一种核酸与化学药物的复合制剂及其制备方法
阅读：4发布：2021-09-16
专利汇可以提供一种核酸与化学药物的复合制剂及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种核酸与化学药物的复合制剂及其制备方法，所述复合制剂为 生物 大分子药物与小分子化学药物制剂的混合物；所述小分子化学药物制剂为用于 炎症 治疗 的化学药物制剂；所述生物大分子药物为非病毒载体包裹生物大分子药物。所述复合制剂的优势是利用人体安全的 生物材料 包裹治疗基因制备出生物大分子核酸药物纳米制剂，该制剂避免了单纯依靠化学药物治疗的毒性大与反复发作的缺点，而且能够弥补单纯利用 基因治疗 所带来的疗效慢的特点；能够在阻止炎症加重的 基础 上进行根治；通过体外和体内实验证实了我们所设计的阳离子脂质体、多肽和透明质酸核酸载体是良好的基因物质的输送载体；该复合制剂为化学药与生物药进行 联合治疗 提供了可行的方案。，下面是一种核酸与化学药物的复合制剂及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种复合制剂，其特征在于，所述复合制剂为生物大分子药物与小分子化学药物制剂的混合物；
所述小分子化学药物制剂为用于炎症治疗的化学药物制剂；所述生物大分子药物为非病毒载体包裹生物大分子药物；所述生物大分子药物组分为核酸；
所述非病毒载体包裹生物大分子药物包括三元纳米颗粒或四元纳米颗粒；
所述三元纳米颗粒包括阳离子脂质体、多肽、生物大分子药物组分；
所述四元纳米颗粒包括阳离子脂质体、多肽、生物大分子药物组分、透明质酸；
所述三元纳米颗粒的制备具体为：混合所述阳离子脂质体与多肽，将所得混合物转移至所述生物大分子药物组分溶液中，常温下孵育25～35分钟得表面带正电荷的纳米颗粒，即为三元纳米颗粒；所述阳离子脂质体、多肽、生物大分子药物的质量比为1:4:1；
所述四元纳米颗粒的制备具体为：向所述三元纳米颗粒中加入透明质酸钠，混合均匀，放置，即得四元纳米颗粒；
所述多肽包括如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，所述核酸选自DNA、siRNA、shRNA或microRNA。
3.根据权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，所述阳离子脂质体是通过以下步骤制得的：将质量比为(3～1):1的(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵与1,2-二油酰-sn-甘油-
3-磷酸乙醇胺的氯仿溶液旋转蒸、去除溶剂，然后水合过夜，超声30～60分钟，即得。
4.一种根据权利要求1～3任一项所述的复合制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体为：将生物大分子药物与小分子化学药物制剂通过物理共混即可。
5.根据权利要求4所述的复合制剂的制备方法，其特征在于，所述共混后生物大分子药物与小分子化学药物制剂中有效成分的浓度比为40:1。
一种核酸与化学药物的复合制剂及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 炎症，特别是关节炎，在中老年人群中普遍存在，给患者的日常工作生活带来很大不便与痛苦，关节是药物治疗较难达到的靶器官，无论是静脉注射、肌肉注射还是口服用药，关节内达到的药物浓度总是有限，并且这些治疗方法存在一定的副作用。而关节穿剌给药的途径虽然一定程度克服了上述存在的问题，但由于局部注射治疗后药物的半衰期短、反复穿刺关节较容易带来更多的感染机会，使得关节穿刺治疗在广泛使用上存在一定局限性。而新近开展的基因治疗方法，则能克服以上治疗方法的弊端，其主要优势表现在将编码某一抗炎物质的基因通过载体转化到关节滑膜中，达到高效、长期、稳定地表达这一抗炎物质来治疗类风湿关节炎的目的，期望由此而改变目前治疗类风湿关节炎的现状。例如生物大分子核酸药物白介素1受体拮抗剂(interleukin 1 receptor antagonist,IL-1Ra)可以在基因水平上调节白细胞介素-1(IL-1)的表达，从而抑制炎症。
[0003] 但单独注射带负电荷的核酸药物难以进入细胞，所以需要合适的输送载体来协助核酸药物进入细胞核，从而达到治病的位点。目前非病毒载体由于没有免疫原性等安全隐患而成为研究的热点(Yin H等人，基于基因治疗的非病毒载体，自然-综述-遗传学.2014；15:541-55.)，但由于难以克服的化学毒性和低转染活性却很难能够成为药用载体。因此，目前治疗的主要手段还是采用小分子化学药物通过皮下或肌肉注射完成。而绝大多数化学药物为激素类药物(肖征宇，类风湿性关节炎的药物治疗方法，中国医师进修杂志，第九期，
1993年)。大剂量长期注射容易对患者造成比如感染、股骨头坏死、消化道出血、高血压、肥胖等等毒副作用。
1993年)。大剂量长期注射容易对患者造成比如感染、股骨头坏死、消化道出血、高血压、肥胖等等毒副作用。
[0004] 为了突破这一技术瓶颈，本发明利用阳离子多肽、经典的无毒脂质体包裹白介素1受体拮抗剂的纳米颗粒与现有的化学药物注射液混合形成混合制剂然后进行关节腔注射。
[0005] 到目前为止，单纯利用生物材料包裹核酸药物进行治疗的方法仍处于实验阶段。为了能够将该技术运用于实际应用，我们打算结合已经上市的醋酸氢化可的松混悬液注射技术，将优化的包裹IL-Ra pcDNA形成的纳米颗粒与醋酸曲安奈德注射液形成混悬注射液，进行关节腔注射治疗关节炎。由于关节腔注射属于局部给药，相对于系统给药简单的多，如果利用安全高效的多肽与脂质体一起输送核酸药物来尝试采用化学药与生物药一起进行联合治疗的方案治疗关节炎，希望该方法会有更好的应用前景。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于克服现有关节炎症技术中的不足，提供一种核酸与化学药物复合制剂及其制备方法。本发明通过核酸、阳离子多肽(如图1)、阳离子脂质体组装的三元纳米颗粒，以及在此基础上包裹透明质酸的四元纳米颗粒分别与市售的醋酸曲安奈德注射液形成混悬注射液：(1)利用已经申请专利的三元纳米颗粒和四元纳米颗粒；(2)利用市售的醋酸曲安奈德注射液；(3)将(1)和(2)进行混合制备复合制剂。因此，我们与现有的lipopolyplexes(脂质体)相比，不仅避免了聚阳离子的毒性(多肽是人体内源性分子)，而且有效突破了通过PEG化实现体内长效循环的弊端。兼顾到达靶细胞之前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008] 本发明涉及用核酸、阳离子多肽、阳离子脂质体组装的三元纳米颗粒，以及在此基础上包裹透明质酸的四元纳米颗粒分别与市售的醋酸曲安奈德注射液形成的混悬注射液(见图10)。具体涉及一类由阳离子多肽与阳离子脂质体包裹核酸形成的三元纳米颗粒、在该三元纳米颗粒表面覆盖透明质酸形成的表面带负电荷的四元纳米颗粒与市售的醋酸曲安奈德注射液。
[0009] 第一方面，本发明涉及一种复合制剂，所述复合制剂为生物大分子药物与小分子化学药物制剂的混合物。
[0010] 优选地，所述小分子化学药物制剂为用于炎症治疗的化学药物制剂；所述生物大分子药物为非病毒载体包裹生物大分子药物。
[0011] 优选地，所述化学药物制剂具体为市售的醋酸曲安奈德注射液。
[0012] 优选地，所述非病毒载体包裹生物大分子药物包括三元纳米颗粒或四元纳米颗粒；所述三元纳米颗粒包括阳离子脂质体、多肽、生物大分子药物组分；所述四元纳米颗粒包括阳离子脂质体、多肽、生物大分子药物组分、透明质酸。
[0013] 优选地，所述三元纳米颗粒的制备具体为：混合所述阳离子脂质体与多肽，将所得混合物转移至所述生物大分子药物组分溶液中，常温下孵育15～35分钟得表面带正电荷的纳米颗粒，即为三元纳米颗粒；
[0014] 更优选地，所述混合物中阳离子脂质体与多肽的质量比为(0.5～2)：(2～10)；所述多肽与生物大分子药物组分的质量比为(2～10)：(0.5～2)；
[0015] 进一步优选地，所述混合物中阳离子脂质体与多肽的质量比为0.75:4或1:4；所述多肽与生物大分子药物组分的质量比为4:1。
[0016] 优选地，所述四元纳米颗粒的制备具体为：向所述三元纳米颗粒中加入透明质酸钠，混合均匀，放置，即得四元纳米颗粒；
[0017] 更优选地，所述放置的时间为5～20分钟；所述透明质酸钠的加入质量与所述多肽的质量比为(5～35)：(2～10)；
[0018] 进一步优选地，所述放置的时间为5分钟；所述透明质酸钠的加入质量与所述多肽的质量比为14.2：4；
[0019] 优选地，所述生物大分子药物组分为核酸，具体包括DNA、siRNA、shRNA、microRNA；
[0020] 优选地，所述生物大分子药物组分为DNA；
[0021] 进一步地，所述DNA具体为IL-1Ra pcDNA。
[0022] 优选地，所述多肽包括如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列，聚阳离子多肽，以及连接靶向基团的阳离子多肽。
[0023] 更优选地，所述多肽包括如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列。
[0024] 优选地，所述阳离子脂质体是通过以下步骤制得的：将质量比为(3～1)：1的(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)与1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)的氯仿溶液旋转蒸、去除溶剂，然后水合过夜，超声30～60分钟。
[0025] 更优选地，所述(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵与1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺的质量比1:1。
[0026] 第二方面，本发明还提供一种所述复合制剂的制备方法，所述制备方法具体为：将生物大分子药物与小分子化学药物制剂物理共混即可。
[0027] 优选地，所述共混后生物大分子药物与小分子化学药物制剂中有效成分的浓度比为40:1。
[0028] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0030] 2、由于本申请所用的脂质与多肽均为内源性的生物安全的医用材料，而且该纳米输送体系通过关节腔注射后通过正负电荷作用迅速被腔内的滑膜细胞内吞，而纳米体系中的脂质组分通过融膜作用实现内吞逃逸，从而有效地将生物大分子药物组分释放到细胞浆中，在化学药起作用的同时，从源头上通过基因调控逐渐消除炎症；
[0032] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0033] 图1：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的构建示意图；
[0034] 图2：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的凝胶电泳图结果；
[0035] 图3：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的Zeta电位图；
[0036] 图4：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的粒径图；
[0037] 图5：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的滑膜细胞C518萤光素酶转染活性图；
[0038] 图6：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒包裹IL-1Ra pcDNA转染滑膜细胞C518后细胞上清IL-1Ra蛋白水平；
[0039] 图7：滑膜细胞经不同比例的纳米颗粒载体包裹IL-1Ra pcDNA复合物溶液培养后的细胞存活率；
[0040] 图8：大鼠在造模后4天的踝关节周长的变化；
[0041] 图9：大鼠在给药后48h后血清中IL-1Ra蛋白水平；
[0042] 图10：为本发明制备方法示意图。
具体实施方式
[0043] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0044] 本发明对包裹生物大分子核酸药物的三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的物化性质表征方法包括：凝胶电泳、动态光散射和Zeta电位；初步的转染活性与毒性实验的DNA质粒是荧光素酶质粒细胞是滑膜细胞C518；包裹治疗性基因为白介素受体拮抗剂(IL-1Ra pcDNA)；体内实验采用Wistar大鼠(雄性，180-200g，斯莱特)构建的急性关节炎模型。利用ELISA检测细胞上清液IL-1Ra蛋白的表达水平(RayBio Human IL-1RA ELISA Kit，RayBiotech)。
[0045] 实施例1
[0046] 本实施例涉及三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的制备方法(如图1所示)：
[0047] 将一定量的阳离子脂质体与多肽混合后加入到核酸水溶液中继续混合均匀。在室温下孵育30分钟制得三元纳米颗粒，然后将透明质酸加入该混合物中并充分混合均匀，静置15分钟制得四元纳米颗粒。
[0048] 阳离子脂质体与多肽的质量比为(0.5～2)：(2～10)；所述多肽与IL-1Ra pcDNA的质量比为(2～10)：(0.5～2)；所述透明质酸钠的加入质量与所述多肽的质量比为(5～35)：(2～10)。
[0049] 三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的用于测物化性质的体系在水溶液中进行；用于细胞实验的载体体系用无血清培养基代替超纯水。
[0050] 实施例2
[0051] 本实施例涉及实施例1所述方法制备的三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的凝胶电泳，具体包括如下操作：
[0052] 称取0.3g的琼脂糖粉末，倒入锥形瓶中，将30ml1×TAE缓冲液加入至锥形瓶中，在加热的条件下将其充分溶解，待温度降到65℃后，加入Gelred in warter 3μL，迅速倒入制胶槽中，插入样品梳，在室温下放置0.5～1h等待胶变为凝固态。接着将样品梳拔出，再将TAE缓冲液倒入样品槽中使其浸没凝胶。制备不同比例的三元纳米颗粒与四元纳米颗粒10μL，将6×上样缓冲液2μL与复合物混匀，上样10μL，同时上样10μL naked IL-1Ra pcDNA作为对照。随后在110mV电压下电泳45min，关掉电泳，取出凝胶置于紫外凝胶成像系统观察并记录电泳图像。
[0053] 结果如图2，条带从左向右依次为Naked DNA，样品L:P1:D＝1:4:1(1)、L:P2:D＝1:4:1(2)、L:P1:D＝0.75:4:1(3)、L:P2:D＝0.75:4:1(4)、L:P1:D:H＝1:4:1:14.2(H-1)、L:
P2:D:H＝1:4:1:14.2(H-2)、L:P1:D:H＝0.75:4:1:14.2(H-3)、L:P2:D:H＝0.75:4:1:14.2(H-4)，其中，H代表透明质酸；L代表阳离子脂质体；D代表DNA；P1为氨基酸序列为RRRRRRRRRRRRRRRRKRPTMRFRYTWNPMK(SEQ ID No.1)的多肽；P2为氨基酸序列为RRRRRRRRRRRRRRRRKMPNWTYRFRMTPRK(SEQ ID No.2)的多肽；各数据代表各组分的质量比(以下各图表同)。
P2:D:H＝1:4:1:14.2(H-2)、L:P1:D:H＝0.75:4:1:14.2(H-3)、L:P2:D:H＝0.75:4:1:14.2(H-4)，其中，H代表透明质酸；L代表阳离子脂质体；D代表DNA；P1为氨基酸序列为RRRRRRRRRRRRRRRRKRPTMRFRYTWNPMK(SEQ ID No.1)的多肽；P2为氨基酸序列为RRRRRRRRRRRRRRRRKMPNWTYRFRMTPRK(SEQ ID No.2)的多肽；各数据代表各组分的质量比(以下各图表同)。
[0054]序号 L(阳离子脂质体) P1/P2(多肽) D(DNA) H(透明质酸)
1 1 P1:4 1 -
2 1 P2:4 1 -
3 0.75 P1:4 1 -
4 0.75 P2:4 1 -
H-1 1 P1:4 1 14.2
H-2 1 P2:4 1 14.2
H-3 0.75 P1:4 1 14.2
H-4 0.75 P2:4 1 14.2
1 1 P1:4 1 -
2 1 P2:4 1 -
3 0.75 P1:4 1 -
4 0.75 P2:4 1 -
H-1 1 P1:4 1 14.2
H-2 1 P2:4 1 14.2
H-3 0.75 P1:4 1 14.2
H-4 0.75 P2:4 1 14.2
[0055] 从电泳图中我们可以观察到三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的位置都有停在起点，说明我们的载体完全包裹了IL-1Ra pcDNA，从而有效保护DNA，避免DNA在细胞吞噬前被降解。
[0056] 实施例3
[0057] 本实施例对实施例2制备的颗粒的Zeta电位进行测试：复合物的电位使用粒度分析仪测定。
[0058] 采用zetasizer 2000测定颗粒的表面电荷，样品测定时间设置为自动，每个样品测定3次，取平均值作图。
[0059] 复合物的ζ电位测定结果如图3所示。从图中可见这8个不同的纳米颗粒的ζ电位比较稳定：PLD带正电荷，HPLD带负电荷，其电荷的绝对值大于25mV，说明它们形成的分散体系也相对稳定。
[0060] 实施例4
[0061] 本实施例对实施例2制备的颗粒(不同比例的复合物200μL)的粒径进行测试，具体如下：室温条件下，用Malvern Nano ZS激光粒度仪测定Q-complexes的水化半径，折射介质设置为水，折射率为1.33，粘度为0.8872cP，每个样品测定3次，取平均值作图。
[0062] 首先，在室温下预热粒度分析仪30min，在微量样品池中加入颗粒溶液，用超纯水稀释至450μL，将微量样品池插入粒度分析仪的测试槽中，每个样品记录三次测试结果，观察并记录样品粒径的平均值，同时也要注意样品的分散性(PDI)。
[0063] 颗粒的粒径见图4，从图中可见这8个不同的纳米颗粒的粒径都比较稳定，基本上在100nm左右，其大小有利于细胞内吞。
[0064] 实施例5
[0065] 本实施例具体为实施例2制备三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的滑膜细胞C518的萤光素酶转染活性实验，包括如下步骤：
[0066] 将培养好的细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为2×104个，将其置于细胞培养箱中培养24h。加入不同的复合物：每孔加入的DNA的质量是250ng，每孔加入200μL的复合物溶液(即每200μL纳米颗粒溶液DNA的质量为250ng)，并平行3个复孔，稀释介质为Opti-MEM培养基，并以商业化转染试剂PEI 25KDa与DNA的复合物作为对照组。孵育24h后，取出96孔板弃去培养液，每孔用200μL 1×PBS缓冲溶液冲洗一遍后，每孔加入200μL的复合物溶液，置于细胞培养箱中培养4h后，取出96孔板，吸去培养液，每孔加入200μL的含10％胎牛血清的DMEM/f12培养基，将其置于细胞培养箱中培养24h。检测瞬时发光强度：过夜后取出96孔板，从每个孔中吸出20μL裂解液至对应的流式管中，打开照度计，预热20min，测试时每个流式管中加入20μL荧光素酶底物，快速吹打均匀，检测其瞬时发光强度(RLU)。检测蛋白总量：采用Micro BCA测定法来确定裂解液中的蛋白总量。通过样品的相对发光强度除以样品的总蛋白浓度后所得数(RLU/mg protein)来衡量细胞转染效率(即荧光素酶蛋白的表达量)，每个样品平行测3次，取平均值作图。
[0067] 检测结果如图5所示，从中可以看出，采用三元纳米颗粒对C518转染的效果与常用转染试剂PEI 25kDa相当，而相应的四元纳米颗粒转染滑膜细胞C518的效果远高于这两组。
[0068] 实施例6
[0069] 本实施例涉及实施例2制备的三元纳米颗粒与四元纳米颗粒转染滑膜细胞C518后IL-1Ra蛋白水平实验，具体包括：
[0070] 将IL-1Ra pcDNA和不同比例的载体组成的复合物转染滑膜细胞，步骤同荧光素报告基因质粒的体外转染的过程，每孔加入200μL的完全培养基后放入细胞培养箱中培养48h，之后将每个实验组和对照组孔的细胞培养上清液吸出，转移至EP管中，即可等待测定。
本测试在96孔板上测定，具体操作按照RayBio Human IL-1RA ELISA试剂盒检测说明书。
本测试在96孔板上测定，具体操作按照RayBio Human IL-1RA ELISA试剂盒检测说明书。
[0071] 检测结果如图6所示，三元纳米颗粒与四元纳米颗粒对滑膜细胞C518转染IL-1RapcDNA的效率均高于裸IL-1Ra pcDNA和PEIkDa，特别是样品L:P1:D＝1:4:1与L:P1:D:H＝1:4:1:14.2其IL-1Ra pcDNA蛋白表达远高于其它组。
[0072] 实施例7
[0073] 本实施例涉及滑膜细胞C518的毒性实验，具体为采用CCK-8Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit考察包裹IL-1Ra pcDNA的纳米颗粒复合物对滑膜细胞的毒性，包括如下步骤：
[0074] 毒性实验开始前，先将细胞接种到96孔中，每孔的细胞数为104个，接种24h后，取出96孔板弃去培养液，每孔用200μL 1×PBS缓冲溶液冲洗一遍后，每孔给不同比例的200μL的复合物溶液，每个样品平行3个复孔，置于细胞培养箱中培养4h后，吸出100μL的复合物溶液，向96孔板每孔细胞中加入CCK-8试剂10μL，避光在细胞培养箱中培养1h后，最后，用多功能酶标仪测定样品在450nm处的吸光度OD值。细胞存活率(百分比)是以待测样品的吸光度相比正常细胞的吸光度值来表示。
[0075] 检测结果如图7所示，大多三元纳米颗粒与四元纳米颗粒对滑膜细胞C518的毒性小于PEI 25kDa。部分样品组的细胞活性达到90％以上。
[0076] 实施例8
[0077] 本实施例涉及大鼠急性关节炎模型的建立以及体内实验，包括如下步骤：
[0078] 取大鼠30只，每只在其关节处注射100μL的完全弗氏佐剂，造模后第二天观察大鼠的关节肿胀程度，将其平均分为5组，每组6只，分别为空白对照组、不治疗组、化药治疗组、化药加基因治疗组、基因治疗组。造模后第二天对大鼠进行治疗，我们选择的是L:P1:D＝1:4:1比例来复合IL-1Ra pcDNA形成纳米颗粒复合物来进行关节炎的治疗，于大鼠的关节腔局部注射不同的药100μL，化药治疗组为100μL醋酸曲安奈德注射液(浓度为10mg/mL)，化药加基因治疗组中含有10mg/mL醋酸曲安奈德注射液50μL和纳米颗粒复合物50μL(含有12.5μgIL-1Ra pcDNA)，基因治疗组的100μL溶液中(含有25μgIL-1Ra pcDNA)，阴性基因治疗组是用L:P1:D＝1:4:1比例来复合PGL3DNA形成纳米颗粒复合物(含有25μgPGL3DNA)，隔一天再给一次药，在第二次给药后48h用ELISA方法检测体内的IL-1Ra蛋白的表达。
[0079] 检测结果如图8与9所示，在化药治疗组与化药加基因治疗组中可以看到相同的改善关节肿胀程度的疗效，在治疗基因组虽然没有看到明显的关节肿胀度的减弱，但从IL-1Ra pcDNA蛋白的表达中看到有一定的增加，说明基因组从本质上改善了关节炎的病情，只是疗效较慢。
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