一种构建独特调节方式下特异性杀灭HIV感染细胞的新型重组HIV载体的方法

本发明涉及一种能够携带外源性强大毒性蛋白编码基因的重组HIV载体(特别是HIV-1载体)，在HIV感染细胞内和HIV非感染的正常细胞内，重组HIV载体中的强大毒性蛋白基因的表达，完全受控于HIV(主要指HIV-1型的野生型)基因组表达产物的可靠调节，因此能够专一性杀死HIV感染细胞而不损伤正常细胞的方法。

目前抗艾滋病所面临的关键性难点是：①艾滋病患者主要死因是HIV整合后潜伏以及病毒颗粒的持续释放。②宿主免疫系统过度活化最终导致的免疫衰竭。③HIV快速的繁殖周期导致HIV大量变异造成抗艾滋病药物的敏感性下降。

临床上治疗艾滋病毒感染与艾滋病主要采用逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合用药，其效果固然不错，但谈不上根治艾滋病。其原因，由于HIV大量变异，导致病毒对药物的耐受，形成耐药变异株。对潜伏感染细胞处于静止状态，抗病毒药物对它们也不发生效应，另外药物难以到达淋巴结和中枢神经系统组织器官，仍有少量HIV复制，因此长期应用抗HIV药物仍不能彻底清除HIV。

艾滋病毒感染与艾滋病治疗的根本目的就在于彻底清除体内的HIV，而基因疗法可能是解决HIV整合后潜伏的根本手段。由于基因打靶技术尚处于摸索阶段(如同源重组效率仅达十万分之一，尚无体内成功的报道)。我认为基因疗法最可行的有效方法有两个，其一，反义核酸技术，其中核酶——即有催化功能的反义RNA分子，能够特异性降解HIV-RNA，是目前最受关注的反义核酸技术。但核酶也有缺陷，面临HIV突变可降低其有效性，而且反义RNA在细胞内半衰期一般为8～14min，即使体内合成法也存在表达水平不易控制，与整合后长期潜伏的野生性HIV基因组不断组装并释放病毒颗粒相比，存在着有效作用持续时间和有效作用是否同步，以及表达水平存在差异等问题。

基于上述原因，我认为目前真正能够有效解决HIV整合后潜伏复制的基本方法是构建携带强大毒性蛋白的编码基因(最好选择基因序列短，产物毒性最强大)的新型重组HIV载体(特别是构建重组HIV-1或2型载体)，其中的好处是：①可寻HIV感染途径追踪杀灭相应的HIV感染细胞和HIV，包括被认为HIV源泉的淋巴结或中枢神经组织器官等地方。这是利用HIV同样的生物学行为，清除HIV的最有效途径和方法。②据不同文献介绍：平均每15～20天，外周血CD4淋巴细胞彻底更新一次，而每天产生或清除的病毒量约109，其中血浆病毒30～50％由前一天感染的CD4+淋巴细胞产生。如果这种动力学的计算是准确的，而构建携带强大毒性蛋白编码基因的重组HIV载体也以同样数量或大于109。那么以CD4+淋巴细胞每15～20天更新一次为一个循环周期，可能用不了多个循环周期，以重组HIV载体及其表达的强大毒性蛋白将会沿着HIV同样的生物学行为途径把HIV感染细胞和HIV全部清除。③如果能够尽快杀死HIV感染细胞和HIV将使HIV无法产生变异株，可能会更有利于抗病毒药物的疗效。④从根本上有利于艾滋病患者，解决自身免疫系统的重建问题。因此构建携带强大毒性蛋白编码基因的新型重组HIV载体是一个诱人的有着可能根治艾滋病毒感染与艾滋病前景的治疗方法。

然而构建新型重组HIV基因转移载体系统，存在着两个关键性方面的问题需要解决：除包装细胞技术的需要改进和杜绝重组野生型HIV的困难外(注：这种困难并非不能解决)。另一个与本发明相关的最重要问题就是如何去除对正常细胞的毒性，解决特异性杀伤HIV感染细胞和HIV的问题。

国内外现有构建携带“自杀”基因的各种重组病毒载体，如逆转录病毒，腺病毒及HIV载体等，通过细胞转染等方法，用HIV的LTR控制所谓“自杀”基因表达。其作用机理：一旦被HIV感染，感染细胞将大量产生Tat蛋白和Tev蛋白将激活HIV载体的LTR，驱动“自杀”基因猛增，导致细胞死亡。携带的目的基因有疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(HSVTK)基因、流感病毒的血凝蛋白等。如采用白喉毒素A链基因，则需采用低毒性的DT-A突变型。对正常细胞而言，无Tat蛋白和Tev蛋白存在下，“自杀”基因表达水平很低，不足以对正常细胞造成伤害。这就是目前携带“自杀”基因的各种重组病毒载体的研究和应用状态。其缺陷有三个：①长期应用表达的“自杀”基因产物对正常细胞蓄积性毒性刺激的结果是难以预测的。②低水平的“自杀”基因表达可使正常细胞耐受，同时可能也会使更低水平复制的HIV感染细胞耐受，刺激产生变异毒株，而不利于清除整合后潜伏的HIV感染细胞和HIV。③非重组型HIV载体将难以模拟HIV的生物学行为，感染相应细胞。

综上所述，可见最有效清除HIV感染细胞和HIV的方法应该是构建携带强大毒性蛋白编码基因的重组HIV载体(特别是HIV-1或2型载体)，为克服现有携带“自杀”基因各种病毒载体存在的功能缺陷，需要有创新性的，非常可靠的调节方式。即必须达到这些目的：①在正常细胞内不充许有1个毒性分子表达，去除全部毒性。②在HIV感染细胞中，仅表达1～几个毒性分子就可将HIV感染细胞和HIV杀死，不存在也没有时间给HIV产生变异毒株的机会。③重组的HIV载体的强大毒性蛋白编码基因的表达，完全受控于HIV基因产物的调节。

本发明的目的在于获得一种能够特异性杀灭HIV感染细胞和HIV并完全避免对非HIV感染的正常细胞损伤的一种创新性疗法。即构建一种完全受控于HIV基因组表达产物可靠调节下，携带强大毒性蛋白编码基因的新型重组HIV载体。

为实现上述目的，本发明构建的重组HIV载体毒性蛋白编码基因的表达，同其它携带“自杀”基因的各种重组病毒载体一样，不仅受控于HIV感染细胞内，号称HIV复制启动器Tat蛋白和Tev蛋白的有力调控；最重要的区别是受到Rev蛋白和晚期合成的蛋白酶的特异性调控。因为只有这种HIV的Rev蛋白和蛋白酶特异性调节方式，才可以保障HIV载体中毒性蛋白编码基因产物最终成为具有生物活性的强大毒性蛋白。其创新要点在于利用Rev蛋白特异性效应元件和蛋白酶特异性结合底物相互作用的原理，在构建新型重组HIV载体时，除插入目的基因等外源性基因外，还同时克隆有这种效应元件和底物的相应基因片断。在正常细胞内即使受到某些转录激活因素的影响，由于没有HIV的Rev蛋白和蛋白酶独特作用，重组的HIV载体也不会产生1分子具有生物活性的毒性蛋白杀伤正常细胞。这就是本发明与现有构建的携带“自杀”基因的各种重组病毒载体的最根本区别。

构建能够特异性杀灭HIV感染细胞的新型重组HIV载体的基本思路是，保留并需要灵活运用各种HIV亚型(特别是HIV-1型的不同亚型)两端的LTR、TB序列、Ψ包装信号、gag部分特定功能编码区以及整合序列等。并将选择标志基因和强大毒性蛋白编码基因以及与HIV的Rev蛋白和蛋白酶特异性相互作用结合序列的相应基因片断等外源性基因克隆其中。如果重组HIV载体基因转移系统很成熟和稳定，则可去掉标志基因。如何利用HIV的Rev蛋白和蛋白酶特异性调节方式，控制重组HIV载体强大毒性蛋白编码基因仅在HIV感染细胞中表达不在正常细胞中表达，本发明有3种不同途径的解决方法：1、HIV的Rev蛋白调节重组新型HIV载体毒性蛋白编码基因表达的方法Rev蛋白作用HIV-1特异性效应元件——顺式作用阻抑序列，如在RNA位点处于3351～3610一段259个核苷酸序列(Cis-acting repression sequence)，简称CRS和顺式作用抗阻抑序列，如在env mRNA一段234个核苷酸序列(cis-antirepressionsequece)，简称RRE。将RRE和CRS在HIV基因组所处的核苷酸序列中的特定位置和作用机理作为参考。在构建新型重组HIV载体过程中，将RRE和CRS片断插入以供外源性基因正确表达相应的合适的位置，就可以使HIV的Rev蛋白在与新型重组HIV载体的RRE和CRS相互作用中发挥有效的重要调节功能。此外，Emerman等人还发现了与Rev蛋白相互作用的另一种重要调控序列，被称为核阻留序列(NRS)。在HIV基因组中共有3个NRS序列，一个在gag基因内，2个在env基因内，在细胞核内的运输系统能识别NRS。只能将不含NRS的mRNA运至胞浆内，而不能转运带有NRS的mRNA。因此Rev蛋白可通过核运输信号NRS(nuclear ex port signal)将未经剪切的病毒RNA运出细胞核。有关Rev蛋白的生物学功能的认识不断深入，但利用Rev蛋白独特的调节作用，将到达本发明的如下目的：1.1、在HIV感染细胞内，HIV基因组早期表达的Rev蛋白与RRE相互作用克服CRS的阻抑作用，同时Rev蛋白在与NRS相互作用中阻止相应的mRNA被剪切，促进未剪接和部分剪接mRNA分子从胞核向胞浆转运。另外只有在Rev蛋白作用下，晚期基因才开始转录。因此Rev蛋白在HIV感染细胞内主要促进HIV基因由早期(转录调节蛋白mRNA)向晚期(转录HIV结构蛋白mRNA)的转化，产生HIV结构蛋白组装病毒颗粒。重要的是没有Rev蛋白的特异性作用也就没有结构蛋白。在HIV感染细胞内，Rev蛋白同时也会与新型重组HIV载体中的RRE相互作用，克服CRS的阻抑作用，并通过Rev蛋白与NRS相互作用使毒性蛋白编码基因(模拟HIV结构蛋白编码基因表达过程)表达强大的毒性蛋白而杀死HIV感染细胞和HIV。

1.2、在正常细胞内，即使受到某些正调控因素的影响，重组的HIV载体基因组由于存在着CRS与RRE和(或)NRS独特的作用因素影响，在没有Rev蛋白特异性调节作用下，即无法克服CRS的阻抑作用也无法克服NRS的核阻留作用。由于没有Rev蛋白的出核运输信号NRS的作用，如果有很低水平外源性基因转录物mRNA也将停留在细胞核内，最终被降解，而不能向胞浆转运翻译成毒性蛋白分子。这如同HIV的结构蛋白不能产生的原理一样——即无Rev蛋白，也就没有HIV的结构蛋白和新型重组HIV载体的毒性蛋白。

这就是利用HIV的Rev蛋白与多个效应元件相互作用的原理来调节新型重组HIV载体目的基因表达毒性蛋白，特异性杀伤HIV感染细胞和HIV而避免损伤正常细胞的方法和作用机理。当然在构建新型重组HIV载体时，如何正确选用能够真正与Rev蛋白相互作用的效应元件，甚至仅用某一可行的NRS序列是构建新型重组HIV载体的关键。

1.3、在构建新型重组HIV载体中，可以将RRE与CRS和(或)NRS等Rev蛋白特异性识别序列，以合适的位置插入或与HIV载体中外源性目的基因相连接而克隆其中。

2、HIV蛋白酶调节新型重组HIV载体毒性蛋白编码基因表达的方法目前HIV-1蛋白酶结构及功能已基本搞清，它是由pol基因与5’端编码含99个氨基酸，二倍体旋光对称c(c2)的天氡氨酰二聚体蛋白。当HIV-1基因开始翻译出Cag或Gag-pol聚蛋白时，蛋白酶自动从Cag-pol聚蛋白劈开分离，然后再劈开其余Gag、Cag-pol聚蛋白，使之成为结构蛋白和功能酶。

当我们了解到HIV蛋白酶特异性识别序列和酶切位点。如蛋白酶每条肽链上均有由天冬氨酸、苏氨酸和甘氨酸(Asp-Thr-Gly)组成的保守序列，该序列是HIV蛋白酶活性部位，而蛋白酶多聚体上则有多个苯丙氨酸或酪氨酸与脯氨酸连接的位点是蛋白酶的催化部位。由于新生的多肽链即原蛋白是没有活性的，必须在特异性蛋白酶作用下水解掉一些肽段或氨基酸残基后，才能显示其生物学活性。所以酶的底物专一性(如结构专一性和立体异构专一性)，成为本发明的第二个可供应用的理论根据。

在构建重组HIV载体时，可将强大毒性蛋白编码基因一侧或两侧连接上HIV蛋白酶特异性识别序列和酶切位点的编码基因片断；也可将毒性蛋白编码基因连接到gag或pol的某一特定核苷酸序列上，表达某一特定聚蛋白(或许存在对毒性蛋白的不同用途)，利用HIV蛋白酶特异性酶切位点使其分离，产生有生物学活性的强大毒性蛋白，达到本发明如下目的：2.1、在HIV感染细胞内，HIV基因组晚期表达的蛋白酶特异性作用，可将病毒颗粒成熟装配时的pol蛋白切割成几个功能酶，同时也将Gag蛋白前体切割成P17、P24、P2、P7、P1以及P6等蛋白质和多肽。必须经过这一过程才能最终装配成熟的病毒颗粒，没有蛋白酶特异性作用也就没有结构蛋白。在HIV感染细胞内，蛋白酶同时也会特异性切开重组HIV载体编码基因表达的毒性蛋白前体或某一特定的聚蛋白，产生具有生物学活性的功能毒性蛋白杀死HIV感染细胞和HIV，或可产生某种新用途。

2.2、在正常细胞内，在某些细胞的正调控因素的影响下，重组的HIV载体外源性基因表达有低水平的中间产物，也只能翻译成无活性的蛋白前体或某一特定聚蛋白。由于不存在HIV蛋白酶特异性水解作用，最终也不能加工形成具有生物学活性的毒性蛋白分子而杀伤正常细胞。这如同HIV的结构蛋白不能产生的原理一样——即没有HIV蛋白酶，也就没有HIV的结构蛋白和新型重组HIV载体的毒性蛋白。

这就是利用HIV蛋白酶调节新型重组HIV载体目的基因表达毒性蛋白，特异性杀伤HIV感染细胞和HIV而避免损伤正常细胞的方法和作用机理。

2.3、在构建新型重组HIV载体中，可以将蛋白酶特异性识别序列和酶切位点的相应基因片断，以合适的位置插入或与HIV载体中外源性目的基因相连接而克隆其中。

3、HIV的Rev蛋白和蛋白酶联合应用调节新型重组HIV载体表达毒性蛋白的方法。

Rev蛋白和蛋白酶的联合调节作用，实质上是对新型重组HIV载体毒性蛋白编码基因表达的一种双重调节方式，即从转录水平到翻译后加工水平对毒性蛋白编码基因产物，在成熟过程的不同阶段发挥特异性调节功能，其对HIV感染细胞和正常细胞的作用机理如同前述。在构建HIV载体时，可以将RRE与CRS和(或)NRS以及蛋白酶特异性识别序列和酶切位点的相应基因片断，以合适的位置插入或与HIV载体中外源性基因相连接而克隆其中，肯定会有多种不同的HIV载体构建方式，而且最终导致外源性基因表达效率不会一样，但会有一个共同结果，即在表达水平非常低的情况下，如仅表达1～几个强大毒性蛋白，也足以杀死HIV感染细胞和HIV。

利用HIV的Rev蛋白和蛋白酶与新型重组HIV载体中相应基因片断产物相互作用的特异性调节方式，是因为HIV感染细胞与正常细胞之间存在着关键的差异性调控焦点，是新型重组HIV载体能够特异性杀死HIV感染细胞和HIV并避免损伤正常细胞的根本保障，同时也造就了本发明。

新型的重组HIV载体的最终归宿在完全静止的HIV感染细胞内和正常细胞内会随着细胞的有限寿命而结束。同时也无需担心重组HIV载体随机整合细胞基因组会导致细胞转化问题。因为这不是治疗癌症，转染宿主体内的是原来根本不存在的逆转录病毒载体。当一个艾滋病毒感染者或艾滋病患者每天都在产生10亿个艾滋病毒时，细胞转化问题已变得毫无意义了，重要的是如何彻底清除体内的艾滋病毒，这是解决矛盾的根本。

最后特别应该指出两点：①HIV的Rev蛋白和蛋白酶的特异性调节方式，可以通过在现有各种重组病毒载体中插入RRE与CRS和(或)NRS序列以及蛋白酶的相应基因片断或相似的模拟基因片断而与其产物相互作用的方法，即指构建各种病毒载体利用本发明的方法和作用机理同样可以用于特异性治疗艾滋病毒感染与艾滋病。②本发明的有关CRS、RRE、NRS等Rev蛋白以及与蛋白酶作用序列相关的数据仅供参考。因为随着科技的进步，对HIV结构和功能的认识会逐步加深，对HIV生活周期的了解也会更加全面。有关各种数据也会因此有所变化，所以需要随时了解世界上最新的有关HIV(特别是HIV-1各亚型)的信息。目前最新的常见DNA和蛋白质数据库可以从以下生物信息学数据库得到；DNA序列数据库主要有NCBI的GenBank，EBI开发的EMBL以及日本静冈市的日本国立遗传学研究所的日本DNA数据库。蛋白质序列数据库主要有由美国、德国和日本3家实验室共同合作开发的国际信息资源PIR，瑞士日内瓦的大学生化系开发的SWISS-PROT。另外还可以通过Internet加入生物医学讨论组，如最著名的BIOSCI。都可作为了解HIV最新信息的来源，以助构建可携带强大毒性蛋白编码基因的新型重组HIV载体。