检测APC基因突变的引物以及试剂盒和方法
阅读：2发布：2021-09-27
专利汇可以提供检测APC基因突变的引物以及试剂盒和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及突变基因检测领域，具体而言，涉及检测检测APC基因突变的引物以及 试剂 盒 和方法。检测APC基因突变的引物，包括以下引物对中的任意一对或多对；引物对1-31的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-62所示。本发明提供的检测APC基因突变的引物，是经过多方面考虑设计，并经过筛选得到，该引物扩增的产物测序时，峰形整齐，峰图完整， 质量 高。通过对人们(特别是新生儿)进行APC基因检测，可以及早的发现具有致病基因的人群，为后期 疾病 的诊断和 治疗 提供科学依据，有助于早期采取措施防止息肉的增长，避免癌变的发生，有效降低家族性腺瘤性息肉病的癌变率。，下面是检测APC基因突变的引物以及试剂盒和方法专利的具体信息内容。
1.检测APC基因突变的引物，其特征在于，包括以下引物对中的任意一对或多对；
引物对1-31的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-62所示。
2.检测APC基因突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的检测APC基因突变的引物。
3.根据权利要求2所述的检测APC基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、缓冲液、酶、双蒸水中的任一种或多种。
4.根据权利要求2所述的检测APC基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。
5.根据权利要求2所述的检测APC基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸纯化试剂。
6.根据权利要求5所述的检测APC基因突变的试剂盒，其特征在于，所述核酸纯化试剂为离心柱型回收试剂盒。
7.根据权利要求2所述的检测APC基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序试剂。
8.根据权利要求7所述的检测APC基因突变的试剂盒，其特征在于，所述测序试剂包括Bigdye、Hi-Di中的任一种或多种。
9.一种检测APC基因突变的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，扩增得到的产物进行纯化，基因测序，与未突变序列比对即可。
10.根据权利要求9所述的检测APC基因突变的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序如下：
94-95℃预变性10-15分钟；94-95℃变性30-35秒，62℃退火30秒，72℃延伸45-50秒，
13-15个循环；94-95℃变性30-35秒，55℃退火30秒，72℃延伸45-50秒，30-40个循环；72℃延伸10-15分钟。
检测APC基因突变的引物以及试剂盒和方法
技术领域
[0001] 本发明涉及突变基因检测领域，具体而言，涉及检测检测APC基因突变的引物以及试剂盒和方法。
背景技术
[0002] 家族性腺瘤性息肉病(fam ilial adenom atoμs polypo-sis,FAP)叫多发性息肉病，是一种常染色体显性遗传性疾病，该病的发生于结肠腺瘤性息肉病基因(adenomatoμs polyposis coli，APC)突变密切相关，超过80％的FAP患者可检测到APC基因突变。FAP全球发病率为出生婴儿的1/7000～1/10000。
[0003] FAP对性别影响相等，男女比例为1：1，大部分病例中都显示出高度的常染色体显性遗传，符合孟德尔遗传定律，外显率为70％至95％，散发病例约占1/3，成年的FAP患者都会存在父母的家族史，以及他们的子女有半数会患有FAP，且涉及好几代人。一般认为到40岁时或到了家系中最大患病年龄加上10岁的年龄时，未出现腺瘤者，即使有家族史，也不会再出现腺瘤。该病不存在地区和种族差异性，平均腺瘤发生年龄约为16岁，发生大肠癌年龄约为40岁。
[0004] APC基因，其编码区由16个外显子组成，编码一种约10.5kb的较大mRNA，表达一种2843个氨基酸的蛋白，分子量约300000道尔顿，APC蛋白具有肿瘤抑制作用，抑制多发息肉癌变的发生。APC基因的外显率高达100％，在子代遗传比约为50％，近些年，随着检测技术的提高，FAP的发病率呈上升趋势。在10％-30％无家族史的患者中有很高的新发生突变率。
APC基因突变类型，主要有点突变和框架移码突变，前者包括无义突变、错位突变和拼接错误，后者包括缺失和插入。APC基因突变有720多种，这些突变遍及整个基因，60％以上的突变位于第16号外显子的5′端。其中密码子第1286～1513号之间的10％左右的编码区集中了约65％的体细胞突变，被称为突变密集区(MCR)。大部分突变属于错位突变，由缺失或1～8个碱基对的插入引起。大约95％的突变结果是在下游形成提前的终止密码子，使APC蛋白呈截短改变，这可能削弱了APC蛋白固有的抑制细胞增殖功能，从而导致APC蛋白功能的障碍。
APC基因突变类型，主要有点突变和框架移码突变，前者包括无义突变、错位突变和拼接错误，后者包括缺失和插入。APC基因突变有720多种，这些突变遍及整个基因，60％以上的突变位于第16号外显子的5′端。其中密码子第1286～1513号之间的10％左右的编码区集中了约65％的体细胞突变，被称为突变密集区(MCR)。大部分突变属于错位突变，由缺失或1～8个碱基对的插入引起。大约95％的突变结果是在下游形成提前的终止密码子，使APC蛋白呈截短改变，这可能削弱了APC蛋白固有的抑制细胞增殖功能，从而导致APC蛋白功能的障碍。
[0005] 目前国内外对FAP的诊断方法包括：1.直肠指检：由于FAP的息肉在直肠表现最多，故单纯的直肠指检可以为下一步的检查提供初步的诊断。2.电子肠镜和钡灌肠：可以了解病变的范围，并能取到活检，明确肿瘤性质。3.纤维胃镜和十二指肠镜检查：可以了解胃和十二指肠是否存在息肉。4.眼底镜检查：由于FAP多并存先天性视网膜色素上皮增生(CHRPE)，有高度的诊断敏感性和特异性，故眼底镜检查可列为家系中尚未出现大肠内腺瘤成员的筛查或诊断手段。X线、CT或MRI：可以了解骨瘤、中枢神经系统肿瘤等结肠外表现。这些临床检测的方法耗时长且繁琐，而且仅适用于已经出生的婴儿，对产前诊断无能为力。
[0006] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0007] 本发明的第一目的在于提供检测APC基因突变的引物，该引物扩增的产物测序时，峰形整齐，峰图完整，质量高。
[0008] 本发明的第二目的在于提供检测APC基因突变的试剂盒，为APC基因突变的检测提供便利。
[0009] 本发明的第三目的在于提供检测APC基因突变的方法，为家族性腺瘤性息肉病的诊断提供技术支持。
[0010] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0011] 检测APC基因突变的引物，包括以下引物对中的任意一对或多对；
[0012] 引物对1-31的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-62所示。
[0013] 本发明提供的检测APC基因突变的引物，是经过多方面考虑设计，并经过筛选得到，该引物扩增的产物测序时，峰形整齐，峰图完整，质量高，而其他引物扩增，如SEQ ID NO.63-78所示的引物对核苷酸序列，测序结果均有杂峰、峰图不完整、质量差。
[0014] 本发明还提供了检测APC基因突变的试剂盒，含有上述的检测APC基因突变的引物，为APC基因突变的检测提供便利。
[0015] 进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、缓冲液、酶、双蒸水中的任一种或多种。
[0016] 由于待扩增的片段较长，酶一般选用LA Taq酶，也可以选用其他能扩增较长片段的酶。
[0017] 进一步地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。DNA提取试剂用于样本基因组的提取，一般样本为血液。
[0018] 进一步地，所述试剂盒还包括核酸纯化试剂。PCR扩增后，对扩增产物进行纯化，以便于测序。
[0019] 进一步地，所述核酸纯化试剂为离心柱型回收试剂盒。
[0020] 进一步地，所述试剂盒还包括测序试剂。
[0021] 进一步地，所述测序试剂包括Bigdye、Hi-Di中的任一种或多种。
[0022] 本发明还提供了一种检测APC基因突变的方法，采用上述的引物对进行PCR扩增，扩增得到的产物进行纯化，基因测序，与未突变序列比对即可。
[0023] 进一步地，所述PCR扩增的程序如下：
[0024] 94-95℃预变性10-15分钟；94-95℃变性30-35秒，62℃退火30秒，72℃延伸45-50秒，13-15个循环；94-95℃变性30-35秒，55℃退火30秒，72℃延伸45-50秒，30-40个循环；72℃延伸10-15分钟。
[0025] 如在不同的实施例中，PCR反应程序可以为94℃预变性15分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸45秒，14个循环；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；最后72℃延伸10分钟。
[0026] 也可以为95℃预变性10分钟；95℃变性35秒，62℃退火30秒，72℃延伸50秒，15个循环；95℃变性35秒，55℃退火30秒，72℃延伸50秒，40个循环；最后72℃延伸15分钟。等等。
[0027] PCR扩增的反应体系可为10-50μL，如15μL PCR反应体系包括：10×PCR buffer 1.5μL、dNTP 2.4μL、Takara LA Taq酶0.15μL、引物(l0μM)0.6μL、基因组DNA(100ng/μL)0.5μL，用ddH2O补足反应体系。
[0028] PCR扩增完成后，对扩增产物进行纯化，一般采用DNA回收试剂盒进行回收即可。
[0029] DNA测序反应体系10μL，包括：PCR纯化产物1μL、Bigdye 0.5μL、5×seq 1.7μL和测序引物0.5μL，加ddH2O补足10μL。反应条件为96℃预变性1min，进行(96℃10sec，55℃10sec，60℃2.5min)33个循环。
[0030] 反应结束后每管内加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μL70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μLHi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟。放入测序仪中测序。
[0031] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0032] (1)本发明提供的检测APC基因突变的引物，该引物扩增的产物测序时，峰形整齐，峰图完整，质量高。
[0033] (2)本发明提供的引物以及试剂盒可用于正常人APC基因筛查，孕期母亲及新生儿筛查，FAP患者定期复查等。
[0034] (3)本发明通过对人们(特别是新生儿)进行APC基因检测，可以及早的发现具有致病基因的人群，为后期疾病的诊断和治疗提供科学依据，有助于早期采取措施防止息肉的增长，避免癌变的发生，有效降低家族性腺瘤性息肉病的癌变率。
[0036] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0037] 图1为本发明实施例2采用SEQ ID NO.1-2扩增产物的测序结果图；
[0038] 图2为本发明实施例2采用SEQ ID NO.3-4扩增产物的测序结果图；
[0039] 图3为本发明实施例2采用SEQ ID NO.5-6扩增产物的测序结果图；
[0040] 图4为本发明实施例2采用SEQ ID NO.7-8扩增产物的测序结果图；
[0041] 图5为本发明实施例2采用SEQ ID NO.9-10扩增产物的测序结果图；
[0042] 图6为本发明实施例2采用SEQ ID NO.11-12扩增产物的测序结果图；
[0043] 图7为本发明实施例2采用SEQ ID NO.13-14扩增产物的测序结果图；
[0044] 图8为本发明实施例2采用SEQ ID NO.15-16扩增产物的测序结果图；
[0045] 图9为本发明实施例2采用SEQ ID NO.17-18扩增产物的测序结果图；
[0046] 图10为本发明实施例2采用SEQ ID NO.19-20扩增产物的测序结果图；
[0047] 图11为本发明实施例2采用SEQ ID NO.21-22扩增产物的测序结果图；
[0048] 图12为本发明实施例2采用SEQ ID NO.23-24扩增产物的测序结果图；
[0049] 图13为本发明实施例2采用SEQ ID NO.25-26扩增产物的测序结果图；
[0050] 图14为本发明实施例2采用SEQ ID NO.27-28扩增产物的测序结果图；
[0051] 图15为本发明实施例2采用SEQ ID NO.29-30扩增产物的测序结果图；
[0052] 图16为本发明实施例2采用SEQ ID NO.31-32扩增产物的测序结果图；
[0053] 图17为本发明实施例2采用SEQ ID NO.33-34扩增产物的测序结果图；
[0054] 图18为本发明实施例2采用SEQ ID NO.35-36扩增产物的测序结果图；
[0055] 图19为本发明实施例2采用SEQ ID NO.37-38扩增产物的测序结果图；
[0056] 图20为本发明实施例2采用SEQ ID NO.39-40扩增产物的测序结果图；
[0057] 图21为本发明实施例2采用SEQ ID NO.41-42扩增产物的测序结果图；
[0058] 图22为本发明实施例2采用SEQ ID NO.43-44扩增产物的测序结果图；
[0059] 图23为本发明实施例2采用SEQ ID NO.45-46扩增产物的测序结果图；
[0060] 图24为本发明实施例2采用SEQ ID NO.47-48扩增产物的测序结果图；
[0061] 图25为本发明实施例2采用SEQ ID NO.49-50扩增产物的测序结果图；
[0062] 图26为本发明实施例2采用SEQ ID NO.51-52扩增产物的测序结果图；
[0063] 图27为本发明实施例2采用SEQ ID NO.53-54扩增产物的测序结果图；
[0064] 图28为本发明实施例2采用SEQ ID NO.55-56扩增产物的测序结果图；
[0065] 图29为本发明实施例2采用SEQ ID NO.57-58扩增产物的测序结果图；
[0066] 图30为本发明实施例2采用SEQ ID NO.59-60扩增产物的测序结果图；
[0067] 图31为本发明实施例2采用SEQ ID NO.61-62扩增产物的测序结果图；
[0068] 图32为本发明实施例3采用SEQ ID NO.63-64扩增产物的测序结果图；
[0069] 图33为本发明实施例3采用SEQ ID NO.65-66扩增产物的测序结果图；
[0070] 图34为本发明实施例3采用SEQ ID NO.67-68扩增产物的测序结果图；
[0071] 图35为本发明实施例3采用SEQ ID NO.69-70扩增产物的测序结果图；
[0072] 图36为本发明实施例3采用SEQ ID NO.71-72扩增产物的测序结果图；
[0073] 图37为本发明实施例3采用SEQ ID NO.73-74扩增产物的测序结果图；
[0074] 图38为本发明实施例3采用SEQ ID NO.75-76扩增产物的测序结果图；
[0075] 图39为本发明实施例3采用SEQ ID NO.77-78扩增产物的测序结果图。
具体实施方式
[0076] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0077] 实施例1
[0078] 一种检测家族性腺瘤性息肉病APC基因突变的试剂盒，包括以下成分：
[0079] (1)对APC基因16个外显子编码区进行PCR扩增，由于第16号外显子较大，设计了31对引物(核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-62所示)进行扩增。
[0080] (2)PCR扩增试剂：10×PCR bμffer、dNTP、Takara LA Taq酶；
[0081] (3)PCR产物纯化试剂：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)(天根，DP209)；
[0082] (4)测序试剂：2.2μL BigDyemix(Bigdye、5×seq)、2.5μL EDTA、30μL乙醇溶液(100％)、100μL乙醇溶液(70％)、8μL Hi-Di。
[0083] 本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
[0084] 上述的引物对均能扩增出如NCBI Reference Sequence:NM_000038.5所示APC基因序列。
[0085] 实施例2
[0086] 一种检测家族性腺瘤性息肉病APC基因突变的试剂盒，其使用步骤包括如下步骤：
[0087] (1)样本基因组DNA提取
[0088] 采用血液基因组DNA提取试剂盒(0.1-1ml)(天根，DP318)提取样本基因组DNA。
[0089] (2)采用不同的引物对对APC基因PCR扩增
[0090] 针对APC基因设计引物(如SEQ ID NO.1-62所示)进行PCR扩增。15μL PCR反应体系包括：10×PCR bμffer 1.5μL、dNTPs 2.4μL、Takara LA Taq酶0.15μL、上下引物(l0μM)各0.3μL、基因组DNA(100ng/μL)0.5μL，用ddH2O补足反应体系。
[0091] PCR反应程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸45秒，14个循环；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；最后72℃延伸10分钟。
[0092] (3)PCR产物纯化
[0093] 采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)(天根，DP209)进行割胶纯化PCR产物，获得相应目的DNA片段；
[0094] (4)DNA测序反应
[0095] DNA测序反应体系10μL，包括：PCR纯化产物1μL、Bigdye 0.5μL、5×seq 1.7μL和测序引物0.5μL(相应的其中一个扩增引物)，加ddH2O补足10μL。反应条件为96℃预变性1min，进行(96℃10sec，55℃10sec，60℃2.5min)33个循环；
[0096] 反应结束后每管内加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μL70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μLHi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟。放入测序仪中测序。
[0097] (5)结果分析
[0098] 对APC基因直接测序，在测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果，测序结果示意图如图1至图31。图1至图31为测序结果的一部分，以说明本发明提供的引物进行扩增后测序时，峰形整齐，峰图完整，质量高。
[0099] 将测定的序列与GenBank数据库APC基因序列进行比较，APC基因序列如NCBI Reference Sequence:NM_000038.5所示，对应编码的氨基酸序列如NCBI Reference Sequence:NP_000029.2所示。
[0100] 通过对家族性腺瘤性息肉病的基因突变分析，然后与测定突变进行比对，为家族性腺瘤性息肉病的诊断提供基础支持。
[0101] 因此，通过对APC基因进行检测，可以及早的发现具有致病基因的人群，为后期疾病的诊断和治疗提供科学依据，并且有助于早期采取措施防止息肉的增长，避免癌变的发生，有效降低家族性腺瘤性息肉病的癌变率。
[0102] 实施例3
[0103] APC基因扩增引物筛选实验，包括以下引物序列及试剂：
[0104] (1)APC基因第5、第8和第16号外显子编码区引物共8对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.63-78所示。
[0105] (2)PCR扩增试剂：10×PCR bμffer、dNTP、Takara LA Taq酶；
[0106] (3)PCR产物纯化试剂：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)(天根，DP209)；
[0107] (4)测序试剂：2.2μL BigDyemix(Bigdye、5×seq)、2.5μL EDTA、30μL乙醇溶液(100％)、100μL乙醇溶液(70％)、8μL Hi-Di。
[0108] APC基因扩增引物筛选实验操作步骤包括：
[0109] (1)样本基因组DNA提取，同实施例2。
[0110] (2)APC基因PCR扩增，同实施例2。
[0111] (3)PCR产物纯化，同实施例2。
[0112] (4)DNA测序反应，同实施例2。
[0113] (5)结果分析
[0114] 对APC基因第5、第8和第16号外显子进行直接测序，在测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果，测序结果示意图如图32至图39。
[0115] 图32至图39为测序结果的一部分，结果表明，APC基因第5、第8和第16号外显子测序结果均有杂峰、峰图不完整、质量差。
[0116] 上述结果说明本发明提供的检测APC基因突变的引物，测序结果无杂峰、峰图完整、质量优，具有明显优势。
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