技术领域：

本发明为一个多组织广泛表达，能够诱导白血病细胞凋亡的肿瘤抑制基因/蛋白(命名为 NECL2基因/蛋白)，涉及生物医学高技术中新基因、新蛋白质的开发与应用领域。

发明背景：

周严等人应用TBLASTN程序，将Glycophorin C胞内区46个氨基酸查询比对EST数据库， 找到一些人EST，其编码区域与Glycophorin C胞内区具有一定的相似性。利用这些EST作为 探针，分别筛选用随机引物构建的成人脑cDNA文库和人胎肝cDNA文库，拼接并测序筛选所 得的阳性克隆，最后得到两个新的人cDNA序列，GenBank接受号分别为AF062733和 AF138903。它们都编码单跨膜蛋白，胞外区具有三个免疫球蛋白结构域，胞内区很短，与 Glycophorin C的胞内区有一定的同源性。由于这两个蛋白与免疫球蛋白超家族中的Nectin家族 成员的结构非常相似，因此分别命名为NECL1(Nectin Like Protein 1)和NECL2(Nectin Like Protein 2)。

经表达谱分析发现，NECL1以脑组织表达为主，NECL2则是多组织广泛表达。

目前研究主要集中于探讨NECL1、NECL2在神经系统分化和肿瘤抑制过程中的功能。 Thomas Biederer等人研究发现，NECL2是一个参与神经细胞突触形成的粘附分子。其对称分布 于突触前后膜，形成同源亲和反式相互作用，促进突触的形成及结构的稳定；在与原代培养神 经元共培养的人胚肾293细胞中，转染NECL2全长真核表达克隆，能够促进非神经细胞来源的 293细胞长出具有功能的突触结构。Murakami等人通过表观遗传学研究发现，NECL2是一个肿 瘤抑制基因，由于杂合子缺失或者其上游启动子区域中CpG岛发生甲基化，导致NECL2在多 种肿瘤细胞中表达下调或缺失，如非小细胞肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、鼻咽癌、 子宫颈癌和胰腺癌等。

但至今为止尚无有关NECL2在白血病细胞中具有肿瘤抑制、诱导凋亡功能的研究报道。

发明目的：

克隆在神经细胞分化和肿瘤细胞凋亡过程中可能起重要作用的基因NECL2，表达其编码的 蛋白质，阐明其生理生化功能，寻找其相互作用蛋白，更清楚的了解NECL2诱导白血病细胞凋 亡功能中的分子机制，从而为白血病的基因诊断和基因治疗以及新药筛选提供可能的目标基因。

内容与要求：

应用基因组信息学原理、分子克隆、cDNA文库筛选、DNA序列测定技术、Northern印 迹杂交、蛋白质表达与纯化技术、抗血清制备、细胞免疫共沉淀、亲和层析、Western blot检 测、细胞培养技术、流式细胞术、DNA片段化凋亡分析技术、酵母双杂交筛选技术以及细胞免 疫荧光和激光共聚焦显微技术等，克隆鉴定编码NECL2蛋白的新基因全长cDNA，通过 Northern印迹杂交进行组织表达谱分析，纯化原核表达的目标蛋白质并免疫家兔制备抗血清， 进而进行免疫组织化学分析，利用流式细胞术和DNA片段化凋亡分析研究NECL2诱导白血病 细胞凋亡现象，运用酵母双杂交筛选技术寻找NECL2的相互作用蛋白，综合运用亲和层析、细 胞免疫共沉淀以及细胞免疫荧光和激光共聚焦显微技术确定肿瘤抑制基因NECL2与cLIP之间 的相互作用。

该基因/蛋白达到的技术指标为：

1.NECL2基因的cDNA序列全长为3512bp，GenBank接收号为AF138903。此序列有 一个1329bp的开放阅读框架，编码一个442个氨基酸的蛋白质。

2.NECL2蛋白结构为：氨基端免疫球蛋白结构域，单跨膜区和一个短的胞内区。

3.NECL2是一个多组织广泛表达的基因，在脑、心、肝、骨骼肌、肾等组织中均有表 达。(见图2)。

4.NECL2基因的胞内区46个氨基酸于大肠杆菌中获得明显表达，经亲和层析纯化后的 产物免疫家兔，制备了高滴度抗NECL2蛋白抗体。

5.NECL2在神经系统中多个部位表达，定位于大脑皮层，海马多形性细胞层，齿状回， 小脑蒲肯野细胞层，脑桥面神经核和脊髓前角运动神经元。(见图4)。

6.NECL2能够诱导白血病细胞NB4发生凋亡。(见图5，图6)。

7.NECL2蛋白可以与cFLIP相互作用(见图7，图8，图9)

附图说明：

图1.NECL2的亲疏水性及组件结构分析

结果显示：结构为：胞外区有三个免疫球蛋白结构域，一个单跨膜区和短的胞内区。第1-44 氨基酸残基为信号肽，第375-396氨基酸残基为跨膜区，三个免疫球蛋白结构域分别位于 氨基酸残基第57-126，159-222和260-315。

图2.NECL2基因小鼠多组织表达谱的Northern印迹分析结果

上图：1心，2脑，3脾，4肺，5肝，6骨骼肌，7肾，8睾丸；下图：β-actin对照 结果显示：在8种成年小鼠组织中，以组成性表达的β-actin为参照，脑、肝、肺、骨骼 肌、睾丸组织有较高水平的NECL2基因表达，心脏组织表达水平较低，其余组织均为阴性。

图3.免疫组化方法检测NECL2蛋白在鼠中枢神经系统的分布

A.大脑皮层，B.海马，C.小脑，D.纹状体，E.脑桥，F.脊髓

结果显示：NECL2主要分布于大脑皮层，海马多形性细胞层，齿状回，小脑蒲肯野细胞层， 纹状体、脑桥面神经核和脊髓前角运动神经元。

图4.DNA片段化实验检测NECL2诱导白血病细胞NB4凋亡

结果显示，在DNA片段化分析中，转染真核表达克隆pcDNA3.1(+)-NECL2的NB4细胞，

在转染36小时后开始出现典型的DNA片段化(DNA laddering)现象，而转染空质粒细胞的 基因组DNA完整无变化。

图5.流式细胞术检测NECL2诱导白血病细胞NB4凋亡

结果显示：在阳性对照组，用已知的白血病细胞凋亡诱导剂三氧化二砷处理细胞，出现了 典型的凋亡现象，即在正常的二倍体峰前出现一个亚二倍体峰；转染空载体的阴性对照组 未出现此现象；而转染真核表达克隆pcDNA3.1(+)-NECL2的NB4细胞，出现了类似阳性 对照组的现象，在正常的二倍体峰前出现了一个亚二倍体峰。

图6.GST-pull down实验检测NECL1、NECL2和NECL5与cFLIP(L)之间的相互作用 结果显示：阴性对照组泳道未检测到任何条带，说明GST融合蛋白中的GST蛋白及 Sepharose 4B球珠不会与cFLIP(L)蛋白相互作用；阳性对照组，即经检测证实表达cFLIP(L) 的293ET细胞的裂解液泳道，出现了55kDa左右大小的条带，与检测的cFLIP(L)蛋白大小 一致，说明实验条件及操作正常；加入了NECL1、NECL2和NECL5胞内区蛋白的实验组 泳道也在55kDa附近出现条带，说明在体外NECL1、NECL2和NECL5的胞内区能够与 cFLIP(L)结合。

图7.细胞免疫共沉淀方法检测NECL2和cFLIP(L)之间的相互作用 结果显示，阴性对照组泳道未检测到任何条带，说明Sepharose 4B球珠不会与NECL1、 NECL2蛋白相互作用；而实验组中所检测到的条带，分别和细胞裂解液中所检测的60kDa 左右大小的NECL1蛋白，以及80kDa左右大小的NECL2蛋白大小一致，说明在体内 NECL1、NECL2能够与cFLIP(L)结合。

图8.细胞免疫荧光方法观察NECL2与cFLIP(L)、cFLIP(S)之间的共定位情况 结果显示：NECL2和cFLIP(L)，以及NECL2和cFLIP(S)，在细胞内表达部位都有重叠， 存在共定位，而且浓聚于相邻细胞接触的胞膜处，NECL2具有将cFLIP(L)、cFLIP(S)募集 到细胞膜的趋势，这为它们之间的相互作用提供了形态学证据。

实施例：

1，RNA的制备和Northern印迹分析

取成年大鼠一只。引颈处死后，快速切取约100μg的睾丸、肌肉、肠、肝、脾、脑、心、 肾组织，装入1.5ml离心管，纱布包裹后迅速液氮冷冻。然后用钝器砸碎，称取100μg组织加 入有1ml Trizol试剂(Life Technologies)的微量组织匀浆器中，按照Trizol试剂说明所述提 取总RNA。

采用甲醛变性的1％琼脂糖凝胶电泳，每个泳道上样所提组织总RNA 25μg，电泳结束 后，用DEPC处理过的水淋洗凝胶数次，50mM的NaOH处理20min以水解RNA，无RNA酶 的水淋洗数次，并用20X SSC浸泡凝胶45min，用20X SSC转膜16-20h，转移结束后，于6X SSC中漂洗滤膜，晾干，80℃干烤固定1-2h。室温存放待杂交用。

用PCR扩增rtSH3p13片段，扩增片段的回收、定量，探针标记DNA用量为25ng，采用随 机引物标记试剂盒(Boehringer Mannheim)对探针进行放射性标记，杂交液使用Clontech 公司Express Hyb TM Hybridization Solution。将杂交液68℃预热，使液体均匀。将Northern 膜放入6X SSC中浸湿，然后置于杂交管中。固定有核酸的一面朝上，膜与杂交管之间勿留气 泡，加入5ml杂交液，68℃预杂交30min。将标记探针于100℃处理10min，然后冰浴10min， 继而与预热的杂交液混匀，加到杂交管中。68℃杂交1-2h。杂交结束后，小心将膜自杂交管 中取出。置于2XSSC/0.5％SDS中室温洗三次，每次15min。然后再用0.1XSSC/0.1％SDS 68 ℃洗膜两次，每次20min。将湿膜置于保鲜膜内，压X光胶片，-70℃曝光(图2)。

2.脑、脊髓组织切片的免疫组织化学分析

5μm厚脑、脊髓组织冰冻切片，改良Bouin液固定10min。PBS洗2次，每次5min。 3％H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。5-10％正常羊血清(PBS配)， 室温封闭10min。倾去血清，滴加适当稀释的抗rtSH3p13血清，4℃过夜。PBS洗3次，每次 5min。滴加适当稀释的生物素标记二抗，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。滴加 适当稀释的辣根过氧化物酶标记的链亲和素，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。AEC 显色(4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml 0.1M乙酸缓冲液，pH5.2，加入15μl 30％ H2O2，过滤后即可)40min。自来水充分冲洗，苏木素复染，封片。(图3)

3.DNA片段化与流式细胞术进行细胞凋亡分析

DNA片段化分析的过程主要是：取5×106细胞，加入裂解液300～500μl，37℃ 6hr以上。 加入5MNaCl(一般的，500μl裂解液加150μl Nacl)，使终浓度为1.5M，振荡后静置10min。 室温1,2000rpm×20min，小心吸取上清。上清1,2000rpm×10min。吸上清至一倍体积的100％ 无水乙醇中，沉淀过夜(2hr以上)。4℃ 1,2000rpm×5min，70％乙醇洗一遍。溶于20μl TE， 加入0.2mg/ml RNa.se，37℃ 2hr。2％琼脂糖凝胶电泳，50v 2hr。(图4)

PI染色流式细胞仪测定细胞凋亡率的过程主要是：收集处理过的约106个细胞，1000rpm 离心5分钟，PBS(pH7.4)洗涤2遍，加入70％乙醇1ml，-20℃固定12小时以上。1000rpm离 心5分钟去上清，PBS洗涤2遍后，用0.5mlPBS重悬细胞，加入PI(终浓度为50ug/ml)和RNase(终 浓度为0.25mg/ml)，室温下避光孵育30分钟后，流式细胞仪检测。(图5)

4.亲和层析(Pull down试验)结合Western Blot检测NECL2与cFLIP的相互作用

取含309μg重组GST-NECL2-C末端融合蛋白溶液和GST蛋白溶液分别与100μl谷胱苷肽 凝胶珠混合，4℃孵育2-3 h后加到分离柱中，使管内液体自然流出。用含1％ TritonX-100的PBS 漂洗柱子三次后，用RIPA缓冲液平衡柱子。向两个柱子中分别加入1ml表达cFLIP的293ET细胞 裂解液，用盖子封上柱子两端，混悬管内谷胱苷肽凝胶珠和提取液，4℃慢摇3h。固定分离柱， 打开两端盖子，让液体自下端流出。用含1％TritonX-100的PBS漂洗柱子三次。

将柱内凝胶珠移至1.5ml离心管，加入1XSDS/PAGE上样缓冲液200μl，悬浮凝胶珠，100℃ 煮沸10分钟，取20μl行12％SDS-PAG电泳。SDS-PAGE结束后，将塑料支架平放，依次放置 海绵垫、3层滤纸、凝胶、NC膜、3层滤纸、海绵垫，赶走各层间气泡，夹好支架，在冰浴中进行 电转，40V，8-10h；或100V，1h 20min(PVDF膜需经100％甲醇浸透，电转液平衡20min后方可 使用)。电转结束后，将膜置于去离子水中漂洗5min。切下边侧的蛋白质分子量Marker条带，浸 入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后10％乙酸脱色至可见蛋白质条带，蒸馏水漂洗观察转移效果， 并密封保存留待以后作为分析结果时分子量的参照。转移的滤膜勿干，准备用于杂交。将做好标记 的滤膜经TBS漂洗后，加入适量封闭液(含5％脱脂奶粉、1％正常马血清的TBS-T溶液)中， 室温轻摇2h。将滤膜放入杂交袋内，按照0.1ml/cm2加入1∶1000的一抗(抗synaptoianin I抗 体，羊IgG)，抗体的稀释度遵循提供者建议。除尽气泡，封口。于4℃轻摇过夜。取出滤膜，用 TBS-T洗三次，每次10min。将膜放入塑料袋内，按照0.1ml/cm2加入碱性磷酸酶标记的抗羊血清。 赶除气泡，封口。室温振荡2h。取出滤膜，用TBS-T洗三次，每次10min。用显色缓冲液(100mM NaCl，5mM MgC12，100mM Tris-HCl pH9.5)洗膜5 min。将滤膜浸入含100μl Reagent A与100μl Reagent B(Bio-Rad)的10ml显色缓冲液中，于室温下轻轻摇晃使蛋白质条带显现，蒸馏水中漂 洗，4℃避光保存并扫描(图6)。

5.细胞免疫共沉淀方法检测NECL2与cFLIP的相互作用

细胞的转染，转染前两天将75cm2培养瓶中处于对数生长期的细胞以1∶3传入75cm2培养 瓶中继续培养。待细胞长至70～80％时，用威格拉斯转染试剂转染质粒。转染后48小时收集细 胞。75cm2培养瓶转染DNA总量为25μg，威格拉斯转染试剂用量为10μl，转染时培养液体 积10ml。细胞的裂解，用PBS轻柔洗涤细胞三次，尽量吸净残余PBS洗液。每瓶中加入1.5ml 冰预的裂解液，放置冰上裂解1小时。用细胞刮将细胞裂解物刮下于4℃ 14000rpm离心20分 钟后收集上清进行后续实验或冻存于-70℃。免疫共沉淀，1ml细胞裂解液中加入40μl 50％ Protein G/A agarose，4℃振摇3小时以除去非特异吸附的蛋白质。12000rpm离心20秒收集 上清。加适量的抗体(单抗10μg，多抗10μl)到1ml上清中，4℃振摇1小时后再追加 50μl 50％Protein G/A agarose，继续振摇1小时(Protein G/A agarose在加入体系中 以前需用PBS洗涤1-2遍，去除游离的ProteinG/A。使用兔多克隆抗体进行沉淀时选用Protein A agarose，使用鼠单克隆抗体进行沉淀时选用Protein G agarose)。洗涤用细胞裂解液洗涤 免疫沉淀物3～5次，最后尽量去除残余的洗涤液，加入50μl 2×SDS上样缓冲液，沸水煮5 分钟，离心后上清即可进行SDS-PAGE。(有时使用上样缓冲液沸水煮会导致Protein A/G从偶 联的Argrose上脱落，Western检测会在大约33KDa处出现条带，对实验结果产生影响。为避 免这种影响，可采用酸洗脱法，洗脱缓冲液配方见注。洗脱后加入1/5~1/10体积的2M Tris-base 中和)Western Blot检测。(图7)

6.细胞免疫荧光激光共聚焦显微镜观察NECL2与cFLIP共定位情况

将NECL2克隆入pEGFPN1(Clontech公司)构建融合绿色荧光蛋白表达载体，并对重组质 粒进行测序鉴定。将上述重组载体和空载体分别转入293ET细胞，进行Wεστερv和细胞荧光检 测，确认融合蛋白得到表达。

将盖玻片分次置于浓酸中浸泡2小时，用去离子水洗净后室温干燥。将经酸处理的盖玻片 置于10倍稀释的多聚赖氨酸溶液中，室温放置5分钟后取出，置于60℃干燥1小时或室温过 夜。用前将盖玻片浸泡于75％乙醇中至少30分钟。

实验前两天将处理过的盖玻片放置于6孔培养板板中，将处于对数生长期的CHO细胞接种 子6孔板中，每孔3×105个细胞，37℃，5％CO2培养至70％饱和度。用50μl无抗生素无血 清DMEM分别稀释3μg质粒和3.5μl Lipofectamine2000。室温放置2分钟后将稀释的质粒和 Lipofectamine 2000混匀，室温放置20分钟。将上述混合物滴加到6孔培养板中，37℃，5％CO2孵箱中继续培养。

细胞免疫荧光染色：1)细胞固定：用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体 吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10分钟。2)PBS漂洗，3×5分钟。3)细胞透化：室温 下，0.5％Triton/PBS透化处理10分钟。4)PBS漂洗，3×5分钟。5)细胞封闭：以3％BSA/PBS 封闭，37℃，30分钟或4℃过夜。6)一抗孵育抗体按1∶100稀释，37℃，30分钟。7)PBS 漂洗，3×5分钟。8)二抗孵育抗体按1∶50稀释37℃，30分钟。9)PBS漂洗，3×5分钟。 10)去离子水漂洗，2×5分钟。11)封片：取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一 面朝下封片，周围用指甲油封住。12)用激光共聚焦显微镜观察(图8)。

7.全长 NECL2 cDNA序列及其编码蛋白质的氨基酸序列：

1   ATGGCGAGTGTAGTGCTGCCGAGCGGATCCCAGTGTGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCG

1    M  A  S  V  V  L  P  S  G  S  Q  C  A  A  A  A  A  A  A  A

61  CCTCCCGGGCTCCGGCTCCGGCTTCTGCTGTTGCTCTTCTCCGCCGCGGCACTGATCCCC

21   P  P  G  L  R  L  R  L  L  L  L  L  F  S  A  A  A  L  I  P

121 ACAGGTGATGGGCAGAATCTGTTTACGAAAGACGTGACAGTGATCGAGGGAGAGGTTGCG

41   T  G  D  G Q  N  L  F  T  K  D  V  T  V  I  E  G  E  V  A

181 ACCATCAGTTGCCAAGTCAATAAGAGTGACGACTCTGTGATTCAGCTACTGAATCCCAAC

61  T  I  S Q  V  N  K  S  D  D  S  V  I  Q  L  L  N  P  N

241 AGGCAGACCATTTATTTCAGGGACTTCAGGCCTTTGAAGGACAGCAGGTTTCAGTTGCTG

81   R  Q  T  I  Y  F  R  D  F  R  P  L  K  D  S  R  F  Q  L  L

301    AATTTTTCTAGCAGTGAACTCAAAGTATCATTGACAAACGTCTCAATTTCTGATGAAGGA

101     N  F  S  S  S  E  L  K  V  S  L  T  N  V  S  I  S  D  E  G

361    AGATACTTTTGCCAGCTCTATACCGATCCCCCACAGGAAAGTTACACCACCATCACAGTC

121     R  Y  F Q  L  Y  T  D  P  P  Q  E  S  Y  T  T  I  T  V

421    CTGGTCCCACCACGTAATCTGATGATCGATATCCAGAGAGACACTGCGGTGGAAGGTGAG

141     L  V  P  P  R  N  L  M  I  D  I  Q  R  D  T  A  V  E  G  E

481    GAGATTGAAGTCAACTGCACTGCTATGGCCAGCAAGCCAGCCACGACTATCAGGTGGTTC

161     E  I  E  V  N T  A  M  A  S  K  P  A  T  T  I  R  W  F

541    AAAGGGAACACAGAGCTAAAAGGCAAATCGGAGGTGGAAGAGTGGTCAGACATGTACACT

181     K  G  N  T  E  L  K  G  K  S  E  V  E  E  W  S  D  M  Y  T

601    GTGACCAGTCAGCTGATGCTGAAGGTGCACAAGGAGGACGATGGGGTCCCAGTGATCTGC

201     V  T  S  Q  L  M  L  K  V  H  K  E  D  D  G  V  P  V  I

661    CAGGTGGAGCACCCTGCGGTCACTGGAAACCTGCAGACCCAGCGGTATCTAGAAGTACAG

221     Q  V  E  H  P  A  V  T  G  N  L  Q  T  Q  R  Y  L  E  V  Q

721    TATAAGCCACAAGTGCACATTCAGATGACTTATCCTCTACAAGGCTTAACCCGGGAAGGG

241     Y  K  P  Q  V  H  I  Q  M  T  Y  P  L  Q  G  L  T  R  E  G

781    GACGCGCTTGAGTTAACATGTGAAGCCATCGGGAAGCCCCAGCCTGTGATGGTAACTTGG

261     D  A  L  E  L  T E  A  I  G  K  P  Q  P  V  M  V  T  W

841    GTGAGAGTCGATGATGAAATGCCTCAACACGCCGTACTGTCTGGGCCCAACCTGTTCATC

281     V  R  V  D  D  E  M  P  Q  H  A  V  L  S  G  P  N  L  F  I

901    AATAACCTAAACAAAACAGATAATGGTACATACCGCTGTGAAGCTTCAAACATAGTGGGG

301     N  N  L  N  K  T  D  N  G  T  Y  R E  A  S  N  I  V  G

961    AAAGCTCACTCGGATTATATGCTGTATGTATACGATCCCCCCACAACTATCCCTCCTCCC

321     K  A  H  S  D  Y  M  L  Y  V  Y  D  P  P  T  T  I  P  P  P

102    ACAACAACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCATCCTTACCATCATCACAGAT

341     T  T  T  T  T  T  T  T  T  T  T  T  T  I  L  T  I  I  T  D

1081   TCCCGAGCAGGTGAAGAAGGCTCGATCAGGGCAGTGGATCATGCCGTGATCGGTGGCGTC

361     S  R  A  G  E  E  G  S  I  R  A  V  D  H  A  V  I  G  G  V

1141   GTGGCGGTGGTGGTGTTCGCCATGCTGTGCTTGCTCATCATTCTGGGGCGCTATTTTGCC

381     V  A  V  V  V  F  A  M  L  C  L  L  I  I  L G  R  Y  F  A

1201   AGACATAAAGGTACATACTTCACTCATGAAGCCAAAGGAGCCGATGACGCAGCAGACGCA

401     R  H  K  G  T  Y  F  T  H  E  A  K  G  A  D  D  A  A  D  A

1261   GACACAGCTATAATCAATGCAGAAGGAGGACAGAACAACTCCGAAGAAAAGAAAGAGTAC

421     D  T  A  I  I  N  A  E  G  G  Q  N  N  S  E  E  K  K  E  Y

1321   TTCATCTAG

441     F  I  *