Cas9-scForkI融合蛋白及其应用
阅读：2发布：2020-10-09
专利汇可以提供Cas9-scForkI融合蛋白及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种Cas9-scForkI融合蛋白及其应用，属于分子 生物 学领域，本发明通过基因工程的办法，把失活的Cas9蛋白进行改造，用(G4S)10即(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10是一个linker，由它连接两个ForkI，然后和失活的Cas9融合成Cas9-scForkI，该融合蛋白可以序列特异性的进行基因组的编辑，本发明Cas9-scForkI融合蛋白做药物筛选或基因修饰更安全，该融合蛋白还可用于 基因 治疗 ，本发明和 现有技术 相比较，设计更加灵活，而且切割活性更高，用作基因敲入的效率更高，蛋白不仅可以用于基因修饰，也可用于基因治疗。，下面是Cas9-scForkI融合蛋白及其应用专利的具体信息内容。
1.Cas9-scForkI融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白。
2.编码要求1所述的Cas9-scForkI融合蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的Cas9-scForkI融合蛋白，其特征在于，所述的Cas9蛋白是失活的Cas9。
5.根据权利要求1所述的Cas9-scForkI融合蛋白，其特征在于，所述的scForkI蛋白是由两个ForkI，中间由一个(G4S)10连接。
6.权利要求1所述的Cas9-scForkI融合蛋白在药物筛选及基因修饰中的应用。
Cas9-scForkI融合蛋白及其应用
技术领域
背景技术
[0002] CRISPR-Cas源自细菌和古细菌的免疫系统，可利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行修饰。RNA导向Cas9可以在多种细胞和生物体中发挥功能，在特异位点裂解完整基因组。Cas9这种基因组编辑的潜能使这项技术已经广泛用于人的细胞系，小鼠，大鼠，多物种的基因敲除及敲入。
[0003] ForkI是一种限制性核酸内切酶，ForkI二聚化后就可以对DNA进行切割。已经有文献报道，失活的Cas9与ForkI融合，即Cas9-ForkI可用于基因组的编辑。而且Cas9-ForkI nickase可以更精确的用于基因组的编辑。但是这两个技术需要设计两个gRNA靶向，设计比较复杂。而且Cas9-ForkI nickase的切割效率也比较低。本发明用一个失活的Cas9蛋白连接两个ForkI，这两个ForkI由(G4S)10连接，该方法设计比较简单，只需要设计一个gRNA，而且切割活性很高。该方法更适用于介导基因敲入。
发明内容
[0004] 本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种Cas9-scForkI融合蛋白。本发明通过基因工程的办法，把人源化Cas9蛋白进行改造，用(G4S)10即(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10是一个linker，由它连接两个ForkI显示，然后和失活的Cas9融合成Cas9-scForkI，该融合蛋白可以序列特异性的进行基因组的编辑。
[0005] 本发明采用的技术方案如下：Cas9-scForkI融合蛋白，所述融合蛋白为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白。
[0006] 编码上述的Cas9-scForkI融合蛋白的核苷酸序列。
[0007] 以上核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008] 所述的Cas9-scForkI融合蛋白，所述的Cas9蛋白是失活的Cas9。
[0009] 所述的Cas9-scForkI融合蛋白，所述的scForkI蛋白是由两个ForkI，中间由一个(G4S)10连接。
[0010] 所述的Cas9-scForkI融合蛋白在药物筛选及基因修饰中的应用。
[0011] 本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明通过基因工程的办法，把失活的Cas9蛋白进行改造，用(G4S)10即(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10是一个linker，由它连接两个ForkI，然后和失活的Cas9融合成Cas9-scForkI，该融合蛋白可以序列特异性的进行基因组的编辑。本发明Cas9-scForkI融合蛋白做药物筛选或基因修饰更安全，该融合蛋白还可用于基因治疗。
[0013] 图1为Cas9-scForkI蛋白活性的验证图；图2为Cas9-scForkI蛋白对Malt1基因切割活性验证图。
具体实施方式
[0014] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0015] 本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0016] 本发明中，SEQ ID NO.8所示序列、引物Primer_F1 、引物Primer_ R1、Malt1基因的gRNA序列、引物Primer F、引物Primer R、引物Primer_F2和引物Primer_ R2，均购于生工生物工程（上海）股份有限公司；胶回收采用胶回收试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司；
hCas9载体购于Addgene，Plasmid 41815；
小鼠ES细胞，购于Millipore；
以SEQ ID NO.8所示合成Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI DNA序列是委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。
hCas9载体购于Addgene，Plasmid 41815；
小鼠ES细胞，购于Millipore；
以SEQ ID NO.8所示合成Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI DNA序列是委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。
[0017] 实施例1 Cas9-scForkI融合蛋白的制备所述的Cas9-scForkI融合蛋白的制备方法，包括步骤如下：
第一部分，pCas9-scForkI真核表达载体的构建：
以SEQ ID NO.8所示合成Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI DNA序列，以Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI DNA序列为模板，用引物Primer_F1：CAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACCATGGACAAGAAGTACTC（SEQ ID NO.3）和引物Primer_ R1：AACTCATTACTAACCGGTTCATGAGCGGAAATTGATCTCGC（SEQ ID NO.4）
进行扩增，配置反应体系如表1所示：
表1 反应体系
5×primerSTAR Buffer 10 ul
dNTP (2.5 mM) 4μl
TaKaRa Taq HS (5 U/μl) 0.5ul
Primer_F1 20pmol 1ul
Primer_ R1 20pmol 1ul
Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI (20ng/ul) 1ul
ddH2O 32.5 ul
总计 50 ul
扩增反应程序：98℃ 10s，61℃ 30s，72℃，5min，共30个循环。
第一部分，pCas9-scForkI真核表达载体的构建：
以SEQ ID NO.8所示合成Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI DNA序列，以Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI DNA序列为模板，用引物Primer_F1：CAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACCATGGACAAGAAGTACTC（SEQ ID NO.3）和引物Primer_ R1：AACTCATTACTAACCGGTTCATGAGCGGAAATTGATCTCGC（SEQ ID NO.4）
进行扩增，配置反应体系如表1所示：
表1 反应体系
5×primerSTAR Buffer 10 ul
dNTP (2.5 mM) 4μl
TaKaRa Taq HS (5 U/μl) 0.5ul
Primer_F1 20pmol 1ul
Primer_ R1 20pmol 1ul
Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI (20ng/ul) 1ul
ddH2O 32.5 ul
总计 50 ul
扩增反应程序：98℃ 10s，61℃ 30s，72℃，5min，共30个循环。
[0018] 胶回收Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-Fork片段，用XbaI和AgeI酶切hCas9载体，胶回收骨架载体。两个片段进行In-Fusion反应（Clothech），转化，克隆鉴定，最终获得pCas9-scForkI真核表达载体。该真核表达载体为了在真核细胞内验证该蛋白的切割活性。
[0019] 第二部分，pET-Cas9-scForkI原核表达载体的构建：以Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI DNA序列为模板，用引物Primer_F2： TTGTTAGCAGCCGGATCCATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGC（SEQ ID NO.9）和引物Primer_ R2：ATCGAAGGTCGTCATATGTCATTATGAGCGGAAATTGATCTCG （SEQ ID NO.10）
进行扩增，配置反应体系如表2所示：
表2 反应体系
5×primerSTAR Buffer 10 ul
dNTP (2.5 mM) 4μl
TaKaRa Taq HS (5 U/μl) 0.5ul
Primer_F2 20pmol 1ul
Primer_ R2 20pmol 1ul
Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI (20ng/ul) 1ul
ddH2O 32.5 ul
总计 50 ul
扩增反应程序：98℃ 10s，61℃ 30s，72℃，5min，共30个循环。
进行扩增，配置反应体系如表2所示：
表2 反应体系
5×primerSTAR Buffer 10 ul
dNTP (2.5 mM) 4μl
TaKaRa Taq HS (5 U/μl) 0.5ul
Primer_F2 20pmol 1ul
Primer_ R2 20pmol 1ul
Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI (20ng/ul) 1ul
ddH2O 32.5 ul
总计 50 ul
扩增反应程序：98℃ 10s，61℃ 30s，72℃，5min，共30个循环。
[0020] 胶回收Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-Fork片段，用BamHI和NdeI酶切pET-16b载体，胶回收骨架载体。两个片段进行In-Fusion反应（Clothech），转化，克隆鉴定，最终获得pET-Cas9-scForkI原核表达载体。该原核表达载体为了表达该蛋白，用于验证该蛋白对DNA的切割活性。
[0021] 第三部分，Cas9-scForkI蛋白的表达与纯化：重组质粒pET-Cas9-scForkI转化大肠杆菌E. coli BL21。转化菌在 5ml 氨苄抗性的培养基中培养过夜，次日转移入 500ml 相同的培养基中培养，经IPTG 16℃过夜诱导，收集所得到的Cas9-scForkI蛋白菌体，经过高压破碎后离心获得可溶性的上清，进行Ni柱亲和层析。待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 5%（v/v）甘油，60mM 咪唑，pH8.0 ) 洗涤，之后用洗脱缓冲液（20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 5%（v/v）甘油，500mM 咪唑，pH8.0 )洗脱掉蛋白。利用PD-10脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有体积百分比为20%甘油的PBS溶液，之后进行SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的Cas9-scForkI蛋白。
[0022] 实施例2 Cas9-scForkI蛋白切割活性的验证2+
将Cas9-scForkI蛋白(300 nM)与线性化的质粒pDNA3.1，tracrRNA，Mg ，crRNA不同
2+
组分孵育。发现Cas9-scForkI蛋白与线性化的质粒pDNA3.1，tracrRNA，Mg ，gRNA孵育这一组，DNA有切割活性。说明Cas9-scForkI蛋白 (300 nM)有活性。
将Cas9-scForkI蛋白(300 nM)与线性化的质粒pDNA3.1，tracrRNA，Mg ，crRNA不同
2+
组分孵育。发现Cas9-scForkI蛋白与线性化的质粒pDNA3.1，tracrRNA，Mg ，gRNA孵育这一组，DNA有切割活性。说明Cas9-scForkI蛋白 (300 nM)有活性。
[0023] 具体如下：体外转录的tracrRNA和crRNA，95℃变性，然后慢慢冷却到室温。将2+
Cas9-scForkI蛋白与线性化和非线性化的质粒pDNA3.1(200 ng)，Mg ，tracrRNA (100 nM)，crRNA (100 nM)不同组分37℃孵育一个小时。反应的buffer为：20 mM HEPES pH
7.5, 150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA，10 mM MgCl2。反应一个小时后，加入5X SDS loading buffer (30% glycerol, 1.2% SDS, 250 mM EDTA)电泳。结果显示如图1所示，
2+
由图1可见，Cas9-scForkI蛋白与线性化的质粒pDNA3.1，tracrRNA，Mg ，gRNA孵育这一组，DNA有切割活性，其他组没有切割活性。
Cas9-scForkI蛋白与线性化和非线性化的质粒pDNA3.1(200 ng)，Mg ，tracrRNA (100 nM)，crRNA (100 nM)不同组分37℃孵育一个小时。反应的buffer为：20 mM HEPES pH
7.5, 150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA，10 mM MgCl2。反应一个小时后，加入5X SDS loading buffer (30% glycerol, 1.2% SDS, 250 mM EDTA)电泳。结果显示如图1所示，
2+
由图1可见，Cas9-scForkI蛋白与线性化的质粒pDNA3.1，tracrRNA，Mg ，gRNA孵育这一组，DNA有切割活性，其他组没有切割活性。
[0024] 实施例3 Cas9-scForkI蛋白对Malt1基因切割活性的验证把Cas9-scForkI真核表达载体与针对Malt1基因的gRNA：AACTGTGCTGCCGGGCAAC（SEQ ID NO.5）电转到小鼠ES细胞。电转染24小时后，挑取克隆，放到96孔板培养。等细胞长满后，每孔加入47.5 ul ES细胞裂解液和2.5 ul 10 mg/ml蛋白酶K，将板置于56 ºC孵育箱消化过夜。次日每板配制10 ml预冷无水乙醇+150 ul 5M NaCl的混合液，室温静置2 hrs，让DNA沉淀，离心，洗脱得到小鼠ES细胞基因组DNA。细胞裂解液配方为：
Tris-HCl pH 7.5（10 mM），EDTA pH 8.0（10 mM），NaCl（10 mM），1% SDS。用引物Primer F: TGCTTTACAAAGTTTCCAGCTGAAG（SEQ ID NO.6）和引物Primer R：AACCAACCAACCAACCAGCTAA（SEQ ID NO.7）进行扩增，配置反应体系如表3所示：
表3
10×Taq Buffer 5 ul
dNTP (2.5 mM) 4μl
TaKaRa Taq (5 U/μl) 0.5ul
Primer F 20pmol 1ul
Primer R20pmol 1ul
基因组DNA 100ng/ul 1ul
ddH2O 37.5 ul
总计 50 ul
扩增反应程序：95℃ 3min，95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环。
Tris-HCl pH 7.5（10 mM），EDTA pH 8.0（10 mM），NaCl（10 mM），1% SDS。用引物Primer F: TGCTTTACAAAGTTTCCAGCTGAAG（SEQ ID NO.6）和引物Primer R：AACCAACCAACCAACCAGCTAA（SEQ ID NO.7）进行扩增，配置反应体系如表3所示：
表3
10×Taq Buffer 5 ul
dNTP (2.5 mM) 4μl
TaKaRa Taq (5 U/μl) 0.5ul
Primer F 20pmol 1ul
Primer R20pmol 1ul
基因组DNA 100ng/ul 1ul
ddH2O 37.5 ul
总计 50 ul
扩增反应程序：95℃ 3min，95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环。
[0025] 回收PCR产物送测序，如图2，结果显示，Cas9-scForkI蛋白对Malt1基因都有切割活性。
[0026] 所述融合蛋白及上述的引物的序列如下所示，部分序列参见表5：SEQ ID NO.1:
MDKKYSIGLA IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE 60ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG 120NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAH MIKFRGHFLI EGDLNPDNSD 180VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA ILSARLSKSR RLENLIAQLP GEKKNGLFGN 240LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT YDDDLDNLLA QIGDQYADLF LAAKNLSDAI 300LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ DLTLLKALVR QQLPEKYKEI FFDQSKNGYA 360GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL VKLNREDLLR KQRTFDNGSI PHQIHLGELH 420AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY YVGPLARGNS RFAWMTRKSE ETITPWNFEE 480VVDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK HSLLYEYFTV YNELTKVKYV TEGMRKPAFL 540SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK KIECFDSVEI SGVEDRFNAS LGTYHDLLKI 600IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE MIEERLKTYA HLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG 660RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN RNFMQLIHDD SLTFKEDIQK AQVSGQGDSL 720HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV MGRHKPENIV IEMARENQTT QKGQKNSRER 780MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVAA 840IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKARGKSDNV PSEEVVKKMK NYWRQLLNAK LITQRKFDNL 900TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH VAQILDSRMN TKYDENDKLI REVKVITLKS 960KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN AVVGTALIKK YPKLESEFVY GDYKVYDVRK 1020MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI TLANGEIRKR PLIETNGETG EIVWDKGRDF 1080ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI LPKRNSDKLI ARKKDWDPKK YGGFDSPTVA 1140YSVLVVAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME RSSFEKNPID FLEAKGYKEV KKDLIIKLPK 1200YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS KYVNFLYLAS HYEKLKGSPE DNEQKQLFVE 1260QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV LSAYNKHRDK PIREQAENII HLFTLTNLGA 1320PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRI DLSQLGGDSR ADPKKKRKVG 1380SQLVKSELEE KKSELRHKLK YVPHEYIELI EIARNSTQDR ILEMKVMEFF MKVYGYRGKH 1440LGGSRKPDGA IYTVGSPIDY GVIVDTKAYS GGYNLPIGQA DEMQRYVEEN QTRNKHINPN 1500EWWKVYPSSV TEFKFLFVSG HFKGNYKAQL TRLNHITNCN GAVLSVEELL IGGEMIKAGT 1560LTLEEVRRKF NNGEINFRSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG 1620GGGSGGGGSG SQLVKSELEE KKSELRHKLK YVPHEYIELI EIARNSTQDR ILEMKVMEFF 1680MKVYGYRGKH LGGSRKPDGA IYTVGSPIDY GVIVDTKAYS GGYNLPIGQA DEMQRYVEEN 1740QTRNKHINPN EWWKVYPSSV TEFKFLFVSG HFKGNYKAQL TRLNHITNCN GAVLSVEELL 1800IGGEMIKAGT LTLEEVRRKF NNGEINFRS 1829SEQ ID NO.2:
atggacaaga agtactccat tgggctcgct atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 60attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 480atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 600atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840cagatcggcg accagtacgc agaccttttt 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2580gataaagcta gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 3540tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 3600tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 3840atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag gaaggtgggt 4140tcccaactcg tgaagagtga acttgaggag aaaaagtcgg agctgcggca caaattgaaa 4200tacgtaccgc atgaatacat cgaacttatc gaaattgcta ggaactcgac tcaagacaga 4260atccttgaga tgaaggtaat ggagttcttt atgaaggttt atggataccg agggaagcat 4320ctcggtggat cacgaaaacc cgacggagca atctatacgg tggggagccc gattgattac 4380ggagtgatcg tcgacacgaa agcctacagc ggtgggtaca atcttcccat cgggcaggca 4440gatgagatgc aacgttatgt cgaagaaaat cagaccagga acaaacacat caatccaaat 4500gagtggtgga aagtgtatcc ttcatcagtg accgagttta agtttttgtt tgtctctggg 4560catttcaaag gcaactataa ggcccagctc acacggttga atcacattac gaactgcaat 4620ggtgcggttt tgtccgtaga ggaactgctc attggtggag aaatgatcaa agcgggaact 4680ctgacactgg aagaagtcag acgcaagttt aacaatggcg agatcaattt ccgctcaggt 4740ggcggaggtt caggcggagg tggatctgga ggaggcggtt ccggcggagg tggttcagga 4800ggtggaggct ccggtggagg tggctcaggt ggcggaggtt caggcggagg tggatctgga 4860ggaggcggtt ccggcggagg tggttcaggt tcccaactcg tgaagagtga acttgaggag 4920aaaaagtcgg agctgcggca caaattgaaa tacgtaccgc atgaatacat cgaacttatc 4980gaaattgcta ggaactcgac tcaagacaga atccttgaga tgaaggtaat ggagttcttt 5040atgaaggttt atggataccg agggaagcat ctcggtggat cacgaaaacc cgacggagca 5100atctatacgg tggggagccc gattgattac ggagtgatcg tcgacacgaa agcctacagc 5160ggtgggtaca atcttcccat cgggcaggca gatgagatgc aacgttatgt cgaagaaaat 5220cagaccagga acaaacacat caatccaaat gagtggtgga aagtgtatcc ttcatcagtg 5280accgagttta agtttttgtt tgtctctggg catttcaaag gcaactataa ggcccagctc 5340acacggttga atcacattac gaactgcaat ggtgcggttt tgtccgtaga ggaactgctc 5400attggtggag aaatgatcaa agcgggaact ctgacactgg aagaagtcag acgcaagttt 5460aacaatggcg agatcaattt ccgctcatga 5490SEQ ID NO.8
atggacaaga agtactccat tgggctcgat atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 60attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 480atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 600atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 1140gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga tctgttgcgc 1200aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 1260gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 1380agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 1680gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 1980cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 2340atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggatcat 2520atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 3540tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 3600tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 3840atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag gaaggtgggt 4140tcccaactcg tgaagagtga acttgaggag aaaaagtcgg agctgcggca caaattgaaa 4200tacgtaccgc atgaatacat cgaacttatc gaaattgcta ggaactcgac tcaagacaga 4260atccttgaga tgaaggtaat ggagttcttt atgaaggttt atggataccg agggaagcat 4320ctcggtggat cacgaaaacc cgacggagca atctatacgg tggggagccc gattgattac 4380ggagtgatcg tcgacacgaa agcctacagc ggtgggtaca atcttcccat cgggcaggca 4440gatgagatgc aacgttatgt cgaagaaaat cagaccagga acaaacacat caatccaaat 4500gagtggtgga aagtgtatcc ttcatcagtg accgagttta agtttttgtt tgtctctggg 4560catttcaaag gcaactataa ggcccagctc acacggttga atcacattac gaactgcaat 4620ggtgcggttt tgtccgtaga ggaactgctc attggtggag aaatgatcaa agcgggaact 4680ctgacactgg aagaagtcag acgcaagttt aacaatggcg agatcaattt ccgctcaggt 4740ggcggaggtt caggcggagg tggatctgga ggaggcggtt ccggcggagg tggttcagga 4800ggtggaggct ccggtggagg tggctcaggt ggcggaggtt caggcggagg tggatctgga 4860ggaggcggtt ccggcggagg tggttcaggt tcccaactcg tgaagagtga acttgaggag 4920aaaaagtcgg agctgcggca caaattgaaa tacgtaccgc atgaatacat cgaacttatc 4980gaaattgcta ggaactcgac tcaagacaga atccttgaga tgaaggtaat ggagttcttt 5040atgaaggttt atggataccg agggaagcat ctcggtggat cacgaaaacc cgacggagca 5100atctatacgg tggggagccc gattgattac ggagtgatcg tcgacacgaa agcctacagc 5160ggtgggtaca atcttcccat cgggcaggca gatgagatgc aacgttatgt cgaagaaaat 5220cagaccagga acaaacacat caatccaaat gagtggtgga aagtgtatcc ttcatcagtg 5280accgagttta agtttttgtt tgtctctggg catttcaaag gcaactataa ggcccagctc 5340acacggttga atcacattac gaactgcaat ggtgcggttt tgtccgtaga ggaactgctc 5400attggtggag aaatgatcaa agcgggaact ctgacactgg aagaagtcag acgcaagttt 5460aacaatggcg agatcaattt ccgctcataa tga 5493表4 引物序列
序列 SEQ ID NO.
引物Primer_F1 CAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACCATGGACAAGAAGTACTC 3
引物Primer_ R1 AACTCATTACTAACCGGTTCATGAGCGGAAATTGATCTCGC 4
Malt1基因的gRNA序列 AACTGTGCTGCCGGGCAAC 5
引物primer F TGCTTTACAAAGTTTCCAGCTGAAG 6
引物Primer R AACCAACCAACCAACCAGCTAA 7
引物Primer_F2 ttgttagcag ccggatccat ggacaagaag tactccattg ggc 9
引物Primer_ R2 atcgaaggtc gtcatatgtc attatgagcg gaaattgatc tcg 10
MDKKYSIGLA IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE 60ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG 120NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAH MIKFRGHFLI EGDLNPDNSD 180VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA ILSARLSKSR RLENLIAQLP GEKKNGLFGN 240LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT YDDDLDNLLA QIGDQYADLF LAAKNLSDAI 300LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ DLTLLKALVR QQLPEKYKEI FFDQSKNGYA 360GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL VKLNREDLLR KQRTFDNGSI PHQIHLGELH 420AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY YVGPLARGNS RFAWMTRKSE ETITPWNFEE 480VVDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK HSLLYEYFTV YNELTKVKYV TEGMRKPAFL 540SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK KIECFDSVEI SGVEDRFNAS LGTYHDLLKI 600IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE MIEERLKTYA HLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG 660RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN RNFMQLIHDD SLTFKEDIQK AQVSGQGDSL 720HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV MGRHKPENIV IEMARENQTT QKGQKNSRER 780MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVAA 840IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKARGKSDNV PSEEVVKKMK NYWRQLLNAK LITQRKFDNL 900TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH VAQILDSRMN TKYDENDKLI REVKVITLKS 960KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN AVVGTALIKK YPKLESEFVY GDYKVYDVRK 1020MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI TLANGEIRKR PLIETNGETG EIVWDKGRDF 1080ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI LPKRNSDKLI ARKKDWDPKK YGGFDSPTVA 1140YSVLVVAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME RSSFEKNPID FLEAKGYKEV KKDLIIKLPK 1200YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS KYVNFLYLAS HYEKLKGSPE DNEQKQLFVE 1260QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV LSAYNKHRDK PIREQAENII HLFTLTNLGA 1320PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRI DLSQLGGDSR ADPKKKRKVG 1380SQLVKSELEE KKSELRHKLK YVPHEYIELI EIARNSTQDR ILEMKVMEFF MKVYGYRGKH 1440LGGSRKPDGA IYTVGSPIDY GVIVDTKAYS GGYNLPIGQA DEMQRYVEEN QTRNKHINPN 1500EWWKVYPSSV TEFKFLFVSG HFKGNYKAQL TRLNHITNCN GAVLSVEELL IGGEMIKAGT 1560LTLEEVRRKF NNGEINFRSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG 1620GGGSGGGGSG SQLVKSELEE KKSELRHKLK YVPHEYIELI EIARNSTQDR ILEMKVMEFF 1680MKVYGYRGKH LGGSRKPDGA IYTVGSPIDY GVIVDTKAYS GGYNLPIGQA DEMQRYVEEN 1740QTRNKHINPN EWWKVYPSSV TEFKFLFVSG HFKGNYKAQL TRLNHITNCN GAVLSVEELL 1800IGGEMIKAGT LTLEEVRRKF NNGEINFRS 1829SEQ ID NO.2:
atggacaaga agtactccat tgggctcgct atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 60attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 480atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 600atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 1140gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga tctgttgcgc 1200aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 1260gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 1380agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 1680gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 1980cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 2340atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggccgct 2520atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580gataaagcta gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 3540tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 3600tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 3840atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag gaaggtgggt 4140tcccaactcg tgaagagtga acttgaggag aaaaagtcgg agctgcggca caaattgaaa 4200tacgtaccgc atgaatacat cgaacttatc gaaattgcta ggaactcgac tcaagacaga 4260atccttgaga tgaaggtaat ggagttcttt atgaaggttt atggataccg agggaagcat 4320ctcggtggat cacgaaaacc cgacggagca atctatacgg tggggagccc gattgattac 4380ggagtgatcg tcgacacgaa agcctacagc ggtgggtaca atcttcccat cgggcaggca 4440gatgagatgc aacgttatgt cgaagaaaat cagaccagga acaaacacat caatccaaat 4500gagtggtgga aagtgtatcc ttcatcagtg accgagttta agtttttgtt tgtctctggg 4560catttcaaag gcaactataa ggcccagctc acacggttga atcacattac gaactgcaat 4620ggtgcggttt tgtccgtaga ggaactgctc attggtggag aaatgatcaa agcgggaact 4680ctgacactgg aagaagtcag acgcaagttt aacaatggcg agatcaattt ccgctcaggt 4740ggcggaggtt caggcggagg tggatctgga ggaggcggtt ccggcggagg tggttcagga 4800ggtggaggct ccggtggagg tggctcaggt ggcggaggtt caggcggagg tggatctgga 4860ggaggcggtt ccggcggagg tggttcaggt tcccaactcg tgaagagtga acttgaggag 4920aaaaagtcgg agctgcggca caaattgaaa tacgtaccgc atgaatacat cgaacttatc 4980gaaattgcta ggaactcgac tcaagacaga atccttgaga tgaaggtaat ggagttcttt 5040atgaaggttt atggataccg agggaagcat ctcggtggat cacgaaaacc cgacggagca 5100atctatacgg tggggagccc gattgattac ggagtgatcg tcgacacgaa agcctacagc 5160ggtgggtaca atcttcccat cgggcaggca gatgagatgc aacgttatgt cgaagaaaat 5220cagaccagga acaaacacat caatccaaat gagtggtgga aagtgtatcc ttcatcagtg 5280accgagttta agtttttgtt tgtctctggg catttcaaag gcaactataa ggcccagctc 5340acacggttga atcacattac gaactgcaat ggtgcggttt tgtccgtaga ggaactgctc 5400attggtggag aaatgatcaa agcgggaact ctgacactgg aagaagtcag acgcaagttt 5460aacaatggcg agatcaattt ccgctcatga 5490SEQ ID NO.8
atggacaaga agtactccat tgggctcgat atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 60attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 480atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 600atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 1140gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga tctgttgcgc 1200aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 1260gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 1380agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 1680gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 1980cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 2340atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggatcat 2520atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 3540tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 3600tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 3840atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag gaaggtgggt 4140tcccaactcg tgaagagtga acttgaggag aaaaagtcgg agctgcggca caaattgaaa 4200tacgtaccgc atgaatacat cgaacttatc gaaattgcta ggaactcgac tcaagacaga 4260atccttgaga tgaaggtaat ggagttcttt atgaaggttt atggataccg agggaagcat 4320ctcggtggat cacgaaaacc cgacggagca atctatacgg tggggagccc gattgattac 4380ggagtgatcg tcgacacgaa agcctacagc ggtgggtaca atcttcccat cgggcaggca 4440gatgagatgc aacgttatgt cgaagaaaat cagaccagga acaaacacat caatccaaat 4500gagtggtgga aagtgtatcc ttcatcagtg accgagttta agtttttgtt tgtctctggg 4560catttcaaag gcaactataa ggcccagctc acacggttga atcacattac gaactgcaat 4620ggtgcggttt tgtccgtaga ggaactgctc attggtggag aaatgatcaa agcgggaact 4680ctgacactgg aagaagtcag acgcaagttt aacaatggcg agatcaattt ccgctcaggt 4740ggcggaggtt caggcggagg tggatctgga ggaggcggtt ccggcggagg tggttcagga 4800ggtggaggct ccggtggagg tggctcaggt ggcggaggtt caggcggagg tggatctgga 4860ggaggcggtt ccggcggagg tggttcaggt tcccaactcg tgaagagtga acttgaggag 4920aaaaagtcgg agctgcggca caaattgaaa tacgtaccgc atgaatacat cgaacttatc 4980gaaattgcta ggaactcgac tcaagacaga atccttgaga tgaaggtaat ggagttcttt 5040atgaaggttt atggataccg agggaagcat ctcggtggat cacgaaaacc cgacggagca 5100atctatacgg tggggagccc gattgattac ggagtgatcg tcgacacgaa agcctacagc 5160ggtgggtaca atcttcccat cgggcaggca gatgagatgc aacgttatgt cgaagaaaat 5220cagaccagga acaaacacat caatccaaat gagtggtgga aagtgtatcc ttcatcagtg 5280accgagttta agtttttgtt tgtctctggg catttcaaag gcaactataa ggcccagctc 5340acacggttga atcacattac gaactgcaat ggtgcggttt tgtccgtaga ggaactgctc 5400attggtggag aaatgatcaa agcgggaact ctgacactgg aagaagtcag acgcaagttt 5460aacaatggcg agatcaattt ccgctcataa tga 5493表4 引物序列
序列 SEQ ID NO.
引物Primer_F1 CAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACCATGGACAAGAAGTACTC 3
引物Primer_ R1 AACTCATTACTAACCGGTTCATGAGCGGAAATTGATCTCGC 4
Malt1基因的gRNA序列 AACTGTGCTGCCGGGCAAC 5
引物primer F TGCTTTACAAAGTTTCCAGCTGAAG 6
引物Primer R AACCAACCAACCAACCAGCTAA 7
引物Primer_F2 ttgttagcag ccggatccat ggacaagaag tactccattg ggc 9
引物Primer_ R2 atcgaaggtc gtcatatgtc attatgagcg gaaattgatc tcg 10
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