用于纤毛病的基因治疗
阅读：362发布：2020-05-11
专利汇可以提供用于纤毛病的基因治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且描述了用于 治疗 纤毛病(例如巴尔得-别德尔综合征(Bardet-Biedl syndrome))的载体，其中所述载体包含与纤毛病基因可操作地连接的启动子，其中所述载体可提供使所述纤毛病基因转导到多个器官中，其中所述启动子是可提供使所述纤毛病基因在经转导器官中表达的遍在启动子，并且其中所述纤毛病基因编码与在所述纤毛病中突变的 蛋白质 相对应的功能性蛋白质。还描述了以上载体在治疗纤毛病的方法中的用途，所述方法包括向患有纤毛病的患者施用 治疗有效量 的载体。，下面是用于纤毛病的基因治疗专利的具体信息内容。
1.用于治疗纤毛病的载体，其中所述载体包含与纤毛病基因可操作地连接的启动子，其中所述载体可提供使所述纤毛病基因转导到多个器官中，其中所述启动子是可提供使所述纤毛病基因在经转导器官中表达的遍在启动子，并且其中所述纤毛病基因编码与在所述纤毛病中突变的蛋白质相对应的功能性人蛋白质。
2.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的载体，其中所述载体是AAV载体。
4.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述载体选自AAV8、AAV9、用来自AAV8或AAV9的衣壳蛋白假型化的AAV载体、AAV-PHP.A、AAV-PHP.B、AAV9.47、AAV-B1、AAV8(Y733F)或AAV2-TT。
5.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述载体是AAV8载体、AAV9载体、或者已用来自AAV8或AAV9的衣壳蛋白假型化的AAV载体。
6.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述启动子选自短延伸因子启动子(EFS)、CAG启动子、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)和β-肌动蛋白启动子。
7.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述启动子具有选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.45的序列。
8.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述启动子是CAG启动子。
9.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述启动子是具有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.47的核苷酸序列的CAG启动子。
10.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述纤毛病基因编码选自以下的功能性人蛋白质：BBS1、BBS2、BBS3/ARL6、BBS4、BBS5、BBS6/MKKS、BBS7、BBS8、BBS9、BBS10、BBS11/TRIM32、BBS12、BBS13/MKS1、BBS14/CEP290、BBS15/C2ORF86、BBS16/SDCCAG8、BBS17/LZTFL1、BBS18/BBIP1、BBS19/IFT27、BBS20/IFT74和BBS21/C8ORF37蛋白。
11.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述纤毛病基因编码选自以下的功能性人蛋白质：BBS1、BBS2、BBS3/ARL6、BBS4、BBS5、BBS6/MKKS、BBS7、BBS8、BBS9、BBS10和BBS12蛋白。
12.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述纤毛病基因编码选自BBS1和BBS10蛋白的功能性人蛋白质。
13.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少70％序列同一性，并且编码功能性人BBS1蛋白。
14.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述纤毛病基因具有SEQ ID NO.11或12的核苷酸序列。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的载体，其中所述纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少70％序列同一性，并且编码功能性人BBS10蛋白。
16.根据权利要求1至12和15中任一项所述的载体，其中所述纤毛病基因具有SEQ ID NO.13或14的核苷酸序列。
17.根据权利要求1至14中任一项所述的载体，其中所述纤毛病基因编码功能性人BBS1蛋白，所述功能性人BBS1蛋白具有SEQ ID NO 9的蛋白质序列或与其具有80％序列同一性。
18.根据权利要求1至12和15中任一项所述的载体，其中所述纤毛病基因编码功能性人BBS10蛋白，所述功能性人BBS10蛋白具有SEQ ID NO 10的蛋白质序列或与其具有80％序列同一性。
19.根据权利要求1至10中任一项所述的载体，其中所述纤毛病选自：巴尔得-别德尔综合征、麦-考综合征、朱伯特综合征、梅克尔-格鲁贝尔综合征、肾消耗病、大洛肯综合征、莱伯先天性黑矇。
20.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述纤毛病是巴尔得-别德尔综合征。
21.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述载体是AAV8载体、AAV9载体、或者已用来自AAV8或AAV9的衣壳蛋白假型化的AAV载体，
其中所述启动子是CAG启动子，并且
其中所述纤毛病基因编码选自BBS1和BBS10蛋白的功能性人蛋白质。
22.根据权利要求21所述的载体，其中所述纤毛病基因具有SEQ ID NO.11、12、13和14之一的核苷酸序列。
23.药物组合物，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的载体，以及一种或更多种可药用赋形剂。
24.治疗纤毛病的方法，其包括向患有纤毛病的患者施用治疗有效量的根据权利要求1至22中任一项所述的载体。
25.权利要求24所述的方法，其中所述载体静脉内施用。
26.权利要求24所述的方法，其中所述载体颅内施用。
27.权利要求24所述的方法，其中所述载体静脉内和颅内施用。
28.权利要求27所述的方法，其中所述载体在同一天静脉内和颅内施用。
29.权利要求27所述的方法，其中所述载体同时静脉内和颅内施用。
30.权利要求24至29中任一项所述的方法，其中所述载体另外地鞘内施用。
31.权利要求24至30中任一项所述的方法，其中所述载体在不进行重复施用的情况下在单时间点施用。
32.根据权利要求1至22中任一项所述的载体，其用于治疗。
33.根据权利要求1至22中任一项所述的载体，其用于治疗纤毛病。
34.根据权利要求1至22中任一项所述的载体在制备用于治疗纤毛病的药物中的用途。
35.权利要求33或权利要求34所述的用途，其中所述载体用于静脉内施用。
36.权利要求33或权利要求34所述的用途，其中所述载体用于颅内施用。
37.权利要求33或权利要求34所述的用途，其中所述载体用于静脉内和颅内施用。
38.权利要求37所述的用途，其中所述载体用于在同一天静脉内和颅内施用。
39.权利要求37所述的用途，其中所述载体用于同时静脉内和颅内施用。
40.权利要求33至39中任一项所述的用途，其中所述载体另外地用于鞘内施用。
41.权利要求33至40中任一项所述的用途，其中所述载体用于在不进行重复施用的情况下在单时间点施用。
用于纤毛病的基因治疗
技术领域
[0001] 本发明涉及用于治疗纤毛病(ciliopathy)(包括巴尔得-别德尔综合征(Bardet-Biedl Syndrome))的基因治疗载体。
背景技术
[0002] 纤毛病最近已作为医学上重要的疾病类别而出现，其由存在于体内大多数细胞上的非运动纤毛(non-motile cilia)功能障碍引起(Waters & Beales，Pediatr Nephrol(2011)26：1039-1056)。大多数纤毛病具有共同的表型，包括视网膜变性。据预测，有超过100种疾病可能是由纤毛功能障碍引起的，在此之后，现已证明了有超过30种病症。所有这些病症都使人衰弱并且常常限制寿命，并且由于他们几乎全部丧失功能，大多数将受益于基因治疗方法的治疗。纤毛病的总患病率为一般群体中500个中有约1例。所有纤毛病都扰乱纤毛功能，因此器官受累重叠。
[0003] 常染色体隐性巴尔得-别德尔综合征(Bardet-Biedl Syndrome，BBS)是最佳表征的纤毛病之一，并且与早发性失明、严重肥胖、复杂的内分泌功能障碍、认知受损和肾衰竭相关。先天患有遗传性巴尔得-别德尔综合征的患者会经历一系列使人衰弱的医学问题，其中一些限制寿命。受影响的儿童由于在眼后部(视网膜)的光敏细胞衰竭而最终通常会在其第一个十年开始失明。在生命的第一年内，他们将增长大量体重，这如果不加以控制的话将会进展为危及生命的肥胖、糖尿病和高血压。许多患者在其生命中的某个时刻也会发生肾衰竭(其可需要透析治疗和/或肾移植)，并且大多数患者会出现某种形式的学习困难。这些问题在一起将影响成人患者独立生活的能力，并且大多数人失业。即使提早诊断出来，基于症状的治疗也只会处理无法预防的并发症，例如视网膜变性和饮食措施难以控制的肥胖。
[0004] 与许多纤毛病一样，BBS是一种常染色体隐性遗传病。迄今为止，已发现有21种基因是致病性的。这些基因产物中的许多在多亚基复合物中相互作用。例如，许多这些蛋白质形成称为BBS体(BBSome)的复合物。认为BBS体介导蛋白质运输至初级纤毛(primary cilium)。另一种复合物，BBS/CCT伴侣蛋白复合物，促进BBS体组装并且由数种BBS蛋白和许多CCT伴侣蛋白构成。由于BBS基因的蛋白质产物在物理上相互作用以执行共同功能，许多不同基因的突变导致相同的不寻常表型发现组合。BBS患者中突变的最常见基因是BBS1(42％)和BBS10(22％)。已在患有巴尔得-别德尔综合征的人中鉴定出超过30种BBS1基因中突变。人BBS1基因位于11号染色体的长(q)臂上第13位。BBS1基因中的突变可能影响纤毛的正常形成和功能。这些细胞结构中的缺陷破坏发育过程中重要的化学信号传导途径，并且导致感官知觉异常。人BBS1基因包含17个外显子并且跨越约23kb。大多数BBS1基因突变是错义或终止突变，并且最常见的突变在蛋白质第390位用氨基酸精氨酸替换氨基酸甲硫氨酸(Met390Arg或M390R)。M390R突变占所有BBS1突变的约80％。人BBS10基因位于12号染色体上，并且BBS10转录物包含仅2个外显子，编码具有723个氨基酸的蛋白质。在BBS10患者中发现的突变是错义突变、无义突变和移码突变的混合。最常见的变化是C91fs，其频率接近50％。
[0005] 迄今为止，目前用于纤毛病的所有基因治疗均以治疗单受损器官为目标。例如，许多团队已尝试使用基因治疗载体的视网膜下注射来治疗眼的视网膜病变(例如Seo等，Invest Ophthalmol Vis Sci.54(9)：6118-32(2013))。然而，使用这样的直接靶向单器官的方法将意味着针对多系统病症(例如纤毛病)将需要为每个单独的靶器官定制设计不同的载体。如果需要使用许多载体的话，那么成本可能过高并且监管过程繁琐。对于患者来说，非常期望使用单注射而不是多器官注射；其具有较小的侵入性，降低了去诊所的访视次数，并且降低了由于多次治疗而引起的风险。因此，需要使用可解决一些或所有受影响器官而不是单器官中的缺陷的方法。
[0006] Williams CL等(Mol Ther.25(4)：904-916(2017))描述了巴尔得-别德尔综合征中外周嗅觉损伤的逆转。与以上讨论的工作一样，Williams描述了以单器官为目标，并且未考虑治疗多个器官。Williams通过鼻内施用包含经荧光蛋白(GFP或mCherry)标记的小鼠BBS基因的基因治疗载体来靶向小鼠鼻组织中的嗅觉感觉神经元(olfactory sensory neuron，OSN)。至关重要的是，在Williams使用的小鼠模型中，BBS蛋白功能仅在成熟嗅觉神经元(OSN)中缺失，因此该小鼠模型仅可在OSN细胞中显示出恢复。这意味着由于所用的小鼠模型，Williams中描述的实验不能提供有关其他细胞类型或组织中BBS基因表达的任何信息，并且不能显示多个器官恢复。
[0007] WO 03/102141描述了突变BBS1基因的鉴定及其多种用途。
[0008] 发明概述
[0009] 在本发明的第一方面，提供了用于治疗纤毛病的载体，其中所述载体包含与纤毛病基因可操作地连接的启动子，其中所述载体可提供使纤毛病基因转导到多个器官中，其中所述启动子是可提供使纤毛病基因在经转导器官中表达的遍在启动子(ubiquitous promoter)，并且其中所述纤毛病基因编码与在纤毛病中突变的蛋白质相对应的功能性蛋白质。
[0010] 纤毛病通常是由导致见于体内大多数细胞上的非运动纤毛功能障碍的单基因突变引起的。因此，引入表达功能性蛋白质的校正基因补偿突变基因并且改善纤毛病的影响。以上限定的载体提供在多个器官中转导。因此，通过一种施用途径施用载体可用于提供在多个器官中的基因表达以改善与纤毛病相关的病理状况。这意味着不必如以前所做的那样单独治疗每个受影响的器官或组织。这种一次靶向多个器官的方法先前尚未在纤毛病中使用过，并且未考虑到这样的方法会发挥作用。
[0011] 纤毛病是与编码缺陷蛋白质的基因突变相关的一组病症，该基因突变导致异常的纤毛形成或功能。因此，纤毛病被定义为“与不编码蛋白质或编码缺陷蛋白质、导致异常纤毛形成或功能的基因突变相关的病症”。由于纤毛是几乎所有脊椎动物细胞的组成部分，纤毛功能障碍可表现为一系列特征，其特征性地包括视网膜变性、肾疾病和脑异常。另外的表现包括先天性肝纤维囊性疾病、糖尿病、肥胖和骨骼发育不良。纤毛病特征已与超过40种基因的突变相关。
[0012] 可使用上述载体治疗的纤毛病可以是可通过表达与在纤毛病中突变的蛋白质相对应的功能性蛋白质来治疗的任何纤毛病。主要地，这是由引起蛋白质功能丧失的突变导致的纤毛病。功能性蛋白质的表达恢复蛋白质功能，这改善异常的纤毛形成或功能。这样的纤毛病是本领域技术人员已知的。可治疗的纤毛病可选自：巴尔得-别德尔综合征、梅克尔-格鲁贝尔综合征(Meckel-Gruber syndrome)、肾消耗病(Nephronophthisis)、大洛肯综合征(Senior-Loken syndrome)、麦-考综合征(McKusick-Kaufman syndrome)、莱伯先天性黑矇(Leber’s congenital amaurosis)和朱伯特综合征(Joubert Syndrome)。在一些实施方案中，用载体治疗的纤毛病选自：巴尔得-别德尔综合征、肾消耗病、大洛肯综合征、麦-考综合征和莱伯先天性黑矇。在另一些实施方案中，用载体治疗的纤毛病选自：巴尔得-别德尔综合征、大洛肯综合征、麦-考综合征和莱伯先天性黑矇。在多个实施方案中，用载体治疗的纤毛病选自：巴尔得-别德尔综合征和麦-考综合征。在一些特别的实施方案中，用载体治疗的纤毛病是巴尔得-别德尔综合征。
[0013] 载体包含编码与在纤毛病中突变的蛋白质相对应的功能性蛋白质的纤毛病基因。换句话说，纤毛病基因编码与引起纤毛病的突变蛋白相对应的功能性蛋白质。纤毛病基因优选编码人蛋白质，例如野生型人蛋白质。确切的纤毛病基因将取决于待治疗的纤毛病以及突变并引起纤毛病病理状况的基因。因此，例如，如果患者患有由BBS1基因中突变引起的纤毛病，则用于治疗该患者的载体将包含编码功能性BBS1蛋白的纤毛病基因。
[0014] 在一些实施方案中，纤毛病基因编码选自以下的功能性蛋白质：BBS1、BBS2、BBS3/ARL6、BBS4、BBS5、BBS6/MKKS、BBS7、BBS8、BBS9、BBS10、BBS11/TRIM32、BBS12、BBS13/MKS1、BBS14/CEP290、BBS15/C2ORF86、BBS16/SDCCAG8、BBS17/LZTFL1、BBS18/BBIP1、BBS19/IFT27、BBS20/IFT74和BBS21/C8ORF37蛋白。
[0015] 在另一些实施方案中，纤毛病基因编码选自以下的功能性蛋白质：BBS1、BBS2、BBS3/ARL6、BBS4、BBS5、BBS6/MKKS、BBS7、BBS8、BBS9、BBS10、BBS11/TRIM32、BBS12、BBS14/CEP290、BBS15/C2ORF86、BBS16/SDCCAG8、BBS17/LZTFL1、BBS18/BBIP1、BBS19/IFT27和BBS20/IFT74蛋白。
[0016] 在多个实施方案中，纤毛病基因编码选自以下的功能性蛋白质：BBS1、BBS2、BBS3/ARL6、BBS4、BBS5、BBS6/MKKS、BBS7、BBS8、BBS9、BBS10、BBS11/TRIM32、BBS12、BBS15/C2ORF86、BBS16/SDCCAG8、BBS17/LZTFL1、BBS18/BBIP1、BBS19/IFT27和BBS20/IFT74蛋白。
[0017] 在数个实施方案中，纤毛病基因编码选自以下的功能性蛋白质：BBS1、BBS2、BBS3/ARL6、BBS4、BBS5、BBS6/MKKS、BBS7、BBS8、BBS9、BBS10、BBS12和BBS18/BBIP1蛋白。
[0018] 在一些特别的实施方案中，纤毛病基因编码选自以下的功能性蛋白质：BBS1、BBS2、BBS3/ARL6、BBS4、BBS5、BBS6/MKKS、BBS7、BBS8、BBS9、BBS10和BBS12蛋白。
[0019] 在一些具体实施方案中，纤毛病基因编码选自BBS1和BBS10蛋白的功能性蛋白质。
[0020] 在一些实施方案中，纤毛病基因编码功能性BBS1蛋白。
[0021] 在另一些实施方案中，纤毛病基因编码功能性BBS10蛋白。
[0022] 在一些实施方案中，待治疗的纤毛病是巴尔得-别德尔综合征，并且纤毛病基因编码选自以下的功能性蛋白质：BBS1、BBS2、BBS3/ARL6、BBS4、BBS5、BBS6/MKKS、BBS7、BBS8、BBS9、BBS10、BBS11/TRIM32、BBS12、BBS13/MKS1、BBS14/CEP290、BBS15/C2ORF86、BBS16/SDCCAG8、BBS17/LZTFL1、BBS18/BBIP1、BBS19/IFT27、BBS20/IFT74和BBS21/C8ORF37蛋白。
[0023] 在另一些实施方案中，待治疗的纤毛病是梅克尔-格鲁贝尔综合征，并且纤毛病基因编码功能性BBS13/MKS1蛋白。
[0024] 在多个实施方案中，待治疗的纤毛病是肾消耗病，并且纤毛病基因编码功能性BBS14/CEP290蛋白。
[0025] 在一些特别的实施方案中，待治疗的纤毛病是大洛肯综合征，并且纤毛病基因编码功能性BBS14/CEP290蛋白。
[0026] 在一些实施方案中，待治疗的纤毛病是麦-考综合征，并且纤毛病基因编码功能性BBS6/MKKS蛋白。
[0027] 在另一些实施方案中，待治疗的纤毛病是莱伯先天性黑矇，并且纤毛病基因编码功能性BBS14/CEP290蛋白。
[0028] 在多个实施方案中，待治疗的纤毛病是朱伯特综合征，并且纤毛病基因编码功能性BBS14/CEP290蛋白。
[0029] 纤毛病基因编码的功能性蛋白质优选不包含在野生型蛋白中不存在的另外的氨基酸。任何另外的氨基酸都可能干扰蛋白质的正常功能。例如，优选的是功能性蛋白质不包含荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP)或mCherry)，或者标签(例如FLAG标签或多组氨酸标签)。
[0030] 在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少70％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少72％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少74％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少76％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少78％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少80％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少82％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少84％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少85％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少86％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少88％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少92％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少94％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少95％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少96％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少97％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少98％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与其具有至少99％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
[0031] 在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少70％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少72％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少74％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少76％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少78％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少80％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少82％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少84％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少85％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少86％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少88％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少92％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少94％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。
在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少95％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少96％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少97％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少98％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少99％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少95％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少96％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少97％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少98％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列或与其具有至少99％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
[0032] 在以上实施方案中，可对纤毛病基因的核苷酸序列进行密码子优化以使蛋白质表达最大化。在密码子优化中，编码的蛋白质的氨基酸序列保持不变，因此其仍将具有功能。其仅是对核苷酸序列进行修饰。SEQ ID NO.11和12是编码BBS1的经密码子优化的核苷酸序列，并且SEQ ID NO.13和14是编码BBS10的经密码子优化的核苷酸序列。已发现这些序列使基因表达出乎意料地大幅提高。
[0033] 在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少70％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少72％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少74％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少76％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少78％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少80％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少82％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少84％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少85％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少86％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少88％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少92％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少94％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少95％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少96％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少97％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少98％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列或与其具有至少99％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列。
[0034] 在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少70％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少72％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少74％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少76％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少78％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少80％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少82％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少84％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少85％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少86％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少88％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少92％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少94％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少95％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少96％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少97％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少98％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列或与其具有至少99％序列同一性，并且编码功能性BBS1蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.12的核苷酸序列。
[0035] 在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少70％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少72％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少74％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少76％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少78％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少80％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少82％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少84％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少85％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少86％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少88％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少92％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少94％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少
95％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少96％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少97％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少98％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少99％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列。
95％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少96％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少97％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少98％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列或与其具有至少99％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.13的核苷酸序列。
[0036] 在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少70％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少72％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少74％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少76％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少78％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少80％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少82％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少84％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少85％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少86％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少88％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在另一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少92％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少94％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在多个实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少
95％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少96％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少97％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少98％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少99％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列。
95％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在某些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少96％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少97％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在许多实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少98％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列或与其具有至少99％序列同一性，并且编码功能性BBS10蛋白。在一些特别的实施方案中，纤毛病基因具有SEQ ID NO.14的核苷酸序列。
[0037] 在多个实施方案中，纤毛病基因编码功能性BBS1蛋白，所述功能性BBS1蛋白具有SEQ ID NO 9的蛋白质序列或与其具有至少80％序列同一性。在一些实施方案中，功能性BBS1蛋白具有SEQ ID NO.9的蛋白质序列或与其具有至少85％序列同一性。在另一些实施方案中，功能性BBS1蛋白具有SEQ ID NO.9的蛋白质序列或与其具有至少90％序列同一性。在许多实施方案中，功能性BBS1蛋白具有SEQ ID NO.9的蛋白质序列或与其具有至少95％序列同一性。在一些特别的实施方案中，功能性BBS1蛋白具有SEQ ID NO.9的蛋白质序列。
[0038] 在另一些实施方案中，纤毛病基因编码功能性BBS10蛋白，所述功能性BBS10蛋白具有SEQ ID NO 10的蛋白质序列或与其具有至少80％序列同一性。在一些实施方案中，功能性BBS10蛋白具有SEQ ID NO.10的蛋白质序列或与其具有至少85％序列同一性。在多个实施方案中，功能性BBS10蛋白具有SEQ ID NO.10的蛋白质序列或与其具有至少90％序列同一性。在许多实施方案中，功能性BBS10蛋白具有SEQ ID NO.10的蛋白质序列或与其具有至少95％序列同一性。在一些特别的实施方案中，功能性BBS10蛋白具有SEQ ID NO.10的蛋白质序列。
[0039] 在以上描述中，术语“同一性”用于指两个序列的相似性。为了本发明的目的，在此限定，为了确定两个序列的百分比同一性，为最佳比较目的而将序列对齐(例如，可在第一序列的序列中引入空位以与第二氨基酸序列或核酸序列进行最佳比对)。然后，比较每个位置处的核苷酸/氨基酸残基。当第一序列中的位置与第二序列中的相应位置被相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是由序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/总位置数目(即，重叠位置)×100)。通常来说，两个序列的长度相同。通常在所比较的两个序列的整个长度上进行序列比较。
[0040] 技术人员将知晓以下事实：数种不同的计算机程序可用于确定两个序列之间的同一性。例如，可使用数学算法来完成序列的比较和两个序列之间百分比同一性的确定。在一个优选实施方案中，使用序列比对软件Clone Manager 9(Sci-Ed软件-www.scied.com)使用全局DNA比对(参数：两条链，评分矩阵：线性(错配2，开放空位(OpenGap)4，延伸空位(ExtGap)1))来确定两个核酸序列之间的百分比同一性。
[0041] 或者，可使用Needleman和Wunsch(1970)算法使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的百分比同一性，该算法已并入到Accelrys GCG软件包中的GAP程序(可在http：//www.accelrys.com/products/gcg/获得)中。评估两个氨基酸序列或核酸序列之间百分比同一性的另一种方法可以是使用可在国家生物技术信息中心(Naional Center for Biotechnology Information，NCBI)网站(www.blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST序列比较工具，例如使用默认参数针对核苷酸序列使用BLASTn或针对氨基酸序列使用BLASTp。
[0042] 纤毛病基因编码“功能性”蛋白质。这意味着该蛋白质在表达时与野生型人蛋白质具有相同的功能和活性。本领域技术人员可容易地确定这一点。纤毛病基因编码的蛋白质可以是野生型人蛋白质。以上讨论的多种蛋白质的野生型人序列是本领域技术人员公知的。例如，它们可在国家生物技术信息中心的可公开访问数据库中找到。此外，本领域技术人员可容易地发现或确定编码这些蛋白质(并且可包含在载体中)的核苷酸序列，例如使用使特定核苷酸密码子与特定氨基酸相关联的遗传密码。
[0043] 载体中包含的启动子是遍在启动子，其与纤毛病基因可操作地连接，使得该启动子指导纤毛病基因在经转导器官中表达。遍在启动子是在广泛多种细胞和组织中具有强活性并且提供组成型表达的启动子。合适的遍在启动子是本领域技术人员公知的。遍在启动子不是组织特异性的。其提供在多种组织/器官中的表达。遍在启动子使得纤毛病基因在经转导器官中表达，使得所表达的蛋白质改善与纤毛病相关的病理状况。
[0044] 合适的遍在启动子包括短的延伸因子启动子(EFS)、CAG启动子、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)和β-肌动蛋白启动子，例如鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)。这些启动子是本领域技术人员公知的。这些启动子的序列的一些实例作为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.45给出。因此，在一些实施方案中，启动子具有选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.45的序列。
[0045] 在一些特别的实施方案中，启动子是EFS启动子，其可具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.46的核苷酸序列。
[0046] 在一些实施方案中，启动子是CAG启动子，其可具有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.47的核苷酸序列。
[0047] 在多个实施方案中，启动子是CMV启动子，其可具有SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.45的核苷酸序列。
[0048] 在某些实施方案中，启动子是UBC启动子，其可具有SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.48的核苷酸序列。
[0049] 在许多实施方案中，启动子是PGK启动子，其可具有SEQ ID NO.7的核苷酸序列。
[0050] 在数个实施方案中，启动子是β-肌动蛋白启动子，其可具有SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.49的核苷酸序列。
[0051] 就特别的元件组合而言，载体可包含与BBS1基因可操作地连接的EFS启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS1基因可选自SEQ ID NO.1、11和12。例如，载体可包含SEQ ID NO.15、16和17之一的序列。或者，载体可包含与BBS10基因可操作地连接的EFS启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS10基因可选自SEQ ID NO.2、13和14。例如，载体可包含SEQ ID NO.30、31和32之一的序列。
[0052] 载体可包含与BBS1基因可操作地连接的UBC启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS1基因可选自SEQ ID NO.1、11和12。例如，载体可包含SEQ ID NO.18、19和20之一的序列。或者，该载体可包含与BBS10基因可操作地连接的UBC启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS10基因可选自SEQ ID NO.2、13和14。例如，载体可包含SEQ ID NO.33、34和35之一的序列。
[0053] 载体可包含与BBS1基因可操作地连接的CMV启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS1基因可选自SEQ ID NO.1、11和12。例如，载体可包含SEQ ID NO.21、22和23之一的序列。或者，载体可包含与BBS10基因可操作地连接的CMV启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS10基因可选自SEQ ID NO.2、13和14。例如，载体可包含SEQ ID NO.36、37和38之一的序列。
[0054] 载体可包含与BBS1基因可操作地连接的CBA启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS1基因可选自SEQ ID NO.1、11和12。例如，载体可包含SEQ ID NO.24、25和26之一的序列。或者，载体可包含与BBS10基因可操作地连接的CBA启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS10基因可选自SEQ ID NO.2、13和14。例如，载体可包含SEQ ID NO.39、40和41之一的序列。
[0055] 载体可包含与BBS1基因可操作地连接的CAG启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS1基因可选自SEQ ID NO.1、11和12。例如，载体可包含SEQ ID NO.27、28和29之一的序列。或者，载体可包含与BBS10基因可操作地连接的CAG启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS10基因可选自SEQ ID NO.2、13和14。例如，载体可包含SEQ ID NO.42、43和44之一的序列。
[0056] 载体可包含与BBS1基因可操作地连接的PGK启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS1基因可选自SEQ ID NO.1、11和12。或者，载体可包含与BBS10基因可操作地连接的PGK启动子，该载体用于治疗巴尔得-别德尔综合征。BBS10基因可选自SEQ ID NO.2、13和14。
[0057] 上述载体可提供使纤毛病基因转导到多个器官中。这可以是任何合适的载体，并且这样的载体是本领域技术人员公知的。在一些特别的实施方案中，载体可穿过血脑屏障。这允许转导在脑和神经系统(包括眼)中发生，以及还在内脏器官和肌肉系统中发生。因此，单载体可用于在多个器官中提供基因表达以改善与纤毛病相关的病理状况。该基因表达可以是全身性的，因为其可发生在全身的多个部位中。此外，通过有限数量的途径施用载体可用于提供全身性基因表达以在全身改善与纤毛病相关的病理状况。这意味着不必单独治疗每个受影响的组织。这种一次靶向多个器官的方法先前尚未在纤毛病中使用过，并且未考虑到这样的方法会发挥作用。
[0058] 可用上述载体转导的器官可选自：中枢神经系统、眼(例如视网膜光感受器和视网膜色素上皮)、心脏、肝、肌肉、胰、脾、肺和肾。因此，在一些实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到选自中枢神经系统、眼、心脏、肝、肌肉、胰、脾、肺和肾的多个器官中。在另一些实施方案中，载体提供所纤毛病基因转导到选自中枢神经系统、眼、心脏、肝、肌肉、胰、脾、肺和肾的至少三个器官中。在多个实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到至少四个所述器官中。在许多实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到至少五个所述器官中。在一些实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到至少六个所述器官中。在另一些实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到至少七个所述器官中。在多个实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到至少八个所述器官中。在一些特别的实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到中枢神经系统、眼、心脏、肝、肌肉、胰、脾、肺和肾中。在某些实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到至少中枢神经系统(例如，脑)和眼中。在多个实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到至少中枢神经系统(例如，脑)、眼，以及肝、肾和脾之一中。在一些实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到至少中枢神经系统(例如，脑)、眼和肝中。在一些特别的实施方案中，载体提供使纤毛病基因转导到至少中枢神经系统(例如，脑)、眼、肝、肾和脾中。
[0059] 合适的载体包括腺相关病毒8(adeno-associated virus-8，AAV8)和腺相关病毒9(adeno-associated virus-9，AAV9)，以及已用来自AAV8或AAV9的衣壳蛋白假型化(pseudotyped)的其他AAV(例如AAV2)。这样的载体在WO 2005/033321中描述。另一些合适的载体包括AAV-PHP.A和AAVPHP.B(Nature Biotechnology 34，204-209(2016))、AAV9.47(Hum Gene Ther.2016年7月；27(7)：497-508)、AAV-B1(Mol.Ther.24，1247-1257)、AAV8(Y733F)(Mol Ther 2009；17：463-471)和AAV2-TT(在WO2015/121501中描述)。也可使用慢病毒载体，例如如Trends in Molecular Medicine，2016年4月，第22卷，第4期和Ther Deliv.2010年10月；1(4)：517-534中所述的。
[0060] 在一些实施方案中，载体是AAV载体，例如AAV8、AAV9、用来自AAV8或AAV9的衣壳蛋白假型化的AAV载体、AAV-PHP.A、AAV-PHP.B、AAV9.47、AAV-B1、AAV8(Y733F)或AAV2-TT。在另一些实施方案中，载体选自AAV8、AAV9、用来自AAV8或AAV9的衣壳蛋白假型化的AAV载体、AAV-PHP.A、AAV-PHP.B、AAV9.47和AAV-B1。在多个实施方案中，载体选自AAV8、AAV9、用来自AAV8或AAV9的衣壳蛋白假型化的AAV载体、AAV-PHP.A和AAV-PHP.B。在许多实施方案中，载体选自AAV8、AAV9、用来自AAV8或AAV9的衣壳蛋白假型化的AAV载体、和AAV-PHP.B。在一些特别的实施方案中，载体选自AAV8、AAV9，以及用来自AAV8或AAV9的衣壳蛋白假型化的AAV载体。在一些实施方案中，载体选自AAV8和用来自AAV8的衣壳蛋白假型化的AAV载体(例如，用来自AAV8的衣壳蛋白假型化的AAV2(AAV2/8))。在另一些实施方案中，载体选自AAV9和用来自AAV9的衣壳蛋白假型化的AAV载体(例如，用来自AAV9的衣壳蛋白假型化的AAV2(AAV2/9))。
[0061] 腺相关病毒载体可以是重组腺相关病毒(rAAV)载体。AAV是在Kenneth I.Berns，″Parvoviridae：The Viruses and Their Replication，″Fields Virology第69章(第3版.1996)中描述的细小病毒科(Parvoviridae)的成员。
[0062] 所有已知AAV血清型的基因组组构都非常相似。AAV的基因组是线性的单链DNA分子，其长度小于约5,000个核苷酸(nt)。末端反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)位于非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VP1、-2和-3)形成衣壳。末端145nt是自互补的并且被组织成使得可形成形成T形发夹的能量稳定的分子内双链体。这些发夹结构用作病毒DNA复制的起点，用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中野生型(wt)AAV感染后，分别从P5启动子和P19启动子表达Rep基因(即编码Rep78和Rep52蛋白)，并且这两种Rep蛋白在病毒基因组的复制中均具有功能。Rep ORF中的剪接事件导致实际上四种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已显示，在哺乳动物细胞中编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA足以产生AAV载体。同样在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白也足以产生AAV载体。
[0063] 在适合用作基因治疗载体的AAV中，载体基因组通常包含待包装用于递送至靶细胞的核酸(例如，纤毛病基因)。根据该具体实施方案，异源核苷酸序列位于载体基因组任一端在病毒ITR之间。在另一些优选实施方案中，使细小病毒(例如AAV)cap基因和细小病毒(例如AAV)rep基因从模板基因组(并且因此从由此产生的病毒体(virion)DNA)缺失。这种构造使可由细小病毒衣壳携带的核酸序列的尺寸最大化。
[0064] 根据该具体实施方案，核酸位于底物任一端在病毒ITR之间。细小病毒基因组具有仅一个ITR也可发挥功能。因此，在基于细小病毒的基因治疗载体中，载体基因组侧接至少一个ITR，但更通常地侧接两个AAV ITR(通常载体基因组的两侧各有一个，即，一个在5’端并且一个在3’端)。在载体基因组中的核酸与一个或更多个ITR之间可存在间插序列。
[0065] 通常来说，将纤毛病基因(即编码与在纤毛病中突变的蛋白质相对应的功能性蛋白质的核苷酸序列(用于在哺乳动物细胞中表达))并入到细小病毒基因组中位于两个常规ITR之间或位于用两个D区改造的ITR的任一侧。
[0066] 在一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含如上所述的载体，以及一种或更多种可药用赋形剂。所述一种或更多种赋形剂包括载体、稀释剂和/或其他医用试剂、药用剂或辅料等。
[0067] 本发明还提供了治疗纤毛病的方法，其包括向患有纤毛病的患者施用治疗有效量的如上所述的载体。优选地，患者是人。
[0068] 当在以上方法中纤毛病得到“治疗”时，这意味着一种或更多种纤毛病症状得到改善。这并不意味着症状得到彻底挽救使得其在患者中不再存在，尽管在一些方法中可以正是这种情况。该治疗方法使得一种或更多种纤毛病症状没有治疗之前严重。该治疗方法可使得多种纤毛病症状没有治疗之前严重。由于在多个器官中转导和基因表达，症状的改善在多个器官中发生。
[0069] “治疗有效量”是指在必需的剂量下和时间段内有效达到期望治疗结果、例如提高对象中功能性蛋白质的水平(以引起足以改善纤毛病症状的水平)的量。
[0070] 该治疗方法引起对象中功能性蛋白质的水平提高。在一些实施方案中，该治疗方法引起功能性蛋白质水平提高至约正常水平(即，见于正常健康对象中的水平)。在一个实施方案中，该治疗方法引起功能性蛋白质水平提高至至多正常水平。
[0071] 载体可以以任何合适的方式施用以允许纤毛病基因在多个器官中表达。在一些特别的实施方案中，载体的单施用可用于提供基因表达以改善与纤毛病相关的病理状况。载体的施用可提供全身性基因表达以在全身改善与纤毛病相关的病理状况。载体可静脉内施用或颅内施用。在一些特别的实施方案中，载体静脉内施用。在一些实施方案中，载体颅内施用。在多个实施方案中，载体静脉内和颅内施用。
[0072] 载体可鞘内施用。这可以单独进行或者作为静脉内和/或颅内施用的补充。
[0073] 颅内施用是借助于立体定向注射将载体直接递送至脑的特定区域。颅内施用不包括视网膜下施用，例如视网膜下注射。
[0074] 此外，载体应优选不鼻内施用。经鼻施用途径可将载体的表达限制在小的鼻细胞亚群，并且不允许载体靶向身体其他部位中的主要受影响组织。另外，由于小鼻细胞亚群的迅速替换，经鼻途径不允许转基因的长期持续表达。
[0075] 如果载体通过多种施用途径施用，例如静脉内和颅内施用，则该载体在同一天在这两个部位施用。在一些实施方案中，多个施用在六个小时的间隔内、在四个小时的间隔内或甚至在两个小时的间隔内给予。在一些实施方案中，多个施用同时给予。
[0076] 载体可在单时间点施用。例如，可给予单注射。如果载体通过多种施用途径施用，例如静脉内和颅内施用，则在两个部位施用载体仅一次(并且如上所述至少在同一天)。随后不给予进一步的施用。
[0077] 此外，本发明提供了上述载体，其用于治疗，例如用于治疗纤毛病。
[0078] 另外，本发明提供了如上所述的载体在制备用于治疗纤毛病的药物中的用途。
[0081] 现在将参照如下附图仅通过实例的方式详细描述本发明：
[0082] 图1：限制性消化。使用Xho1消化的AAV2/8、辅助病毒和BBS1的质粒DNA。凝胶电泳，其显示1％琼脂糖凝胶上用限制性酶Xho1消化的辅助质粒(pHGTI，泳道2)、AAV2/8质粒(pLT-AAV2/8，泳道3)和BBS1质粒(pAV-EFS-BBS1，泳道4)各自的质粒DNA。HyperLadder在泳道1中见到。质粒用于产生hAAV2/8-EFS-BBS1。条带大小分别为：对于辅助质粒：6318bp和11549bp(泳道2)，并且对于AAV2/8质粒：186bp、2109bp和4844bp(泳道3)。对于pAV-EFS-BBS1，条带大小为236bp、643bp、1195bp和5078bp(泳道4)。
[0083] 图2：293T细胞的人BBS1转染。用EFS-BBS1质粒转染293T之后的蛋白质和mRNA表达。A)由从经转染和未转染293T细胞提取的mRNA进行逆转录PCR之后的2％琼脂糖凝胶。泳道1为标志物，并且泳道2、4和6显示经转染的cDNA；泳道3、5和7为没有进行逆转录的经转染细胞；泳道8、10和12为未转染的cDNA；以及泳道9、11和13为未转染的无逆转录酶对照。泳道14显示用于PCR的ddH2O样品作为阴性对照。B)在转染之后的293T细胞中可见转染之后的BBS1蛋白表达。泳道2、3和4是经转染细胞，并且泳道5、6和7是未转染的。HSP90β和GAPDH的蛋白质表达用作内对照。
[0084] 图3：人BBS1在视网膜和CNS(中枢神经系统)中的表达。显示转基因人BBS1表达的RT-PCR。颅内和全身性递送之后的P35动物。AAV2/8-EFS-BBS1的颅内注射(I.C.)显示人BBS1与小鼠Bbs1在脑和眼中明显表达(黑色箭头)，表明具有良好的转导和表达。在静脉内(全身性)注射动物(I.V.)的眼中观察到人BBS1的明显表达(白色箭头)。设计了区分小鼠和人BBS1的特异性引物。mBbs1(小鼠Bbs1)；AAV-hBBS1(经转导的人BBS1)；β-肌动蛋白(β-肌动蛋白阳性对照)；肾病蛋白(Nephrin)(阴性对照)。
[0085] 图4.在小鼠中P0颅内和全身性递送之后在P180(注射之后180天)通过RT-PCR的人BBS1在视网膜和CNS(中枢神经系统)中的表达。A)在静脉内(全身性)注射动物(I.V.)的眼和脑中观察到人BBS1的明显表达。B)AAV2/8-EFS-BBS1的颅内注射(I.C.)显示人BBS1在脑中明显表达，表明具有良好的转导和表达。设计了区分小鼠和人BBS1的特异性人引物。M390R＝Bbs1M390R/M390R动物。+/+＝野生型动物。RT-＝RT-PCR阴性对照。
[0086] 图5.在经处理和未经处理的Bbs1M390R/M390R中的表型表达示出，在经P0颅内处理动物中体重减小。当用AAV2/8EFS-BBS1构建体颅内处理时，Bbs1M390R/M390R动物显示在雄性和雌性中体重在统计学上显著地恢复回至野生型水平(参见p值)。IC＝颅内。Het＝杂合动物，Bbs1M390R/M390R。WT＝野生型动物。M390R＝纯合动物Bbs1M390R/M390R。误差条显示平均值的标准误差(S.E.M)。在进行非线性曲线拟合(冈珀茨增长曲线拟合(Gompertz growth curve fitting))、随后进行ANOVA和Tukey检验之后获得p值。
[0087] 图6.在经处理和未经处理的Bbs1M390R/M390R中的表型表达示出，在经P0全身性处理动物中体重减轻。当用AAV2/8 EFS-BBS1构建体静脉内处理时，Bbs1M390R/M390R动物显示在雄性和雌性中相对于野生型水平的增重减弱(参见p值)。IV＝静脉内。Het＝杂合动物，Bbs1M390R/M390R。WT＝野生型动物。M390R＝纯合动物Bbs1M390R/M390R。误差条显示平均值的标准误差(S.E.M)。在进行非线性曲线拟合(Gompertz增长曲线拟合)、随后进行ANOVA和Tukey检验之后获得p值。
[0088] 图7.冈珀茨增长非线性回归分析的图示。冈珀茨增长对所有测试的非线性回归曲线函数中的最佳者进行拟合。A.经颅内P0处理的雄性。B.经全身性P0处理的雄性。C.经颅内P0处理的雌性。D.经全身性P0处理的雌性。I.C.＝颅内。I.V.＝静脉内。
[0089] 图8.血清瘦素血浆浓度/体重。经AAV2/8-EFS-BBS1 IV和IC处理的Bbs1M390R/M390R动物在处理之后6个月血清瘦素浓度降低。M390R＝纯合动物Bbs1M390R/M390R。WT＝野生型动物。IC＝经颅内处理。IV＝经静脉内处理。
[0090] 图9.伊红-苏木精视网膜切片，其显示经AAV2/8-EFS-BBS1 IV处理的Bbs1M390R/M390R动物在处理之后6个月光感受器的损失减弱。对于量化，参见图11。ONL＝外核层。IN＝内核层。所有图像均用×40物镜拍摄。
[0091] 图10.伊红-苏木精视网膜切片，其显示经AAV2/8-EFS-BBS1 IC处理的Bbs1M390R/M390R动物在处理之后6个月光感受器的损失减弱。对于量化，参见图11。ONL＝外核层。IN＝内核层。所有图像均用×40物镜拍摄。
[0092] 图11.外核层切片视网膜厚度的量化。与未经处理的动物相比，在Bbs1M390R/M390R经处理动物中恢复的ONL核的数目加倍。
[0093] 图12.在以下实例中使用的包含EFS和人BBS1的载体(EFS-hBBS1)的图，其中标明了主要特征。该载体用于产生AAV2/8-EFS-BBS1病毒。在本发明的某些实施方案中，启动子、纤毛病基因和限制性位点可根据最终产物而不同。
[0094] 图13.在P0颅内AAV2/8-EFS-BBS1递送之后52周时眼和脑中通过RT-PCR的人BBS1表达。在颅内注射AAV2/8-EFS-BBS1(经IC处理)之后，在经注射动物的眼和脑中观察到人BBS1的明显表达，表明具有良好的转导和持久表达。设计了区分小鼠和人BBS1的特异性人引物，并且未观察到小鼠Bbs1的检出。M390R＝Bbs1M390R/M390R；WT，野生型动物，UT，未经处理；经IC处理，经颅内处理。
[0095] 图14.注射一年之后的构建体效力。与野生型未经处理的同窝出生仔畜(littermate)相比，在用构建体AAV2/8 EFS-BBS1进行围产期颅内处理之后12个月，Bbs1M390R/M390R经处理雄性继续显示体重减轻。WT＝野生型动物。M390R＝纯合动物Bbs1M390R/M390R
。误差条显示平均值的标准误差(S.E.M)。
。误差条显示平均值的标准误差(S.E.M)。
[0096] 图15.处理之后52周循环瘦素的水平。雄性和雌性Bbs1M390R/M390R动物显示瘦素水平升高。经AAV2/8-EFS-BBS1处理雄性动物与未经处理的野生型动物具有相同的瘦素水平。经处理的Bbs1M390R/M390R与未经处理的野生型无显著性差异(p值0.647)。未经处理的Bbs1M390R/M390R M390R/M390R M390R/M390R与经处理的Bbs1 具有0.027的显著性p值。与未经处理的Bbs1 动物相
比，经AAV2/8-EFS-BBS1处理的雌性动物显示其瘦素水平显著降低(p值0.041)。M，雄性；F，雌性；WT，野生型；HOM，Bbs1M390R/M390R；UT，未经处理；IC，颅内。
比，经AAV2/8-EFS-BBS1处理的雌性动物显示其瘦素水平显著降低(p值0.041)。M，雄性；F，雌性；WT，野生型；HOM，Bbs1M390R/M390R；UT，未经处理；IC，颅内。
[0097] 图16.显示用来自SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.29的所有构建体单独转染之后BBS1的表达的实时PCR。在构建体转染之后，提取总RNA，并针对具有SEQ ID NO.15的构建体(EFS-WTBBS1)对RNA水平进行量化和归一化。
[0098] 图17.显示用来自SEQ ID NO.30至SEQ ID NO.44的所有构建体单独转染之后BBS10的表达的实时PCR。在构建体转染之后，提取总RNA，并针对具有未转染HEK293T总mRNA的构建体对RNA水平进行量化和归一化。
[0099] 图18.示出在用具有SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.29的构建体单独转染之后BBS1蛋白的表达的Western印迹。使用Image J量化印迹，并且针对SEQ ID NO.15(EFS-WTBBS1)对所有BBS1表达水平进行归一化。
[0100] 图19.使用Image J量化来自图18的印迹，并针对SEQ ID NO.15(EFS WT BBS1)对所有BBS1表达水平进行归一化。与初始EFS-WTBBS1构建体相比，几乎所有构建体和新BBS1序列均显示提高的BBS1蛋白表达。
[0101] 图20.来自经P0 AAV2/9-CAG-COSEQ1-BBS1颅内注射动物的样品的COSEQ1-BBS1的RT-PCR。在用P0 AAV2/9-CAG-COSEQ1-BBS1注射之后8、14和40天时对Bbs1+/M390R动物进行挑选(culled)。提取总RNA并合成cDNA。进行预期条带为188个核苷酸的COSEQ1-BBS1的PCR，并且在脑和眼中检出基因表达的表达。P，注射之后的天数，C-所注射的对照载剂，bp.碱基对。
[0102] 发明详述
[0103] 本发明人已开发了通过简单注射施用并且一次靶向多个器官的单载体。这种方法比替代的多载体方法更简单并且当然更具成本效益。恢复多于一个器官的功能(例如，视力和体重降低)将通过改善纤毛病患者的健康和生命质量而改变人生。
[0104] 鉴于纤毛病中广泛的器官受累，需要能解决中枢神经系统和内脏症状二者的多器官治疗。此外，在婴儿期患者中症状的早期出现将理想地需要这样的治疗尽可能早地施用。在新生儿期递送单治疗将有效地靶向多个器官，防止不可逆的病理状况，并且具有成本效益。
[0105] 为了实现这些目的，本发明人已使用基于基因治疗的方案，该方案利用腺相关病毒来实现多器官治疗。直到最近，由于不能找到可靶向外周器官并且穿过血脑屏障的病毒载体，多器官基因递送一直是困难的。然而，AAV8和AAV9可穿过血脑屏障并介导高度有效地基因递送至小鼠(Foust KD等Nat Biotechnol.2009；27(1)：59-65)和非人灵长类(Foust KD等Nat Biotechnol.2010；28(3)：271-4；Bevan AK等Mol Ther.2011；19(11)：1971-80)的中枢神经系统的发现改变了该领域的观点。现在可行的是，考虑简化载体的施用以使得可用较少的施用途径而不是使用每个器官一种施用的方案来治疗多个器官。例如，已示出向新生小鼠静脉内施用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的AAV8或AAV9引起脑和神经系统(包括眼)的广泛且全局的转导。此外，本发明人的数据表明该方法也引起广泛的全身性转导，包括内脏器官和肌肉系统(FASEB J.2015年9月；29(9)：3876-88.)。
[0106] 防止在婴儿期出现症状的多系统且进行性的病症(例如巴尔得-别德尔综合征)是用于新生儿治疗性AAV递送的理想候选者。由于在BBS1中发现了引起BBS的最常见突变，因M390R/M390R此本发明人已在一种BBS鼠疾病模型Bbs1 中测试了携带人基因BBS1的AAV8和AAV9载体。该模型是常见突变的“敲入”并且已得到充分验证和表征以重演人BBS表型(包括失明和肥胖)。外源性BBS1基因的转录由哺乳动物遍在EFS启动子驱动，该启动子在所靶向器官中广泛表达。这种方法利用了AAV8和AAV9穿过血脑屏障的能力，在此随后可靶向神经元缺陷(例如视网膜、海马/齿状回或下丘脑食欲中枢)，从而分别恢复视网膜功能和肥胖。这些疾病模型中成功的全身性基因转移在为患者进行临床试验之前提供载体的必要的原理验证、最佳剂量信息、恢复效力，以及毒性和安全性概况。
[0107] 本发明人将在短延伸因子启动子(EFS)控制下的人BBS1 cDNA克隆到用来自腺相关病毒8的衣壳蛋白假型化的AAV-2载体(AAV2/8)中。这些数据显示EFS-BBS1构建体在HEK293T细胞中高效转染并表达人BBS1。在通过P0幼畜的颅内递送或全身性(IV)递送产生病毒并感染之后，在视网膜和脑中显示良好的转导。在经处理小鼠中未观察到毒理作用。本发明人能够示出，当处理突变Bbs1M30R/M390R动物时，肥胖和视网膜表型可得到高度地挽救。
[0108] BBS1核苷酸和氨基酸序列在人和小鼠之间高度保守(92.2％)。产生了在Bbs1基因中携带M390R突变(患者中最常见的突变)的敲入小鼠(Proc Natl Acad Sci USA.2007年12月4日；104(49)：19422-19427)。Bbs1M390R/M390R小鼠视网膜的顺序组织学(sequential histology)显示内段和外段(IS和OS)的进行性变性，这是缓慢的并且在出生之后6个月才完成。Bbs1M390R/M390R敲入小鼠的视网膜电图(electroretinogram，ERG)显示a波和b波衰减显著，而c波衰减较低，表明变性主要影响视锥和视杆光感受器细胞而不影响视网膜色素上皮(RPE)。另外，Bbs1M390R/M390R小鼠还发生肥胖，其与提示瘦素抗性的高血清水平的脂肪细胞来源瘦素激素、食物摄入增多和活动能力降低相关。此外，还检测到许多神经解剖学缺陷，包括纹状体和海马(其是在认知和学习中重要的区域)尺寸减小。这些表型重演了人疾病，使小鼠模型理想地用于评估新治疗。小鼠Bbs10基因和人BBS10基因均由两个外显子编码。其蛋白质以具有67％同一性的氨基酸序列保守。Bbs10 null(Bbs10-/-)小鼠缺少Bbs10的整个外显子2。Bbs10-/-小鼠表现出典型的BBS表型，围产期发育不全(runting)且从8开始发生肥胖，并且在生命的第三个月超重。Bbs10-/-小鼠还发生饮食过多和高循环瘦素水平。Bbs10-/-小鼠发生严重的视网膜变性，到3月龄时，光感受器的内部IS和OS以及ONL明显损失(Cilia 2015 4：10)。
[0109] 材料和方法
[0110] 已产生构建体，其中已将人BBS1 cDNA(SEQ ID NO.1-NM_024649.4)克隆到AAV2/8病毒质粒中在EFS启动子(人真核翻译延伸因子1α1短启动子)的控制下。由于该项目的目的是靶向用于巴尔得-别德尔综合征1(BBS1)的病毒基因治疗，因此产生了包含人野生型BBS1cDNA并且由延伸因子-1α短(EFS)启动子驱动的腺相关病毒(AAV)。对于病毒产生，使用通常方法。用包含EFS-BBS1-AAV-ITR的质粒、AAV2 Rep-Cap质粒和辅助质粒转染4000cm2的HEK293T细胞单层细胞。一旦显示细胞病变作用，就收获细胞并裂解以释放病毒。通过使用两个连续氯化铯梯度进行离心来对腺相关病毒进行纯化。将最终产物脱盐，用分光光度法测定病毒颗粒的滴度，并针对PFU/IFU进行噬斑形成测定。
[0111] 本发明人还将BBS10野生型cDNA(SEQ ID NO.2)克隆在EFS启动子的控制之下，并且还克隆了BBS1的全新经密码子优化序列(SEQ ID NO.11和12)和BBS10的全新经密码子优化序列(SEQ ID NO.13和14)以改善基因表达水平和效力。新序列克隆在EFS、CAG、CMV、CBA、UBC启动子的控制之下。将所述启动子与所述BBS1和BBS10序列的所有可能组合克隆到包含pAV-AAV-ITR的质粒中。启动子克隆在SpeI与EcoRI限制性位点之间，随后用EcoRI和SalI限制性酶在启动子的3’下游插入BBS编码序列。对克隆进行测序以检查启动子和编码区中不想要的突变。包含启动子和基因序列的所有序列示为SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.44。
[0112] 为了测试基因表达的改善，使用1μg/μl的DNA，使用Lipofectamine 2000方案用以下所有不同的构建体转染HEK293T细胞：
[0113] pAV-EFS-WTBBS1，pAV-EFS-COSEQ1-BBS1，pAV-EFS-COSEQ2-BBS1，pAV-UBC-WTBBS1，pAV-UBC-COSEQ1-BBS1，pAV-UBC-COSEQ2-BBS1，pAV-CMV-WTBBS1，pAV-CMV-COSEQ1-BBS1，pAV-CMV-COSEQ2-BBS1，pAV-CBA-WTBBS1，pAV-CBA-COSEQ1-BBS1，pAV-CBA-COSEQ2-BBS1，pAV-CAG-WTBBS1，pAV-CAG-COSEQ1-BBS1，pAV-CAG-COSEQ2-BBS1，pAV-EFS-WTBBS10，pAV-EFS-COSEQ1-BBS10，pAV-EFS-COSEQ2-BBS10，pAV-UBC-WTBBS10，pAV-UBC-COSEQ1-BBS10，pAV-UBC-COSEQ2-BBS10，pAV-CMV-WTBBS10，pAV-CMV-COSEQ1-BBS10，pAV-CMV-COSEQ2-BBS10，pAV-CBA-WTBBS10，pAV-CBA-COSEQ1-BBS10，pAV-CBA-COSEQ2-BBS10，pAV-CAG-WTBBS10，pAV-CAG-COSEQ1-BBS10，pAV-CAG-COSEQ2-BBS10。
[0114] 用0.5ml Trizol收获细胞的总mRNA。量化总mRNA，并且对于每次转染使用1μg的mRNA进行实时PCR。每个序列的特异性引物用于每种构建体以量化人BBS1表达的水平。对于所有BBS构建体针对EFS-BBS1和对于BBS10构建体针对未转染样品对Ct值表达水平进行归一化。
[0115] 在分开的实验中，还针对BBS1蛋白表达转染了细胞。RIPA缓冲液用于提取总蛋白质，并针对每次转染量化总蛋白质。对于每次转染将1μg/μl样品蛋白上样到4％至20％丙烯酰胺凝胶中。用针对BBS1的特异性抗体进行western印迹，并对凝胶进行扫描和分析。作为上样对照，用GAPDH抗体进行第二western印迹。通过首先针对每个泳道针对GAPDH进行归一化并随后针对每个凝胶相对于EFS-WTBBS1表达进行归一化来量化印迹。
[0116] 病毒施用和滴度
[0117] 在Bbs1M390R/+雄性和Bbs1M390R/+雌性之间准备进行定时交配。P0幼畜按性别和Bbs1基因型进行基因分型。在P0动物中通过两种施用途径给予腺病毒相关载体：a)颅内(5μl 3.5x1013vg/ml(载体基因组/ml))和全身性(IV)(20μl 3.5x1013vg/ml)。全身性注射通过颞面静脉(temporal face vein)进行。
[0118] 本发明人对3个不同的动物组进行注射：Bbs1M390R/M390R动物、野生型动物和杂合动物。未注射对照已用作每个组的对照。使用总共n＝6只动物/组。在注射之后6个月之后，经处理动物没有显示任何身体或行为痛苦。
[0119] 基于经密码子优化序列和构建体的结果，本发明人决定测试新构建体向不同组织递送和表达人BBS1的能力。本作者测试了新病毒衣壳(AAV2/9)、新CAG启动子和新CAG-COSEQ1-BBS1构建体(SEQ ID NO.28)。产生包含CAG-COSEQ1-BBS1构建体(SEQ ID NO.28)的AAV2/9载体并通过给药P0新生幼畜测试恢复Bbs1活性的有效性。在5μl注射剂中以12 M390R/M390R +/M390
0.175x10 vg/动物对Bbs1 新生幼畜进行颅内注射。也向对照Bbs1 和WT动物注
射AAV2/9-CAG-COSEQ1-BBS1或载剂，并在注射之后14天和40天测试人BBS1表达。
0.175x10 vg/动物对Bbs1 新生幼畜进行颅内注射。也向对照Bbs1 和WT动物注
射AAV2/9-CAG-COSEQ1-BBS1或载剂，并在注射之后14天和40天测试人BBS1表达。
[0120] 结果
[0121] 本发明人首次展示使用基因治疗技术对受纤毛病病症、巴尔得-别德尔综合征影响的多个组织进行治疗。在遍在启动子EFS的控制下，人BBS1 cDNA转导了BBS1蛋白在AAV2/8载体中的表达。图1示出了在对克隆的pAV-EFS-BBS1进行消化之后的确切大小(泳道4)，表明克隆正确。为了产生该AAV，获得了生产质粒(producer plasmid)pHGTI、pLT-AAV2-8和pAV-EFS-BBS1。辅助质粒是pHGTI，其包含编码单纯疱疹病毒蛋白的序列。这些对于高效产生AAV是必需的。pLT-AAV2-8质粒包含编码分别来自AAV2和AAV8的AAV rep和cap基因的序列。rep基因是AAV复制所必需的，并且cap基因编码决定AAV向性(tropism)的衣壳蛋白。最后，pLT-AAV2-8质粒包含AAV末端反向重复序列，其与BBS1 cDNA一起由EFS启动子控制。正是这些序列被包装到AAV中并递送至细胞。
[0122] 为了评估获得的生产质粒是否如预期那样，通过消化pLT-AAV2-8、pHGTI和pAV-EFS-BBS1质粒DNA进行了限制性酶消化(图1)。pLT-AAV2-8质粒的条带大小分别为186bp、2109bp和4844bp(泳道3，图1)。对于转基因pAV-EFS-BBS1构建体，条带大小为236bp、643bp、
1195bp和5078bp(泳道4，图1)。对于辅助质粒，可见的条带大小分别为6318bp和11549(泳道
2，图1)，这证实了质粒中不存在另外的不想要的DNA。
1195bp和5078bp(泳道4，图1)。对于辅助质粒，可见的条带大小分别为6318bp和11549(泳道
2，图1)，这证实了质粒中不存在另外的不想要的DNA。
[0123] 当用pAV-EFS-BBS1质粒转染HEK293T细胞时，观察到BBS1的高表达。此数据表明EFS能够在体外驱动人BBS1的表达(图2)。本发明人产生并纯化了AAV2/8-EFS-BBS1，并经颅内和全身性递送对P0野生型胚胎进行注射。AAV2/8-EFS-BBS1的转导能力在这两种组织视网膜和脑中得到证明。见到人BBS1在视网膜中的特异性表达和脑表达(图3，图4)。
[0124] 进行了功能研究以评估在Bbs1M390R/M390R小鼠模型中BBS1表达的效力。在P0向野生型、杂合Bbs1M390R/+和Bbs1M390R/M390R同窝出生仔畜注射AAV2/8-EFS-BBS1。平行地，将来自所有三种基因型的未经处理动物的组群保持作为对照。本发明人追踪该组群26周，每周测量每只动物的体重。在颅内注射和全身性注射的Bbs1M390R/M390R动物中在体重维持方面均显示显著的改善(图5至7)。在用AAV2/8-EFS-BBS1处理的野生型动物和未经处理动物之间未观察到体重差异。已显示人BBS1表达水平持续至少一年，因为发现在颅内注射之后52周，人BBS1在眼和视网膜中表达(图13)。如图14中所示，体重调节的改善也维持了一整年。通过非线性回归随后进行单因素ANOVA和Tukey检验统计学分析的过程，从统计学上证明了与未经处理动物相比，在用AAV2/8-EFS-BBS1处理的Bbs1M390R/M390R动物中体重挽救显著(图6)。分析血清中瘦素的水平。在用AAV2/8-EFS-BBS1静脉内和颅内处理的Bbs1M390R/M390R动物中，瘦素恢复到正常水平(图8)。对于用AAV2/8-EFS-BBS1在出生以前进行处理的雄性和雌性二者，正常瘦素水平维持52周(图15)。
[0125] 在P0用AAV2/8-EFS-BBS1处理的Bbs1M390R/M390R动物还显示外核细胞ONL的数目损失减弱。所述减弱通过与未经处理的Bbs1M390R/M390R动物相比量化在6个月时经处理动物的视网膜中存在的存活光感受器的核的数目得到证明。在经静脉内和颅内处理的组中均观察到这种作用(图9、10和11)。
[0126] 使用新的经密码子优化序列，研究者示出在BBS1构建体转染之后BBS1 mRNA的相对表达得到改善(参见图16)。CMV启动子显示最高的表达水平，随后是CAG启动子表达。与野生型人BBS1 cDNA相比，BBS1密码子优化序列COSEQ1-BBS1和COSEQ2-BBS1具有好得多的表达。具有更好表达的构建体是提高19倍的CMV-COSEQ1-BBS1、提高10倍的CMV-WTBBS1和提高7倍的CAG-COSEQ1-BBS1。所有表达均相对于EFS-WTBBS1表达进行了归一化。使用新的BBS10构建体，转染也显示人BBS10表达提高，并且在大多数启动子-BBS10序列组合中，新的经密码子优化BBS10序列实现更好的BBS10 RNA产率(图17)。
[0127] 来自所有BBS1构建体转染物的蛋白质提取物的Western印迹显示，对于所有BBS1构建体，蛋白质表达均提高。检测到BBS1(65kDa)和GAPDH(38kDa)的特异性条带(参见图18)。如图19中所示进行蛋白质的量的分析和归一化。
[0128] 凝胶分析显示，新的经密码子优化序列COSEQ1-BBS1和COSEQ1-BBS2如何能够比野生型BBS1更好地表达BBS1，无论用于驱动表达的启动子是哪种。最高表达见于序列COSEQ1-BBS1，其用CMV启动子实现33倍提高，并且用CAG启动子实现24倍提高。
[0129] 本发明人示出了在载体转导之后40天AAV2/9-CAG-COSEQ1-BBS1构建体中新经密码子优化序列COSEQ1-BBS1在脑和眼中表达(参见图20)。为了检查条带的特异性，将条带切割，清洗并进行Sanger测序，观察到COSEQ1-BBS1的正确序列。
[0130] 讨论
[0131] 这些结果示出，本发明人能够用单施用基因治疗载体将表达野生型BBS1蛋白的人功能性BBS1基因递送至多个受影响的组织。WT Bbs1在CNS中的表达提高，随后是下丘脑瘦素调节功能的恢复，这表现为体重减轻和循环瘦素降低。类似地，在全身性递送之后6个月，在人BBS1在眼中表达之后视网膜变性减弱(图3至15)。
[0132] 大多数纤毛病的多组织性质使得用单治疗来治疗一些或全部受影响的不同器官具有挑战性。即使如果目前将基因治疗开发成治疗特定器官，其也仅可用于该特定表型而将不会更普遍地治疗该病症。
[0133] 所有纤毛病都具有受不同严重程度影响的相同器官(参见综述N Engl J Med 2011；364：1533-1543 2011年4月21日)。在所有它们中，BBS是一种较多器官直接受BBS基因中突变影响的纤毛病。本发明人已证明基因治疗能够以单载体剂量靶向多个受影响的组织。因此，本发明将能够通过单施用来靶向受影响器官中的特定纤毛病基因以恢复功能。
[0134] 即使在纤毛病病症主要影响单器官的情况下，例如在一些纤毛视网膜病症的情况下，静脉内、颅内、和/或静脉内和颅内施用也将比视网膜下治疗的实际技术更有效且无风险。
[0135] 另一些纤毛病的治疗
[0136] 上述实验表明，蛋白质的全身性表达替代造成纤毛病(在这种情况下为巴尔得-别德尔综合征)之突变基因的功能是治疗一些或所有受纤毛病影响之器官的有效方式。因此，这是比先前的尝试更有效的治疗纤毛病的方式。所有纤毛病都是以一种方式或另一种影响纤毛功能或结构的类似病症谱的一部分。这种关系的表型输出是，已发现相同基因可导致多于一种的纤毛病。在不同的纤毛病中可找到共同的共有基因，例如MKKS/BBS6与巴尔得-别德尔综合征和麦-考综合征相关。共有表型表达(意味着相同的器官受到影响)和遗传同质性(同一基因参与多于一种纤毛病)的事实使得这项基因递送和表达发明成为治疗许多纤毛病的独特方法。因此，该方法不仅限于巴尔得-别德尔综合征，而且其还适用于许多纤毛病。而且，所有纤毛病都是由单基因的突变引起的，因此，合适非突变基因的全身性表达使与纤毛病相关的病理状况在全身得到改善。
[0137] 如上所示，可使用这种基因治疗方法来治疗巴尔得-别德尔综合征。下表示出了其中可发生突变而引起与巴尔得-别德尔综合征相关的表型病理状况的许多基因。因此，使用如上所述的包含合适基因以表达野生型非突变蛋白的基因治疗载体可治疗巴尔得-别德尔综合征。
[0138] 另外，一些与巴尔得-别德尔综合征相关的基因也与另一些相关纤毛病相关。结果，具有合适基因的上述方法也可用于治疗另一些纤毛病，例如朱伯特综合征、梅克尔-格鲁贝尔综合征、肾消耗病、大洛肯综合征、麦-考综合征和莱伯先天性黑矇。例如，麦-考综合征由MKKS/BBS6基因中的突变引起。因此，提供MKKS/BBS6基因表达以使得野生型MKKS/BBS6蛋白被表达的载体可用于治疗或缓解麦-考综合征以及巴尔得-别德尔综合征。这也适用于下表中提及的多种其他纤毛病。
[0139]
[0140] 序列
[0141] SEQ ID NO.1-人巴尔得-别德尔综合征1(BBS1)核苷酸序列(WT)，cDNA(NM_024649.4)
[0142] SEQ ID NO.2-人巴尔得-别德尔综合征10(BBS10)核苷酸序列(WT)，cDNA(NM_024685.3)
[0143] SEQ ID NO.3-短延伸因子(EFS)启动子序列
[0144] SEQ ID NO.4-CAG启动子序列
[0145] SEQ ID NO.5-泛素C(UBC)启动子序列
[0146] SEQ ID NO.6-巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子序列
[0147] SEQ ID NO.7-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子序列
[0148] SEQ ID NO.8-鸡β肌动蛋白(CBA)启动子序列
[0149] SEQ ID NO.9-人BBS1全蛋白序列(Q8NFJ9)
[0150] SEQ ID NO.10-人BBS10全蛋白序列(Q8TAM1)
[0151] SEQ ID NO.11-编码人BBS1蛋白的经密码子优化的核苷酸序列(称为COSEQ1-BBS1)
[0152] SEQ ID NO.12-编码人BBS1蛋白的经密码子优化的核苷酸序列(称为COSEQ2-BBS1)
[0153] SEQ ID NO.13-编码人BBS10蛋白的经密码子优化的核苷酸序列(称为COSEQ1-BBS10)
[0154] SEQ ID NO.14-编码人BBS10蛋白的经密码子优化的核苷酸序列(称为COSEQ2-BBS10)
[0155] SEQ ID NO 15-包含EFS启动子(第41至272位nt)和野生型BBS1核苷酸序列(第1238至3019位nt)的构建体(称为EFS-WTBBS1)
[0156] SEQ ID NO 16-包含EFS启动子(第41至272位nt)和COSEQ1-BBS1核苷酸序列(第1243至3024位nt)的构建体(称为EFS-COSEQ1-BBS1)
[0157] SEQ ID NO 17-包含EFS启动子(第41至272位nt)和COSEQ2-BBS1核苷酸序列(第1243至3024位nt)的构建体(称为EFS-COSEQ2-BBS1)
[0158] SEQ ID NO 18-包含UBC启动子(第29至1198位nt)和野生型BBS1核苷酸序列(第1281至3062位nt)的构建体(称为UBC-WTBBS1)
[0159] SEQ ID NO 19-包含UBC启动子(第29至1198位nt)和COSEQ1-BBS1核苷酸序列(第1285至3066位nt)的构建体(称为UBC-COSEQ11BBS1)
[0160] SEQ ID NO 20-包含UBC启动子(第29至1198位nt)和COSEQ2-BBS1核苷酸序列(第1285至3066位nt)的构建体(称为UBC-COSEQ2-BBS1)
[0161] SEQ ID NO 21-包含CMV启动子(第367至570位nt)和野生型BBS1核苷酸序列(第626至2407位nt)的构建体(称为CMV-WTBBS1)
[0162] SEQ ID NO 22-包含CMV启动子(第367至570位nt)和COSEQ1-BBS1核苷酸序列(第630至2411位nt)的构建体(称为CMV-COSEQ1-BBS1)
[0163] SEQ ID NO 23-包含CMV启动子(第367至570位nt)和COSEQ2-BBS1核苷酸序列(第630至2411位nt)的构建体(称为CMV-COSEQ2-BBS1)
[0164] SEQ ID NO 24-包含CBA启动子(第42至319位nt)和野生型BBS1核苷酸序列(第469至2250位nt)的构建体(称为CBA-WTBBS1)
[0165] SEQ ID NO 25-包含CBA启动子(第42至319位nt)和COSEQ1-BBS1核苷酸序列(第473至2254位nt)的构建体(称为CBA-COSEQ1-BBS1)
[0166] SEQ ID NO 26-包含CBA启动子(第42至319位nt)和COSEQ2-BBS1核苷酸序列(第473至2254位nt)的构建体(称为CBA-COSEQ2-BBS1)
[0167] SEQ ID NO 27-包含CAG启动子(第35至562位nt)和野生型BBS1核苷酸序列(第712至2493位nt)的构建体(称为CAG-WTBBS1)
[0168] SEQ ID NO 28-包含CAG启动子(第35至562位nt)和COSEQ1-BBS1核苷酸序列(第716至2497位nt)的构建体(称为CAG-COSEQ1-BBS1)
[0169] SEQ ID NO 29-包含CAG启动子(第35至562位nt)和COSEQ2-BBS1核苷酸序列(第716至2497位nt)的构建体(称为CAG-COSEQ2-BBS1)
[0170] SEQ ID NO 30-包含EFS启动子(第41至272位nt)和野生型BBS10核苷酸序列(第1243至3414位nt)的构建体(称为EFS-WTBBS10)
[0171] SEQ ID NO 31-包含EFS启动子(第41至272位nt)和COSEQ1-BBS10核苷酸序列(第1243至3414位nt)的构建体(称为EFS-COSEQ1-BBS10)
[0172] SEQ ID NO 32-包含EFS启动子(第41至272位nt)和COSEQ2-BBS10核苷酸序列(第1243至3414位nt)的构建体(称为EFS-COSEQ2-BBS10)
[0173] SEQ ID NO 33-包含UBC启动子(第29至1198位nt)和野生型BBS10核苷酸序列(第1285至3456位nt)的构建体(称为UBC-WTBBS10)
[0174] SEQ ID NO 34-包含UBC启动子(第29至1198位nt)和COSEQ1-BBS10核苷酸序列(第1285至3456位nt)的构建体(称为UBC-COSEQ1BBS10)
[0175] SEQ ID NO 35-包含UBC启动子(第29至1198位nt)和COSEQ2-BBS10核苷酸序列(第1285至3456位nt)的构建体(称为UBC-COSEQ2-BBS10)
[0176] SEQ ID NO 36-包含CMV启动子(第367至570位nt)和野生型BBS10核苷酸序列(第630至2801位nt)的构建体(称为CMV-WTBBS10)
[0177] SEQ ID NO 37-包含CMV启动子(第367至570位nt)和COSEQ1-BBS10核苷酸序列(第630至2801位nt)的构建体(称为CMV-COSEQ1-BBS10)
[0178] SEQ ID NO 38-包含CMV启动子(第367至570位nt)和COSEQ2-BBS10核苷酸序列(第630至2801位nt)的构建体(称为CMV-COSEQ2-BBS10)
[0179] SEQ ID NO 39-包含CBA启动子(第42至319位nt)和野生型BBS10核苷酸序列(第473至2644位nt)的构建体(称为CBA-WTBBS10)
[0180] SEQ ID NO 40-包含CBA启动子(第42至319位nt)和COSEQ1-BBS10核苷酸序列(第473至2644位nt)的构建体(称为CBA-COSEQ1-BBS10)
[0181] SEQ ID NO 41-包含CBA启动子(第42至319位nt)和COSEQ2-BBS10核苷酸序列(第473至2644位nt)的构建体(称为CBA-COSEQ2-BBS10)
[0182] SEQ ID NO 42-包含CAG启动子(第35至562位nt)和野生型BBS10核苷酸序列(第716至2887位nt)的构建体(称为CAG-WTBBS10)
[0183] SEQ ID NO 43-包含CAG启动子(第35至562位nt)和COSEQ1-BBS10核苷酸序列(第716至2887位nt)的构建体(称为CAG-COSEQ1-BBS10)
[0184] SEQ ID NO 44-包含CAG启动子(第35至562位nt)和COSEQ2-BBS10核苷酸序列(第716至2887位nt)的构建体(称为CAG-COSEQ2-BBS10)
[0185] SEQ ID NO.45-替代的CMV启动子序列
[0186] SEQ ID NO.46-替代的短延伸因子(EFS)启动子序列
[0187] SEQ ID NO.47-替代的CAG启动子序列
[0188] SEQ ID NO.48-替代的泛素C(UBC)启动子序列
[0189] SEQ ID NO.49-替代的鸡β肌动蛋白(CBA)启动子序列
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