例包括但不限于Maxam-Gilbert测序、焦磷酸测序、链终止测序、大规模平行签名测序、单分子测序、纳米孔测序、Illumina测序等。在一些实施方案中，例如通过定量CEP290蛋白表达(例如，通过Western印迹)或功能(例如，通过分析纤毛的生长、结构、功能等)，或通过DNA直接测序并与获自对照DNA序列(例如，野生型CEP290 DNA序列)的序列进行比较来间接检测CEP290基因中的突变或缺失。

[0064] 在一些方面，本公开提供治疗有此需要的受试者中眼纤毛病的方法，该方法包括向患有眼纤毛病的受试者施用如本公开所述的治疗有效量的分离的核酸或rAAV。

[0065] 物质的“有效量”是足以产生所需效果的量。在一些实施方案中，分离的核酸(例如，包含编码本文所述的CEP290蛋白片段的转基因的分离的核酸)的有效量是足以转染(或在rAAV介导的递送的情况下感染)足够数目的受试者靶组织靶细胞的量。在一些实施方案中，靶组织是眼组织(例如，光感受器细胞、视杆细胞、视锥细胞、视网膜神经节细胞、视网膜细胞等)。在一些实施方案中，有效量的分离的核酸(例如，其可以通过rAAV递送)可以是足以对受试者具有治疗益处的量，例如，增加或补充目标基因或蛋白(例如，CEP290)表达的量，以改善受试者的一种或更多种疾病症状(例如，眼纤毛病如LCA的症状)等。有效量取决于多种因素，例如，如受试者的物种、年龄、体重、健康状况以及被靶向的组织，并且因此可以在如本公开其他地方所述的受试者和组织之间变化。

[0066] 分离的核酸

[0067] 在一些方面，本公开提供用于表达人CEP290或其片段的分离的核酸。“核酸”序列是指DNA或RNA序列。在一些实施方案中，本公开的蛋白和核酸是分离的。如本文所用，术语“分离的”意指人工产生的。如本文关于核酸所用，术语“分离的”指：(i)通过例如聚合酶链式反应(PCR)在体外扩增；(ii)通过克隆重组产生；(iii)如通过裂解和凝胶分离纯化；或(iv)通过例如化学合成来合成。分离的核酸是可以通过本领域熟知的重组DNA技术容易地操作的核酸。因此，认为包含在已知其5'和3'限制性位点或已经公开了其聚合酶链式反应(PCR)引物序列的载体中的核苷酸序列被认为是分离的，但是存在于其天然宿主中的其天然状态的核酸序列却不是分离的。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不是必须纯化的。例如，在克隆或表达载体内分离的核酸不是纯化的，因为它可能包含它所存在其中的细胞的物质的仅仅极低的百分比。然而，该术语在此处使用时，这种核酸是分离的，因为它可以通过本领域普通技术人员已知的标准技术容易地操作。如本文关于蛋白或肽所用，术语“分离的”是指已经从其天然环境中分离的或人工产生的(例如，通过化学合成、通过重组DNA技术等)蛋白或肽。

[0068] 技术人员还将认识到，可以进行保守的氨基酸取代以提供衣壳蛋白的功能上相等的变体或同源物。在一些方面，本公开包括导致保守氨基酸取代的序列改变。如本文所用，保守氨基酸取代是指不改变进行氨基酸取代的蛋白的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，例如可以在汇编此类方法的参考文献中找到，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等编，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel，等编，John Wiley&Sons，Inc，New York。氨基酸的保守取代包括以下组中氨基酸之间的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N和(g)E、D。因此，可以对本文公开的蛋白和多肽的氨基酸序列进行保守的氨基酸取代。

[0069] 本发明的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(AAV)载体(rAAV载体)。在一些实施方案中，如本公开所述的分离的核酸包含含有第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)或其变体的区域(例如，第一区域)。可以将分离的核酸(例如，重组AAV载体)包装到衣壳蛋白中并施用于受试者和/或递送至选择的靶细胞。“重组AAV(rAAV)载体”通常最少由转基因及其调控序列以及5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)组成。如本文其他地方所公开，转基因可以包含一个或更多个编码一种或更多种蛋白(例如，人CEP290或其片段)的区域。如本公开其他地方所述，转基因还可以包含编码例如miRNA结合位点和/或表达控制序列(例如，poly-A尾)的区域。

[0070] 通常，ITR序列的长度约为145bp。优选地，分子中使用编码ITR的基本上整个序列，尽管允许对这些序列进行某种程度的微小修饰。修饰这些ITR序列的能力在本领域技术范围内。(参见，例如，诸如Sambrook等，“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)；和K.Fisher等，J Virol.，70：520 532(1996)的课本)。在本发明中使用的这种分子的实例是包含转基因的“顺式作用”质粒，其中所选的转基因序列和相关的调控元件的侧翼是5'和3'AAV ITR序列。AAV ITR序列可以从包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型的任何已知的AAV中获得。在一些实施方案中，分离的核酸(例如，rAAV载体)包含至少一种ITR，所述ITR具有选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其变体的血清型。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码AAV2 ITR的区域(例如，第一区域)。

[0071] 在一些实施方案中，分离的核酸进一步包含含有第二AAV ITR的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)。在一些实施方案中，第二AAV ITR具有选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其变体的血清型。在一些实施方案中，第二ITR是缺乏功能性末端决定位点(terminal resolution site，TRS)的突变ITR。术语“缺乏末端决定位点”可以指AAV ITR，其包含去除ITR末端决定位点(TRS)功能的突变(例如，诸如非同义突变或错义突变等有义突变)，或指缺少编码功能性TRS(例如，ΔTRS ITR)的核酸序列的截短的AAV ITR。不希望受任何特定理论的束缚，包含缺乏功能性TRS的ITR的rAAV载体产生自互补的rAAV载体，例如，如McCarthy(2008)Molecular Therapy 16(10)：1648-1656中所述。

[0072] 除了上面鉴定的用于重组AAV载体的主要元件外，载体还包括常规控制元件，它们以允许其在被载体转染或被本发明所产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因的元件有效地连接。如本文所用，“有效连接的”序列包括与目的基因紧邻的表达控制序列和以反式或远距离作用以控制目的基因的表达控制序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当需要时，增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子，在本领域中是已知的并且可以被利用。

[0073] 如本文所用，当核酸序列(例如，编码序列)和调节序列以将核酸序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制下的方式共价连接时，被认为是有效连接的。如果希望将核酸序列翻译成功能性蛋白，则如果在5'调节序列中诱导启动子导致编码序列的转录并且如果两条DNA序列之间的连接的性质不会(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或者(3)干扰相应的RNA转录产物被翻译成蛋白，则认为两条DNA序列是有效连接的。因此，如果启动子区能够影响该DNA序列的转录，使得所得的转录产物可以被翻译成所需的蛋白或多肽，则该启动子区与核酸序列有效连接。类似地，当两个或更多个编码区以使得它们从共同启动子的转录导致两个或更多个已经在框内翻译的蛋白的表达的方式连接时，则它们有效连接。在一些实施方案中，有效连接的编码序列产生融合蛋白。在一些实施方案中，有效连接的编码序列产生功能性RNA(例如，miRNA)。

[0074] “启动子”是指被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的、启动基因的特异性转录所需的DNA序列。短语“有效定位”、“在控制之下”或“在转录控制之下”是指启动子相对于核酸而言处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶起始和基因的表达。

[0075] 对于编码蛋白的核酸，通常在转基因序列之后和3'AAV ITR序列之前插入聚腺苷酸化序列。用于本公开的rAAV构建体还可包含内含子，期望位于启动子/增强子序列与转基因之间。一种可能的内含子序列源自SV-40，并被称为SV-40T内含子序列。可以使用的另一个载体元件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列用于从单个基因转录本中产生一种以上的多肽。IRES序列将用于产生包含多于一个多肽链的蛋白。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的[参见，例如，Sambrook等，以及例如在其第3.18 3.26和16.17 16.27页中引用的参考文献和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1989]。在一些实施方案中，口蹄疫病毒
2A序列包括在多聚蛋白中；这是一个小肽(长度约18个氨基酸)，其已显示出介导多聚蛋白的裂解(Ryan，M D等，EMBO，1994；4：928-933；Mattion，N M等，J Virology，November 1996；
p.8124-8127；Furler，S等，Gene Therapy，2001；8：864-873；和Halpin，C等，The Plant Journal，1999；4：453-459)。先前已经在包括质粒和基因治疗载体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中证明了2A序列的裂解活性(Ryan，MD等，EMBO，1994；4：928-933；Mattion，N M等，J Virology，November 1996；p.8124-8127；Furler，S等，Gene Therapy，2001；8：864-873；和Halpin，C等，The Plant Journal，1999；4：453-459；de Felipe，P等，Gene Therapy，1999；
6：198-208；de Felipe，P等，Human Gene Therapy，2000；11：1921-1931.；和Klump，H等，Gene Therapy，2001；8：811-817)。

[0076] 组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见，例如，Boshart等，Cell，41：521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。在一些实施方案中，所述启动子是增强的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述启动子是U6启动子。在一些实施方案中，所述启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。

[0077] 诱导型启动子允许基因表达的调节，并且可以由外源提供的化合物、环境因素如温度或特定生理状态例如急性期、细胞的特定分化状态的存在或仅在复制细胞中来调节。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。已经描述了许多其他系统，并且本领域技术人员可以容易地选择它们。由外源提供的启动子调控的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-3351(1996))、四环素可抑制系统(Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992))、四环素诱导系统(Gossen等，Science，268：1766-1769(1995)，也参见Harvey等，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：
512-518(1998))，RU486诱导系统(Wang等，Nat.Biotech.，15：239-243(1997)和Wang等，Gene Ther.，4：432-441(1997))和雷帕霉素诱导系统(Magari等，J.Clin.Invest.，100：
2865-2872(1997))。在这种情况下可能有用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中调节的启动子。

[0078] 在另一个实施方案中，将使用转基因的天然启动子。当期望转基因的表达应模仿天然表达时，天然启动子可以是优选的。当必须在时间上或发育上或以组织特异性方式或响应于特定转录刺激而调节转基因的表达时，可以使用天然启动子。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件，例如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列也可以用于模拟天然表达。

[0079] 在一些实施方案中，调节序列赋予组织特异性基因以表达能力。在某些情况下，组织特异性调节序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。这样的组织特异性调节序列(例如启动子、增强子等)是本领域熟知的。在一些实施方案中，组织特异性启动子是眼特异性启动子。眼特异性启动子的实例包括但不限于视网膜劈裂蛋白启动子、K12启动子、视紫红质启动子、视杆细胞特异性启动子、视锥细胞特异性启动子、视紫红质激酶启动子、GRK1启动子、光感受器间类视黄醇结合蛋白近端(IRBP)启动子和视蛋白启动子(例如红色视蛋白启动子、蓝色视蛋白启动子等)。

[0080] 在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶III(pol III)启动子。pol III启动子的非限制性实例包括U6和H1启动子序列。在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶II(pol II)启动子。pol II启动子的非限制性实例包括T7、T3、SP6、RSV和巨细胞病毒启动子序列。在一些实施方案中，pol III启动子序列驱动一种或更多种抑制性核酸的表达，而pol II启动子序列驱动小基因的表达。

[0081] 重组腺相关病毒(rAAV)

[0082] 在一些方面，本公开提供分离的AAV。如本文关于AAV所用，术语“分离的”是指已经人工生产或获得的AAV。分离的AAV可以使用重组方法产生。这类AAV在本文中被称为“重组AAV”。重组AAV(rAAV)优选具有组织特异性靶向能力，使得rAAV的核酸酶和/或转基因被特异性地递送至一个或更多个预定组织。AAV衣壳是一种决定这些组织特异性靶向能力的重要的元件。因此，可以选择具有适合于被靶向组织的衣壳的rAAV。

[0083] 获得具有所需衣壳蛋白的重组AAV的方法是本领域熟知的。(参见，例如，US 2003/0138772)，其内容通过引用整体并入本文)。通常，所述方法包括培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码AAV衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；重组AAV载体，其由AAV反向末端重复序列(ITR)和转基因组成；以及足够的辅助功能，以允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由AAV的cap基因编码的结构蛋白。AAV包含三种衣壳蛋白-病毒体蛋白1至3(称为VP1、VP2和VP3)，所有这些蛋白均通过替代剪接从单个cap基因转录。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3的分子量分别为约87kDa、约72kDa和约62kDa。在一些实施方案中，在翻译后，衣壳蛋白在病毒基因组周围形成球形的60-mer蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组、递送基因组并与宿主相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。

[0084] 在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有选自由AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAVrh8、AAV9和AAV10组成的组的AAV血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有源自非人灵长类动物的血清型，例如AAVrh8血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有对受试者的眼睛具有嗜性的血清型，例如比其他载体更有效地转导受试者眼细胞的AAV(例如，AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39和AAVrh.43)。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白是AAV8血清型或AAV5血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：9所示的序列。

[0085] 可以将在宿主细胞中培养以将rAAV载体包装在AAV衣壳中的组分反式提供给宿主细胞。或者，可以由稳定的宿主细胞提供任何一种或更多种所需组分(例如重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)，所述稳定宿主细胞已经使用本领域技术人员已知的方法进行工程化以包含一种或更多种所需组分。最合适的是，这种稳定的宿主细胞包含在诱导型启动子控制下的所需组分。然而，所需组分可以在组成型启动子的控制下。在讨论适合与转基因一起使用的调节元件时，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一个替代方案中，选择的稳定宿主细胞可包含在组成型启动子控制下的所选组分和在一个或更多个诱导型启动子控制下的其他所选组分。例如，可以产生稳定的宿主细胞，其源自293细胞(其包含在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但其包含在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其他稳定的宿主细胞。

[0086] 在一些实施方案中，本公开涉及包含核酸的宿主细胞，所述核酸包含编码蛋白(例如，CEP290蛋白片段)的编码序列。在一些实施方案中，本公开涉及包含上述宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，包含上述宿主细胞的组合物还包含冷冻保存剂。

[0087] 可以使用任何适当的遗传元件(载体)将产生本公开的rAAV所需的重组AAV载体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至包装宿主细胞。可以通过任何合适的方法(包括本文所述的那些)递送选定的遗传元件。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y。类似地，产生rAAV病毒体的方法是公知的，并且合适方法的选择并不局限于本公开。参见，例如，K.Fisher等，J.Virol.，70：520-532(1993)和美国专利号5,478,745。

[0088] 在一些实施方案中，可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)产生重组AAV。通常，通过用待包装成AAV颗粒的重组AAV载体(包含转基因)、AAV辅助功能载体和附属功能载体转染宿主细胞来产生重组AAV。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即rep和cap)，其以反式起作用以产生有效的AAV复制和衣壳化。优选地，AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体产生而不产生任何可检测的野生型AAV病毒体(即包含功能性rep和cap基因的AAV病毒体)。适用于本公开的载体的非限制性实例包括pHLP19，其描述于美国专利号6,001,650，和pRep6cap6载体，其描述于美国专利号6,156,303，这两个专利全部内容通过引用并入本文。附属功能载体编码AAV复制所依赖的的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能(即“附属功能”)的核苷酸序列。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于涉及AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以衍生自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除1型单纯疱疹病毒以外)和牛痘病毒。

[0089] 在一些方面，本公开提供转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞摄取外源DNA，并且当将外源DNA被引入细胞膜内部时，细胞已经被“转染”。许多转染技术是本领域公知的。参见，例如，Graham等(1973)Virology，52：456，Sambrook等(1989)Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Davis等(1986)Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier和Chu等(1981)Gene 13：197。此类技术可用于将一种或更多种外源核酸，例如核苷酸整合载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞中。

[0090] “宿主细胞”是指包含或能够包含目的物质的任何细胞。通常，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可用作AAV辅助构建体、AAV小基因质粒、附属功能载体或与重组AAV的产生相关的其他转移DNA的接受者。该术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，本文所用的“宿主细胞”可以指已经用外源DNA序列转染的细胞。应理解，归因于自然的、偶然的或有意的突变，单个亲本细胞的后代在形态学或基因组或总DNA补足物上不一定与原始亲本完全相同。

[0091] 如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆种群。在本领域中进一步已知在此类克隆群的储存或转移过程中，核型可能发生自发或诱导的变化。因此，源自所述细胞系的细胞可能与祖细胞或培养物不完全相同，并且所述细胞系包括此类变体。

[0092] 如本文所用，术语“重组细胞”是指其中已经引入外源DNA区段(例如导致生物活性多肽转录或生物活性核酸例如RNA产生的DNA区段)的细胞。

[0093] 如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等，其在与适当的控制元件结合时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。在一些实施方案中，有用的载体预期为这样的载体，其中待转录的核酸区段置于启动子的转录控制下。“启动子”是指被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的、启动基因的特异性转录所需的DNA序列。短语“有效定位”、“在控制之下”或“在转录控制之下”是指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的起始和基因表达。术语“表达载体或构建体”是指包含核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如以从转录的基因产生生物活性多肽产物或功能性RNA(例如，导向RNA)。用于将重组载体包装在期望的AAV衣壳中以产生本公开的rAAV的前述方法并不意味着是限制性的，并且其他合适的方法对于技术人员是明显的。

[0094] rAAV介导的CEP290转基因至眼的递送

[0095] 本文提供用于将转基因递送至受试者的眼(例如，光感受器，诸如视杆细胞或视锥细胞、视网膜细胞等)组织的方法。所述方法通常涉及向受试者施用有效量的rAAV，所述rAAV包含用于在受试者中表达转基因(例如，CEP290蛋白片段)的核酸。rAAV的“有效量”是足以感染足够数量的受试者中靶组织细胞的量。在一些实施方案中，靶组织是眼(例如，光感受器、视网膜等)组织。有效量的rAAV可以是足以在受试者中具有治疗益处的量，例如，以在受试者中改善疾病的一个或更多个症状，例如眼纤毛病的症状(例如与CEP290基因的缺失或突变相关的眼纤毛病，例如LCA)。在一些情况下，有效量的rAAV可以是足以产生稳定的体细胞转基因动物模型的量。有效量取决于多种因素，例如受试者物种、年龄、体重、健康状况以及要靶向的眼组织，因此其可以在受试者和组织之间变化。

[0096] 有效量还可能取决于所用的rAAV。本发明部分基于以下认识：包含具有特定血清型(例如AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39和AAVrh.43)的衣壳蛋白的rAAV比包含具有不同血清型的衣壳蛋白的rAAV更能有效介导眼(例如光感受器、视网膜等)组织的转导。因此，在一些实施方案中，rAAV包含具有选自由AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39和AAVrh.43组成的组的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV包含AAV8血清型的衣壳蛋白(SEQ ID NO：9)。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：9具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白是AAV5衣壳蛋白。

[0097] 在某些实施方案中，rAAV的有效量为每千克1010、1011、1012、1013或1014个基因组拷贝。在某些实施方案中，rAAV的有效量是每个受试者1010、1011、1012、1013、1014或1015个基因组拷贝。

[0098] 有效量也可能取决于施用方式。例如，在某些情况下，通过基质内施用或皮下注射靶向眼(例如光感受器、视网膜等)组织比通过其他方法(例如全身施用、局部施用)靶向眼(例如，光感受器、视网膜等)组织可能需要不同(例如，更高或更低)的剂量。在一些实施方案中，具有某些血清型(例如，AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39和AAVrh.43)的rAAV的基质内注射(IS)介导眼(例如角膜、光感受器、视网膜等)细胞的有效转导。因此，在一些实施方案中，注射是基质内注射(IS)。在一些实施方案中，施用是通过注射，任选地视网膜下注射或玻璃体内注射。在一些实施方案中，注射是局部施用(例如，对眼睛的局部施用)。在某些情况下，施用多个剂量的rAAV。

[0099] 不希望受任何特定理论的束缚，本文所述的rAAV对眼(例如，光感受器、视网膜等)细胞的有效转导可用于治疗患有眼部疾病(例如，眼纤毛病)的受试者。因此，本文还提供了用于治疗眼部疾病的方法和组合物。在一些方面，本公开提供治疗眼纤毛病(例如，与CEP290基因缺失或突变相关的眼纤毛病)的方法，该方法包含：向患有或怀疑患有眼纤毛病的受试者施用有效量的rAAV，其中rAAV包含(i)具有选自由AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39和AAVrh.43组成的组的血清型的衣壳蛋白；和(ii)包含与转基因(例如，如编码本公开所述的CEP290蛋白片段的转基因)有效连接的启动子的核酸。

[0100] 在一些实施方案中，如本公开所述的rAAV(或分离的核酸)的施用导致包含纤毛、任选地光感受器感觉纤毛的细胞和多个细胞的转导。光感受器(PR)感觉纤毛从内部区段的顶表面的基体成核。随着微管的延伸，它们形成双微管结构，称为连接纤毛(CC)。CC类似于原型纤毛的转换区，并且延伸到光感受器细胞的外部区段(OS)中。CC用作内部区段和外部区段之间的载荷部分的单向或双向运输的管道。CC还作为“门卫”来调节载荷的进出，这有助于维持其独特的组成。在一些实施方案中，如本公开所述的rAAV(或分离的核酸)的施用导致光感受器感觉纤毛、连接纤毛或其组合的生长或形成。

[0101] 可以根据本领域已知的任何适当方法将rAAV以组合物的形式递送至受试者。可以将rAAV(优选悬浮在生理上相容的运载体中(即以组合物的形式))施用于受试者，即宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类动物(例如猕猴)。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。

[0102] 例如，可以通过眼内注射或局部施用(例如滴眼剂)将rAAV递送至哺乳动物受试者。在一些实施方案中，所述眼内注射是基质内注射、结膜下注射或玻璃体内注射。在一些实施方案中，注射不是局部施用。也可以使用施用方法的组合(例如局部施用和基质内注射)。

[0103] 本公开的组合物可仅包含rAAV，或rAAV与一种或更多种其他病毒(例如，编码具有一个或更多个不同转基因的第二rAAV)的组合。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的rAAV，其每个均具有一个或更多个不同的转基因。

[0104] 在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的运载体。考虑到rAAV所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的运载体。例如，一种合适的运载体包括盐水，其可以用多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。其他示例性运载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。运载体的选择不是本公开的限制。

[0105] 任选地，除了rAAV和运载体之外，本发明的组合物还可包含其他药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。

[0106] 施用足够量的rAAV以转染目标组织(例如眼组织，例如光感受器、视网膜等组织)的细胞，并提供足够水平的基因转移和表达而没有过度的不利影响。药学上可接受的施用途径的实例包括但不限于直接递送至选定器官(例如向眼睛的视网膜下递送)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、瘤内和其他胃肠外(parental)施用途径。如果需要，可以组合施用途径。

[0107] 实现特定“治疗效果”所需的rAAV病毒体的剂量，例如，基因组拷贝/每千克体重(GC/kg)的剂量单位，基于几个因素而变化，这些因素包括但不限于：rAAV病毒体施用的途径，达到治疗效果所需的基因或RNA表达水平，所治疗的特定疾病或失调，以及基因或RNA产物的稳定性。基于上述因素以及其他因素，本领域技术人员可以容易地确定用于治疗患有特定疾病或失调的患者的rAAV病毒体剂量范围。

[0108] rAAV的有效量是足以靶向感染动物、靶向所需组织的量。有效量主要取决于诸如受试者的物种、年龄、体重、健康状况以及要靶向的组织之类的因素，并且因此可以在动物和组织之间变化。例如，有效量的rAAV通常为约1ml至约100ml的范围的溶液，其含有约109至1016个基因组拷贝。在某些情况下，约1011至1013个rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在某些实施方案中，109个rAAV基因组拷贝有效地靶向眼组织(例如，角膜组织)。在一些实
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施方案中，当施用于受试者的眼时，超过10个rAAV基因组拷贝浓缩的剂量是有毒的。在一些实施方案中，有效量通过多个rAAV的剂量产生。

[0109] 在一些实施方案中，向受试者施用的rAAV的剂量在每个日历日(例如24小时期间)不超过一次。在一些实施方案中，向受试者施用的rAAV的剂量在每2、3、4、5、6或7个日历日不超过一次。在一些实施方案中，向受试者施用的rAAV的剂量在每个日历周(例如7个日历日)不超过一次。在一些实施方案中，向受试者施用的rAAV的剂量的不超过两周一次(例如，在两个日历周期间一次)。在一些实施方案中，向受试者施用的rAAV的剂量不超过每个日历月一次(例如，30个日历日一次)。在一些实施方案中，向受试者施用的rAAV的剂量不超过每六个日历月一次。在一些实施方案中，向受试者施用的rAAV的剂量不超过每个日历年一次(例如，365天或闰年366天)。

[0110] 在一些实施方案中，配制rAAV组合物以减少组合物中AAV颗粒的聚集，特别是在存在高rAAV浓度(例如～1013GC/ml或更高)的情况下。可以使用适当的减少聚集的方法，包括例如添加表面活性剂、pH调节、盐浓度调节等。(参见，例如Wright FR等，Molecular Therapy(2005)12，171-178，其内容通过引用并入本文。)

[0111] 药学上可接受的赋形剂和运载体溶液的配制是本领域技术人员熟知的，跟开发适合的剂量和治疗方案用于在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物一样。通常，这些制剂可以包含至少约0.1％或更多的活性化合物，当然，尽管活性成分的百分比可以变化并且可以方便地介于总配方重量或体积的约1％或2％和约70％或80％或更多之间。自然地，可以制备每种治疗上有用的组合物中的活性化合物的量，使得可以在任何给定的单位剂量的化合物中获得合适的剂量。制备此类药物制剂的领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学因素等因素，因此，可以期望多种剂量和治疗方案。

[0112] 在一些实施方案中，将本文公开的适当配制的药物组合物中的rAAV直接递送至靶组织，例如直接递送至眼组织(例如，光感受器、视网膜等组织)。然而，在某些情况下，可能需要单独或经由另一种途径，例如皮下、胰内、鼻内、肠胃外、静脉内、肌内、鞘内或口服、腹膜内或通过吸入另外递送基于rAAV的治疗性构建体。在一些实施方案中，使用如美国专利号5,543,158；5,641,515和5,399,363(各自均通过引用整体并入本文)所述的施用方式来递送rAAV。在一些实施方案中，优选的施用方式是玻璃体内注射或视网膜下注射。

[0113] 适用于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在许多情况下，该形式是无菌的并且液体达到易于注射的程度。在生产和储存条件下其必须是稳定的，并且必须防腐以防微生物(如细菌和真菌)的污染。运载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。例如，可以通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以使可注射组合物的吸收延长。

[0114] 例如，为了施用可注射的水溶液，如果需要，对溶液进行适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，可以使用合适的无菌水性介质。例如，可以将一剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，或者添加到1000ml皮下输液液体中，或者在建议的输注部位注射(参见例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版，1035至1038页和1570至1580页)。剂量的某些变化必然取决于宿主的状况。在任何情况下，负责施用的人员将确定适合个体宿主的适当剂量。

[0115] 如果需要，通过将所需量的活性rAAV与本文列举的多种其他成分在适当的溶剂中混合，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物包含基本分散介质和以上列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。

[0116] 本文公开的rAAV组合物也可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，并且其由无机酸(例如如盐酸或磷酸)或诸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等的有机酸形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。配制后，将以与剂型相容的方式和治疗有效量施用溶液。可以容易地以各种剂型例如可注射溶液，药物释放胶囊等来施用制剂。

[0117] 如本文所用，“运载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、运载体溶液、悬浮液、胶体等。用于药物活性物质的这类介质和试剂的使用是本领域熟知的。补充活性成分也可以掺入到组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。

[0118] 递送媒介物例如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可以用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以通过包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中进行配制以用于递送。

[0119] 这样的制剂对于引入本文公开的核酸或rAAV构建体的药学上可接受的制剂是优选的。脂质体的形成和使用是本领域技术人员通常已知的。最近，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物运载体的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。

[0120] 脂质体已成功用于通常对其他程序转染排斥的多种细胞类型。此外，脂质体没有基于病毒的递送系统典型的DNA长度限制。脂质体已被有效地用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入多种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了一些成功的临床试验，所述临床试验研究了脂质体介导的药物递送的有效性。

[0121] 脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成，并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV的直径通常为25nm至4μm。MLV的超声处理导致形成直径在200至范围内、内核中含有水溶液的小单层囊泡(SUV)。

[0122] 或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以稳定且可再现的方式包裹物质。为了避免归因于细胞内聚合物重载的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物设计此类超细颗粒(尺寸约为0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒。

[0123] 试剂盒及相关组合物

[0124] 在一些实施方案中，本文所述的试剂可以组装成药物或诊断或研究试剂盒，以促进它们在治疗、诊断或研究应用中的使用。试剂盒可包括一个或更多个容纳本公开的成分的容器和使用说明书。具体地，这样的试剂盒可包括一种或更多种本文所述的试剂，以及描述这些试剂的预期应用和正确使用的说明书。在某些实施方案中，试剂盒中的试剂可以是适于特定应用和试剂施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可包含用于进行各种实验的适当浓度或数量的组分。

[0125] 在一些实施方案中，本公开涉及用于生产rAAV的试剂盒，该试剂盒包含容纳分离的核酸的容器，所述分离的核酸包含编码具有SEQ ID NO：2至4中任何一个所示的氨基酸序列的CEP290蛋白片段的转基因。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含容纳编码AAV衣壳蛋白，例如AAV8衣壳蛋白(例如，SEQ ID NO：9)的分离的核酸的容器。

[0126] 试剂盒可以被设计成便于研究人员使用本文所述的方法，并且可以采取多种形式。如果适用，试剂盒的每种组合物可以以液体形式(例如溶液)或以固体形式(例如干粉)提供。在某些情况下，某些组合物可以是可组成的或可加工的(例如，制成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他物质(例如，水或细胞培养基)，其与或未与试剂盒一起提供。如本文所用，“说明书”可以定义说明和/或宣传的内容，并且通常包括本公开的包装或与本公开的包装相关联的书面说明。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书，以使用户清楚地认识到该说明书与试剂盒相关，例如，视听的(例如，录像带、DVD等)、互联网和/或基于网络的通讯等。书面说明可以采用系统管理药品或生物制品的制备、使用或销售的政府机构规定的形式，该说明书还可以反映用于动物施用的制备、使用或销售的机构的批准。

[0127] 试剂盒可在一个或更多个容器中包含本文所述的任何一种或更多种组分。举例来说，在一个实施方案中，试剂盒可包括用于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并施用于受试者的说明书。该试剂盒可包括容纳本文所述试剂的容器。这些试剂可以是液体、凝胶或固体(粉末)形式。试剂可以无菌制备，包装在注射器中并冷藏运输。或者，可以将其容纳在小瓶或其他容器中以进行存储。第二容器可具有无菌制备的其他试剂。或者，该试剂盒可以包括在注射器、小瓶、管或其他容器中预混合并运输的活性试剂。

[0128] 通过以下实施例将更详细地描述本发明的示例性实施方案。这些实施方案是本发明的示例，本领域技术人员将认识到，本发明不限于示例性实施方案。

[0129] 实施例

[0130] CEP290-LCA的治疗策略

[0131] CEP290-LCA患者视网膜中央区域的相对缺乏(sparing)表明，基因治疗可能是患者视觉恢复的可行选择。但是，用于CEP290-LCA的不依赖突变的基因替代策略的开发进展已被延迟，主要是由于长CEP290基因不适合在用于基因治疗的常规AAV载体系统中包装。该实施例描述了通过AAV递送CEP290片段以治疗CEP290-LCA。在一些实施方案中，所述CEP290片段以不依赖突变的方式恢复纤毛生长和光感受器功能，并且因此可用于治疗归因于CEP290突变的非综合征型LCA和全身性纤毛疾病中的视网膜变性。

[0132] 全长CEP290 cDNA长～8kb，其通常超过常规AAV载体的包装限制。图1中显示代表不同蛋白相互作用结构域的位置的全长CEP290基因的示意图。在此，鉴定了在光感受器(PR)中保留功能并可以使用常规AAV载体递送的CEP290片段。由于CEP290是一种纤毛蛋白并调节纤毛的生长，因此开发纤毛生长的体外测定法，以用作替代标记物来测试较短的CEP290区域的功能。观察到，源自Cep290突变体(Cep290rd16)小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)重现早期发作的严重PR变性表型，具有更少的具有纤毛的细胞和与对照相比形成的纤毛更短的细胞。该观察结果与先前的研究一致，这些研究表明源自CEP290-LCA患者样品的成纤维细胞中的纤毛更少、更短。

[0133] 如图2A至2B所示，与长度～3.8μm的对照纤毛相比，Cep290rd16 MEF的纤毛长度为～2.7μm。此外，与对照相比，在Cep290rd16 MEF中检测到更少的具有纤毛的细胞。

[0134] 接下来，研究表达全长人CEP290蛋白对Cep290rd16 MEF中纤毛长度的影响。观察到，如通过与纤毛标记物ARL13b共染色所确定的，全长人CEP290蛋白正确地定位在纤毛上(图3)。GFP蛋白的表达没有导致其定位至纤毛上。此外，纤毛长度的测量表明，与GFP的表达相比，CEP290蛋白的表达显著挽救了Cep290rd16 MEF的纤毛长度。

[0135] vCEP290的构建

[0136] CEP290基因编码主要是卷曲螺旋的蛋白。产生了去除人CEP290的重复结构域的构建体，例如编码融合GFP的miniCEP290580-1695、miniCEP2901751-2050和miniCEP2902037-2479的质粒(图4A)。将变体克隆到表达CMV启动子控制下的基因的pEGFP-C1载体中。如通过对来自瞬时转染的小鼠胚胎成纤维细胞的蛋白提取物的免疫印迹分析所确定的，构建体表达稳定的CEP290蛋白片段(图4B；参见箭头)。为了测试miniCEP290的功能潜力，使用了使用rd16Cep290  MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)的替代检测系统。图9显示了CEP290变体的其他实例。

[0137] vCEP290对纤毛长度的影响

[0138] 如图5A所示，不同的GFP-vCEP290编码质粒在Cep290rd16或野生型小鼠胚胎成纤维580-1695
细胞中的表达表明，vCEP290 主要定位于基体(与γ-微管蛋白共定位)和近端纤毛(与ADP-核糖基化因子样13B共定位；ARL13B；纤毛标志物)。其他变体的表达表明相对分散的定位模式。然后评估了vCEP290调节Cep290rd16成纤维细胞中纤毛长度的能力。如图5B所示，当表达vCEP290580-1695时，突变的成纤维细胞的纤毛长度显著增加。其他变体和仅表达GFP的阴性对照未显示成纤维细胞中纤毛长度的变化。未观察到对野生型成纤维细胞纤毛长度的影响。

[0139] 然后研究进一步缩短vCEP290580-1695是否会导致纤毛长度挽救。产生编码融合GFP的vCEP290580-1180和vCEP2901181-1695的质粒，并测试它们在Cep290rd16成纤维细胞中的表达、定位和挽救纤毛长度的潜力。如通过使用抗GFP抗体的免疫印迹确定的，两种变体均显示最佳表达，并且定位于纤毛(图6A至6B)。vCEP2901181-1695的数据表明主要定位于纤毛基部，并rd16且在基体周围弥漫性染色。纤毛挽救测定数据表明，任一变体的表达导致Cep290 成纤维细胞的纤毛长度显著增加(图6C和图10)。

[0140] vCEP290在体内的潜力

[0141] 研究vCEP290构建体在体内的功能性。将vCEP290580-1180、vCEP2901181-1695和2037-2479
vCEP290 (作为阴性对照，因为它没有挽救成纤维细胞中的纤毛长度缺陷)克隆到
AAV2载体中，该载体具有CBA启动子并包含目的基因(例如，vCEP290)和GFP之间的IRES(内部核糖体进入位点)。这允许CEP290和GFP均可从单个双顺反子mRNA进行翻译，并使用抗GFP抗体协助鉴定转导的光感受器。将每个rAAV(例如，AAV2/8-CBA-vCep290580-1180-IRES-GFP、
1181-1695 2037-2472
AAV2/8-CBA-vCep290 -IRES-GFP、AAV2/8-CBA-vCep290 -IRES-GFP和阴性对照
AAV2/8-CBA-GFP)以8x109vg/眼以1μl的体积注入P0期的Cep290rd16幼崽的视网膜下腔。评估小鼠的PR功能和视网膜形态至注射后多达5周。

[0142] 在注射后3周通过视网膜电描记术(ERG)对PR功能的分析表明了注射miniCEP290580-1180的小鼠的暗视(视杆细胞PR介导的)和明视(视锥细胞PR介导的)(图7A-7B和图11-12)响应的改善(25至30％)。使用miniCEP2902037-2479或GFP未检测到任何改善。进一步的分析表明，ERG的改善在注射后多达4周都是稳定的。

[0143] 还计算了视网膜冷冻切片中与PR存活相关的ONL层数：在用miniCep290580-1180注射的Cep290rd16视网膜中观察到～6至7层；在用miniCep2901181-1695注射的Cep290rd16视网膜中观察到4至5层和；在用miniCep2902037-2472或GFP(相当于3周龄未注射的Cep290rd16)注射的视网膜中观察到2至3层，如图8A所示。还观察到，用miniCEP290580-1180注射的Cep290rd16视网膜的超薄切片显示出外核层(ONL)的显著保存(图8B)。

[0144] 通过用外周蛋白-RDS(视网膜变性缓慢，PR外部区段标记物45)染色，检测了注射miniCEP290580-1180的小鼠中光感受器(PR)外部区段的结构保存。RDS是一种结构蛋白，其特异性地定位在外部区段(OS)圆盘(discs)上并维持OS结构。与在注射GFP的小鼠中不可检测的RDS表达相比，注射miniCEP290580-1180的Cep290rd16小鼠表现出RDS定位于外部区段的改善(图8C)。还检测了视紫红质和视锥视蛋白这两个关键的视觉传导蛋白的表达。在注射2037-2479 580-1180
miniCEP290 的视网膜中未检测到可检测的视蛋白表达。然而，注射miniCEP290
的视网膜揭示了在外部区段中视紫红质和视锥视蛋白的可检测表达(图8D)。还观察到内部区段和外核层中一些视锥视蛋白的染色。总体而言，数据表明miniCEP290580-1180的表达可以改善CE P290rd16视网膜的功能、形态和视蛋白运输。

[0145] 材料和方法

[0146] 细胞培养、瞬时转染和免疫染色

[0147] 将源自WT和Cep290rd16小鼠的MEF保存在含10％FBS的DMEM中。使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)进行GFP-CEP290-FL或GFP-miniCEP290的瞬时转染。将收获的转染的细胞用于免疫印迹或血清饥饿以诱导纤毛生长。然后将纤毛化的细胞免疫染色，在Leica显微镜(DM5500)下成像。然后使用Image J处理图像以进行纤毛长度评估。

[0148] 构建体和AAV生产

[0149] 为了进行体外实验，将表达全长或miniCEP290的cDNA克隆到在CMV启动子控制下表达GFP标签蛋白的pEGFP-C1质粒中。为了产生AAV，将编码miniCEP290的cDNA在IRES(内部核糖体进入位点)GFP上游的CMV增强子/CBA(鸡β-肌动蛋白)启动子与β-珠蛋白内含子之间克隆到pAAV2载体质粒中。该表达盒的侧翼是AAV2反向末端重复序列(ITR)。通过HEK293-三重转染法将重组AAV2基因组与AAV8衣壳包装在一起，并通过CsCl梯度离心法进行纯化。

[0150] 视网膜下注射

[0151] 野生型C57BL6/J小鼠获自商业来源。还获得Cep290rd16小鼠。向Cep290rd16小鼠幼崽9
(P0/P1)视网膜下单侧注射8x10vg/μl(总体积1μl)的病毒。

[0152] 视网膜的ERG和免疫荧光显微镜术

[0153] 进行暗视和明视ERG。为了暗视响应，使小鼠暗适应过夜，并且所有程序在暗红色光下进行。在以30cd/m2(白色6500K)的背景照明进行光适应8分钟后，记录光适应的(明视)ERG。

[0154] 通过用一抗：视紫红质、M-视蛋白和外周蛋白-RDS、ARL13B、GFP(Abcam)和γ-微管蛋白对视网膜冷冻切片进行染色来进行免疫荧光显微术。用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤后，加入Alexa-488或Alexa-546偶联的二抗，并将切片进一步孵育1h。洗涤后，将细胞核用DAPI染色，并使用Leica显微镜(DM5500)进行细胞成像。

[0155] 序列

[0156] >人CEP290氨基酸序列；NCBI参考序列：NP_079390.3(SEQ ID NO：1)MPPNINWKEIMKVDPDDLPRQEELADNLLISLSKVEVNELKSEKQENVIHLFRITQSLMKMKAQEVELALEEVEKAGEEQAKFENQLKTKVMKLENELEMAQQSAGGRDTRFLRNEICQLEKQLEQKDRELEDMEKELEKEKKVNEQLALRNEEAENENSKLRRENKRLKKKNEQLCQDIIDYQKQIDSQKETLLSRRGEDSDYRSQLSKKNYELIQYLDEIQTLTEANEKIEVQNQEMRKNLEESVQEMEKMTDEYNRMKAIVHQTDNVIDQLKKENDHYQLQVQELTDLLKSKNEEDDPIMVAVNAKVEEWKLILSSKDDEIIEYQQMLHNLREKLKNAQLDADKSNVMALQQGIQERDSQIKMLTEQVEQYTKEMEKNTCIIEDLKNELQRNKGASTLSQQTHMKIQSTLDILKEKTKEAERTAELAEADAREKDKELVEALKRLKDYESGVYGLEDAVVEIKNCKNQIKIRDREIEILTKEINKLELKISDFLDENEALRERVGLEPKTMIDLTEFRNSKHLKQQQYRAENQILLKEIESLEEERLDLKKKIRQMAQERGKRSATSGLTTEDLNLTENISQGDRISERKLDLLSLKNMSEAQSKNEFLSRELIEKERDLERSRTVIAKFQNKLKELVEENKQLEEGMKEILQAIKEMQKDPDVKGGETSLIIPSLERLVNAIESKNAEGIFDASLHLKAQVDQLTGRNEELRQELRESRKEAINYSQQLAKANLKIDHLEKETSLLRQSEGSNVVFKGIDLPDGIAPSSASIINSQNEYLIHLLQELENKEKKLKNLEDSLEDYNRKFAVIRHQQSLLYKEYLSEKETWKTESKTIKEEKRKLEDQVQQDAIKVKEYNNLLNALQMDSDEMKKILAENSRKITVLQVNEKSLIRQYTTLVELERQLRKENEKQKNELLSMEAEVCEKIGCLQRFKEMAIFKIAALQKVVDNSVSLSELELANKQYNELTAKYRDILQKDNMLVQRTSNLEHLECENISLKEQVESINKELEITKEKLHTIEQAWEQETKLGNESSMDKAKKSITNSDIVSISKKITMLEMKELNERQRAEHCQKMYEHLRTSLKQMEERNFELETKFAELTKINLDAQKVEQMLRDELADSVSKAVSDADRQRILELEKNEMELKVEVSKLREISDIARRQVEILNAQQQSRDKEVESLRMQLLDYQAQSDEKSLIAKLHQHNVSLQLSEATALGKLESITSKLQKMEAYNLRLEQKLDEKEQALYYARLEGRNRAKHLRQTIQSLRRQFSGALPLAQQEKFSKTMIQLQNDKLKIMQEMKNSQQEHRNMENKTLEMELKLKGLEELISTLKDTKGAQKVINWHMKIEELRLQELKLNRELVKDKEEIKYLNNIISEYERTISSLEEEIVQQNKFHEERQMAWDQREVDLERQLDIFDRQQNEILNAAQKFEEATGSIPDPSLPLPNQLEIALRKIKENIRIILETRATCKSLEEKLKEKESALRLAEQNILSRDKVINELRLRLPATAEREKLIAELGRKEMEPKSHHTLKIAHQTIANMQARLNQKEEVLKKYQRLLEKAREEQREIVKKHEEDLHILHHRLELQADSSLNKFKQTAWDLMKQSPTPVPTNKHFIRLAEMEQTVAEQDDSLSSLLVKLKKVSQDLERQREITELKVKEFENIKLQLQENHEDEVKKVKAEVEDLKYLLDQSQKESQCLKSELQAQKEANSRAPTTTMRNLVERLKSQLALKEKQQKALSRALLELRAEMTAAAEERIISATSQKEAHLNVQQIVDRHTRELKTQVEDLNENLLKLKEALKTSKNRENSLTDNLNDLNNELQKKQKAYNKILREKEEIDQENDELKRQIKRLTSGLQGKPLTDNKQSLIEELQRKVKKLENQLEGKVEEVDLKPMKEKNAKEELIRWEEGKKWQAKIEGIRNKLKEKEGEVFTLTKQLNTLKDLFAKADKEKLTLQRKLKTTGMTVDQVLGIRALESEKELEELKKRNLDLENDILYMRAHQALPRDSVVEDLHLQNRYLQEKLHALEKQFSKDTYSKPSISGIESDDHCQREQELQKENLKLSSENIELKFQLEQANKDLPRLKNQVRDLKEMCEFLKKEKAEVQRKLGHVRGSGRSGKTIPELEKTIGLMKKVVEKVQRENEQLKKASGILTSEKMANIEQENEKLKAELEKLKAHLGHQLSMHYESKTKGTEKIIAENERLRKELKKETDAAEKLRIAKNNLEILNEKMTVQLEETGKRLQFAESRGPQLEGADSKSWKSIVVTRMYETKLKELETDIAKKNQSITDLKQLVKEATEREQKVNKYNEDLEQQIKILKHVPEGAETEQGLKRELQVLRLANHQLDKEKAELIHQIEANKDQSGAESTIPDADQLKEKIKDLETQLKMSDLEKQHLKEEIKKLKKELENFDPSFFEEIEDLKYNYKEEVKKNILLEEKVKKLSEQLGVELTSPVAASEEFEDEEESPVNFPIY

[0157] >CEP290片段(aa580-1685)氨基酸序列(SEQ ID NO：2)

[0158] TENISQGDRISERKLDLLSLKNMSEAQSKNEFLSRELIEKERDLERSRTVIAKFQNKLKELVEENKQLEEGMKEILQAIKEMQKDPDVKGGETSLIIPSLERLVNAIESKNAEGIFDASLHLKAQVDQLTGRNEELRQELRESRKEAINYSQQLAKANLKIDHLEKETSLLRQSEGSNVVFKGIDLPDGIAPSSASIINSQNEYLIHLLQELENKEKKLKNLEDSLEDYNRKFAVIRHQQSLLYKEYLSEKETWKTESKTIKEEKRKLEDQVQQDAIKVKEYNNLLNALQMDSDEMKKILAENSRKITVLQVNEKSLIRQYTTLVELERQLRKENEKQKNELLSMEAEVCEKIGCLQRFKEMAIFKIAALQKVVDNSVSLSELELANKQYNELTAKYRDILQKDNMLVQRTSNLEHLECENISLKEQVESINKELEITKEKLHTIEQAWEQETKLGNESSMDKAKKSITNSDIVSISKKITMLEMKELNERQRAEHCQKMYEHLRTSLKQMEERNFELETKFAELTKINLDAQKVEQMLRDELADSVSKAVSDADRQRILELEKNEMELKVEVSKLREISDIARRQVEILNAQQQSRDKEVESLRMQLLDYQAQSDEKSLIAKLHQHNVSLQLSEATALGKLESITSKLQKMEAYNLRLEQKLDEKEQALYYARLEGRNRAKHLRQTIQSLRRQFSGALPLAQQEKFSKTMIQLQNDKLKIMQEMKNSQQEHRNMENKTLEMELKLKGLEELISTLKDTKGAQKVINWHMKIEELRLQELKLNRELVKDKEEIKYLNNIISEYERTISSLEEEIVQQNKFHEERQMAWDQREVDLERQLDIFDRQQNEILNAAQKFEEATGSIPDPSLPLPNQLEIALRKIKENIRIILETRATCKSLEEKLKEKESALRLAEQNILSRDKVINELRLRLPATAEREKLIAELGRKEMEPKSHHTLKIAHQTIANMQARLNQKEEVLKKYQRLLEKAREEQREIVKKHEEDLHILHHRLELQADSSLNKFKQTAWDLMKQSPTPVPTNKHFIRLAEMEQTVAEQDDSLSSLLVKLKKVSQDLERQREITELKVKEFENIKLQLQENHEDEVKKVKAEVEDLKYLLD

[0159] >CEP290片段(aa580-1180)氨基酸序列(SEQ ID NO：3)

[0160] TENISQGDRISERKLDLLSLKNMSEAQSKNEFLSRELIEKERDLERSRTVIAKFQNKLKELVEENKQLEEGMKEILQAIKEMQKDPDVKGGETSLIIPSLERLVNAIESKNAEGIFDASLHLKAQVDQLTGRNEELRQELRESRKEAINYSQQLAKANLKIDHLEKETSLLRQSEGSNVVFKGIDLPDGIAPSSASIINSQNEYLIHLLQELENKEKKLKNLEDSLEDYNRKFAVIRHQQSLLYKEYLSEKETWKTESKTIKEEKRKLEDQVQQDAIKVKEYNNLLNALQMDSDEMKKILAENSRKITVLQVNEKSLIRQYTTLVELERQLRKENEKQKNELLSMEAEVCEKIGCLQRFKEMAIFKIAALQKVVDNSVSLSELELANKQYNELTAKYRDILQKDNMLVQRTSNLEHLECENISLKEQVESINKELEITKEKLHTIEQAWEQETKLGNESSMDKAKKSITNSDIVSISKKITMLEMKELNERQRAEHCQKMYEHLRTSLKQMEERNFELETKFAELTKINLDAQKVEQMLRDELADSVSKAVSDADRQRILELEKNEMELKVEVSKLREISDIARRQVEILNAQQQSRDKEV

[0161] >CEP290片段(aa1181-1695)氨基酸序列(SEQ ID NO：4)

[0162] ESLRMQLLDYQAQSDEKSLIAKLHQHNVSLQLSEATALGKLESITSKLQKMEAYNLRLEQKLDEKEQALYYARLEGRNRAKHLRQTIQSLRRQFSGALPLAQQEKFSKTMIQLQNDKLKIMQEMKNSQQEHRNMENKTLEMELKLKGLEELISTLKDTKGAQKVINWHMKIEELRLQELKLNRELVKDKEEIKYLNNIISEYERTISSLEEEIVQQNKFHEERQMAWDQREVDLERQLDIFDRQQNEILNAAQKFEEATGSIPDPSLPLPNQLEIALRKIKENIRIILETRATCKSLEEKLKEKESALRLAEQNILSRDKVINELRLRLPATAEREKLIAELGRKEMEPKSHHTLKIAHQTIANMQARLNQKEEVLKKYQRLLEKAREEQREIVKKHEEDLHILHHRLELQADSSLNKFKQTAWDLMKQSPTPVPTNKHFIRLAEMEQTVAEQDDSLSSLLVKLKKVSQDLERQREITELKVKEFENIKLQLQENHEDEVKKVKAEVEDLKYLLD

[0163] >CEP290片段(aa580-1695)核酸序列(SEQ ID NO：5)

[0164] ACTGAAAACATTTCTCAAGGAGATAGAATAAGTGAAAGAAAATTGGATTTATTGAGCCTCAAAAATATGAGTGAAGCACAATCAAAGAATGAATTTCTTTCAAGAGAACTAATTGAAAAAGAAAGAGATTTAGAAAGGAGTAGGACAGTGATAGCCAAATTTCAGAATAAATTAAAAGAATTAGTTGAAGAAAATAAGCAACTTGAAGAAGGTATGAAAGAAATATTGCAAGCAATTAAGGAAATGCAGAAAGATCCTGATGTTAAAGGAGGAGAAACATCTCTAATTATCCCTAGCCTTGAAAGACTAGTTAATGCTATAGAATCAAAGAATGCAGAAGGAATCTTTGATGCGAGTCTGCATTTGAAAGCCCAAGTTGATCAGCTTACCGGAAGAAATGAAGAATTAAGACAGGAGCTCAGGGAATCTCGGAAAGAGGCTATAAATTATTCACAGCAGTTGGCAAAAGCTAATTTAAAGATAGACCATCTTGAAAAAGAAACTAGTCTTTTACGACAATCAGAAGGATCGAATGTTGTTTTTAAAGGAATTGACTTACCTGATGGGATAGCACCATCTAGTGCCAGTATCATTAATTCTCAGAATGAATATTTAATACATTTGTTACAGGAACTAGAAAATAAAGAAAAAAAGTTAAAGAATTTAGAAGATTCTCTTGAAGATTACAACAGAAAATTTGCTGTAATTCGTCATCAACAAAGTTTGTTGTATAAAGAATACCTAAGTGAAAAGGAGACCTGGAAAACAGAATCTAAAACAATAAAAGAGGAAAAGAGAAAACTTGAGGATCAAGTCCAACAAGATGCTATAAAAGTAAAAGAATATAATAATTTGCTCAATGCTCTTCAGATGGATTCGGATGAAATGAAAAAAATACTTGCAGAAAATAGTAGGAAAATTACTGTTTTGCAAGTGAATGAAAAATCACTTATAAGGCAATATACAACCTTAGTAGAATTGGAGCGACAACTTAGAAAAGAAAATGAGAAGCAAAAGAATGAATTGTTGTCAATGGAGGCTGAAGTTTGTGAAAAAATTGGGTGTTTGCAAAGATTTAAGGAAATGGCCATTTTCAAGATTGCAGCTCTCCAAAAAGTTGTAGATAATAGTGTTTCTTTGTCTGAACTAGAACTGGCTAATAAACAGTACAATGAACTGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTGCAAAAAGATAATATGCTTGTTCAAAGAACAAGTAACTTGGAACACCTGGAGTGTGAAAACATCTCCTTAAAAGAACAAGTGGAGTCTATAAATAAAGAACTGGAGATTACCAAGGAAAAACTTCACACTATTGAACAAGCCTGGGAACAGGAAACTAAATTAGGTAATGAATCTAGCATGGATAAGGCAAAGAAATCAATAACCAACAGTGACATTGTTTCCATTTCAAAAAAAATAACTATGCTGGAAATGAAGGAATTAAATGAAAGGCAGCGGGCTGAACATTGTCAAAAAATGTATGAACACTTACGGACTTCGTTAAAGCAAATGGAGGAACGTAATTTTGAATTGGAAACCAAATTTGCTGAGCTTACCAAAATCAATTTGGATGCACAGAAGGTGGAACAGATGTTAAGAGATGAATTAGCTGATAGTGTGAGCAAGGCAGTAAGTGATGCTGATAGGCAACGGATTCTAGAATTAGAGAAGAATGAAATGGAACTAAAAGTTGAAGTGTCAAAACTGAGAGAGATTTCTGATATTGCCAGAAGACAAGTTGAAATTTTGAATGCACAACAACAATCTAGGGACAAGGAAGTAACTGAAAACATTTCTCAAGGAGATAGAATAAGTGAAAGAAAATTGGATTTATTGAGCCTCAAAAATATGAGTGAAGCACAATCAAAGAATGAATTTCTTTCAAGAGAACTAATTGAAAAAGAAAGAGATTTAGAAAGGAGTAGGACAGTGATAGCCAAATTTCAGAATAAATTAAAAGAATTAGTTGAAGAAAATAAGCAACTTGAAGAAGGTATGAAAGAAATATTGCAAGCAATTAAGGAAATGCAGAAAGATCCTGATGTTAAAGGAGGAGAAACATCTCTAATTATCCCTAGCCTTGAAAGACTAGTTAATGCTATAGAATCAAAGAATGCAGAAGGAATCTTTGATGCGAGTCTGCATTTGAAAGCCCAAGTTGATCAGCTTACCGGAAGAAATGAAGAATTAAGACAGGAGCTCAGGGAATCTCGGAAAGAGGCTATAAATTATTCACAGCAGTTGGCAAAAGCTAATTTAAAGATAGACCATCTTGAAAAAGAAACTAGTCTTTTACGACAATCAGAAGGATCGAATGTTGTTTTTAAAGGAATTGACTTACCTGATGGGATAGCACCATCTAGTGCCAGTATCATTAATTCTCAGAATGAATATTTAATACATTTGTTACAGGAACTAGAAAATAAAGAAAAAAAGTTAAAGAATTTAGAAGATTCTCTTGAAGATTACAACAGAAAATTTGCTGTAATTCGTCATCAACAAAGTTTGTTGTATAAAGAATACCTAAGTGAAAAGGAGACCTGGAAAACAGAATCTAAAACAATAAAAGAGGAAAAGAGAAAACTTGAGGATCAAGTCCAACAAGATGCTATAAAAGTAAAAGAATATAATAATTTGCTCAATGCTCTTCAGATGGATTCGGATGAAATGAAAAAAATACTTGCAGAAAATAGTAGGAAAATTACTGTTTTGCAAGTGAATGAAAAATCACTTATAAGGCAATATACAACCTTAGTAGAATTGGAGCGACAACTTAGAAAAGAAAATGAGAAGCAAAAGAATGAATTGTTGTCAATGGAGGCTGAAGTTTGTGAAAAAATTGGGTGTTTGCAAAGATTTAAGGAAATGGCCATTTTCAAGATTGCAGCTCTCCAAAAAGTTGTAGATAATAGTGTTTCTTTGTCTGAACTAGAACTGGCTAATAAACAGTACAATGAACTGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTGCAAAAAGATAATATGCTTGTTCAAAGAACAAGTAACTTGGAACACCTGGAGTGTGAAAACATCTCCTTAAAAGAACAAGTGGAGTCTATAAATAAAGAACTGGAGATTACCAAGGAAAAACTTCACACTATTGAACAAGCCTGGGAACAGGAAACTAAATTAGGTAATGAATCTAGCATGGATAAGGCAAAGAAATCAATAACCAACAGTGACATTGTTTCCATTTCAAAAAAAATAACTATGCTGGAAATGAAGGAATTAAATGAAAGGCAGCGGGCTGAACATTGTCAAAAAATGTATGAACACTTACGGACTTCGTTAAAGCAAATGGAGGAACGTAATTTTGAATTGGAAACCAAATTTGCTGAGCTTACCAAAATCAATTTGGATGCACAGAAGGTGGAACAGATGTTAAGAGATGAATTAGCTGATAGTGTGAGCAAGGCAGTAAGTGATGCTGATAGGCAACGGATTCTAGAATTAGAGAAGAATGAAATGGAACTAAAAGTTGAAGTGTCAAAACTGAGAGAGATTTCTGATATTGCCAGAAGACAAGTTGAAATTTTGAATGCACAACAACAATCTAGGGACAAGGAAGTA[0165] >CEP290片段(aa580-1180)核酸序列(SEQ ID NO：6)

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[0167] >CEP290片段(aa1181-1695)核酸序列(SEQ ID NO：7)

[0168] GAGTCCCTCAGAATGCAACTGCTAGACTATCAGGCACAGTCTGATGAAAAGTCGCTCATTGCCAAGTTGCACCAACATAATGTCTCTCTTCAACTGAGTGAGGCTACTGCTCTTGGTAAGTTGGAGTCAATTACATCTAAACTGCAGAAGATGGAGGCCTACAACTTGCGCTTAGAGCAGAAACTTGATGAAAAAGAACAGGCTCTCTATTATGCTCGTTTGGAGGGAAGAAACAGAGCAAAACATCTGCGCCAAACAATTCAGTCTCTACGACGACAGTTTAGTGGAGCTTTACCCTTGGCACAACAGGAAAAGTTCTCCAAAACAATGATTCAACTACAAAATGACAAACTTAAGATAATGCAAGAAATGAAAAATTCTCAACAAGAACATAGAAATATGGAGAACAAAACATTGGAGATGGAATTAAAATTAAAGGGCCTGGAAGAGTTAATAAGCACTTTAAAGGATACCAAAGGAGCCCAAAAGGTAATCAACTGGCATATGAAAATAGAAGAACTTCGTCTTCAAGAACTTAAACTAAATCGGGAATTAGTCAAGGATAAAGAAGAAATAAAATATTTGAATAACATAATTTCTGAATATGAACGTACAATCAGCAGTCTTGAAGAAGAAATTGTGCAACAGAACAAGTTTCATGAAGAAAGACAAATGGCCTGGGATCAAAGAGAAGTTGACCTGGAACGCCAACTAGACATTTTTGACCGTCAGCAAAATGAAATACTAAATGCGGCACAAAAGTTTGAAGAAGCTACAGGATCAATCCCTGACCCTAGTTTGCCCCTTCCAAATCAACTTGAGATCGCTCTAAGGAAAATTAAGGAGAACATTCGAATAATTCTAGAAACACGGGCAACTTGCAAATCACTAGAAGAGAAACTAAAAGAGAAAGAATCTGCTTTAAGGTTAGCAGAACAAAATATACTGTCAAGAGACAAAGTAATCAATGAACTGAGGCTTCGATTGCCTGCCACTGCAGAAAGAGAAAAGCTCATAGCTGAGCTAGGCAGAAAAGAGATGGAACCAAAATCTCACCACACATTGAAAATTGCTCATCAAACCATTGCAAACATGCAAGCAAGGTTAAATCAAAAAGAAGAAGTATTAAAGAAGTATCAACGTCTTCTAGAAAAAGCCAGAGAGGAGCAAAGAGAAATTGTGAAGAAACATGAGGAAGACCTTCATATTCTTCATCACAGATTAGAACTACAGGCTGATAGTTCACTAAATAAATTCAAACAAACGGCTTGGGATTTAATGAAACAGTCTCCCACTCCAGTTCCTACCAACAAGCATTTTATTCGTCTGGCTGAGATGGAACAGACAGTAGCAGAACAAGATGACTCTCTTTCCTCACTCTTGGTCAAACTAAAGAAAGTATCACAAGATTTGGAGAGACAAAGAGAAATCACTGAATTAAAAGTAAAAGAATTTGAAAATATCAAATTACAGCTTCAAGAAAACCATGAAGATGAAGTGAAAAAAGTAAAAGCGGAAGTAGAGGATTTAAAGTATCTTCTGGAC

[0169] >CEP290核酸序列；NCBI参考序列：NM_025114.3(SEQ ID NO：8)

[0170] ATTTGAAGTCCTCGTTCCACGCCTTCTCATCATCCTGAACACCGAGCTCTGGGACTCCGGCGGAGAATCTAAACGTAAAGCATCACCCACGGTCGTGAACTGTAGGCTCTCCTGGCATCCGGGATCTTATTCTGGCCTTGGCGGAGTTGGGGATGGTGTCGCCTAGCAGCCGCTGCCGCTTTGGCTTGCTCGGGACCATTTGGCTGGACCCAGAGTCCGCGTGGAACCGCGATAGGGATCTGTCAGGGCCCGCGGCCGGGTCCAGCTTGGTGGTTGCGGTAGTGAGAGGCCTCCGCTGGTTGCCAGGCTTGGTCTAGAGGTGGAGCACAGTGAAAGAATTCAAGATGCCACCTAATATAAACTGGAAAGAAATAATGAAAGTTGACCCAGATGACCTGCCCCGTCAAGAAGAACTGGCAGATAATTTATTGATTTCCTTATCCAAGGTGGAAGTAAATGAGCTAAAAAGTGAAAAGCAAGAAAATGTGATACACCTTTTCAGAATTACTCAGTCACTAATGAAGATGAAAGCTCAAGAAGTGGAGCTGGCTTTGGAAGAAGTAGAAAAAGCTGGAGAAGAACAAGCAAAATTTGAAAATCAATTAAAAACTAAAGTAATGAAACTGGAAAATGAACTGGAGATGGCTCAGCAGTCTGCAGGTGGACGAGATACTCGGTTTTTACGTAATGAAATTTGCCAACTTGAAAAACAATTAGAACAAAAAGATAGAGAATTGGAGGACATGGAAAAGGAGTTGGAGAAAGAGAAGAAAGTTAATGAGCAATTGGCTCTTCGAAATGAGGAGGCAGAAAATGAAAACAGCAAATTAAGAAGAGAGAACAAACGTCTAAAGAAAAAGAATGAACAACTTTGTCAGGATATTATTGACTACCAGAAACAAATAGATTCACAGAAAGAAACACTTTTATCAAGAAGAGGGGAAGACAGTGACTACCGATCACAGTTGTCTAAAAAAAACTATGAGCTTATCCAATATCTTGATGAAATTCAGACTTTAACAGAAGCTAATGAGAAAATTGAAGTTCAGAATCAAGAAATGAGAAAAAATTTAGAAGAGTCTGTACAGGAAATGGAGAAGATGACTGATGAATATAATAGAATGAAAGCTATTGTGCATCAGACAGATAATGTAATAGATCAGTTAAAAAAAGAAAACGATCATTATCAACTTCAAGTGCAGGAGCTTACAGATCTTCTGAAATCAAAAAATGAAGAAGATGATCCAATTATGGTAGCTGTCAATGCAAAAGTAGAAGAATGGAAGCTAATTTTGTCTTCTAAAGATGATGAAATTATTGAGTATCAGCAAATGTTACATAACCTAAGGGAGAAACTTAAGAATGCTCAGCTTGATGCTGATAAAAGTAATGTTATGGCTCTACAGCAGGGTATACAGGAACGAGACAGTCAAATTAAGATGCTCACCGAACAAGTAGAACAATATACAAAAGAAATGGAAAAGAATACTTGTATTATTGAAGATTTGAAAAATGAGCTCCAAAGAAACAAAGGTGCTTCAACCCTTTCTCAACAGACTCATATGAAAATTCAGTCAACGTTAGACATTTTAAAAGAGAAAACTAAAGAGGCTGAGAGAACAGCTGAACTGGCTGAGGCTGATGCTAGGGAAAAGGATAAAGAATTAGTTGAGGCTCTGAAGAGGTTAAAAGATTATGAATCGGGAGTATATGGTTTAGAAGATGCTGTCGTTGAAATAAAGAATTGTAAAAACCAAATTAAAATAAGAGATCGAGAGATTGAAATATTAACAAAGGAAATCAATAAACTTGAATTGAAGATCAGTGATTTCCTTGATGAAAATGAGGCACTTAGAGAGCGTGTGGGCCTTGAACCAAAGACAATGATTGATTTAACTGAATTTAGAAATAGCAAACACTTAAAACAGCAGCAGTACAGAGCTGAAAACCAGATTCTTTTGAAAGAGATTGAAAGTCTAGAGGAAGAACGACTTGATCTGAAAAAAAAAATTCGTCAAATGGCTCAAGAAAGAGGAAAAAGAAGTGCAACTTCAGGATTAACCACTGAGGACCTGAACCTAACTGAAAACATTTCTCAAGGAGATAGAATAAGTGAAAGAAAATTGGATTTATTGAGCCTCAAAAATATGAGTGAAGCACAATCAAAGAATGAATTTCTTTCAAGAGAACTAATTGAAAAAGAAAGAGATTTAGAAAGGAGTAGGACAGTGATAGCCAAATTTCAGAATAAATTAAAAGAATTAGTTGAAGAAAATAAGCAACTTGAAGAAGGTATGAAAGAAATATTGCAAGCAATTAAGGAAATGCAGAAAGATCCTGATGTTAAAGGAGGAGAAACATCTCTAATTATCCCTAGCCTTGAAAGACTAGTTAATGCTATAGAATCAAAGAATGCAGAAGGAATCTTTGATGCGAGTCTGCATTTGAAAGCCCAAGTTGATCAGCTTACCGGAAGAAATGAAGAATTAAGACAGGAGCTCAGGGAATCTCGGAAAGAGGCTATAAATTATTCACAGCAGTTGGCAAAAGCTAATTTAAAGATAGACCATCTTGAAAAAGAAACTAGTCTTTTACGACAATCAGAAGGATCGAATGTTGTTTTTAAAGGAATTGACTTACCTGATGGGATAGCACCATCTAGTGCCAGTATCATTAATTCTCAGAATGAATATTTAATACATTTGTTACAGGAACTAGAAAATAAAGAAAAAAAGTTAAAGAATTTAGAAGATTCTCTTGAAGATTACAACAGAAAATTTGCTGTAATTCGTCATCAACAAAGTTTGTTGTATAAAGAATACCTAAGTGAAAAGGAGACCTGGAAAACAGAATCTAAAACAATAAAAGAGGAAAAGAGAAAACTTGAGGATCAAGTCCAACAAGATGCTATAAAAGTAAAAGAATATAATAATTTGCTCAATGCTCTTCAGATGGATTCGGATGAAATGAAAAAAATACTTGCAGAAAATAGTAGGAAAATTACTGTTTTGCAAGTGAATGAAAAATCACTTATAAGGCAATATACAACCTTAGTAGAATTGGAGCGACAACTTAGAAAAGAAAATGAGAAGCAAAAGAATGAATTGTTGTCAATGGAGGCTGAAGTTTGTGAAAAAATTGGGTGTTTGCAAAGATTTAAGGAAATGGCCATTTTCAAGATTGCAGCTCTCCAAAAAGTTGTAGATAATAGTGTTTCTTTGTCTGAACTAGAACTGGCTAATAAACAGTACAATGAACTGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTGCAAAAAGATAATATGCTTGTTCAAAGAACAAGTAACTTGGAACACCTGGAGTGTGAAAACATCTCCTTAAAAGAACAAGTGGAGTCTATAAATAAAGAACTGGAGATTACCAAGGAAAAACTTCACACTATTGAACAAGCCTGGGAACAGGAAACTAAATTAGGTAATGAATCTAGCATGGATAAGGCAAAGAAATCAATAACCAACAGTGACATTGTTTCCATTTCAAAAAAAATAACTATGCTGGAAATGAAGGAATTAAATGAAAGGCAGCGGGCTGAACATTGTCAAAAAATGTATGAACACTTACGGACTTCGTTAAAGCAAATGGAGGAACGTAATTTTGAATTGGAAACCAAATTTGCTGAGCTTACCAAAATCAATTTGGATGCACAGAAGGTGGAACAGATGTTAAGAGATGAATTAGCTGATAGTGTGAGCAAGGCAGTAAGTGATGCTGATAGGCAACGGATTCTAGAATTAGAGAAGAATGAAATGGAACTAAAAGTTGAAGTGTCAAAACTGAGAGAGATTTCTGATATTGCCAGAAGACAAGTTGAAATTTTGAATGCACAACAACAATCTAGGGACAAGGAAGTAGAGTCCCTCAGAATGCAACTGCTAGACTATCAGGCACAGTCTGATGAAAAGTCGCTCATTGCCAAGTTGCACCAACATAATGTCTCTCTTCAACTGAGTGAGGCTACTGCTCTTGGTAAGTTGGAGTCAATTACATCTAAACTGCAGAAGATGGAGGCCTACAACTTGCGCTTAGAGCAGAAACTTGATGAAAAAGAACAGGCTCTCTATTATGCTCGTTTGGAGGGAAGAAACAGAGCAAAACATCTGCGCCAAACAATTCAGTCTCTACGACGACAGTTTAGTGGAGCTTTACCCTTGGCACAACAGGAAAAGTTCTCCAAAACAATGATTCAACTACAAAATGACAAACTTAAGATAATGCAAGAAATGAAAAATTCTCAACAAGAACATAGAAATATGGAGAACAAAACATTGGAGATGGAATTAAAATTAAAGGGCCTGGAAGAGTTAATAAGCACTTTAAAGGATACCAAAGGAGCCCAAAAGGTAATCAACTGGCATATGAAAATAGAAGAACTTCGTCTTCAAGAACTTAAACTAAATCGGGAATTAGTCAAGGATAAAGAAGAAATAAAATATTTGAATAACATAATTTCTGAATATGAACGTACAATCAGCAGTCTTGAAGAAGAAATTGTGCAACAGAACAAGTTTCATGAAGAAAGACAAATGGCCTGGGATCAAAGAGAAGTTGACCTGGAACGCCAACTAGACATTTTTGACCGTCAGCAAAATGAAATACTAAATGCGGCACAAAAGTTTGAAGAAGCTACAGGATCAATCCCTGACCCTAGTTTGCCCCTTCCAAATCAACTTGAGATCGCTCTAAGGAAAATTAAGGAGAACATTCGAATAATTCTAGAAACACGGGCAACTTGCAAATCACTAGAAGAGAAACTAAAAGAGAAAGAATCTGCTTTAAGGTTAGCAGAACAAAATATACTGTCAAGAGACAAAGTAATCAATGAACTGAGGCTTCGATTGCCTGCCACTGCAGAAAGAGAAAAGCTCATAGCTGAGCTAGGCAGAAAAGAGATGGAACCAAAATCTCACCACACATTGAAAATTGCTCATCAAACCATTGCAAACATGCAAGCAAGGTTAAATCAAAAAGAAGAAGTATTAAAGAAGTATCAACGTCTTCTAGAAAAAGCCAGAGAGGAGCAAAGAGAAATTGTGAAGAAACATGAGGAAGACCTTCATATTCTTCATCACAGATTAGAACTACAGGCTGATAGTTCACTAAATAAATTCAAACAAACGGCTTGGGATTTAATGAAACAGTCTCCCACTCCAGTTCCTACCAACAAGCATTTTATTCGTCTGGCTGAGATGGAACAGACAGTAGCAGAACAAGATGACTCTCTTTCCTCACTCTTGGTCAAACTAAAGAAAGTATCACAAGATTTGGAGAGACAAAGAGAAATCACTGAATTAAAAGTAAAAGAATTTGAAAATATCAAATTACAGCTTCAAGAAAACCATGAAGATGAAGTGAAAAAAGTAAAAGCGGAAGTAGAGGATTTAAAGTATCTTCTGGACCAGTCACAAAAGGAGTCACAGTGTTTAAAATCTGAACTTCAGGCTCAAAAAGAAGCAAATTCAAGAGCTCCAACAACTACAATGAGAAATCTAGTAGAACGGCTAAAGAGCCAATTAGCCTTGAAGGAGAAACAACAGAAAGCACTTAGTCGGGCACTTTTAGAACTCCGGGCAGAAATGACAGCAGCTGCTGAAGAACGTATTATTTCTGCAACTTCTCAAAAAGAGGCCCATCTCAATGTTCAACAAATCGTTGATCGACATACTAGAGAGCTAAAGACACAAGTTGAAGATTTAAATGAAAATCTTTTAAAATTGAAAGAAGCACTTAAAACAAGTAAAAACAGAGAAAACTCACTAACTGATAATTTGAATGACTTAAATAATGAACTGCAAAAGAAACAAAAAGCCTATAATAAAATACTTAGAGAGAAAGAGGAAATTGATCAAGAGAATGATGAACTGAAAAGGCAAATTAAAAGACTAACCAGTGGATTACAGGGCAAACCCCTGACAGATAATAAACAAAGTCTAATTGAAGAACTCCAAAGGAAAGTTAAAAAACTAGAGAACCAATTAGAGGGAAAGGTGGAGGAAGTAGACCTAAAACCTATGAAAGAAAAGAATGCTAAAGAAGAATTAATTAGGTGGGAAGAAGGTAAAAAGTGGCAAGCCAAAATAGAAGGAATTCGAAACAAGTTAAAAGAGAAAGAGGGGGAAGTCTTTACTTTAACAAAGCAGTTGAATACTTTGAAGGATCTTTTTGCCAAAGCCGATAAAGAGAAACTTACTTTGCAGAGGAAACTAAAAACAACTGGCATGACTGTTGATCAGGTTTTGGGAATACGAGCTTTGGAGTCAGAAAAAGAATTGGAAGAATTAAAAAAGAGAAATCTTGACTTAGAAAATGATATATTGTATATGAGGGCCCACCAAGCTCTTCCTCGAGATTCTGTTGTAGAAGATTTACATTTACAAAATAGATACCTCCAAGAAAAACTTCATGCTTTAGAAAAACAGTTTTCAAAGGATACATATTCTAAGCCTTCAATTTCAGGAATAGAGTCAGATGATCATTGTCAGAGAGAACAGGAGCTTCAGAAGGAAAACTTGAAGTTGTCATCTGAAAATATTGAACTGAAATTTCAGCTTGAACAAGCAAATAAAGATTTGCCAAGATTAAAGAATCAAGTCAGAGATTTGAAGGAAATGTGTGAATTTCTTAAGAAAGAAAAAGCAGAAGTTCAGCGGAAACTTGGCCATGTTAGAGGGTCTGGTAGAAGTGGAAAGACAATCCCAGAACTGGAAAAAACCATTGGTTTAATGAAAAAAGTAGTTGAAAAAGTCCAGAGAGAAAATGAACAGTTGAAAAAAGCATCAGGAATATTGACTAGTGAAAAAATGGCTAATATTGAGCAGGAAAATGAAAAATTGAAGGCTGAATTAGAAAAACTTAAAGCTCATCTTGGGCATCAGTTGAGCATGCACTATGAATCCAAGACCAAAGGCACAGAAAAAATTATTGCTGAAAATGAAAGGCTTCGTAAAGAACTTAAAAAAGAAACTGATGCTGCAGAGAAATTACGGATAGCAAAGAATAATTTAGAGATATTAAATGAGAAGATGACAGTTCAACTAGAAGAGACTGGTAAGAGATTGCAGTTTGCAGAAAGCAGAGGTCCACAGCTTGAAGGTGCTGACAGTAAGAGCTGGAAATCCATTGTGGTTACAAGAATGTATGAAACCAAGTTAAAAGAATTGGAAACTGATATTGCCAAAAAAAATCAAAGCATTACTGACCTTAAACAGCTTGTAAAAGAAGCAACAGAGAGAGAACAAAAAGTTAACAAATACAATGAAGACCTTGAACAACAGATTAAGATTCTTAAACATGTTCCTGAAGGTGCTGAGACAGAGCAAGGCCTTAAACGGGAGCTTCAAGTTCTTAGATTAGCTAATCATCAGCTGGATAAAGAGAAAGCAGAATTAATCCATCAGATAGAAGCTAACAAGGACCAAAGTGGAGCTGAAAGCACCATACCTGATGCTGATCAACTAAAGGAAAAAATAAAAGATCTAGAGACACAGCTCAAAATGTCAGATCTAGAAAAGCAGCATTTGAAGGAGGAAATAAAGAAGCTGAAAAAAGAACTGGAAAATTTTGATCCTTCATTTTTTGAAGAAATTGAAGATCTTAAGTATAATTACAAGGAAGAAGTGAAGAAGAATATTCTCTTAGAAGAGAAGGTAAAAAAACTTTCAGAACAATTGGGAGTTGAATTAACTAGCCCTGTTGCTGCTTCTGAAGAGTTTGAAGATGAAGAAGAAAGTCCTGTTAATTTCCCCATTTACTAAAGGTCACCTATAAACTTTGTTTCATTTAACTATTTATTAACTTTATAAGTTAAATATACTTGGAAATAAGCAGTTCTCCGAACTGTAGTATTTCCTTCTCACTACCTTGTACCTTTATACTTAGATTGGAATTCTTAATAAATAAAATTATATGAAATTTTCAACTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAA

[0171] >AAV8衣壳蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：9)

[0172] MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

[0173] 尽管本文已经描述和说明了本发明的几个实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得结果的多种其他手段和/或结构和/或一个或更多个本文描述的优点，并且这样的变化和/或修改中的每一个都被认为在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解本文描述的所有参数、尺寸、材料和构造均是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于本发明为其所使用的教导的特定应用。通过使用不超过常规的实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。因此，应当理解，前述实施方式仅以示例的方式给出，并且在所附权利要求书及其相等物的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、制品、材料和/或方法不是相互矛盾的，则两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料和/或方法的任何组合都包括在本发明的范围内。

[0174] 除非明确相反地指出，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个”应理解为指“至少一个”。

[0175] 如在说明书和权利要求书中所使用的，短语“和/或”应理解为指这样结合的元素中的“任何一个或两个”，即在某些情况下结合地存在而在其他情况下分离地存在的元素。除非明确相反的指出，否则除了被“和/或”子句具体标识的元素之外，其他元素可以可选地存在，无论与那些具体标识的元素相关还是无关。因此，作为非限制性实施例，在与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施方案中可以指没有B的A(可选地包括B以外的其他元素)；在另一个实施方案中，指不含A的B(任选地包括除A以外的其他元素)；在另一个实施方案中，指A和B二者(可选地包括其他元素)；等。

[0176] 如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含的，即不仅包含多个元素或元素列表中的至少一个，而且还包括多于一个，及可选地其他未列出的项。只有明确相反指出的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或当在权利要求书中使用时，“由...组成”，指包含多个元素或元素列表中的恰好一个元素。一般而言，当前面有排他性的术语时，例如“任何一个”、“其中一个”、“仅一个”或“恰好一个”，本文中使用的术语“或”才应仅解释为指示排他性的取舍(即“一个或其他但不是两个”。当在权利要求书中使用时，“基本上由…组成”应具有专利法领域中所使用的普通含义。

[0177] 如本文在说明书和权利要求书中所使用的，在提及一个或更多个元素的列表时，短语“至少一个”应被理解为指从该元素列表中的任何一个或更多个元素中选择至少一个元素，但不必包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许短语“至少一个”所指代的元素列表中具体识别的元素之外的元素可以可选地存在，无论与那些具体识别的元素有关还是无关。因此，作为非限制性实施例，“A和B的至少一个”(或相等地，“A或B的至少一个”，或相等地“A和/或B的至少一个”)在一个实施方案中可以指至少一个，任选地包括一个以上，不存在B的A(并且任选地包括除B以外的其他元素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个，任选地包括一个以上，不存在A的B(并且任选地包括除A以外的其他元素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个，任选地包括一个以上，A，以及至少一个，任选地包括一个以上，B(以及可选地包括其他元素)；等。

[0178] 在权利要求书以及上述说明书中，诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等所有过渡性短语都应理解为开放式的，即指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，仅过渡性短语“由…组成”和“基本上由…构成”应分别是封闭的或半封闭的过渡性短语。

[0179] 在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数术语来修饰权利要求元素本身并不意味着一个权利要求元素相对于另一个或实施方法的时间顺序上的任何优先权、优先或顺序，而仅用作区分具有确定名称的一个权利要求元素与具有相同名称的另一个元素(但用于序数术语)的标签以区分权利要求保护的元素。