近年来，关于癌治疗，基因治疗引人注目，到目前为止提出 了各种各样的基因治疗法，并进行了临床试验。其中，对于使用 载体细胞的基因治疗，由Freeman等人进行了临床试验。该基因 治疗使用通过逆转录病毒导入了HSV-tk基因的卵巢癌细胞PA-1 作为载体细胞，进行了用于卵巢癌治疗、以及恶性间皮瘤治疗目 的的临床试验(参照下面的非专利文献1、2)。另外，Culver等人 使用小鼠NIH-3T3细胞作为载体细胞，对脑肿瘤进行了临床试验 (参照下面的非专利文献3)。然而，如果考虑到对人适用的癌治 疗，作为载体细胞要求使用来自人的细胞。
还有Coukos等人进行了使用卵巢癌细胞PA-1作为载体细胞 的基因治疗(参照下面非专利文献4)。该基因治疗构建了在肿瘤 细胞中进行特异增殖的溶瘤病毒(oncolytic virus)，使该病毒感 染载体细胞(产毒细胞)，然后将该载体细胞注射到肿瘤部位。作 为溶瘤病毒使用单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，对于裸鼠的卵巢癌 腹腔内播散性转移模型，进行注射到腹腔内的动物实验(参照下 面的专利文献1、2)。
然而，上述的卵巢癌细胞PA-1虽然是增殖能力高、操作容易 的细胞，但细胞质小、容易破坏。因此，即使通过逆转录病毒导 入HSV-tk基因，HSV-tk基因在肿瘤部位的表达少，所以在 Freeman等人的临床试验中，对卵巢癌和恶性间皮瘤没有获得充 分的抗肿瘤效果。
在使用溶瘤病毒HSV-1的癌基因治疗中，作为载体细胞使用 PA-1时，与单独溶瘤病毒HSV-1疗法相比也没有获得明显的抗肿 瘤效果。利用病毒进行癌基因治疗的问题在于由于血中的中和抗 体的原因而不能多次给予病毒。可以认为使用PA-1时，由于细胞 脆弱，病毒产生量也少，因此在通过细胞间相互作用(cell to cell interaction)感染靶肿瘤细胞之前，细胞被破坏掉，进而病毒直 接被中和抗体灭活，不能获得抗肿瘤效果。
另外在细胞性免疫基因治疗的临床试验中，作为载体细胞有 时使用患者自身的癌细胞或成纤维细胞(fibroblast)，这种情况 下，由于直至获得稳定的细胞系需要时间，手术困难，以及基因 导入因个体不同而存在差异，不稳定，所以很难获得稳定的效果。

发明要解决的课题
本发明正是要解决这样的以往问题而进行的，所以本发明的 目的在于挑选出在使用溶瘤病毒的癌基因治疗中能够获得强力抗 肿瘤效果的新的载体细胞，以及确立使用所得到的载体细胞等可 获得显著抗肿瘤效果的新的癌基因治疗法以及提供在该治疗法中 使用的新的癌基因治疗药物。
用于解决课题的手段
本发明者鉴于上述课题进行了不断研究，结果发现(1)通过 使用特定的细胞株作为载体细胞，与以往的载体细胞相比，可获 得强力的抗肿瘤效果，以及(2)预先给予病毒实施免疫处理后， 通过给予感染了溶瘤病毒的载体细胞，诱导·引起生物体的CTL反 应，可在体内获得显著的抗肿瘤效果等，至此完成了本发明。
即，本发明的癌基因治疗药物含有用溶瘤病毒感染并使该病 毒作用于肿瘤细胞的载体细胞，该载体细胞从以下(1)～(4) 的细胞中选择。
(1)A549细胞
(2)293细胞
(3)SW626细胞
(4)HT-3(HT-III细胞)
如下面所叙述的那样，在上述4种细胞中，A549细胞的使用 特别理想。
溶瘤病毒最好是从腺病毒、疱疹病毒、HIV病毒等慢病毒、 逆转录病毒、呼肠病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、或其它的溶瘤 病毒中选择。其中由于使用腺病毒可获得如下面所述那样的良好 结果，所以特别理想。
另外，本发明的溶瘤病毒最好是根据治疗对象癌的种类等而 含有1A1.3B启动子(IAI.3B启动子)、中期因子启动子、β-HCG 启动子、SCCA1启动子、cox-2启动子、PSA启动子、或其它肿 瘤特异性启动子。而在本发明中溶瘤病毒只要是能感染靶肿瘤细 胞、能够增殖的就可以，例如腺病毒，在其范畴内包括野生型腺 病毒。其它溶瘤病毒，如ONYX公司的E1B基因缺失型的溶瘤腺病 毒、或UAB大学的E1A基因部分缺损型的Ad5-Δ24腺病毒等不含 有肿瘤特异性启动子的也可以。
将本发明的癌基因治疗药物做成癌治疗用药剂试剂盒的构 成，优选进一步含有为诱导生物体对载体细胞的给予所产生的 CTL反应而给予的免疫处理用病毒的构成。对于免疫处理用病毒 最好使用与溶瘤病毒同种类的病毒。另外对于免疫处理用病毒最 好是使用非增殖型的病毒和/或经紫外线等灭活的病毒。通过用 紫外线等灭活，可以将从免疫处理用病毒给予至载体细胞给予的 期间缩短。
本发明的癌基因治疗药物作为癌治疗用药剂试剂盒，除了含 有载体细胞、或载体细胞与溶瘤病毒的配合(或再加上免疫处理 用病毒的3者的配合)外，另外还可含有下面(1)～(4)的物质 中的1或2种以上物质。
(1)端胶原(atelocollagen)
(2)在给予前，使载体细胞感染的GM-CSF(granulocyte- macrophage colony stimulating factor：粒细胞·巨噬细胞集落 刺激因子)表达载体
(3)铁剂
(4)卟啉化合物(例如，5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid：ALA))
另外，在给予免疫处理用病毒的同时、或在给予前后，最好 是给予用于肿瘤免疫的来自患者肿瘤细胞或认为对与它类似的抗 原进行提示的一般可获得的经放射线照射的肿瘤细胞，本发明的 癌基因治疗药物也可以含有用于肿瘤免疫的这样的经放射线照射 的肿瘤细胞。
使用本发明癌基因药的合适的治疗方法是为了诱导生物体对 载体细胞的给予所产生的CTL反应，向人给予免疫处理用病毒， 经过规定期间后，至少给予人一次用溶瘤病毒感染并使该病毒作 用于肿瘤细胞的载体细胞。
在上述癌治疗方法中，最好是将从给予免疫处理用病毒至给 予载体细胞的期间大致定在2周～13周(更优选3周～4周)。另外 最好是(1)免疫处理用病毒的给予量为：对于对该病毒呈抗体阴 性的患者定在大约105病毒粒子～1011病毒粒子，而另一方面对于 对该病毒呈抗体阳性的患者定在大约102病毒粒子～107病毒粒子 (因场合不同，也可以给予102病毒粒子或不给予)，(2)通过载 体细胞给予溶瘤病毒的1次给予量大约定在109病毒粒子～1014病 毒粒子，(3)溶瘤病毒对载体细胞的感染量大约定在0.1病毒粒子 /细胞(viral particle/cell：以下称为“vp/cell”)～2000vp/cell (优选5vp/cell～500vp/cell)。
另外，在上述癌基因治疗方法中，最好采用下述(1)～(5) 的方法。
(1)通过肿瘤内给予方式给予载体细胞。
(2)与载体细胞一起给予端胶原。
(3)给予用溶瘤病毒和GM-CSF表达载体感染的载体细胞。
(4)与载体细胞一起给予铁剂和/或卟啉化合物(例如5- 氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid：ALA))。
(5)在给予免疫处理用病毒的同时、或在其前后，给予用于 肿瘤免疫的肿瘤细胞。
发明的效果
本发明的癌基因治疗药物由于使用经筛选结果确认在体外 (in vitro)和体内(in vivo)都有高的抗肿瘤效果的A549细胞 等细胞株作为载体细胞，所以可获得比以往的载体细胞更强力的 抗肿瘤效果。
另外，做成配合了预先给予的免疫处理用病毒和之后给予的 载体细胞这2种药剂的构成时，通过预先给予腺病毒等病毒来实施 免疫处理，然后给予用溶瘤病毒感染的载体细胞，从而使该病毒 感染靶肿瘤细胞而产生直接的抗肿瘤效果，进一步诱导生物体对 感染靶细胞的CTL反应，在体内可获得显著的抗肿瘤效果。
附图说明
图1是表示通过IC50的细胞数对使用各种细胞株作为载体细 胞时对卵巢癌细胞HEY的增殖抑制效果进行研究的结果的图表。
图2是表示在单独使用溶瘤病毒的情况和使用载体细胞的情 况下，在病毒抗体存在下，通过IC50的抗腺病毒抗体的抗体效价 对卵巢癌细胞HEY的增殖抑制效果进行研究的结果的图表。
图3表示对于溶瘤腺病毒感染293细胞等，在病毒抗体存在下， 通过IC50的抗腺病毒抗体的抗体效价对卵巢癌细胞HEY的增殖 抑制效果进行研究的结果的图表。
图4对于293细胞、A549细胞、SW626细胞、HT-3细胞的各 载体细胞，通过细胞数对其在病毒抗体存在下对卵巢癌细胞HEY 的增殖抑制效果进行研究的结果的图表。
图5表示使用将人卵巢癌细胞RMG-1移植到裸鼠皮下形成 的10-15mm巨大肿瘤模型，对本发明的癌基因治疗药物的体内 抗肿瘤效果进行研究的结果的图表。
图6表示使用将人卵巢癌细胞PA-1移植到裸鼠皮下形成的10 -15mm巨大肿瘤模型，对本发明的癌基因治疗药物的体内抗肿瘤 效果进行研究的结果的图表。
图7是表示使用免疫功能正常的皮下肿瘤模型小鼠 ((C57BL/6×C3/He)F1小鼠)对本发明的癌基因治疗药物的体内 抗肿瘤效果进行研究的结果的图表。
图8是通过显微镜对腺病毒所的给予所引起的A549细胞的细 胞融合进行观察的图。
图9是通过显微镜对作为对照没有给予腺病毒的A549细胞进 行观察的图。
图10(a)是通过RT-PCR对1～21个的人手术标本中的中期 因子(MK)mRNA表达进行研究的结果，(b)是用同样的方法通 过RT-PCR对中期因子mRNA在恶性神经胶质瘤的4个细胞株中 的表达进行研究的结果，(c)是通过免疫印迹法解析对中期因子在 上述各细胞株中的表达进行研究的结果。
图11是表示使用长度不同的2个中期因子启动子，对启动子在 上述各细胞株中的活性进行比较的结果的图表。
图12(a)是表示此次设计的含有中期因子启动子的溶瘤腺病 毒的构造的模式图，(b)是用3种腺病毒感染上述各细胞株，通过免 疫印迹法解析对E1A蛋白在各个细胞株中的表达进行研究的结 果。
图13(a)是对3种腺病毒引起的癌细胞增殖抑制效果进行比较 研究的结果，(b)是对腺病毒的E3区对增殖抑制效果的影响进行研 究的结果，(c)是对腺病毒在直径5mm裸鼠皮下移植模型中的抗肿 瘤效果进行研究的结果。
图14是表示用含有中期因子启动子的溶瘤病毒感染载体细 胞，制备本发明的癌基因治疗药物，将该治疗药物对直径10- 15mm巨大肿瘤的抗肿瘤效果与单独给予病毒时的情况进行比较 的结果的图表。
图15是表示对Fe对腺病毒AdE3-1A1.3B对于卵巢癌细胞 PA-1增殖抑制效果的影响进行研究的结果的图表。
图16是表示对ALA对腺病毒AdE3-1A1.3B对于卵巢癌细胞 PA-1增殖抑制效果的影响进行研究的结果的图表。
图17是表示对Fe和ALA都存在下对腺病毒AdE3-1A1.3B对 于卵巢癌细胞PA-1增殖抑制效果的影响进行研究的结果的图表。
图18(a)是用免疫功能正常的皮下肿瘤模型小鼠 ((C57BL/6×C3/He)F1小鼠)，研究本发明的癌基因治疗药物(免 疫处理用病毒没有用UV处理的场合)的体内抗肿瘤效果的结果， (b)是表示对供该实验使用的各小鼠的存活率进行长期观察的结果 的图表。
图19是对于从给予免疫处理用病毒至给予载体细胞的给予间 隔进行研究的结果，(a)是对各小鼠的肿瘤体积进行观察的结果， (b)是对各组小鼠的存活率进行观察的结果。
图20是表示对通过使用经UV灭活处理的腺病毒UV-Ad-β -gal作为免疫处理用病毒能否缩短上述给予间隔进行研究的结 果的图表(存活曲线)。
图21是表示对使用上述UV-Ad-β-gal作为免疫处理用病 毒时的该病毒的给予量进行研究的结果的图表(肿瘤生长曲线)。
图22是对肿瘤免疫的效果进行研究的结果，(a)是对各小鼠的 肿瘤体积进行观察的结果，(b)是对各组小鼠的存活率进行观察的 结果。各组小鼠数为n＝5。图中，对照“SCC7”“OVHM”是没有进 行肿瘤免疫，而将1×106个扁平上皮癌细胞SCC7或卵巢癌细胞 OVHM进行皮下移植，给予AdE3-1A1.3B感染载体细胞A549的 小鼠的结果。“OVHM-RT+Ad-β-gal→SCC7，OVHM”是在用放射 线照射过的OVHM进行肿瘤免疫和通过Ad-β-gal诱导对腺病毒 的CTL后，做成SCC7或OVHM的皮下肿瘤，给予AdE3-1A1.3B 感染载体细胞A549的小鼠的结果。
图23是表示对用非小细胞性肺癌细胞A549细胞进行肿瘤免 疫的效果进行研究的结果的图表(存活曲线)。各组小鼠数为n＝ 10。图中，对照“OVHM”是不进行肿瘤免疫，而将1×106个卵巢 癌细胞OVHM进行皮下移植，给予AdE3-1A1.3B感染载体细胞 A549的小鼠的结果。图中“AdE3-IAI.3B-感染A549→OVHM” 是将感染AdE3-1A1.3B并经放射线照射的A549细胞106个进行皮 下免疫，将1×106个卵巢癌细胞OVHM进行皮下移植，给予 AdE3-1A1.3B感染载体细胞A549的小鼠的结果。
图24是表示将端胶原与载体细胞一起给予时，研究是否可改 善由副作用所导致的死亡率的结果的图表。图中括弧内的N表示小 鼠数。
图25是给予1-3次没有经UV灭活处理的腺病毒Ad-β- gal，对在抗腺病毒抗体存在下的抗肿瘤效果进行研究的结果，(a) 是对各小鼠的肿瘤体积进行观察的结果、(b)是对各组小鼠的存活 率进行观察的结果。作为载体细胞使用A549细胞和293细胞的混 合物。各组小鼠数为n＝5。
图26是给予1-3次没有经UV灭活处理的腺病毒Ad-β- gal，对在抗腺病毒抗体存在下的抗肿瘤效果进行研究的结果，(a) 是对各小鼠的肿瘤体积进行观察的结果、(b)是对各组小鼠的存活 率进行观察的结果。作为载体细胞只使用A549细胞。各组小鼠数 为n＝5。
图27是给予用腺病毒AdE3-1A1.3B和GM-CSF表达载体 感染的载体细胞(A549细胞)，并且与该载体细胞一起给予端胶 原时，对体内抗肿瘤效果进行研究的结果，(a)是对各小鼠的肿瘤 体积进行观察的结果、(b)是对各组小鼠的存活率进行观察的结果。 图中“Ad-β-gal”前的“×1”“×2”“×3”分别表示给予1次、2次、3次腺 病毒Ad-β-gal。各组小鼠数为n＝5。
图28是对于在给予载体细胞时向腹腔内注射铁剂的情况下的 体内抗肿瘤效果进行研究的结果，(a)是对各小鼠的肿瘤体积进行 观察的结果、(b)是对各组小鼠的存活率进行观察的结果。图中 “Ad-β-gal”前的“×1”“×2”“×3”分别表示给予1次、2次、3次腺 病毒Ad-β-gal。各组小鼠数为n＝5。
图29是表示在对载体细胞A549进行的放射线处理中，使用裸 鼠对照射的放射线量进行研究的结果的图表。
图30是表示在对(C57BL/6×C3/He)F1小鼠进行OVHM皮下 移植的实验中，对于用不同的放射线量对载体细胞A549进行放射 线处理时的抗肿瘤效果进行研究的结果的图表。
图31是表示对于溶瘤病毒对载体细胞A549的感染量进行研 究的结果的图表。
图32是对利用卵巢癌细胞OVHM进行肿瘤免疫的效果进行研 究的结果，(a)是对各小鼠的肿瘤体积进行观察的结果、(b)是对各 组小鼠的存活率进行观察的结果。图中“A549”是不进行肿瘤免疫， 给予3次AdE3-1A1.3B感染载体细胞A549的小鼠、 “OVHM-RT→A549”是通过经放射线照射的OVHM进行肿瘤免疫 后，给予3次AdE3-1A1.3B感染载体细胞A549的小鼠、各组小鼠 数为n＝5。

以下就本发明的一个实施方式进行说明。
〔1〕本发明的癌基因治疗药物
本发明癌基因治疗药物含有用溶瘤病毒感染并使该病毒作用 于肿瘤细胞的载体细胞，该载体细胞可以从例如以下(1)～(4) 的细胞中选择。
(1)A549细胞
(2)293细胞
(3)SW626细胞
(4)HT-3细胞(HT-III细胞)
图1是表示本发明者为了找出可在癌基因治疗药物使用的有 效的载体细胞，进行载体细胞筛选的结果，更具体讲，是表示制 备用溶瘤病毒感染各种候选细胞株的癌基因治疗药物，研究各个 癌细胞增殖抑制效果的结果的图表。溶瘤病毒使用腺病毒AdE3- 1A1.3B(IAI.3B)。该腺病毒AdE3-1A1.3B是含有E1A基因和 E3基因、而且在E1A基因上游含有作为肿瘤特异性启动子的卵巢 癌特异性1A1.3B启动子(IAI.3B启动子)的腺病毒。使该腺病毒 AdE3-1A1.3B以500vp/cell对各种候选细胞株感染2天后，将各 细胞添加到培养到第2天的卵巢癌细胞HEY中，研究该癌细胞 HEY在培养第5天的增殖抑制效果。
图1的图表纵轴表示各种候选细胞株得到50％增殖抑制效果 (IC50)时的细胞数，细胞数越少的细胞株，增殖抑制效果越高。 如该图表示的那样，在此次调查的癌细胞株中，293细胞、A549 细胞、SW626细胞、HT-3细胞(HT-III细胞)依次表现出很高 的增殖抑制效果。293细胞、A549细胞和SW626细胞与以往作为 载体细胞使用的PA-1细胞相比，大约表现出高出100倍左右的增 殖抑制效果。HT-3细胞也表现出与SW626细胞同等程度的高的增 殖抑制效果。
另外，制备用溶瘤腺病毒感染上述的293细胞、A549细胞、 SW626细胞和HT-3细胞的癌基因治疗药物，对于各治疗药物在足 量的抗腺病毒中和抗体存在下(Ab(+))的癌细胞增殖抑制效果 进行研究。结果如图4表示的那样，表明即使在抗体存在下，使用 上述4种细胞作为载体细胞的癌基因治疗药物无论那一个都表现 出强的癌细胞增殖抑制效果。以往利用病毒进行癌基因治疗的难 点是由于抗体的产生导致不能多次给予，而使用上述4种细胞作为 载体细胞时，即便有抗体存在，也可在体外获得强力的增殖抑制 效果。另外，如图4所示的那样，使用上述4种细胞中的A549细胞 作为载体细胞时，表现出最强的增殖抑制效果。即，在足量抗腺 病毒中和抗体存在下给予腺病毒感染A549细胞时，即便在抗体存 在下，靶癌细胞的增殖也几乎完全被抑制。
另外，在使用直径10-15mm的巨大裸鼠皮下肿瘤模型的体 内实验中，作为载体细胞使用上述的A549细胞、293细胞和SW626 细胞时，也表现出强力的抗肿瘤效果(参照图5和图6)。而有关这 些实验的详细情况在下面的实施例中进行说明。
如上所述，在用溶瘤病毒感染载体细胞而得到的癌基因治疗 药物中，通过使用A549细胞、293细胞、SW626细胞、HT-3细 胞中的任一个作为载体细胞，都可以获得很高的抗肿瘤效果。
对上述4种细胞进行说明，A549细胞是非小细胞性肺癌细胞 株，有关其详细情况在例如论文Giard，D.J.，Aaronson，S.A.， Todaro，G.J.，Arnstein，P.，Kersey，J.H.，Dosik，H.，and Parks，W.P. In vitro cultivation of human tumors：establishment of cell lines derived from a series of solid tumors，J.Natl.Cancer Inst.，51：1417-1423， 1973.等中有记载。293细胞是来自人胎儿肾的细胞，是在试验研 究中经常被用作腺病毒产生细胞的细胞株。有关293细胞在例如论 文Xie QW，et al.Complementation analysis of mutants of nitric oxide synthase reveals that the active site requires two hemes.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 93：4891-4896，1996.等中有说明。SW626细胞是大 肠癌卵巢转移株，有关其详细资料在例如论文Fogh J，et al. Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors.J.Natl.Cancer Inst.58：209-214，1977.等有记载。 HT-3细胞是子宫颈部扁平上皮癌细胞，有关其详细情况在例如论 文Fogh J，et al.Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors.J.Natl.Cancer Inst.58：209-214，1977. 中有记载。这4种细胞株无论那一个都可从ATCC(American Type Culture Collection)等细胞保存机构获得，此外也可以使用市售的 产品。
A549细胞作为载体细胞使用时具有很多优点，如(1)可产 生高效力的溶瘤腺病毒，是非常坚韧的细胞，容易操作，(2)在 抗腺病毒抗体存在下，最强力抑制癌细胞的增殖，(3)A549细胞 由于原本是II型的肺胞上皮细胞，所以一感染腺病毒等病毒就放出 分泌颗粒，该性质被认为在癌治疗中起到有利作用，(4)感染腺 病毒后，A549细胞也难以受到CTL产生的杀细胞效果等。因此， 在上述4种细胞中使用A549细胞特别理想。
另外作为载体细胞也可以并用多种细胞。在下面的实施例中， 通过作为载体细胞并用A549细胞和293细胞，证实了强力的癌治 疗效果。如上所述，当并用多种细胞时，可以在癌治疗中利用各 细胞的特征、优点，很理想。例如，SW626细胞由于粘连(adhere) 需要比较长的时间，所以一注射到腹腔内，不只是停留在局部， 而是向整个周围扩散，认为非常适合卵巢癌等的腹腔内治疗。另 外，SW626细胞，其病毒产生量的峰值比A549细胞或293细胞等 更迟，所以具有作用时间比较长的特征。
在本发明的癌基因治疗药物中，作为使上述载体细胞感染的 溶瘤病毒，可以使用以往用于基因导入的病毒载体，例如腺病毒、 腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2 型(HSV-2)、HIV病毒(爱滋病毒)等慢病毒或小鼠白血病病 毒等逆转录病毒、呼肠病毒、水泡性口炎病毒(VSV)等，其它 的溶瘤病毒也可以。溶瘤病毒只要是增殖型病毒载体、并能够在 靶肿瘤细胞或肿瘤组织中特异增殖、具有改变病毒基因、融解·杀 伤靶细胞的细胞溶菌作用的病毒就可以，例如腺病毒的情况下， 只要是含有对于其增殖所必需的E1A或E1B区的病毒就可以。
本发明的癌基因治疗药物几乎可以适用于所有恶性肿瘤，可 成为治疗对象癌的种类可举例如卵巢癌、扁平上皮癌(子宫颈部 癌、皮肤癌、头颈部癌、食道癌、肺癌等)、消化器官癌(大肠癌、 胰癌、肝癌、胃癌等)、成神经细胞瘤、脑肿瘤、乳癌、精巢癌、 前列腺癌等。另外通过使用腺病毒34，35型等可感染血液细胞的病 毒，本发明的癌基因治疗药物也适用于血液性恶性肿瘤。
可以根据治疗对象癌的种类选择导入溶瘤病毒的肿瘤特异性 启动子的种类。例如，对于卵巢癌可以使用1A1.3B启动子、对于 脑肿瘤、恶性神经胶质瘤等可以使用中期因子启动子、对于精巢 癌可使用β-HCG启动子、对于扁平上皮癌可使用SCCA1启动子和 SCCA2启动子、对于大肠癌可使用CEA启动子、对于前列腺癌可 使用PSA启动子、对于肝癌可使用AFP启动子。当然，也可以使 用其它的众所周知的肿瘤特异性启动子，例如，对各种恶性肿瘤 发挥启动子活性并具有很宽作用谱的cox-2启动予以及其它骨钙 素启动子等各种癌特异性启动子。上述中期因子启动子对于除了 脑肿瘤、恶性神经胶质瘤之外的各种恶性肿瘤都可以使用，在这 点上具有与cox-2启动子同样宽的作用谱。
关于所使用的各启动子序列的长度等，只要可获得肿瘤特异 性启动子活性，就没有特别限定。上述1A1.3B启动子根据国际公 开第03/025190号论文和文献Cancer Research 63，2506-2512， 2003记载设计·制备，可以插入到病毒基因组。上述的中期因子启 动子、β-HCG启动子、SCCA1启动子分别根据国际公开第02/ 10368号论文、国际公开第01/90344号论文、国际公开第00/ 60068号论文的记载进行设计·制备，可以插入到病毒基因组。
关于上述SCCA1启动子在论文Biochimica et Biophysica Acta 91522(2001)1-8，Molecular cloning of human squamous cell carcinoma antigen 1 gene and characterization of its promoter， Katsuyuki Hamada，Hiroto Shinomiya，Yoshihiro Asano，Toshimasa Kihana，Mari Iwamoto，Yasushi Hanakawa，Koji Hashimoto，Susumu Hirose，Satoru Kyo，Masaharu Ito中进行了详细的说明。
例如，制作溶瘤腺病毒时，可以通过在作为腺病毒增殖必需 基因的初期基因E1A或E1B的上游插入肿瘤特异性启动子或与初 期基因E1A或E1B启动子置换而构建。在使用HSV-1、HSV-2、 逆转录病毒、呼肠病毒、水泡性口炎病毒(VSV)等腺病毒以外 的病毒时，同样可以通过在病毒增殖必需基因的上游插入肿瘤特 异性启动子或与该基因的启动子置换而构建。
当然，溶瘤病毒只要是在靶肿瘤细胞或肿瘤组织中具有特异 增殖的性质，就并不一定必须含有肿瘤特异性启动子。例如，也 可以使用ONYX公司的E1B基因缺失型溶瘤腺病毒，或UAB大学 的E1A基因部分缺损型的Ad5-Δ24腺病毒等不含有肿瘤特异性 启动子的溶瘤病毒。另外作为溶瘤病毒也可以使用野生型腺病毒， 或其一部分基因缺失后的病毒。
用溶瘤病毒感染载体细胞的方法可以按照常规方法进行，并 没有特别限定，例如将载体细胞加到平皿中，然后添加可使所有 细胞都感染的量的溶瘤病毒，于95％O2、5％CO2、37℃、胎牛血 清FCS(-)、RPMI培养基的条件下培养6小时至36小时左右使其 感染的方法比较简便。在下面的实施例中，A549细胞、SW626细 胞、HT-3细胞用这种方法培养从而感染溶瘤病毒，对于293细胞， 则在FCS(+)10％、DM EM培养基的条件下进行培养，从而感 染溶瘤病毒。另外，胎牛血清FCS在感染3-6小时时用FCS(-) 条件，当感染时间在上述时间以上时，置于FCS(-)状态3-6 小时，之后加FCS10％为好。
溶瘤病毒对载体细胞的感染量和感染时间可以根据治疗对象 的肿瘤大小·种类、载体细胞的种类·给予量、所使用的溶瘤病毒 的种类、本基因治疗药物的给予方法等选择最适的量和时间。虽 然没有特别限定，不过，作为一个例子，当载体细胞使用A549细 胞时，腹腔内给予时设定为约5-250vp/cell、大约6-24小时， 肿瘤内给予时设定为约5-500vp/cell、大约12-24小时，当为 SW626细胞时，腹腔内给予时设定为约250-2000vp/cell、大约6 -24小时，肿瘤内给予时设定为约100-500vp/cell、大约12-24 小时，当使用293细胞时，肿瘤内给予时设定为约5-50vp/cell、 大约12-24小时，腹腔内给予时设定为约0.1-10vp/cell、大约6 -24小时。这样，根据载体细胞的种类、给予方法不同，相应的 感染量·感染时间也不同，在上述例子中，腹腔内给予时，可以在 约0.1-2000vp/cell、大约6-24小时的范围，当肿瘤内给予时， 可以在约5-500vp/cell、大约12-24小时的范围分别设定感染量 ·感染时间。
用溶瘤病毒感染载体细胞、制备本发明的癌基因治疗药物时， 也可以在使用之前以不感染溶瘤病毒的状态保存载体细胞。另一 方面在将用溶瘤病毒感染、并经放射线照射的载体细胞冷冻，在 医疗现场将它解冻后做成使用的制品形态时，最好保存用病毒感 染的载体细胞。载体细胞的保存例如可以在液氮中或-150℃左右 的温度下保存。另外，溶瘤病毒可以在例如-80℃左右的温度下 保存。
使用时，通过上述方法使溶瘤病毒感染载体细胞，将得到的 病毒感染载体细胞直接或与惯用医药制剂载体做成本发明的癌基 因治疗药物，给予人(或小鼠、大鼠等实验动物)。如下面叙述的 那样，给予载体细胞时，最好是配合端胶原、铁剂、卟啉化合物 中的1或2个以上化合物后与载体细胞同时给予。另外，为了提高 CTL反应，最好给予不仅使溶瘤病毒感染、也使GM-CSF表达载 体感染的载体细胞，譬如用病毒载体双重感染的载体细胞。
将本发明的癌基因治疗药物与下面提到的免疫处理用病毒配 合构成时，在给予免疫处理用病毒后，经过规定期间后给予载体 细胞。载体细胞使用癌细胞时，最好是在病毒感染前或感染后进 行放射线照射。在下面的实施例中，载体细胞使用A549细胞、 SW626细胞、HT-3细胞时，在将这些细胞给予裸鼠前，分别于 120-400Gy、20-40Gy、20-40Gy下进行放射线照射。对A549 细胞的放射线照射量研究的结果表明如果是120Gy或其以上，就 没有观察到细胞增殖(图29)，所以照射量最好设定为120Gy～ 600Gy(更优选150Gy～400Gy)左右。
本发明的癌基因治疗药物最好是作为非口服剂给予，但也可 以作为口服剂使用。以非口服剂给予可以是体内法、间接体内法 中的任一种。运用体内法时，要根据肿瘤的大小·种类、症状的程 度、患者的年龄、体重等调整用量(换言之，病毒感染载体细胞 的给予量)，例如，可以通过静脉注射、点滴静脉注射、肿瘤内注 射、腹腔注射那样的腔内注射等来给予，载体细胞最好是通过肿 瘤内注射的方法给予。这样的注射剂可以按照常规方法制造，作 为稀释剂一般使用生理盐水、细胞培养液等。还可根据需要，加 入杀菌剂、防腐剂、稳定剂、等渗剂、止痛剂等。这些制剂中的 病毒感染载体细胞的配合量没有特别限定，可以任意设定。
当然，上述的病毒感染载体细胞也可以经数次给予患者，或 分为多个疗程，对于每一个疗程的给予次数、给予间隔等可以任 意设定。
如上述那样，病毒感染载体细胞的给予量可以根据肿瘤的大 小·种类、症状的程度、患者的年龄、体重等决定，通常情况下， 可以将1次载体细胞的给予量设定为大约107细胞数～1010细胞 数，将通过载体细胞给予溶瘤病毒的1次给予量设定在大约109病 毒粒子～1014病毒粒子。
载体细胞的种类可以根据治疗对象癌的种类等适当选择。另 外也可以通过基因重组技术改变载体细胞，例如变得容易与靶肿 瘤细胞结合那样地，在载体细胞的细胞表面人为地使特定蛋白质 等表达，也可以进行使仙台病毒感染载体细胞等处理。
溶瘤病毒通过细胞间相互作用(cell to cell interatcion)，由载 体细胞到靶肿瘤细胞进行感染，可以在肿瘤细胞内进行特异增殖， 发挥融解·杀伤肿瘤细胞的细胞溶菌作用。利用病毒的癌基因治疗 难点在于由于抗体的产生导致不能多次给予，而使用载体细胞由 于通过细胞间相互作用可以做到直接感染靶肿瘤细胞，所以可多 次给予，预期有强力的抗肿瘤效果。
〔2〕将本发明的癌基因治疗药物与下面提到的免疫处理用病 毒配合构成的情形及其合适的使用例
如以下说明的那样，最好是将本发明的癌基因治疗药物与免 疫处理用病毒配合构成。
与免疫处理用病毒配合时，本发明的癌基因治疗药物是配合 了为了诱导生物体对载体细胞的给予所产生的CTL反应而给予的 免疫处理用病毒、和用溶瘤病毒感染并使该病毒作用于生物体肿 瘤细胞的载体细胞的药物，即，配合了预先给予的免疫处理用病 毒和之后给予的载体细胞这2种药剂的药物，通过预先给予腺病毒 等病毒来实施免疫处理(预先免疫(immunization))后，给予 用溶瘤病毒感染的载体细胞，可诱导·引起生物体的CTL反应，在 体内可获得显著的抗肿瘤效果。
实际上在使用免疫功能正常的同系的模型小鼠的实验中，本 发明的癌基因治疗药物表现出显著的抗肿瘤效果。下面将进行详 细叙述，将卵巢癌细胞OVHM向(C57BL/6×C3/He)F1、鼠进行皮 下移植，然后局部注射用导入了卵巢癌特异性启动子的溶瘤腺病 毒感染的载体细胞(A549细胞)，在3个月前预先用腺病毒 (Ad-β-gal)实施免疫处理的小鼠中，在给予开始后3-4日就表 现出明显的抗肿瘤效果，9日后肿瘤完全消失，淋巴节转移也消失 (参照以下图7和图18)。
因此，尽管有抗体产生，在有了免疫力的小鼠中获得更强力 而且显著的抗肿瘤效果，可以认为这是由于免疫处理用腺病毒的 给予诱导·引起了生物体的CTL反应(通过细胞损伤性T细胞的细 胞损伤活性)的缘故。即，以往的利用病毒的癌基因治疗难点在 于由于抗体产生而不能多次给予，而本发明的癌基因治疗药物通 过利用生物体的免疫机构，攻击感染病毒的靶肿瘤细胞，可以说 是将它变成了武器。
免疫处理用病毒和溶瘤病毒最好是使用同种类病毒。对于免 疫处理用病毒最好使用非增殖型病毒和/或灭活的病毒，对非增 殖型病毒再通过紫外线照射等破坏DNA进行灭活就更好。例如， 免疫处理用病毒使用腺病毒时，可以使用E1区缺失的病毒和/或 经紫外线照射破坏DNA灭活的病毒。如此，对于免疫处理用病毒 也可以使用将增殖型病毒经紫外线照射等灭活后的病毒。
在下面的实施例中，作为免疫处理用病毒，使用E1区缺失， 整合了在巨细胞病毒(CMV)启动子的调控下编码β-半乳糖苷酶 (β-gal)的LacZ基因的腺病毒(Ad-β-gal)。显然，作为免 疫处理用病毒并不受此限定，也可以是增殖型腺病毒经紫外线 (UV)灭活的病毒，最好是对没有整合LacZ基因以及其它任何基 因、只有PolyA序列的非增殖型腺病毒(Ad-PolyA)进行紫外线 照射灭活后使用。
在本发明的癌基因治疗药物中，免疫处理用病毒的给予量虽 然可以根据患者的抗病毒抗体效价、肿瘤的大小·种类、症状程度、 患者年龄、体重等适当选择，但最好是根据抗病毒抗体为阳性， 还是阴性来改变给予量。例如，作为免疫处理用病毒和溶瘤病毒 使用5型腺病毒时，对于对该腺病毒为抗体阴性(-)的患者，免 疫处理用病毒的给予量大约定在105病毒粒子～1011病毒粒子，而 对于对该腺病毒为抗体阳性(+)的患者，免疫处理用病毒的给 予量大约定在102病毒粒子～107病毒粒子(根据情况，也可以给 予少于102病毒粒子或不给于)。免疫处理用病毒的给予方法虽然 没有特别限定，但最好是通过皮内注射或皮下注射的方法给予。
另外，在实验等中，对小鼠、大鼠等动物给予本发明的癌基 因治疗药物时，考虑体重差别后，可以按照给予人时的大约1000 分之一的量设定各药剂的给予量。
从给予免疫处理用病毒至给予载体细胞的期间大约设定在2 周～3个月，希望尽可能缩短期间。在下面的实施例中，通过对免 疫处理用病毒(腺病毒)进行紫外线照射灭活，已经可以将上述 期间缩短到3周～4周左右。
有关病毒感染载体细胞的给予量等前面已叙述过，可将通过 载体细胞一次给予溶瘤病毒的给予量大约设定在109病毒粒子～ 1014病毒粒子，将溶瘤病毒对载体细胞的感染量大约设定在 0.1vp/cell～2000vp/cell(优选5vp/cell～500vp/cell、更优选 150vp/cell～400vp/cell)。
在给予免疫处理用病毒的同时、或在其前后，最好给予用于 肿瘤免疫的肿瘤细胞(癌细胞)。即，在通过免疫处理用病毒进行 免疫的同时、或在其前后，最好利用肿瘤细胞进行接种(疫苗)(通 过给予预先进行了放射线、乙醇、甲醛等处理的肿瘤细胞，可做 到提高生物体对治疗对象肿瘤细胞的免疫应答)。
作为上述接种(疫苗)(肿瘤免疫)中使用的肿瘤细胞，希望 使用来自患者的肿瘤细胞，也可以使用被认为对与此细胞类似的 抗原进行提示的一般可获得的肿瘤细胞。在下面的实施例中，在 研究对卵巢癌(OVHM)治疗效果的实验中，肿瘤免疫中使用与 治疗对象肿瘤细胞种类不同的肿瘤细胞(扁平上皮癌细胞SCC7或 肺癌细胞A549细胞)时也证实了良好的癌治疗效果。
在上述接种(疫苗)(肿瘤免疫)中，肿瘤细胞的给予量没有 特别限定，例如，可以设定在大约105细胞数～1010细胞数。对肿 瘤细胞的放射线照射量最好设定在120Gy～600Gy(更优选 200Gy～500Gy)左右，肿瘤细胞的给予方法最好是使用皮内注 射或皮下注射的方法给予。
另外，为了提高在治疗对象癌中的病毒产生量，可以给予铁 剂和/或给予卟啉化合物。作为卟啉化合物如5-氨基酮戊酸 (5-aminolevulinic acid：ALA)、血卟啉(hematoporphyrin)、 光卟啉(photofrin)等。作为铁剂，口服剂如硫酸亚铁(FeSO4)、 柠檬酸亚铁、静脉注射用铁剂如硫酸软骨素铁、含糖氧化铁。给 予方法没有特别限定，最好是与本发明的癌基因治疗药物一起以 注射剂或口服剂形式给予。
实际上通过给予铁剂(Fe)和/或5-氨基酮戊酸(ALA)， 可以显著亢进溶瘤腺病毒AdE3-1A1.3B的癌细胞增殖抑制效果 (参照图15-17和图28)。
最好是与载体细胞一起给予端胶原(通过用胃蛋白酶处理等 只将胶原的末端肽键切断，使分子量变小，成为水溶性蛋白)。如 下面的实施例给出的那样，当将端胶原与载体细胞同时给予时， 由副作用所导致的死亡率锐减(图24)。这可认为是在溶瘤腺病毒 的扩散被端胶原抑制的同时，发生了对抗腺病毒抗体的封闭的缘 故。
因此，通过将端胶原与载体细胞同时给予，可抑制副作用， 溶瘤病毒的高给予成为可能。端胶原可以使用市售品(例如，株 式会社高研的制品)，或使用胶原经胃蛋白酶处理等制造的产品。 端胶原最好是与载体细胞一起混在注射液中给予，药液中浓度为 0.01-3.0％(w/v)左右被认为可充分发挥效果(在下面的实施 例中，即使药液中为0.1-0.2％的低浓度也充分证实了效果)。
另外，如上所述，为了提高免疫反应，最好给予不仅使溶瘤 病毒、而且还使GM-CSF表达载体感染载体细胞，譬如用病毒载 体双重感染的载体细胞(或也可以采用同时给予使两载体分别感 染的载体细胞的方法)。
对于GM-CSF表达载体最好使用与溶瘤病毒同种类的病毒 载体。例如，使用腺病毒作为溶瘤病毒时，对于GM-CSF表达载 体可以使用E1区缺失、整合了编码GM-CSF(granulocyte- macrophage colony stimulating factor：粒细胞·巨噬细胞集落刺激 因子)的GM-CSF基因的腺病毒。
因此当使病毒载体感染载体细胞时，将溶瘤病毒和GM-CSF 表达载体两者合起来的感染量大约定为5病毒粒子/细胞～2000 病毒粒子/细胞。
实际上通过使用GM-CSF表达载体证实了非常好的癌治疗 效果(图27)。
另外，也可考虑取代使用GM-CSF表达载体，使用将GM- CSF蛋白与载体细胞一起混在注射液或经静脉全身给予的方法。
本发明的癌基因治疗药物的使用方法显然并不限定于上述的 方法，可以考虑各种各样的使用例子。例如，为了提高溶瘤病毒 的感染力，也可以将本发明的癌基因治疗药物与其它的抗癌剂或 放射线照射等并用。
关于本发明的癌基因治疗药物的较佳使用例，分为(1)对于 免疫处理用病毒的抗体为阴性的患者情况，(2)该抗体为阳性的 患者情况进行说明。
上述(1)的情况，对于免疫处理用病毒，例如，将上述的非 增殖型腺病毒经紫外线照射灭活后使用。给予量大约定为105vp至 1011vp左右。在给予免疫处理用病毒的同时，给予大约105个至1010 个用于肿瘤免疫的用200Gy左右进行放射线处理的来自患者的肿 瘤细胞(癌细胞)。免疫处理用病毒和肿瘤细胞的给予方法采用皮 内注射或皮下注射。
在给予免疫处理用病毒和肿瘤细胞后大约3-4周后，通过肿 瘤内注射给予载体细胞。载体细胞的给予量定为例如每1次1×107 个-1×1010个左右。使用A549细胞作为载体细胞，经150Gy至 400Gy左右放射线处理后给予。溶瘤病毒和GM-CSF表达载体使 用腺病毒，分别以250vp/cell左右、5-20vp/cell左右使载体细胞 感染。注射液中按照液中浓度大约为0.1-0.2％那样混合端胶原后 注射。另外同时将铁(Fe)按照40-100mg左右进行静脉注射。 或同时将ALA按照2-2000mg给予到肿瘤内。
将以上操作作为1次，给予1-6次载体细胞等。当多次给予时， 可以连日或每隔2、3日注射。
患者为抗体阳性的上述(2)的情况，除了将免疫处理用病毒 的给予量定为大约105vp或其以下以外，与上述(1)同样，给予 本发明的癌基因治疗药物。
作为本发明的癌基因治疗药物的具体例子，可举例如(1)特 定的载体细胞，(2)再配合使载体细胞感染的溶瘤病毒，(3)在 上述(1)或(2)的配合中再配合免疫处理用病毒，(4)在上述 (1)～(3)的配合中再配合端胶原，(5)在上述(1)～(4) 的配合中再配合GM-CSF表达载体，(6)在上述(1)～(5)的 配合中再配合用于提高病毒产生量的铁剂和/或卟啉化合物，(7) 在上述(1)～(6)的配合中再配合用于肿瘤免疫而给予的肿瘤 细胞，(8)在上述(1)～(7)的配合中再配合保存、感染·培养、 医药制剂的制备等中所需的化合物(试剂、缓冲液、酶等)、或容 器(反应用、感染·培养用、保存用等)等。
实施例
以下参照附图，对本发明的实施例进行说明，但本发明并不 限定于这些实施例。
〔实施例1：载体细胞的筛选以及在抗体存在下的抗肿瘤效 果〕
为了在已有的癌细胞株中筛选作为载体细胞发挥强力的癌细 胞增殖抑制效果的细胞株，进行以下实验。
作为使载体细胞感染的溶瘤病毒使用腺病毒AdE3-1A1.3B (IAI.3B)。该腺病毒AdE3-1A1.3B含有E1A基因和E3基因，而 且是在E1A基因上游含有作为肿瘤特异性启动子的卵巢癌特异性 1A1.3B启动子(IAI.3B启动子)的腺病毒。使该腺病毒AdE3- 1A1.3B对各种载体细胞按照500vp/cell感染2日后，将该载体细胞 加到培养到第2天的卵巢癌细胞株HEY中，在培养第5天调查该细 胞株HEY的体外增殖抑制效果。
上述实验结果如图1所示。图1的图表纵轴表示得到的有关各 种候选细胞株的50％增殖抑制效果(IC50)的细胞数，细胞数越 少的细胞株，其增殖抑制效果越高。如该图表示的那样，在此次 研究的癌细胞株中，293细胞、A549细胞、SW626细胞、HT-3 细胞(HT-III细胞)依次表现出很高的增殖抑制效果。293细胞、 A549细胞和SW626细胞与以往作为载体细胞使用的PA-1细胞相 比，表现出高出大约100倍左右的增殖抑制效果。HT-3细胞也表 现出与SW626细胞同等程度的高的增殖抑制效果。
然后，在单独溶瘤病毒的场合下和使用载体细胞的场合下， 对在病毒抗体存在下增殖抑制效果怎样变化进行了研究。载体细 胞使用293细胞，使上述腺病毒AdE3-1A1.3B感染该293细胞2 日，将得到的腺病毒AdE3-1A1.3B感染293细胞和其细胞上清 (AdE3-1A13B 293 cell+SUPT)在抗腺病毒抗体存在下加到12孔 板中。各孔中前一天加有5万个左右的卵巢癌细胞株HEY。对于抗 腺病毒抗体，将具有600倍抗体效价的抗体稀释为各种各样的抗体 效价后使用。同样，作为单独溶瘤病毒的场合，将腺病毒AdE3- 1A1.3B在抗腺病毒抗体存在下按照1孔1000vp/cell加到12孔板 中。然后对于在各个场合下培养到第5天的癌细胞(HEY细胞)的 增殖抑制效果进行研究。
上述实验结果如图2所示。该图表的纵轴表示得到50％的增殖 抑制效果(IC50)时的抗腺病毒抗体的稀释度。即，使用293细 胞时，即使稀释5倍左右(120倍的抗体效价)也可获得50％的增 殖抑制效果，单独腺病毒的场合通过稀释600倍左右(1倍的抗体 效价)可获得50％的增殖抑制效果。因此使用载体细胞时显示出 即使在抗体效价高的条件下也能发挥增殖抑制效果。
同样在抗腺病毒抗体存在下，研究在(1)腺病毒感染293细胞 的上清和细胞成分(AdE3-1A13B 293cell+SUPT)、(2)含有腺病毒 的细胞上清(AdE3-1A13B，SUPT)、(3)含有腺病毒的细胞上清经 0.2μm过滤膜处理(AdE3-1A13B，SUPT，filter)、(4)单独腺病毒 (AdE3-1A13B)等各个场合下对HEY细胞的增殖抑制效果。研 究结果如图3所示。该图表的纵轴表示获得50％增殖抑制效果 (IC50)时的抗腺病毒抗体的稀释度。如该图表示的那样，使用 载体细胞(293细胞)的场合与其它场合比可获得更强力的抗肿瘤 效果。
另外在与上述同样的实验中，对于293细胞、A549细胞、 SW626细胞、HT-3细胞的各载体细胞，在具有600倍抗体效价的 抗腺病毒抗体存在下(Ab(+))、或不存在下(Ab(-))研究对 癌细胞株HEY细胞的增殖抑制效果。其结果如图4所示。该图表的 纵轴表示培养第5天的癌细胞数。如该图所示那样，在上述4种细 胞中，使用A549细胞作为载体细胞时，表现出最强力的增殖抑制 效果。即在足量的抗腺病毒中和抗体存在下给予腺病毒感染A549 细胞，靶癌细胞的增殖尽管在抗体存在下也几乎完全被抑制。至 于另外3种细胞在抗体存在下也获得了充分的增殖抑制效果。
利用病毒进行癌基因治疗难点在于由于抗病毒的中和抗体产 生而不能多次给予，通过使用载体细胞，利用细胞间相互作用可 以直接做到感染靶癌细胞，从而可以多次给予。另外，通过使用 上述4种细胞作为载体细胞，可以获得强力的抗肿瘤效果。
〔实施例2：裸鼠皮下肿瘤模型中的体内抗肿瘤效果〕
以下，使用裸鼠皮下肿瘤模型，对本发明的癌基因治疗药物 的体内抗肿瘤效果进行研究。在实验中，将人卵巢癌细胞RMG- 1移植到出生后5周的裸鼠皮下，4周后、对于变成直径约10- 15mm的巨大肿瘤，向肿瘤内注射6次本发明的癌基因治疗药物， 观察肿瘤体积的变化。观察的结果如图5的图表所示。图表中、黑 方块的“对照”是肿瘤内注射6次PBS缓冲液的结果、黑圆的 “AdE3-1A1.3B”是按照1只小鼠1×1010病毒粒子给予上述腺病毒 AdE3-1A1.3B的结果、黑三角是按照1只小鼠1×107个给予用腺 病毒AdE3-1A1.3B以250vp/cell感染的SW626细胞的结果、黑菱 形是按照1只小鼠1×107个给予用腺病毒AdE3-1A1.3B以 25vp/cell感染的293细胞的结果、白方块是按照1只小鼠1×107个 给予用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549细胞的结 果。如该图表示的那样，使用293细胞和A549细胞作为载体细胞 时，给予后经过50天，直径约10-15mm的巨大肿瘤完全消退。 SW626细胞表现出98％的增殖抑制效果。
将人卵巢癌细胞PA-1移植到出生后5周的裸鼠皮下进行与上 述同样的实验。其结果如图6所示。如该图所示那样，使用293细 胞和A549细胞作为载体细胞，直径约10-15mm的巨大肿瘤完全 消退。SW626细胞使得5只小鼠中的4只的肿瘤完全消失。
〔实施例3：在具有免疫力的皮下肿瘤模型小鼠中的体内抗肿 瘤效果〕
以下，使用免疫功能正常的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠对本发 明的癌基因治疗药物的体内抗肿瘤效果进行了研究。在本实验中， 对有关如下场合的抗肿瘤效果进行研究：(1)对同系的模型小鼠皮 下移植同种卵巢癌细胞OVHM，对移植10日后形成的5-10mm皮 下肿瘤，向肿瘤内给予6次用上述腺病毒AdE3-1A1.3B以 250vp/cell感染的放射线处理(放射线治疗)后的A549细胞的场 合，(2)通过给予作为免疫处理用病毒的腺病毒，对出生后7周的同 系的模型小鼠进行预先免疫，3个月后，与上述(1)的场合同样地， 皮下移植卵巢癌细胞OVHM，移植10日后、向肿瘤内给予6次用上 述腺病毒AdE3-1A1.3B以250vp/cell感染的放射线处理后的 A549细胞的场合，(3)作为对照，向肿瘤内给予6次PBS缓冲液的 场合等。
图7的图表给出了上述实验结果。图表中，黑方块的“对照”是 上述(3)对照的结果，黑圆的“Ad(-)→A549”是上述(1)的没有给予 免疫处理用腺病毒时的结果，黑三角的“Ad(+)→A549”是上述(2) 的给予免疫处理用腺病毒时的结果。另外，免疫处理用腺病毒使 用不含有E1基因的非增殖型腺病毒，更具体讲使用在CMV启动子 的下游插入了LacZ基因的腺病毒。如该图表示的那样，在预先没 有用腺病毒免疫的上述(1)的情况下，与对照相比表现出20％的抗 肿瘤效果，反之在用腺病毒实施免疫处理的上述(2)的情况下，在 注射开始后3-4日表现出明显抗肿瘤效果，9日后肿瘤完全消失， 淋巴节转移也消失。因此，尽管有抗体产生，在有了免疫力的小 鼠中获得了更强力而且显著的抗肿瘤效果，这可以认为是由于免 疫处理用腺病毒的给予诱导·引起生物体的CTL反应的缘故。
溶瘤病毒通过细胞间相互作用，由载体细胞到靶肿瘤细胞进 行感染，可以在肿瘤细胞内进行特异增殖，发挥融解·杀伤肿瘤细 胞的细胞溶菌作用，在本发明的癌基因治疗药物中，认为通过预 先给予免疫处理用腺病毒，诱导生物体排除感染了溶瘤腺病毒的 靶肿瘤细胞的强的CTL反应，可诱导腺病毒感染肿瘤细胞的完全 自然排除。
作为腺病毒感染靶肿瘤细胞的感染方法之一，可以考虑腺病 毒引起的细胞融合。图8给出了向加入了A549细胞的孔中按照每1 细胞10000病毒粒子加入经紫外线照射灭活的腺病毒，培养过夜后 通过显微镜观察的结果。如该图箭头表示的那样，通过加入腺病 毒引起细胞融合，在各处看到多核细胞。在没有给予腺病毒的 A549细胞中没有观察到这样的变化(参照图9)。
除了细胞融合以外，作为可考虑的感染方法，认为通过载体 细胞附着靶细胞，再通过局部的腺病毒的猝发或通过含有腺病毒 的载体细胞片段可做到使腺病毒感染靶肿瘤细胞。无论那一种方 法，在感染了病毒的靶肿瘤细胞中，含有肿瘤特异性启动子的腺 病毒增加，成为强力的免疫原(或通过对感染了腺病毒的靶肿瘤 细胞所含有的癌特异性肽进行二次抗原识别)，认为通过CTL反应 可以排除肿瘤细胞。
〔实施例4：使用中期因子启动子时的抗肿瘤效果〕
接下来对使用中期因子启动子时的抗肿瘤效果进行研究。图 10(a)是通过RT-PCR对中期因子(MK)mRNA在1～21个人 手术标本中的表达进行研究的结果。如该图表示的那样，证实中 期因子mRNA在成神经胶质细胞瘤(glioblastoma)、称为未分化 星形细胞瘤(anaplastic astrocytoma)的恶性神经胶质瘤(malignant glioma)和弥散性星形细胞瘤(diffuse astrocytoma)中过量表达。 因此，确认中期因子在脑肿瘤等很多癌中过量表达。
图10(b)是用与上述同样的方法，通过RT-PCR对中期因 子mRNA在恶性神经胶质瘤的4个细胞株中的表达进行研究的结 果。如该图表示的那样，证实在4个细胞株中，在U87MG中没有 表达，在U251MG、LN319、U373MG中中期因子mRNA过量表 达。
图10(c)是通过免疫印迹法解析对中期因子蛋白在上述各细 胞株中的表达进行研究的结果，被证实与mRNA同样在U87MG没 有表达，中期因子蛋白在U251MG、LN 319、U373MG中过量表 达。
然后进行中期因子的启动子分析。在实验中，比较了长度不 同的2个中期因子启动子(600个碱基与2300个碱基)的活性。将 在各个启动子的下游插入了虫荧光素酶基因的质粒(pGL3- MK600和pGL3-MK2300)导入上述各细胞株，通过研究各个细 胞株的虫荧光素酶活性来评价启动子活性。其结果如图11表示的 那样，在恶性神经胶质瘤细胞株中，长度为600个碱基的启动子表 现出比长度为2300个碱基的启动子更高的启动子活性。
图12(a)是表示此次设计的含有中期因子启动子的溶瘤(细 胞溶菌型)腺病毒构造的模式图。长度为600个碱基或2300个碱 基的中期因子启动子被导入到552bp的位置。
图12(b)是使3种腺病毒感染上述各细胞株，通过免疫印迹 法解析对E1A蛋白在各个细胞株中的表达进行研究的结果。如该 图表示的那样，用含有长度为600个碱基的中期因子启动子的腺病 毒(AdMK600)感染时，只在表达中期因子的U251MG、LN319、 U373MG中观察到腺病毒的E1A蛋白的表达。与此相反，使用野 生型的腺病毒(AdWild)时，在包括正常脑细胞在内的所有细胞 中都可观察到E1A蛋白的表达，使用对照病毒AdLacZ时，无论在 那一个细胞中都没有观察到E1A蛋白的表达。
图13(a)是对3种腺病毒产生的癌细胞增殖抑制效果进行比 较研究的结果。使用野生型的腺病毒(AdWild)时，在所有细胞 中都表现出强的增殖抑制效果，而使用含有中期因子启动子的腺 病毒(AdMK600和AdMK2300)时，只在表达中期因子的 U251MG、LN319、U373MG中表现出增殖抑制效果，这些值与 中期因子mRNA的表达量、启动子活性密切相关。另外，与含有 长度为2300个碱基的中期因子启动子的腺病毒AdMK2300相比， AdMK600表现出强的增殖抑制效果。
图13(b)是研究腺病毒的E3区对增殖抑制效果的影响的结 果，如该图表示的那样，含有E3区的AdMK600表现出比没有E3 区的腺病毒(AdMK600-ΔE3)强10倍左右的增殖抑制效果。
图13(c)是对腺病毒在肿瘤直径5-10mm左右大小的裸鼠皮 下移植模型中的抗肿瘤效果进行研究的结果。图中，黑菱形是给 予野生型腺病毒AdWild的结果，黑方块是给予含有中期因子启动 子的腺病毒AdMK600的结果，黑三角是给予插入了LacZ基因的腺 病毒Ad-β-gal的结果，黑圆是只给予PBS缓冲液的结果。如该图 表示的那样，在不表达中期因子的U87MG中只有野生型腺病毒表 现出抗肿瘤效果，而在表达中期因子的U373MG中，AdMK600和 AdWild都带来肿瘤的完全消失，在只注射了PBS缓冲液的对照和 注射AdLacZ的模型之间没有看到大的差异。
另外，使含有上述中期因子启动子的腺病毒(Ad-MK600) 感染载体细胞，将该病毒感染载体细胞的抗肿瘤效果与单独给予 Ad-MK600的场合进行了比较。实验中使用293细胞和A549细胞 作为载体细胞。将上述U373MG细胞移植到5周龄裸鼠中，3周后 获得10-15mm的巨大肿瘤后，给予病毒感染载体细胞或只给予 Ad-MK600，给予4周后比较肿瘤体积的大小。结果如图14所示。 图中，“Ad-MK600”是单独给予Ad-MK600的结果、“293”“A549” 是分别给予使用293细胞、A549细胞作为载体细胞的病毒感染载 体细胞的结果。如该图表示的那样，给予病毒感染载体细胞时肿 瘤完全消失了。另外单独给予Ad-MK600时与对照(control)之 间几乎看不到差别。
由到此为止的实验结果可以证实通过使用A549细胞、293细 胞等作为载体细胞，使用含有1A1.3B启动子或中期因子启动子的 腺病毒作为溶瘤病毒，实际上对卵巢癌、恶性神经胶质瘤表现出 良好的治疗效果。中期因子启动子对除了恶性神经胶质瘤之外的 各种恶性肿瘤都可以使用，可以认为对除了恶性神经胶质瘤以外 的癌治疗都有效。
〔实施例5：Fe和ALA对腺病毒AdE3-1A1.3B的增殖抑制效 果的影响〕
将卵巢癌细胞HEY按照10000/well加到12孔平皿后，次日按 照50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml的各浓度加入FeSO4，向 所有孔中加细胞损伤型腺病毒AdE3-1A1.3B，5日后以IC50对腺 病毒的增殖抑制效果进行评价。评价结果如图15所示。图中纵轴 相对地表示各场合下的IC50的病毒给予量(vp/cell)。如该图表示 的那样，在并用50μg/ml的FeSO4和腺病毒时，比单独腺病毒表现 出约20倍的增殖抑制效果，当并用5μg/ml的FeSO4和腺病毒时比 单独腺病毒表现出约8倍的增殖抑制效果。
接下来将卵巢癌细胞HEY按照10000/well加到12孔平皿后， 次日按照50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml的各浓度加入5- 氨基酮戊酸(ALA)，向所有孔中加入细胞损伤型腺病毒 AdE3-1A1.3B，5日后以IC50对腺病毒的增殖抑制效果进行评价。 评价结果如图16所示。图中纵轴相对地表示各场合下的IC50的病 毒给予量(vp/cell)。如该图表示的那样，在并用50μg/ml的ALA 和腺病毒时，比单独腺病毒表现出约100倍的增殖抑制效果。
另外将卵巢癌细胞H EY按照10000/well加到12孔平皿后，次 日按照50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml的各浓度加FeSO4， 向所有孔中加入细胞损伤型腺病毒AdE3-1A1.3B和5-氨基酮戊 酸(ALA)50μg/ml、或作为对照单独加入腺病毒，5日后以IC50 对腺病毒的增殖抑制效果进行评价。评价结果如图17所示。图中 纵轴相对地表示各场合下的IC50的病毒给予量(vp/cell)。如该图 表示的那样，在并用FeSO450μg/ml、ALA 50μg/ml和腺病毒时， 比单独腺病毒表现出约1000倍的增殖抑制效果，当并用FeSO45μg/ml、ALA 50μg/ml和腺病毒时比单独腺病毒表现出约700倍的 增殖抑制效果，当并用FeSO40.5μg/ml、ALA 50μg/ml和腺病毒 时比单独使用腺病毒表现出约200倍的增殖抑制效果。
如上所述，显然ALA和Fe对溶瘤腺病毒AdE3-1A1.3B的增殖 抑制效果具有显著的亢进。其理由在于，通过β-gal分析表明提高 腺病毒的感染能力，通过PFU分析表明腺病毒的产生量增加，显 然ALA和Fe可提高腺病毒的感染力、使产生量增加，即随着腺病 毒对癌细胞内的感染力的增加和在细胞内的产生量增加，显著提 高了抗肿瘤效果。
以前就知道ALA是卟啉代谢物，被整合到癌细胞中，作为其 代谢物的原卟啉IX容易蓄积，由于该代谢物具有光敏作用，与准 分子染料激光器(excimer dye laser)并用，一直用于表面性癌 的PDT治疗(photodynamic therapy)。
上述原卟啉IX通过与Fe结合形成血红素，在细胞内形成细胞 色素等血红素蛋白。该血红素蛋白在细胞内线粒体参与呼吸系统， 在ATP产生中起作用，参与蛋白合成。因此，血红素蛋白由于参 与用于腺病毒感染时产生腺病毒的蛋白合成，所以认为这些卟啉 代谢亢进与腺病毒产生增加有关的可能性很大。
因此，在本发明的癌基因治疗药物、癌基因治疗方法中，通 过并用这些Fe和/或ALA等卟啉化合物，预期可进一步提高治疗 效果。即，通过并用Fe和/或ALA等卟啉化合物，可直接增加抗 肿瘤效果、甚至在抗体存在下的感染抑制状态下，通过靶细胞的 腺病毒产生的增加所导致的CTL反应的亢进，在同系的小鼠模型 中抗肿瘤效果提高，认为在人中也会呈现出同样的良好的抗肿瘤 效果。
另外在使用溶瘤病毒的癌基因治疗中，即使不使用载体细胞 的场合，预期通过并用Fe和/或ALA等卟啉化合物，也可提高治 疗效果。
〔实施例6：使用本发明的癌基因治疗药物的癌治疗法最优化 的研究〕
为了谋求将使用本发明的癌基因治疗药物的癌治疗法的最优 化，进行了以下一系列实验。
首先与图7所示实验同样地，使用免疫功能正常的皮下肿瘤模 型小鼠((C57BL/6×C3/He)F1小鼠)，对本发明的癌基因治疗药物 的体内抗肿瘤效果进行了研究。在本实验中，通过给予免疫处理 用病毒预先对出生后5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠进行免疫处 理，免疫12周后，按照1只小鼠1×106个皮下移植卵巢癌细胞 OVHM，形成5-10mm的肿瘤后，向肿瘤内给予用上述腺病毒 AdE3-1A1.3B以250vp/cell感染的A549细胞(Ad-A549)。作 为免疫处理用病毒使用不含有E1基因的非增殖型的腺病毒，更具 体讲，使用在CMV启动子的下游插入了LacZ基因且未经紫外线等 灭活处理的腺病毒Ad-β-gal，将该Ad-β-gal按照每只小鼠 11×1010vp进行皮内给予。另外，载体细胞A549细胞经用200Gy 进行放射线处理后，按照1只小鼠1次5×106个向肿瘤内共计给予6 次。
图18(a)、(b)给出了上述实验结果。各图表中， “Ad-β-gal→Ad-A549”是上述实验结果，“Ad-A549”是只给予载 体细胞的结果，“Ad-β-gal”是没有给予免疫处理用病毒，作为治 疗只给予Ad-β-gal的结果，“对照”是给予PBS缓冲液的结果。各 组小鼠数为n＝5。(a)的图表是在比较短期观察各小鼠的肿瘤体 积的结果，(b)的图表是长期观察各组小鼠存活率的结果。如这 些图表示的那样，确认“Ad-β-gal→Ad-A549”具有强力的体内抗 肿瘤效果。
然后对从免疫处理用腺病毒给予至载体细胞给予的给予间隔 进行研究。本实验除了对该给予间隔进行各种各样的改变以及用 腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染载体细胞A549细胞以外， 其它与图18所示实验同样地进行。
图19(a)、(b)给出了上述实验结果。各图表中“2-4w”、 “5-9w”、“10-15w”、“16-22w”为分别将上述给予间隔设定 为2-4周、5-9周、10-15周、16-22周的间隔的实验结果，各 组小鼠数为n＝5。如这些图表示的那样，将上述给予间隔设定为 10-15周时可获得最好的抗肿瘤效果。像本实验那样，当作为免 疫处理用病毒使用未经灭活处理的腺病毒Ad-β-gal时，在给予 该病毒后大约10-15周，认为由T细胞引起的CTL反应与由中和抗 体引起的感染抑制相比处于优势。
如果考虑临床应用，上述给予间隔希望是较短期间。因此， 通过使用灭活处理的腺病毒Ad-β-gal作为免疫处理用病毒，研 究能否将上述给予间隔缩短。研究结果如图20所示那样，可知当 作为免疫处理用病毒使用紫外线(UV)照射灭活处理的腺病毒UV -Ad-β-gal时，将上述给予间隔设定在4周或3周时可获得良好 的抗肿瘤效果，即，通过对免疫处理用病毒进行灭活处理，可以 将上述给予间隔缩短到3-4周左右。
上述实验除了将灭活处理的腺病毒UV-Ad-β-gal作为免 疫处理用病毒使用、将上述UV-Ad-β-gal按照每只小鼠 1×107vp进行皮内给予、将上述给予间隔设定为3周、4周、5周或 6周以及使腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染载体细胞A549 细胞以外，其它与图18所示实验同样地进行。各组小鼠数为n＝10。
图21是对将上述UV-Ad-β-gal作为免疫处理用病毒使用 时的该病毒的给予量进行研究的结果。在该实验中，在1×106vp 至1×1011vp范围内改变上述UV-Ad-β-gal的给予量。另外，除 了上述给予间隔设定为6周以外，其它与图20所示实验同样地进 行。其结果表明UV-Ad-β-gal给予量为1×107vp时可获得最好 的抗肿瘤效果(根据该结果，在图20所示的实验中，将UV-Ad -β-gal的给予量设定为1×107vp)。
图22(a)、(b)是对肿瘤免疫(tumor vaccination)效果进 行研究的结果。将上述UV-Ad-β-gal按照每只小鼠1×107vp进 行皮内给予，给予10日后将用于肿瘤免疫的经放射线照射的卵巢 癌细胞OVHM1×106个进行皮下移植。同时将扁平上皮癌细胞 SCC7或卵巢癌细胞OVHM1×106个进行皮下移植，向形成了5- 10mm肿瘤的小鼠肿瘤内给予6次每次5×106个AdE3-1A1.3B感 染A549细胞的小鼠(图中，“OVHM-RT+Ad-β-gal→SCC7”、 “OVHM-RT+Ad-β-gal→OVHM”)与对照(图中，不进行肿 瘤免疫而对SCC7肿瘤进行载体细胞治疗的“SCC7”、不进行肿瘤 免疫而对OVHM肿瘤进行载体细胞治疗的“OVHM”)相比，肿瘤 的成长·增殖被显著抑制，特别是对使用经放射线照射的OVHM进 行肿瘤免疫、形成OVHM肿瘤的小鼠使用载体细胞进行治疗时， 所有小鼠中肿瘤都消失，没有看到复发。
图23是对使用非小细胞性肺癌细胞A549细胞进行的肿瘤免 疫效果进行研究的结果。在该实验中，将用腺病毒AdE3-1A1.3B 以100vp/cell感染的经放射线处理后的A549细胞按照每只小鼠 1×106个进行皮下移植，移植40日后皮下移植1×106个卵巢癌细胞 OVHM。在该小鼠(图中，“AdE3-1A1.3B-感染A549→OVHM”) 与对照(图中，没有进行肿瘤免疫，形成OVHM肿瘤，通过载体 细胞进行治疗的“OVHM”)相比，肿瘤的成长·增殖被显著抑制， 存活率大大改善。
由以上结果可知即使用不同种类的癌细胞进行肿瘤免疫，也 有抗肿瘤效果。
接下来对将载体细胞和端胶原一起给予时的效果进行研究。 在该实验中，将用腺病毒AdE3-1A1.3B以规定量感染的A549细 胞5×106个给予出生后5-10周的(C57BL/6×C3/He)F1鼠，此时 混合注入端胶原使其最终浓度达到0.1％，研究是否可改善由于腺 病毒的给予所带来的副作用引起的死亡率。研究结果如图24所示。 图中右侧条是将端胶原与用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell或 250vp/cell感染的A549细胞一起给予的结果，左侧和中央条分别 是给予用腺病毒AdE3-1A1.3B分别以5vp/cell、50vp/cell感染的 A549细胞的结果(没有混合注入端胶原)。如该图表示的那样， 同时给予端胶原时，由副作用引起的死亡率锐减，还可增加给予 量。这可认为是端胶原抑制腺病毒的扩散，并发生了对抗腺病毒 中和抗体的封闭的缘故。
由以上结果可知通过同时给予端胶原与载体细胞，可以抑制 副作用，可给予高容量的腺病毒。
然后，对给予1次、2次、3次灭活处理的上述腺病毒Ad-β- gal、由于猝发效果使得各个血中抗腺病毒抗体增加的小鼠中的抗 肿瘤效果进行了研究。在该实验中，给予出生后5周的 (C57BL/6×C3/He)F1鼠1次、2次或3次腺病毒Ad-β-gal(各 次每隔3周，1次给予1×1010vp)，然后，按照1只小鼠1×106个皮下 移植卵巢癌细胞OVHM，形成5-10mm肿瘤后，将放射线处理后 的载体细胞给予到肿瘤内。作为载体细胞单独使用A549细胞、或 将A549细胞和293细胞混合后使用。
A549细胞与293细胞的混合物，对每只小鼠向肿瘤内注射用 腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549细胞3.75×106个， 和用腺病毒AdE3-1A1.3B以10vp/cell感染的293细胞3.75×106 个，此为一次，共计向肿瘤内注射6次。结果如图25(a)、(b)所 示。而单独A549细胞的场合，每只小鼠向肿瘤内注射用腺病毒 AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549细胞7.5×106个，此为一 次，共计向肿瘤内给予6次。其结果如图26(a)、(b)所示。在图 25和图26中，“×1”“×2”“×3”分别是给予1次、2次、3次腺病毒 Ad-β-gal的结果。如这些图表示的那样，通过多次给予腺病毒 Ad-β-gal，即使在抗腺病毒抗体阳性的小鼠中，也可确认载体 细胞产生的抗肿瘤效果。另外在此次实验中，与单独A549细胞相 比，将A549细胞和293细胞混合后作为载体细胞使用成绩更好。
图27(a)、(b)是对给予不仅用腺病毒AdE3-1A1.3B，而 且用GM-CSF表达载体感染的载体细胞(A549细胞)，并且与该 载体细胞一起给予端胶原时的体内抗肿瘤效果进行研究的结果。 在该实验中，与图26所示实验同样，向出生后5周的 (C57BL/6×C3/He)F1小鼠注射1次、2次或3次(各次每隔3周，1 次注射1×1010vp)腺病毒Ad-β-gal，然后，按照1只小鼠1×106 个皮下移植卵巢癌细胞OVHM，形成5-10mm肿瘤后，将放射线 处理后的载体细胞给予到肿瘤内。其中，载体细胞(A549细胞) 在用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的同时，还用GM- CSF表达载体(在缺失了腺病毒的E1基因的部位的CMV启动子下 游插入了GM-CSF基因的载体)以10vp/cell感染。将这样制备的 经放射线处理后的A549细胞按照1次7.5×106个与端胶原(浓度 0.1％)一起给予到肿瘤内，向肿瘤内共计注射3次(×3)。
图27(a)、(b)中，“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+GMCSF” 是上述实验结果，“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B”是按照1次7.5×106 个给予只用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的载体细胞 (A549细胞)，向肿瘤内共计给予6次(×6)的结果。如该图表示 的那样，使用“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+GMCSF”是，尽管 给予3次，但与给予6次“AdE3-1A1.3B”相比，给予腺病毒Ad -β-gal 1次、2次、3次的任一场合都可看到非常强的体内抗肿 瘤效果。
由以上结果可知对载体细胞不仅感染溶瘤腺病毒，而且还感 染GM-CSF表达载体，对癌治疗是非常有效的。
图28(a)、(b)是对在给予载体细胞时还向腹腔内给予铁剂 时的效果进行研究的结果。在该实验中，与图27所示实验同样， 向出生后5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠注射1次、2次或3次(各 次每隔3周，1次注射1×1010vp)腺病毒Ad-β-gal，然后，按照 1只小鼠1×106个皮下移植卵巢癌细胞OVHM，形成5-10mm肿瘤 后，将放射线处理后的载体细胞给予到肿瘤内。其中，在给予载 体细胞时，向腹腔内给予作为铁剂的铁葡聚糖(Fe-Dextran) 0.01mg。载体细胞使用用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/ceU感染 的A549细胞，1次7.5×106个向肿瘤内共计给予3次(×3)(每次还 给予铁剂)。
图28(a)、(b)中，“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+Fe”是上 述实验结果，“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B”是按照1次7.5×106个 给予用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的载体细胞(A549 细胞)，向肿瘤内共计给予6次(×6)的结果。如该图表示的那样， 使用“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+Fe”，尽管只是3次，但给予1 次、2次、3次腺病毒Ad-β-gal的任一情况下的利用载体细胞的 治疗与使用AdE3-1A1.3B感染载体细胞6次的治疗相比，可确认 非常强的体内抗肿瘤效果。
由以上结果可知在给予载体细胞时一起给予铁剂对癌治疗是 非常有效的。
接下来在载体细胞给予前对载体细胞进行的放射线处理中， 对照射的放射线量进行了研究。实验中使用出生后5周的裸鼠，对 A549细胞用不同的放射线量进行放射线处理后，按照每只小鼠 1×107个进行皮下移植，观察肿瘤的形成·成长。其结果如图29所 示。如该图表示的那样，通过将照射的放射线量定在120Gy或其 以上，可抑制肿瘤的形成·成长。
图30给出了在使用(C57BL/6×C3/He)F1小鼠的实验中，用不 同的放射线量对载体细胞(A549细胞)进行放射线处理时的抗肿 瘤效果的研究结果。在该实验中，向出生后5周的 (C57BL/6×C3/He)F1小鼠给予1×1010vp腺病毒UV-Ad-β- gal，注射5周后、按照每只小鼠1×106个皮下移植卵巢癌细胞 OVHM，形成5-10mm的肿瘤后，向肿瘤内给予以放射线量50Gy、 100Gy、200Gy或400Gy进行放射线处理的载体细胞。载体细胞使 用用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549细胞，每1次 7.5×106个、共计向肿瘤内给予6次。其结果表明在放射线处理中 照射的放射线量400Gy可获得比200Gy更良好的结果。
图31给出了有关溶瘤病毒对载体细胞的感染量的研究结果。 在该实验中，将腺病毒Ad-β-gal按照1×1010vp给予到出生后5 周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠，给予4周后，按照1只小鼠1×106 个皮下移植卵巢癌细胞OVHM，形成5-10mm肿瘤后，向肿瘤内 给予以放射线量250Gy进行放射线处理的载体细胞。另外，腺病 毒AdE3-1A1.3B对载体细胞(A549细胞)的感染量定在 100vp/cell、250vp/cell或500vp/cell中的任一个，1次给予7.5×106 个载体细胞，向肿瘤内共计给予6次。进一步，在给予载体细胞时， 同时向肿瘤内给予端胶原(浓度0.1％)。其结果可知上述感染量为 250vp/cell时可获得最好结果，如果设定在150-400vp/cell左右 效果也很好。
图32(a)、(b)是在与图31所示实验同样的实验中对肿瘤免 疫效果进行研究的结果。在该实验中，将腺病毒Ad-β-gal按照 1×1010vp给予到出生后5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠中，给予4 周后，按照1只小鼠1×106个皮下移植为了肿瘤免疫而以放射线量 80Gy进行放射线处理的卵巢癌细胞OVHM-RT。然后再皮下移 植1×106个卵巢癌细胞OVHM，形成5-10mm肿瘤后，向肿瘤内 给予以放射线量250Gy进行放射线处理的载体细胞。载体细胞使 用用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549细胞，1次 7.5×106个，共计肿瘤内给予3次。另外，在给予载体细胞时，一 并向肿瘤内给予端胶原(浓度0.1％)。其结果表明进行肿瘤免疫的 小鼠(图中，“OVHM-RT→A549”)与没有进行肿瘤免疫的小鼠 (图中，“A549”)相比，肿瘤的成长·增殖被显著抑制，存活率 大大改善。
由以上结果可知，在使用本发明癌基因治疗药物时，通过并 用肿瘤免疫，可以获得良好的抗肿瘤效果。
产业上可利用性
如上所述，本发明的癌基因治疗药物几乎可以适用于所有的 恶性肿瘤，预期对卵巢癌、扁平上皮癌(子宫颈部癌、皮肤癌、 头颈部癌、食道癌、肺癌等)、消化器官癌(大肠癌、胰癌、肝癌、 胃癌等)、成神经细胞瘤、脑肿瘤、乳癌、精巢癌、前列腺癌等各 种癌具有强力的抗肿瘤效果。
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