一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒
阅读：364发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本实用新型涉及一种用于检测 治疗 恶性 肿瘤 的一线药物耐药基因表达量的 试剂 盒 ，其特征在于，所述试剂盒包含盒体(1)、盒盖(2)和设置在盒体(1)内的 衬垫 (3)，所述衬垫(3)上设有小孔，装有随机六聚体引物的试剂管(4)、逆转录酶的试剂管(5)、装有RNA酶 抑制剂 的试剂管(6)、装有逆转录缓冲液的试剂管(7)、装有dNTP Mix的试剂管(8)、装有实时 荧光 定量PCR Mix反应试剂的试剂管(9)均被设在小孔内；盒盖(2)内侧还设有条码区(12)。本实用新型将四个耐药基因的表达量检测整合到一个试剂盒中，检测面广、结构设计合理、检测灵敏度高，方便携带、保存。，下面是一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含盒体(1)、盒盖(2)和设置在盒体(1)内的衬垫(3)，所述衬垫(3)上设有小孔，装有随机六聚体引物的试剂管(4)、逆转录酶的试剂管(5)、装有RNA酶抑制剂的试剂管(6)、装有逆转录缓冲液的试剂管(7)、装有dNTP Mix的试剂管(8)、装有实时荧光定量PCR Mix反应试剂的试剂管(9)均被设在小孔内；盒盖(2)内侧还设有条码区(12)。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述小孔内还设有装有探针的试剂管(10)和装有引物的试剂管(11)。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述小孔在衬垫(3)上分成两排平行排列。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，其特征在于，衬垫(3)与试剂盒底部之间为冷冻区(13)。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述冷冻区(13)内填充冷冻材料。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述冷冻区(13)位于衬垫(3)设有逆转录酶的试剂管(5)、装有RNA酶抑制剂的试剂管(6)的下方。
7.根据权利要求5所述的一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述冷冻材料为冰袋。
8.根据权利要求1所述的一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述条码区(12)含试剂盒中试剂保存、配制信息。
一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试
剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 随着医学研究和药物研发水平不断进步，越来越多的治疗肿瘤类药物被开发出来，但是，一些患者在使用某些药物进行治疗时效果并不理想，表现为肿瘤对药物敏感度低，耐药性强等，研究表明这一现象与人体内的某些基因过表达有关。
[0003] 铂类药物是最常用的肿瘤化疗药物之一，它主要通过引起肿瘤细胞内DNA的交联形成加合物，阻碍DNA合成与复制，从而抑制肿瘤细胞的生长。ERCC1是核酸切除修复系统NER(nucleotide excision repair)的一个关键基因，NER可以切除加合物并修复被损伤的DNA，从而降低化疗效果，因此，ERCC1在mRNA中的高表达与铂类药物的耐药性有关。
[0004] 吉西他滨是临床上用来治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌及其他实体肿瘤的一种抗肿瘤药物，药物进入细胞后，可通过一系列的磷酸激酶活化，生成三磷酸核苷类似物，与DNA合成的底物竞争从而掺入DNA链，中断DNA的合成。临床研究表明，RRM1基因的表达水平与吉西他滨疗效负相关，RRM1mRNA表达水平低的非小细胞肺癌患者，在接受吉西他滨和铂类药物联合化疗后有较好的应答，其中位总生存期也比RRM1mRNA表达水平高的患者长，此外，RRM1在胰腺癌中的高表达也会导致患者对吉西他滨产生抗性，美国国家综合癌症网络非小细胞肺癌临床实践指南(2011)已经将RRM1表达水平作为治疗的预测生物标记，因此，检测RRM1表达水平对于预测吉西他滨的疗效是非常必要的，RRM1表达水平低的患者采用吉西他滨为主的化疗疗效较好。
[0005] 抗微管类化疗药物是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的一类光谱化疗药，细胞内微管蛋白分为α、β两个亚型，是细胞骨架的中药组成部分，是有丝分裂时纺锤体的基本组成单位，也是抗微管药物的主要作用靶点。据研究显示，TUBB3基因编码的β-Tubulin-Ⅲ(3型β微管蛋白)与抗微管化疗药敏感性的关系最密切，低TUBB3mRNA表达水平的肿瘤患者接受抗微管类药物化疗的效果较好，中位生存期较长，反之，高TUBB3mRNA表达水平的肿瘤患者的抗微管类药物化疗疗效较差。
[0006] 氟类药物是尿嘧啶的氟代衍生物，可在细胞内转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP)，从而抑制脱氧核苷酸合成酶，阻止脱氧核苷酸(dUMP)甲基化为脱氧胸苷酸(dTMP)，进而影响DNA的合成，另外，也能掺入RNA中干扰蛋白质的合成，从而达到抑制肿瘤生长的作用。TYMS(ThymidylateSynthetase)基因编码的胸苷酸合成酶(TS)是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，同时它是氟类药物在体内作用发挥细胞毒作用的目标酶，氟类药物在体内转化为5-FU，5-FU的代谢物与TS结合，阻碍TS的正常功能，从而抑制DNA合成。众多临床研究结果都显示TYMS基因的mRNA表达水平与氟类药物疗效密切相关，低TYMS mRNA表达水平的肿瘤患者接受氟类药物化疗的效果较好，反之，TYMS高表达的患者接受氟类药物化疗的效果较差。
[0007] 上述研究结果都表明，在一线治疗的恶性肿瘤患者中检测ERCC1、RRM1、TUBB3和TYMS基因的表达量具有重要的临床意义，是正确对患者用药治疗的先决条件。发明内容
[0008] 本实用新型所要解决的技术问题是提供一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，将四个耐药基因的表达量检测整合到一个试剂盒中，应用实时荧光定量PCR技术对耐药基因进行定量检测，实时监测整个PCR进程，具有特异性更强、灵敏度更高高、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。
[0009] 本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒。
[0010] 一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，所述试剂盒包含盒体1、盒盖2和设置在盒体1内的衬垫3，所述衬垫3上设有小孔，装有随机六聚体引物的试剂管4、逆转录酶的试剂管5、装有RNA酶抑制剂的试剂管6、装有逆转录缓冲液的试剂管7、装有dNTP Mix的试剂管8、装有实时荧光定量PCR Mix反应试剂的试剂管9均被设在小孔内；盒盖2内侧还设有条码区12。
[0011] 所述小孔内还设有装有探针的试剂管10和装有引物的试剂管11。
[0012] 所述小孔在衬垫3上分成两排平行排列。
[0013] 衬垫3与试剂盒底部之间为冷冻区13。
[0014] 冷冻区13在试剂盒的左下测，冷冻区13内填充冷冻材料。
[0015] 所述冷冻区13位于衬垫3设有逆转录酶的试剂管5、装有RNA酶抑制剂的试剂管6的下方。
[0016] 采用隔板将冷冻区和其他区域隔开。
[0017] 所述冷冻材料为冰袋。
[0018] 所述条码区12含试剂盒中试剂保存、配制信息。
[0019] 有益效果
[0020] 由于采用了上述的技术方案，本实用新型与现有技术相比，具有以下的优点和积极效果：
[0021] (1)本实用新型的试剂盒结构设计合理、检测灵敏度高，方便携带保存，检测全面；
[0022] (2)本实用新型的试剂盒在检测ERCC1、RRM1、TUBB3和TYMS四种耐药基因的表达量时，通过荧光信号积累实时监测整个PCR进程，同时对四个耐药基因的表达量同时进行检测，可以更加准确、便捷的得到检测结果，而且自动化程度高，有效降低污染。便于临床检测中推广。附图说明
[0023] 图1是本实用新型的一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒结构示意图。
具体实施方式
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。此外应理解，在阅读了本实用新型讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0025] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026] 下述实施例中所使用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0027] 本实用新型的实施方式涉及一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒。
[0028] 如图1所示：本实用新型的实施方式涉及一种用于检测治疗恶性肿瘤的一线药物耐药基因表达量的试剂盒，所述试剂盒包含盒体1、盒盖2和设置在盒体1内的衬垫3，所述衬垫3上设有8个小孔，小孔在衬垫3上分成两排平行排列，装有随机六聚体引物的试剂管4、逆转录酶的试剂管5、装有RNA酶抑制剂的试剂管6、装有逆转录缓冲液的试剂管7被置于左侧、装有dNTP Mix的试剂管8、装有实时荧光定量PCR Mix反应试剂的试剂管9，装有探针的试剂管10和装有引物的试剂管11被置于右侧；衬垫3与试剂盒底部之间为冷冻区13，冷冻区13在试剂盒的左下测，冷冻区13内填充冷冻材料，其中冷冻材料为冰袋，冷冻区13相对应的衬垫3上的小孔内设有逆转录酶的试剂管5、装有RNA酶抑制剂的试剂管6，采用隔板将冷冻区和其他区域隔开；盒盖2内侧还设有条码区12，含试剂盒中试剂保存、配制信息。
[0029] 其中ERCC1、RRM1、TUBB3、TYMS和内参基因ATCB引物序列如下：
[0030] ERCC1-F 5’-ATGGCCCTCACGGAGTTTTGT-3’
[0031] ERCC1-R 5’-CATCTGGGCACTGAAAGGGA-3’
[0032] RRM1-F 5’-ACTAGCTGATGCATGTGA-3’
[0033] RRM1-R 5’-TCCATAACAAATTCTGGATTCG-3’
[0034] TUBB3-F 5’-GCGGGAGGGATTTGGATT-3’
[0035] TUBB3-R 5’-GGAAGGGTGGTTCCAGGC-3’
[0036] TYMS-F 5’-GAGGCGGTGGAGCACATTT-3’
[0037] TYMS-R 5’-CGTTTGTTGTGAGCAGAGG-3’
[0038] ATCB-F 5’-CCGACTTCCCCTCCATAGT-3’
[0039] ATCB-R 5’-AGGGTGCGGATGCCTCTCTT-3’
[0040] 其中，所述ERCC1、RRM1、TUBB3、TYMS和内参基因ATCB探针序列如下(R表示荧光报告基团，Q表示荧光淬灭基团)：
[0041] ERCC1-5’-R-ACGCCCTAGCTCACTCCCCT-Q-3’
[0042] RRM1-5’-R-GCCGCCAAGAAAGTCATGTTTGA-Q-3’
[0043] TUBB3-5’-R-AAAGTTGTCTGGCTCCAA-Q-3’
[0044] TYMS-5’-R-CTGGCACCTGTCGGTGTT-Q-3’
[0045] ATCB-5’-R-CCCCACGAACCAGGGCGTGA-Q-3’
[0046] 上述引物和探针的浓度均为5μmol/L。
[0047] 其中，逆转录缓冲液的试剂包括250mM Tris-HCL(PH8.3)、375mM KCL、15mM MgCl2、50mM DTT。
[0048] 其中，PCR Mix试剂包括Taq DNA聚合酶浓度为50U/mL，dNTPs浓度为400μM，Mgcl2浓度为4mM。
[0049] 检测步骤如下：
[0051] (2)逆转录反应如下：
[0052] 反应体系为总RNA 5μg，随机六聚体引物1μL，RNase free水至总体积12μL，离心混匀后，70℃反应5分钟，立即置于冰上冰浴5分钟；依次加入以下各成分，逆转录缓冲液4μl，10mM dNTP Mix 2μL，RNA酶抑制剂(20U/μL)1μL，稍离心混匀各成分，37℃反应5分钟；加逆转录酶(200U/μL)1μL，42℃反应60分钟；72℃10分钟灭活逆转录酶。迅速置于冰浴中5分钟，反转录得到的cDNA可以-20℃保存。
[0053] (3)分别将已知拷贝数的ATCB、ERCC1、RRM1、TUBB3和TYMS基因标准品梯度稀释至6 5 4 3 2
10、10、10、10、10拷贝数/μL；
10、10、10、10、10拷贝数/μL；
[0054] (4)分别以步骤(2)所得的cDNA和以步骤(3)梯度稀释的基因标准品为模板，加入引物、探针、实时荧光定量PCR MIX反应液、去离子水建立反应体系；
[0055] 引物序列如下：
[0056] ERCC1-F 5’-ATGGCCCTCACGGAGTTTTGT-3’
[0057] ERCC1-R 5’-CATCTGGGCACTGAAAGGGA-3’
[0058] RRM1-F 5’-ACTAGCTGATGCATGTGA-3’
[0059] RRM1-R 5’-TCCATAACAAATTCTGGATTCG-3’
[0060] TUBB3-F 5’-GCGGGAGGGATTTGGATT-3’
[0061] TUBB3-R 5’-GGAAGGGTGGTTCCAGGC-3’
[0062] TYMS-F 5’-GAGGCGGTGGAGCACATTT-3’
[0063] TYMS-R 5’-CGTTTGTTGTGAGCAGAGG-3’
[0064] ATCB-F 5’-CCGACTTCCCCTCCATAGT-3’
[0065] ATCB-R 5’-AGGGTGCGGATGCCTCTCTT-3’
[0066] 探针序列如下：
[0067] ERCC1-5’-R-ACGCCCTAGCTCACTCCCCT-Q-3’
[0068] RRM1-5’-R-GCCGCCAAGAAAGTCATGTTTGA-Q-3’
[0069] TUBB3-5’-R-AAAGTTGTCTGGCTCCAA-Q-3’
[0070] TYMS-5’-R-CTGGCACCTGTCGGTGTT-Q-3’
[0071] ATCB-5’-R-CCCCACGAACCAGGGCGTGA-Q-3’
[0072] 反应体系为：实时荧光定量PCR Mix反应试剂10μL、引物2μL、探针0.5μL、模板1μL、去离子水6.5μL，组成共20μL体系。
[0073] 反应条件：使用ABI公司的7500PCR基因扩增仪，反应程序为：
[0074] 95℃，5min，1个循环；
[0075] 95℃，15s→60℃，60s，40个循环。
[0076] (5)检测结果分析：根据检测模板的循环阈值(Ct值)与该模板的初始拷贝数(Copies)的对数存在线性关系，将各个标准品的初始拷贝数取对数作为横坐标，将其所对应的循环阈值为纵坐标，做出相应的标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值对其含有的目标基因的初始拷贝数进行分析，从标准曲线上读取其含有的目标基因的初始拷贝数。
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