治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法
阅读：6发布：2021-02-04
专利汇可以提供治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且用于 治疗 血友病的治疗产品或者药物可以通过包括如下的简单方法生产：将用于治疗血友病的凝血因子VIII(IX)的基因埋入由表达具有粒子形成能 力 的蛋白获得的空 纳米粒子 中，所述蛋白为真核细胞中的诸如乙型 肝炎 病毒表面 抗原 蛋白。如此产生的药物能够将凝血因子的基因有效地最小 副作用 危险地引入 肝细胞 。，下面是治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法专利的具体信息内容。
1.用于治疗血友病的治疗产品，包括
由显示出粒子形成能力的蛋白形成的中空纳米粒子；以及
包埋入所述中空纳米粒子的用于治疗血友病的基因。
2.用于治疗血友病的治疗产品，包括
由引入生物识别分子到在真核细胞中表达蛋白获得的蛋白粒子中 形成的中空纳米粒子；以及包埋入所述中空纳米粒子的用于治疗血友病的基因。
3.根据权利要求2的治疗血友病的治疗产品，
其中
所述真核细胞是酵母或者重组体酵母。
4.根据权利要求2的治疗血友病的治疗产品，
其中
所述真核细胞是昆虫细胞。
5.根据权利要求2的治疗血友病的治疗产品，
其中
所述真核细胞是动物细胞。
6.根据权利要求1到5任一项的用于治疗血友病的治疗产品，其 中
所述显示出粒子形成能力的蛋白是乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。
7.根据权利要求1到6任一项的用于治疗血友病的治疗产品，其 中
所述用于治疗血友病的基因是凝血因子VIII或者IX。
8.根据权利要求1到7任一项的用于治疗血友病的治疗产品，其 由
治疗产品通过静脉注射被施用于人体。
9.治疗血友病的方法，包括施用权利要求1到8任一项的治疗 产品。
技术领域
本发明涉及利用中空纳米粒子治疗血友病的治疗产品(药物)以及 利用其治疗血友病的方法。尤其是，本发明涉及含有装入用于转入细 胞的粒子中的物质的治疗产品(药物)，所述物质可以特异性导入细胞 中用于血友病治疗，本发明还涉及利用该产品治疗血友病的方法。
本申请要求2003年3月17提交的日本专利申请2003-071788的优先 权，在此处引入作为参考。
背景技术
在近年来医学领域，研制直接作用于感染位点显示高治疗效果又 具有较少副作用的药物正在活跃地进行当中。尤其是，称作药物递送 系统(DDS)的方法作为特异性转运有效组分诸如药物的有效组分到靶 细胞或者组织使得组分作用于目标位点的方法正在吸引人们的广泛关 注。
另一方面，在近几年来的分子细胞生物学领域，对基因转移到指 定细胞的研究也正在成为不可或缺的技术。而且，随着人类基因组计 划的进展，各种疾病的遗传背景已经变得不再神秘。因此，如果显示 出对于这些细胞或者组织高特异性的基因转移方法目前已被建立，将 该方法应用于基因治疗领域将成为可能。
在将基因引入细胞的方法中，已知存在将基因转入大分子然后通 过内吞作用吸入细胞的方法(磷酸钙法或者ripofectomaine法)以及将电 脉冲刺激施加于细胞膜使其通透从而使基因被吸入细胞的方法(电穿孔 法或者基因枪方法)。这两种方法目前都被应用于分子生物学实验中。
这些方法虽然简单，但是易于直接物理性损伤细胞。而且，基因 转移的位点必须通过外科方法暴露。为此，该方法不能轻易地施加于 活体的细胞或者组织。此外，它难以实现接近100％的转移率。
还有已知作为将物质较安全引入的脂质体方法。该方法可应用于 活体的细胞或者组织因为其不损伤细胞。然而，该方法存在的问题是 它难以对单纯脂质的脂质体上的细胞或者组织赋予高特异性，而且体 内基因转移率比期待值要显著低。
近来发展了一种将目的基因掺入病毒DNA产生感染性病毒以便影 响基因导入的技术。本方法作为用于基因治疗多种遗传以及获得性疾 病的划时代的方法吸引了广泛关注，因为该方法不用将转移位点暴露 在外，可以应用于个体并且具有接近100％的转移效率。
例如，血友病为由于缺乏凝血因子以出血作为主要症状的遗传性 疾病。人们注意到血友病A由缺乏凝血因子VIII(抗血友病因子)引起， 而且血友病B由缺乏凝血因子IX(克里斯马斯氏因子)引起。血友病A以 及血友病B分别由X染色体上因子VIII以及IX的基因失调引起。通常， 通过静脉注射VIII(IX)因子药物的补充治疗被用于血友病患者。在这 一点上，为了恒量表达接近生理水平量的凝血因子VIII(IX)，例如在 日本专利公开2002-527493中提出了制备包括编码因子VIII的序列的腺 伴随载体以及将如此制备的载体施用于血友病A患者的技术。
然而，采用病毒DNA的基因转移的严重问题在于病毒非特异性感 染多种细胞，因此基因被引入除了靶细胞以外的其他细胞。还有一种 可能就是病毒基因组本身被整合到染色体引起将来无法预料的副作 用。而且，因为病毒缺乏细胞或者组织特异性，如果VIII因子将被表 达于肝中，必须将载体施用于例如门静脉，或者根据组织学类型连接 编码因子VIII的序列和特异性转录的控制序列。
本发明者也在日本公开特许公告2001-316298中提出了利用蛋白 的中空纳米粒子特异性安全地将诸如基因，蛋白或者化合物的物质转 运以及引入靶细胞或者组织的方法，所述蛋白显示出粒子形成能力并 且向其中引入了生物识别分子。
根据公开在日本公开特许公告2001-316298中技术，借助于中空 纳米粒子可以转运多种物质。现在有责任进一步开发利用该技术治疗 特定疾病诸如血友病的药物。
发明公开
鉴于上述本领域的发展状况，本发明的目的是提供治疗血友病的 药物，其中凝血因子的基因可以通过简单的引入方法被有效地引入肝 细胞，同时具有最小的副作用，以及利用该药物治疗血友病的方法。
本发明者已经进行了长久的研究，并且通过静脉内注射包含凝血 因子VIII以及IX的基因的乙型肝炎病毒表面抗原粒子的实验到植入了 人肝癌细胞的试验动物，发现基因可以特异性引入来源于人肝脏的组 织部分表达凝血因子从而产生治疗血友病的有利结果。该发现完成了 本发明。
根据本发明，提供了用于治疗血友病包括由显示出粒子形成能力 的蛋白形成的中空纳米粒子以及用于治疗血友病埋入中空纳米粒子的 基因的药物。
根据本发明，提供了用于治疗血友病的药物，包括由引入生物识 别分子到蛋白粒子形成的中空纳米粒子以及用于治疗血友病，埋入中 空纳米粒子的基因，所述蛋白粒子获得自真核细胞中表达的蛋白。
形成粒子的蛋白可以例如为乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。当表达 在真核细胞中时，蛋白作为膜蛋白表达并且聚集在泡囊膜上并作为粒 子释放。如此产生的中空纳米粒子能够识别肝细胞并特异性地转运粒 子中的物质到肝细胞，以便通过埋入用于血友病治疗的基因，具体为 凝血因子VIII或者IX于中空粒子中，这些基因可以特异性表达在肝细 胞中。
用于本发明治疗的药物可以通过静脉注射的简单方法有效地治疗 血友病并可以直接最小副作用危险地用于临床应用。
根据本发明用于治疗血友病的方法通过施用用于治疗本发明的血 友病的药物治疗血友病。
本发明的其它目的以及优点根据其下列优选实施方案的说明特别 是结合附图将变得更加显而易见。
另一方面，在近几年来的分子细胞生物学领域，对基因转移到指 定细胞的研究也正在成为不可或缺的技术。而且，随着人类基因组计 划的进展，各种疾病的遗传背景已经变得不再神秘。因此，如果显示 出对于这些细胞或者组织高特异性的基因转移方法目前已被建立，将 该方法应用于基因治疗领域将成为可能。
在将基因引入细胞的方法中，已知存在将基因转入大分子然后通 过内吞作用吸入细胞的方法(磷酸钙法或者ripofectomaine法)以及将电 脉冲刺激施加于细胞膜使其通透从而使基因被吸入细胞的方法(电穿孔 法或者基因枪方法)。这两种方法目前都被应用于分子生物学实验中。
这些方法虽然简单，但是易于直接物理性损伤细胞。而且，基因 转移的位点必须通过外科方法暴露。为此，该方法不能轻易地施加于 活体的细胞或者组织。此外，它难以实现接近100％的转移率。
还有已知作为将物质较安全引入的脂质体方法。该方法可应用于 活体的细胞或者组织因为其不损伤细胞。然而，该方法存在的问题是 它难以对单纯脂质的脂质体上的细胞或者组织赋予高特异性，而且体 内基因转移率比期待值要显著低。
近来发展了一种将目的基因掺入病毒DNA产生感染性病毒以便影 响基因导入的技术。本方法作为用于基因治疗多种遗传以及获得性疾 病的划时代的方法吸引了广泛关注，因为该方法不用将转移位点暴露 在外，可以应用于个体并且具有接近100％的转移效率。
例如，血友病为由于缺乏凝血因子以出血作为主要症状的遗传性 疾病。人们注意到血友病A由缺乏凝血因子VIII(抗血友病因子)引起， 而且血友病B由缺乏凝血因子IX(克里斯马斯氏因子)引起。血友病A以 及血友病B分别由X染色体上因子VIII以及IX的基因失调引起。通常， 通过静脉注射VIII(IX)因子药物的补充治疗被用于血友病患者。在这 一点上，为了恒量表达接近生理水平量的凝血因子VIII(IX)，例如在 日本专利公开2002-527493中提出了制备包括编码因子VIII的序列的腺 伴随载体以及将如此制备的载体施用于血友病A患者的技术。
然而，采用病毒DNA的基因转移的严重问题在于病毒非特异性感 染多种细胞，因此基因被引入除了靶细胞以外的其他细胞。还有一种 可能就是病毒基因组本身被整合到染色体引起将来无法预料的副作 用。而且，因为病毒缺乏细胞或者组织特异性，如果VIII因子将被表 达于肝中，必须将载体施用于例如门静脉，或者根据组织学类型连接 编码因子VIII的序列和特异性转录的控制序列。
本发明者也在日本公开特许公告2001-316298中提出了利用蛋白 的中空纳米粒子特异性安全地将诸如基因，蛋白或者化合物的物质转 运以及引入靶细胞或者组织的方法，所述蛋白显示出粒子形成能力并 且向其中引入了生物识别分子。
根据公开在日本公开特许公告2001-316298中技术，借助于中空 纳米粒子可以转运多种物质。现在有责任进一步开发利用该技术治疗 特定疾病诸如血友病的药物。
发明公开
鉴于上述本领域的发展状况，本发明的目的是提供治疗血友病的 药物，其中凝血因子的基因可以通过简单的引入方法被有效地引入肝 细胞，同时具有最小的副作用，以及利用该药物治疗血友病的方法。
本发明者已经进行了长久的研究，并且通过静脉内注射包含凝血 因子VIII以及IX的基因的乙型肝炎病毒表面抗原粒子的实验到植入了 人肝癌细胞的试验动物，发现基因可以特异性引入来源于人肝脏的组 织部分表达凝血因子从而产生治疗血友病的有利结果。该发现完成了 本发明。
根据本发明，提供了用于治疗血友病包括由显示出粒子形成能力 的蛋白形成的中空纳米粒子以及用于治疗血友病埋入中空纳米粒子的 基因的药物。
根据本发明，提供了用于治疗血友病的药物，包括由引入生物识 别分子到蛋白粒子形成的中空纳米粒子以及用于治疗血友病，埋入中 空纳米粒子的基因，所述蛋白粒子获得自真核细胞中表达的蛋白。
形成粒子的蛋白可以例如为乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。当表达 在真核细胞中时，蛋白作为膜蛋白表达并且聚集在泡囊膜上并作为粒 子释放。如此产生的中空纳米粒子能够识别肝细胞并特异性地转运粒 子中的物质到肝细胞，以便通过埋入用于血友病治疗的基因，具体为 凝血因子VIII或者IX于中空粒子中，这些基因可以特异性表达在肝细 胞中。
用于本发明治疗的药物可以通过静脉注射的简单方法有效地治疗 血友病并可以直接最小副作用危险地用于临床应用。
根据本发明用于治疗血友病的方法通过施用用于治疗本发明的血 友病的药物治疗血友病。
本发明的其它目的以及优点根据其下列优选实施方案的说明特别 是结合附图将变得更加显而易见。
附图说明
图1图示了根据本发明实施方案的HBsAg基因的不同蛋白区域。
图2图示了根据本发明的实施方案采用重组体酵母表达以及纯化 HBsAg粒子的操作。
图3显示了根据本发明的实施方案通过包含hFVIII基因的HBsAg 粒子表达凝血因子VIII的表达效果。
图4显示了根据本发明的实施方案通过包含hFIX基因的HBsAg粒 子表达凝血因子IX的效果。
本发明的最佳实施方案
体现本发明的中空纳米粒子将生物识别分子引入具有粒子形成能 力的蛋白使其可以特异性转运编码凝血因子VIII以及IX的基因到目的 细胞或者组织，例如到肝细胞或者肝脏组织。具有粒子形成能力的蛋 白可以例如是从多种病毒获得的亚病毒颗粒。蛋白例如可以是乙型肝 炎病毒(HBV)表面抗原蛋白。
由具有这种粒子形成能力的蛋白形成的蛋白粒子例如可以是通过 在真核细胞中表达蛋白获得的蛋白粒子。简而言之，如果具有粒子形 成能力的蛋白表达在真核细胞中，蛋白作为膜蛋白表达并且聚集在囊 泡膜上以便作为粒子释放。真核细胞例如可以是酵母，重组体酵母， 昆虫细胞以及动物细胞。
如随后实施例所述，本发明者发现并且报道，通过在重组体酵母 中表达上述的HBV表面抗原L蛋白，可以形成大量基本上呈椭圆形的 中空粒子，每一具有大约20nm的小头直径以及大约150nm的大头直 径，并且每一具有埋于酵母来源双脂质层中的HBV表面抗原L蛋白(J. Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992)。因为这些粒子既不包含 HBV基因组又不包含HBV蛋白并且由此不起病毒的作用，粒子对于人 体是非常安全的。而且，这些粒子显示特异于肝细胞的受体，该受体 位于其表面上对HBV的肝细胞显示极强的传染力，由此粒子显示出作 为特异性转运物质到肝细胞的转运工具的高效力。
利用重组体酵母形成蛋白粒子的方法很方便，因为粒子可以高效 地从细胞裂解物中的可溶性蛋白产生。
另一方面，采用昆虫细胞以及动物细胞的方法据报道是大量产生 外源蛋白所希望的方法因为这些细胞是比酵母细胞更接近于高等动物 细胞的真核细胞，并且因为昆虫细胞以及动物细胞能够再生酵母不能 再生的高位结构，诸如糖链。昆虫细胞的常规系统采用巴库洛病毒， 并且伴随表达病毒，因此在蛋白表达的时候细胞死亡或者溶解。因此， 存在的问题就是连续地进行蛋白表达或者通过从死细胞分离的蛋白酶 分解蛋白。而且，如果蛋白表达在分泌物上，培养基中所含的胎牛血 清大量地混合使其难以纯化粒子。然而，不采用巴库洛病毒并且可以 进行无血清培养的昆虫细胞系统近来已由Invitrogen公司开发，并且正 在进入销售。因此，借助于这种昆虫细胞系统，有可能获得可以及其 容易纯化并且可以再现高位结构的蛋白粒子。
借助本发明的中空纳米粒子，通过将上述各种方法获得的粒子表 面的受体改变为任选的生物识别分子，可以将物质极高特异性地转运 并且引入除了肝细胞外任选的细胞或者组织。
当然，显示出粒子形成能力的蛋白不局限于上述的乙型肝炎病毒 表面抗原蛋白，并且可以是来源于动物细胞，植物细胞，病毒或者细 菌或者任何多种合成蛋白的任一天然蛋白。如果例如是来源于病毒的 抗原蛋白可能诱导活体中的抗体，这种被修饰减小其抗原性的蛋白可 以用作生物识别分子。
被引入显示出粒子形成能力蛋白中的生物识别分子优选地例如为 生长因子，细胞功能调节分子，诸如细胞因子，细胞表面抗原，组织 特异性抗原，识别细胞或者组织的分子，诸如受体，来源于病毒以及 微生物的分子，抗体，糖链或者脂质。这些可以根据靶细胞或者组织 进行合适地选择以及应用。
根据本发明，编码凝血因子VIII以及IX，希望被引入任选的细胞 或者组织假若是肝细胞或者组织的基因被封入上述中空纳米粒子中产 生用于治疗血友病的物质转运工具。
为了将基因引入上述的中空纳米粒子，可以利用用于化学实验或 者分子生物学实验中的任何多种常规技术。这些方法的实例包括电穿 孔法，超声波法，单向扩散法或者采用电荷脂质的方法。
利用这些中空纳米粒子或者物质转运工具，将特定物质体内或者 体外转入细胞或者组织成为可能。此外，借助于中空纳米粒子或者物 质转运工具可以将物质引入特定细胞或者组织作为治疗各种疾病的方 法或者其中的一个步骤。
本发明的药物的效力实际上已经通过下面将要解释的实施例所述 的动物试验得以证实。在这些实施例中，包含编码凝血因子VIII以及IX 的本发明药物的效力通过如下方法得以证实：首先将药物施用于移植 有来源于人肝癌的细胞的裸鼠，然后测定血清中凝血因子VIII以及IX 的表达水平。虽然药物通过静脉内施用，药物也可以口服，肌内注射， 腹膜内或者皮下施用。
本发明现在将如同参考附图一样参考特定的实施例进行更详细的 解释。本发明不局限于下列实施例，并且可以包含各种变化，取代或 等效物，只要不背离在权利要求中限定的本发明的目的以及范围。
实施例
在该实施例中，下述的HBsAg表示乙型肝炎病毒表面抗原。具体 地，HBsAg是HBV.的外壳蛋白。参考图1的示意图，在HBsAg中有3个 蛋白，也就是S-蛋白，M-蛋白以及L-蛋白。其中，S-蛋白是为这3个 蛋白所共有的重要的外壳蛋白。M-蛋白是由55个氨基酸组成的前-S2 肽，并且其连接于S-蛋白的N-末端侧。L-蛋白是由108个或者119个氨 基酸组成的前-S1肽，并且其连接于M-蛋白的N-末端侧。这种L-蛋白 的碱基序列以及氨基酸序列分别由序列1以及2表示。
在已知的方法中，HBsAg的L-蛋白的前-S1结构域具有直接接合 肝细胞的位点并且当HBV结合于肝细胞时起重要的作用(Cell.Vol.46， 429-436，1986：J.of Virol.，Vol.73，2052-2057，1999)。
当蛋白HBsAg表达在真核细胞中时，蛋白作为膜蛋白表达并且聚 集在泡囊膜上。HBsAg的L-蛋白分子在絮凝期间絮凝在一起并且吸收 在泡囊膜中。HBsAg的L-蛋白的这种絮凝的分子作为粒子以出芽方式 释放在细胞腔侧。
在下述的实施例中，使用HBsAg的L-蛋白。图2图示了用于下列 实施例中描述的HBsAg粒子纯化的表达以及操作。
实施例1
由重组体酵母表达HBsA粒子
根据本发明者报道的文献J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953- 1961，1992，将具有L-蛋白表达质粒pGLDLIIP39-RcT的重组体酵母 (Saccharomyces Cerevisiae AH22R-菌株)培养在合成培养基High-Pi以及 855N-P400中表达L-蛋白粒子(图2a以及2b)。从稳定生长期(大约72小 时后)的重组体酵母，利用Pierce Chemicals有限公司生产的酵母蛋白质 提取试剂制备全细胞提取物。全细胞提取物中的蛋白由十二烷基硫酸 钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)彼此分离，并且通过银染色鉴定 样品中的HBsAg。以这种方式，HBsAg被证实是具有大约52kDa分子 量的蛋白。
实施例2
从重组体酵母纯化HBsAg粒子
(1)将培养在合成培养基855N-P400上的重组体酵母(湿重：26g)悬 浮在100ml的缓冲溶液A(7.5M尿素，0.1M磷酸钠(pH 7.2)，15mM EDTA，2mM PMSF以及0.1％吐温80)中，并且利用珠子搅拌器 (BEAD-BEATER)用玻璃珠对酵母进行匀浆化。匀浆化后，通过离心 回收上清液(图2c以及2d)。
(2)然后将上清液与0.75-倍体积的33％(wlw)PEG6OOO混合并且 用冰冷却产生的混合物30分钟。然后，在7000rpm离心30分钟后回收 沉淀。然后将沉淀重新悬浮在不含吐温80的缓冲液A溶液中。
(3)重新悬浮后将溶液在显示10到40％密度梯度范围的CsCl中进行 分层。然后将溶液在28000rpm超离心16小时。离心的样品分离成12级 分并且通过Western印迹法鉴定含HBsAg的级分，其中第一抗体是抗 HBsAg单克隆抗体。进一步，利用不含吐温80的缓冲液A溶液透析含 HBsAg的级分。
(4)在(3)中透析获得的溶液(12ml)在糖上分层，显示出从5到50％ 的密度梯度范围。然后将生成的物质在28000rpm超离心16小时。离心 后，像(3)一样鉴定含HBsAg的级分。含HBsAg的级分用不含尿素也不 含吐温80但是含0.85％NaCl的缓冲液A溶液进行透析(图2e中(2)到 (4))。
(5)重复以上(4)的类似操作。利用Advantec公司生产的超滤器 Q2000浓缩透析的样品，并保藏在4℃直至使用(图2f)。CsCl平衡离心 后Western印迹(3)的结果表明HBsAg是分子量为52kDa显示出S-抗原性 的蛋白。最终，约24mg的纯化HBsAg粒子可以从湿重26g来源于培养 基2.5L的细胞裂解物获得。
利用银染色SDS-PAGE分析来自纯化操作的序列的级分。另外， 为了证实酵母来源的蛋白酶已通过净化过程除去，将通过(5)获得的 HBsAg粒子培养在37℃12小时，并进行SDS-PAGE 12小时，继之以 SDS-PAGE，通过银染色进行鉴定。结果，证实来源于酵母的蛋白酶 在序列纯化步骤中被完全除去。
实施例3
将hFVIIJ以及hFIX基因封入HBsA粒子(制备包括hFVIII以及hFIX基因 埋入其中的HBsAg粒子)
将通过上述方法制备的HBsAg粒子中封入编码人凝血因子VIII (IX)的基因(hFVIII以及hFIX)作为治疗血友病的基因从而产生埋入基因 (hFVIII以及hFIX)的HBsAg粒子作为本发明的药物。
在本实施例中，由Torino大学的Dr.L.Naldini捐赠的 pRRLsin.cPPT.CMV.FVIII.Wpre以及pRRLsin.cPPT.Alb.FIX.Wpre (Human Gene Therapy，Vol.13，243-260，2002)被用作用于将hFVIJI 以及hFIX基因封入HBsAg粒子的表达载体。
具有hFVIII(hFIX)基因埋入其中的HBsAg粒子通过电穿孔法方将 上述表达载体引入HBsAg粒子进行制备。具体地，将20μg的上述表 达载体添加给溶于500μl的PBS(pH 7.2)的HBsAg粒子中的100μg的L- 蛋白粒子。利用4mm的样品池在Gene Pulser II电穿孔系统(由Bio-Rad 有限公司生产)上，于50V以及750μF进行电穿孔。
实施例4
由埋入hFVIII(hFIX)基因的HBsAg粒子在移植有人肝癌的裸鼠中表达 凝血因子VIII (IX)的效果
利用试验用动物检验由上述实施例制备的封入hFVIII(hFIX)基因 的HBsAg粒子表达凝血因子VIII(IX)的效果。
在本实施例中，将来源于人肝癌Nue的1×107个细胞施用于从 Nippon Clair有限公司购买的试验动物裸鼠(Balb/cnu/nu，雌性，5周龄) 的两侧背部皮下区域。饲养小鼠大约5到6周直到实体癌生长到约1cm 直径的大小产生患有癌症的小鼠。
埋入其中约20μg hFVIII(hFIX)基因表达载体的HBsAg粒子通过 尾部静脉施用于上述患癌小鼠，并且通过酶免疫分析(ELISA)测定血 液中凝血因子VIII(IX)的量随时间的变化。利用分别特异性于VIII以 及IX因子的Asserachom VIIIC：Ag试剂盒以及Asserachom IX：Ag试剂 盒(由Diagnostica Stago Inc生产)，进行ELISA。
使用施用来源于人结肠癌WiDr的1×107个细胞获得的患癌小鼠作 为阴性对照，并且利用如上所述的方法测定血浆中凝血因子VIII(IX) 的量。
测定的血浆中凝血因子VIII相对于上述试剂盒的阳性对照血浆中 凝血因子VIII的转移部分的％量显示在图3中。血浆中凝血因子IX的浓 度转移显示在图4中。从图3以及图4可以看出，阴性对照随时间没有 变化，而施用了来源于人肝癌的肿瘤细胞的小鼠(Nue)约十天后观察到 凝血因子VIII以及IX的表达，并且表达水平达到人类病人从严重病态 恢复到中度病态的值(Cur.Gene Therapy，Vol.1，301到305，2001)。 然后该水平保持至少持续一个月并且随后约40天后降低。这种表达的 下降可能归因于由于肿瘤细胞(Nue)引起癌症的坏死。
因此，已经证实含hFVIII(hFIX)基因作为体现本发明药物的 HBsAg粒子能够将基因高特异性并且高效地引入人类肝细胞，并且实 际上显示出抗血友病的疗效。此外，根据本试验，由含FVIII(hFIX)基 因的HBsAg粒子治疗血友病的方案可以建立在试验动物的水平上。
虽然pRRRLsinPPTCMVFVIIIpre(pRRLsinPPTAlbFIXpre)在上述实 施例中用作表达hFVIII(hflX)基因的载体，本发明并不限于此，诸如描 述于出版物Cur.Gene Therapy，Vol.1，301-305，2001中的多种载体也 可以使用。例如凝血因子VIII的轻以及重链可以整合在不同的载体中。 此外，缺乏B-结构域的凝血因子VIII也可以整合在载体中用于实现类 似的结果。
工业实用性
根据本发明用于治疗血友病的上述药物可以通过静脉注射的简单 方法可以有效地治疗血友病并可以直接最小副作用危险地用于临床应 用。
序列表
<110>株式会社贝亚克莱(BEACLE Inc.)
法兰德斯校际生物技术研究所(VIB(VLAAMS INTERUNIVERSITAIR
INSTITUUT VOOR BIOTECHNOLOGIE)VZW)
D.COLLEN RESEARCH FOUNDATION VZW ONDERWIJS EN NAVORSING
CAMPUS GASTHUISERG K.U.LEUVEN
<120>治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法(DRUG FOR TREATING
HEMOPHILIA AND METHOD OF TREATING HEMOPHILIA USING THE
SAME)
<130>03P08BK01
<160>2
<210>1
<211>1218
<212>DNA
<213>Hepatitis B virus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1218)
<400>1
atg aga tct ttg ttg atc ttg gtt ttg tgt ttc ttg cca ttg gct gct 48
Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala
1 5 10 15
ttg ggt aag gtt cga caa ggc atg ggg acg aat ctt tct gtt ccc aat 96
Leu Gly Lys Val Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn
20 25 30
cct ctg gga ttc ttt ccc gat cac cag ttg gac cct gcg ttc gga gcc 144
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala
35 40 45
aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac ccc aac aag gat caa tgg 192
Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Gln Trp
50 55 60
cca gag gca aat cag gta gga gcg gga gca ttc ggg cca ggg ttc acc 240
Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr
65 70 75 80
cca cca cac ggc ggt ctt ttg ggg tgg agc cct cag gct cag ggc ata 288
Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile
85 90 95
ttg aca aca gtg cca gca gca cct cct cct gcc tcc acc aat cgg cag 336
Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln
100 105 110
tca gga aga cag cct act ccc atc tct cca cct cta aga gac agt cat 384
Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His
115 120 125
cct cag gcc atg cag tgg aat tcc aca aca ttc cac caa gct ctg cta 432
Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu
130 135 140
gat ccc aga gtg agg ggc cta tat ttt cct gct ggt ggc tcc agt tcc 480
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
gga aca gta aac cct gtt ccg act act gcc tca ccc ata tct ggg gac 528
Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Gly Asp
165 170 175
cct gca ccg aac atg gag aac aca aca tca gga ttc cta gga ccc ctg 576
Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu
180 185 190
ctc gtg tta cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata 624
Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
195 200 205
cca cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga 672
Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly
210 215 220
gca ccc acg tgt cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cac 720
Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His
225 230 235 240
tca cca acc tct tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt 768
Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys
245 250 255
ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc 816
Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile
260 265 270
ttc ttg ttg gtt ctt ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct 864
Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro
275 280 285
cta ctt cca gga aca tca acc acc agc acg ggg cca tgc aag acc tgc 912
Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys
290 295 300
acg att cct gct caa gga acc tct atg ttt ccc tct tgt tgc tgt aca 960
Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
305 310 315 320
aaa cct tcg gac gga aac tgc act tgt att ccc atc cca tca tcc tgg 1008
Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
325 330 335
gct ttc gca aga ttc cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tcc tgg 1056
Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
340 345 350
ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc 1104
Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro
355 360 365
act gtt tgg ctt tca gtt ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt 1152
Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser
370 375 380
ctg tac aac atc ttg agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt 1200
Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe
385 390 395 400
tgt ctt tgg gta tat att 1218
Cys Leu Trp Val Tyr Ile
405
<210>2
<211>406
<212>PRT
<213>Hepatitis B virus
<400>2
Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Gly Lys Val Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn
20 25 30
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala
35 40 45
Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Gln Trp
50 55 60
Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr
65 70 75 80
Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile
85 90 95
Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln
100 105 110
Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His
115 120 125
Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu
130 135 140
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Gly Asp
165 170 175
Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu
180 185 190
Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
195 200 205
Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly
210 215 220
Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His
225 230 235 240
Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys
245 250 255
Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile
260 265 270
Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro
275 280 285
Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys
290 295 300
Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
325 330 335
Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
340 345 350
Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro
355 360 365
Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser
370 375 380
Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe
385 390 395 400
Cys Leu Trp Val Tyr Ile
405
图2图示了根据本发明的实施方案采用重组体酵母表达以及纯化 HBsAg粒子的操作。
图3显示了根据本发明的实施方案通过包含hFVIII基因的HBsAg 粒子表达凝血因子VIII的表达效果。
图4显示了根据本发明的实施方案通过包含hFIX基因的HBsAg粒 子表达凝血因子IX的效果。
本发明的最佳实施方案
体现本发明的中空纳米粒子将生物识别分子引入具有粒子形成能 力的蛋白使其可以特异性转运编码凝血因子VIII以及IX的基因到目的 细胞或者组织，例如到肝细胞或者肝脏组织。具有粒子形成能力的蛋 白可以例如是从多种病毒获得的亚病毒颗粒。蛋白例如可以是乙型肝 炎病毒(HBV)表面抗原蛋白。
由具有这种粒子形成能力的蛋白形成的蛋白粒子例如可以是通过 在真核细胞中表达蛋白获得的蛋白粒子。简而言之，如果具有粒子形 成能力的蛋白表达在真核细胞中，蛋白作为膜蛋白表达并且聚集在囊 泡膜上以便作为粒子释放。真核细胞例如可以是酵母，重组体酵母， 昆虫细胞以及动物细胞。
如随后实施例所述，本发明者发现并且报道，通过在重组体酵母 中表达上述的HBV表面抗原L蛋白，可以形成大量基本上呈椭圆形的 中空粒子，每一具有大约20nm的小头直径以及大约150nm的大头直 径，并且每一具有埋于酵母来源双脂质层中的HBV表面抗原L蛋白(J. Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992)。因为这些粒子既不包含 HBV基因组又不包含HBV蛋白并且由此不起病毒的作用，粒子对于人 体是非常安全的。而且，这些粒子显示特异于肝细胞的受体，该受体 位于其表面上对HBV的肝细胞显示极强的传染力，由此粒子显示出作 为特异性转运物质到肝细胞的转运工具的高效力。
利用重组体酵母形成蛋白粒子的方法很方便，因为粒子可以高效 地从细胞裂解物中的可溶性蛋白产生。
另一方面，采用昆虫细胞以及动物细胞的方法据报道是大量产生 外源蛋白所希望的方法因为这些细胞是比酵母细胞更接近于高等动物 细胞的真核细胞，并且因为昆虫细胞以及动物细胞能够再生酵母不能 再生的高位结构，诸如糖链。昆虫细胞的常规系统采用巴库洛病毒， 并且伴随表达病毒，因此在蛋白表达的时候细胞死亡或者溶解。因此， 存在的问题就是连续地进行蛋白表达或者通过从死细胞分离的蛋白酶 分解蛋白。而且，如果蛋白表达在分泌物上，培养基中所含的胎牛血 清大量地混合使其难以纯化粒子。然而，不采用巴库洛病毒并且可以 进行无血清培养的昆虫细胞系统近来已由Invitrogen公司开发，并且正 在进入销售。因此，借助于这种昆虫细胞系统，有可能获得可以及其 容易纯化并且可以再现高位结构的蛋白粒子。
借助本发明的中空纳米粒子，通过将上述各种方法获得的粒子表 面的受体改变为任选的生物识别分子，可以将物质极高特异性地转运 并且引入除了肝细胞外任选的细胞或者组织。
当然，显示出粒子形成能力的蛋白不局限于上述的乙型肝炎病毒 表面抗原蛋白，并且可以是来源于动物细胞，植物细胞，病毒或者细 菌或者任何多种合成蛋白的任一天然蛋白。如果例如是来源于病毒的 抗原蛋白可能诱导活体中的抗体，这种被修饰减小其抗原性的蛋白可 以用作生物识别分子。
被引入显示出粒子形成能力蛋白中的生物识别分子优选地例如为 生长因子，细胞功能调节分子，诸如细胞因子，细胞表面抗原，组织 特异性抗原，识别细胞或者组织的分子，诸如受体，来源于病毒以及 微生物的分子，抗体，糖链或者脂质。这些可以根据靶细胞或者组织 进行合适地选择以及应用。
根据本发明，编码凝血因子VIII以及IX，希望被引入任选的细胞 或者组织假若是肝细胞或者组织的基因被封入上述中空纳米粒子中产 生用于治疗血友病的物质转运工具。
为了将基因引入上述的中空纳米粒子，可以利用用于化学实验或 者分子生物学实验中的任何多种常规技术。这些方法的实例包括电穿 孔法，超声波法，单向扩散法或者采用电荷脂质的方法。
利用这些中空纳米粒子或者物质转运工具，将特定物质体内或者 体外转入细胞或者组织成为可能。此外，借助于中空纳米粒子或者物 质转运工具可以将物质引入特定细胞或者组织作为治疗各种疾病的方 法或者其中的一个步骤。
本发明的药物的效力实际上已经通过下面将要解释的实施例所述 的动物试验得以证实。在这些实施例中，包含编码凝血因子VIII以及IX 的本发明药物的效力通过如下方法得以证实：首先将药物施用于移植 有来源于人肝癌的细胞的裸鼠，然后测定血清中凝血因子VIII以及IX 的表达水平。虽然药物通过静脉内施用，药物也可以口服，肌内注射， 腹膜内或者皮下施用。
本发明现在将如同参考附图一样参考特定的实施例进行更详细的 解释。本发明不局限于下列实施例，并且可以包含各种变化，取代或 等效物，只要不背离在权利要求中限定的本发明的目的以及范围。
实施例
在该实施例中，下述的HBsAg表示乙型肝炎病毒表面抗原。具体 地，HBsAg是HBV.的外壳蛋白。参考图1的示意图，在HBsAg中有3个 蛋白，也就是S-蛋白，M-蛋白以及L-蛋白。其中，S-蛋白是为这3个 蛋白所共有的重要的外壳蛋白。M-蛋白是由55个氨基酸组成的前-S2 肽，并且其连接于S-蛋白的N-末端侧。L-蛋白是由108个或者119个氨 基酸组成的前-S1肽，并且其连接于M-蛋白的N-末端侧。这种L-蛋白 的碱基序列以及氨基酸序列分别由序列1以及2表示。
在已知的方法中，HBsAg的L-蛋白的前-S1结构域具有直接接合 肝细胞的位点并且当HBV结合于肝细胞时起重要的作用(Cell.Vol.46， 429-436，1986：J.of Virol.，Vol.73，2052-2057，1999)。
当蛋白HBsAg表达在真核细胞中时，蛋白作为膜蛋白表达并且聚 集在泡囊膜上。HBsAg的L-蛋白分子在絮凝期间絮凝在一起并且吸收 在泡囊膜中。HBsAg的L-蛋白的这种絮凝的分子作为粒子以出芽方式 释放在细胞腔侧。
在下述的实施例中，使用HBsAg的L-蛋白。图2图示了用于下列 实施例中描述的HBsAg粒子纯化的表达以及操作。
实施例1
由重组体酵母表达HBsA粒子
根据本发明者报道的文献J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953- 1961，1992，将具有L-蛋白表达质粒pGLDLIIP39-RcT的重组体酵母 (Saccharomyces Cerevisiae AH22R-菌株)培养在合成培养基High-Pi以及 855N-P400中表达L-蛋白粒子(图2a以及2b)。从稳定生长期(大约72小 时后)的重组体酵母，利用Pierce Chemicals有限公司生产的酵母蛋白质 提取试剂制备全细胞提取物。全细胞提取物中的蛋白由十二烷基硫酸 钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)彼此分离，并且通过银染色鉴定 样品中的HBsAg。以这种方式，HBsAg被证实是具有大约52kDa分子 量的蛋白。
实施例2
从重组体酵母纯化HBsAg粒子
(1)将培养在合成培养基855N-P400上的重组体酵母(湿重：26g)悬 浮在100ml的缓冲溶液A(7.5M尿素，0.1M磷酸钠(pH 7.2)，15mM EDTA，2mM PMSF以及0.1％吐温80)中，并且利用珠子搅拌器 (BEAD-BEATER)用玻璃珠对酵母进行匀浆化。匀浆化后，通过离心 回收上清液(图2c以及2d)。
(2)然后将上清液与0.75-倍体积的33％(wlw)PEG6OOO混合并且 用冰冷却产生的混合物30分钟。然后，在7000rpm离心30分钟后回收 沉淀。然后将沉淀重新悬浮在不含吐温80的缓冲液A溶液中。
(3)重新悬浮后将溶液在显示10到40％密度梯度范围的CsCl中进行 分层。然后将溶液在28000rpm超离心16小时。离心的样品分离成12级 分并且通过Western印迹法鉴定含HBsAg的级分，其中第一抗体是抗 HBsAg单克隆抗体。进一步，利用不含吐温80的缓冲液A溶液透析含 HBsAg的级分。
(4)在(3)中透析获得的溶液(12ml)在糖上分层，显示出从5到50％ 的密度梯度范围。然后将生成的物质在28000rpm超离心16小时。离心 后，像(3)一样鉴定含HBsAg的级分。含HBsAg的级分用不含尿素也不 含吐温80但是含0.85％NaCl的缓冲液A溶液进行透析(图2e中(2)到 (4))。
(5)重复以上(4)的类似操作。利用Advantec公司生产的超滤器 Q2000浓缩透析的样品，并保藏在4℃直至使用(图2f)。CsCl平衡离心 后Western印迹(3)的结果表明HBsAg是分子量为52kDa显示出S-抗原性 的蛋白。最终，约24mg的纯化HBsAg粒子可以从湿重26g来源于培养 基2.5L的细胞裂解物获得。
利用银染色SDS-PAGE分析来自纯化操作的序列的级分。另外， 为了证实酵母来源的蛋白酶已通过净化过程除去，将通过(5)获得的 HBsAg粒子培养在37℃12小时，并进行SDS-PAGE 12小时，继之以 SDS-PAGE，通过银染色进行鉴定。结果，证实来源于酵母的蛋白酶 在序列纯化步骤中被完全除去。
实施例3
将hFVIIJ以及hFIX基因封入HBsA粒子(制备包括hFVIII以及hFIX基因 埋入其中的HBsAg粒子)
将通过上述方法制备的HBsAg粒子中封入编码人凝血因子VIII (IX)的基因(hFVIII以及hFIX)作为治疗血友病的基因从而产生埋入基因 (hFVIII以及hFIX)的HBsAg粒子作为本发明的药物。
在本实施例中，由Torino大学的Dr.L.Naldini捐赠的 pRRLsin.cPPT.CMV.FVIII.Wpre以及pRRLsin.cPPT.Alb.FIX.Wpre (Human Gene Therapy，Vol.13，243-260，2002)被用作用于将hFVIJI 以及hFIX基因封入HBsAg粒子的表达载体。
具有hFVIII(hFIX)基因埋入其中的HBsAg粒子通过电穿孔法方将 上述表达载体引入HBsAg粒子进行制备。具体地，将20μg的上述表 达载体添加给溶于500μl的PBS(pH 7.2)的HBsAg粒子中的100μg的L- 蛋白粒子。利用4mm的样品池在Gene Pulser II电穿孔系统(由Bio-Rad 有限公司生产)上，于50V以及750μF进行电穿孔。
实施例4
由埋入hFVIII(hFIX)基因的HBsAg粒子在移植有人肝癌的裸鼠中表达 凝血因子VIII (IX)的效果
利用试验用动物检验由上述实施例制备的封入hFVIII(hFIX)基因 的HBsAg粒子表达凝血因子VIII(IX)的效果。
在本实施例中，将来源于人肝癌Nue的1×107个细胞施用于从 Nippon Clair有限公司购买的试验动物裸鼠(Balb/cnu/nu，雌性，5周龄) 的两侧背部皮下区域。饲养小鼠大约5到6周直到实体癌生长到约1cm 直径的大小产生患有癌症的小鼠。
埋入其中约20μg hFVIII(hFIX)基因表达载体的HBsAg粒子通过 尾部静脉施用于上述患癌小鼠，并且通过酶免疫分析(ELISA)测定血 液中凝血因子VIII(IX)的量随时间的变化。利用分别特异性于VIII以 及IX因子的Asserachom VIIIC：Ag试剂盒以及Asserachom IX：Ag试剂 盒(由Diagnostica Stago Inc生产)，进行ELISA。
使用施用来源于人结肠癌WiDr的1×107个细胞获得的患癌小鼠作 为阴性对照，并且利用如上所述的方法测定血浆中凝血因子VIII(IX) 的量。
测定的血浆中凝血因子VIII相对于上述试剂盒的阳性对照血浆中 凝血因子VIII的转移部分的％量显示在图3中。血浆中凝血因子IX的浓 度转移显示在图4中。从图3以及图4可以看出，阴性对照随时间没有 变化，而施用了来源于人肝癌的肿瘤细胞的小鼠(Nue)约十天后观察到 凝血因子VIII以及IX的表达，并且表达水平达到人类病人从严重病态 恢复到中度病态的值(Cur.Gene Therapy，Vol.1，301到305，2001)。 然后该水平保持至少持续一个月并且随后约40天后降低。这种表达的 下降可能归因于由于肿瘤细胞(Nue)引起癌症的坏死。
因此，已经证实含hFVIII(hFIX)基因作为体现本发明药物的 HBsAg粒子能够将基因高特异性并且高效地引入人类肝细胞，并且实 际上显示出抗血友病的疗效。此外，根据本试验，由含FVIII(hFIX)基 因的HBsAg粒子治疗血友病的方案可以建立在试验动物的水平上。
虽然pRRRLsinPPTCMVFVIIIpre(pRRLsinPPTAlbFIXpre)在上述实 施例中用作表达hFVIII(hflX)基因的载体，本发明并不限于此，诸如描 述于出版物Cur.Gene Therapy，Vol.1，301-305，2001中的多种载体也 可以使用。例如凝血因子VIII的轻以及重链可以整合在不同的载体中。 此外，缺乏B-结构域的凝血因子VIII也可以整合在载体中用于实现类 似的结果。
工业实用性
根据本发明用于治疗血友病的上述药物可以通过静脉注射的简单 方法可以有效地治疗血友病并可以直接最小副作用危险地用于临床应 用。
序列表
<110>株式会社贝亚克莱(BEACLE Inc.)
法兰德斯校际生物技术研究所(VIB(VLAAMS INTERUNIVERSITAIR
INSTITUUT VOOR BIOTECHNOLOGIE)VZW)
D.COLLEN RESEARCH FOUNDATION VZW ONDERWIJS EN NAVORSING
CAMPUS GASTHUISERG K.U.LEUVEN
<120>治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法(DRUG FOR TREATING
HEMOPHILIA AND METHOD OF TREATING HEMOPHILIA USING THE
SAME)
<130>03P08BK01
<160>2
<210>1
<211>1218
<212>DNA
<213>Hepatitis B virus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1218)
<400>1
atg aga tct ttg ttg atc ttg gtt ttg tgt ttc ttg cca ttg gct gct 48
Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala
1 5 10 15
ttg ggt aag gtt cga caa ggc atg ggg acg aat ctt tct gtt ccc aat 96
Leu Gly Lys Val Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn
20 25 30
cct ctg gga ttc ttt ccc gat cac cag ttg gac cct gcg ttc gga gcc 144
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala
35 40 45
aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac ccc aac aag gat caa tgg 192
Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Gln Trp
50 55 60
cca gag gca aat cag gta gga gcg gga gca ttc ggg cca ggg ttc acc 240
Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr
65 70 75 80
cca cca cac ggc ggt ctt ttg ggg tgg agc cct cag gct cag ggc ata 288
Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile
85 90 95
ttg aca aca gtg cca gca gca cct cct cct gcc tcc acc aat cgg cag 336
Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln
100 105 110
tca gga aga cag cct act ccc atc tct cca cct cta aga gac agt cat 384
Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His
115 120 125
cct cag gcc atg cag tgg aat tcc aca aca ttc cac caa gct ctg cta 432
Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu
130 135 140
gat ccc aga gtg agg ggc cta tat ttt cct gct ggt ggc tcc agt tcc 480
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
gga aca gta aac cct gtt ccg act act gcc tca ccc ata tct ggg gac 528
Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Gly Asp
165 170 175
cct gca ccg aac atg gag aac aca aca tca gga ttc cta gga ccc ctg 576
Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu
180 185 190
ctc gtg tta cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata 624
Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
195 200 205
cca cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga 672
Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly
210 215 220
gca ccc acg tgt cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cac 720
Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His
225 230 235 240
tca cca acc tct tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt 768
Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys
245 250 255
ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc 816
Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile
260 265 270
ttc ttg ttg gtt ctt ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct 864
Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro
275 280 285
cta ctt cca gga aca tca acc acc agc acg ggg cca tgc aag acc tgc 912
Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys
290 295 300
acg att cct gct caa gga acc tct atg ttt ccc tct tgt tgc tgt aca 960
Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
305 310 315 320
aaa cct tcg gac gga aac tgc act tgt att ccc atc cca tca tcc tgg 1008
Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
325 330 335
gct ttc gca aga ttc cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tcc tgg 1056
Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
340 345 350
ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc 1104
Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro
355 360 365
act gtt tgg ctt tca gtt ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt 1152
Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser
370 375 380
ctg tac aac atc ttg agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt 1200
Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe
385 390 395 400
tgt ctt tgg gta tat att 1218
Cys Leu Trp Val Tyr Ile
405
<210>2
<211>406
<212>PRT
<213>Hepatitis B virus
<400>2
Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Gly Lys Val Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn
20 25 30
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala
35 40 45
Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Gln Trp
50 55 60
Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr
65 70 75 80
Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile
85 90 95
Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln
100 105 110
Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His
115 120 125
Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu
130 135 140
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Gly Asp
165 170 175
Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu
180 185 190
Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
195 200 205
Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly
210 215 220
Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His
225 230 235 240
Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys
245 250 255
Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile
260 265 270
Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro
275 280 285
Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys
290 295 300
Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
325 330 335
Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
340 345 350
Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro
355 360 365
Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser
370 375 380
Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe
385 390 395 400
Cys Leu Trp Val Tyr Ile
405
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