[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及两种携带SGSH基因表达框的重组腺相关病毒载体及其在治疗IIIA型粘多糖贮积症的应用。

[0002] 粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)是一类因溶酶体内相关的酸性水解酶缺乏或活性降低使酸性黏多糖(也称糖胺聚糖，glycosaminoglycan，GAG)无法降解或降解不完全，导致GAG及其中间代谢产物在体内堆积引起的严重致残、致死的单基因遗传性代谢病[1]。GAG是一类蛋白多糖，其代谢产物的主要类型及在体内的分布情况如下：(1)硫酸皮肤素(dermatan sulfate，DS)，主要分布于皮肤、韧带、动脉及心瓣膜组织里；(2)硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)(包括4-CS、6-CS)，主要存在于骨、软骨、角膜、肌腱、血管等组织；(3)硫酸乙酰肝素(Heparan Sulphate，HS)，主要存在于大动脉、肝、肺和各种细胞膜表面；(4)硫酸角质素(keratan sulfate，KS)，为角膜、软骨的基质成分；(5)透明质素[2](hyaluronan，HA)，广泛存在于关节液、软骨、结缔组织基质、皮肤、脐带和玻璃体液中 。这些代谢不完全物的过量堆积，会影响细胞的正常功能，从而导致患者多器官、多组织的受损。

[0003] 根据溶酶体分解酶缺陷及贮积粘多糖种类的不同，目前可将MPS分为7大型17种亚型，包括：MPS Ⅰ型(含ⅠH、ⅠS、ⅠH/S三种亚型)，MPS Ⅱ型(含ⅡA、ⅡB两种亚型)，MPS Ⅲ型(含ⅢA、ⅢB、ⅢC、ⅢD四种亚型)，MPS Ⅳ型(含ⅣA、ⅣB两种亚型)，MPS Ⅵ型(含ⅥA、ⅥB两种亚型)，MPS Ⅶ型，MPS Ⅸ型(含HYAL1、HYAL2、HYAL3三种亚型)[3]。MPS Ⅴ型后经证实实际为MPS Ⅰ S亚型， MPS Ⅷ型也被证实不是一个新的类型，因国际MPS命名机构的提议，原先的编号被保留。国内以MPS Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ四型较常见。除MPS Ⅱ型为X染色体连锁隐性遗传(XR)外，其余均为常染色体隐性遗传(AR)。

[0004] MPS Ⅲ型(又称Sanffilippo综合征)根据缺乏的酶的不同及成纤维细胞混合培养结果将本病分为A、B、C、D四种亚型。A型为乙酰肝素-N-硫酸酯酶(N-sulfoglucosamine sulfohydrolase，SGSH)缺乏，B型为α-N-乙酰葡糖胺酶缺乏，C型为N-乙酰基转移酶缺乏，D型为葡糖胺-6-硫酸酯酶缺乏。以上酶的缺乏均可引起硫酸(类)肝素(HS)在体内无法正常降解从而蓄积[4]。

[0005] 黏多糖贮积症Ⅲ A型(mucopolysaccharidosis type  3A，MPS 3A，又称Sanffilippo综合征A型)是一种由基因缺陷导致的常染色体隐性遗传病，发病率根据种群[5]不同约为1/100000到1/500000 。该疾病的患者体内溶酶体缺乏乙酰肝素-N-硫酸酯酶(N-sulfoglucosamine sulfohydrolase，SGSH)使硫酸乙酰肝素(Heparan Sulphate，HS)无法从溶酶体降解从而不断累积，影响细胞正常的生理活动[6]。疾病会导致进行性的智力低下，同时可出现进行性神经症状，如抽风运动过多、痉挛性四肢瘫、全身无力、攻击性行为等，此[7]
为该症最突出的症状 。大多数病人面部表现正常，少数病人表现头大、面容丑陋、腹部膨隆、进行性耳聋、关节僵直和手屈曲呈爪状[8]。骨骼改变仅有多发性成骨不全和顶骨后部致密、增厚。这些改变对诊断本病具有一定程度的特异性[9]。肝、脾肿大为轻度到中度，无角膜浑浊，无心脏受累。本型的骨骼异常较轻微，可有颅顶、颞后部及枕骨增厚乳突气化不良；椎体上下缘稍隆起，或呈椭圆形；锁骨内侧端增宽，部分病人前肋呈“船桨”样增宽；髂骨翼外展，髂骨体短而窄。髋臼上缘较平直；管状骨粗短，干骺端稍增宽，可伴有骨的塑形障碍。骨髓腔窄小、不规则等[10]。Héron等报告了15例MPS IIIA诊断的主要临床表现为语言延迟(93％)，粗糙特征(92％)，异常行为(75％)，肝肿大(51％)，自闭症谱系障碍(29％)，以及癫痫(17％)。Delgadillo等报告了34例MPS IIIA患者的类似症状; 言语延迟，粗面部特征和多动症是最常发生的3例，多动症发生在中位年龄为3.8岁，言语损失为5.8岁，癫痫发作为
7.0岁(范围，2.5-16.0岁)，以及失去行走能力为10.4岁。Valstar等发现发育迟缓和/或行为问题的最初迹象通常出现的中位年龄为2.5岁。80名患者中有53名被诊断为癫痫，中位年龄为11.0岁[11]。

[0006] 目前，MPS 3A没有有效的治疗方法，只能通过辅助治疗来改善患者的生存质量[12]。治疗MPS 3A的关键是使患者溶酶体得到足量的降解HS的SGSH，手段包括骨髓和干细胞移植，酶替代治疗和基因治疗。遗憾的是，临床研究发现骨髓移植并不能减轻智力的退化[13]；酶替代疗法即为患者输入重组SGSH蛋白，难点在于输入的蛋白难以通过血脑屏障发[14]挥作用 ，患者需要终生用药，过程痛苦并且费用昂贵。基因治疗被认为可以从根本上治愈本症[15]。目前国际上有Lysogene(法国)及Abeona(美国)两者将基因治疗药物推进到一期和二期临床阶段。Lysogene采用颅内注射的方式给药，需要进行手术，给药过程复杂为病人带来痛苦。Abeona公司设计的药物采用U1a启动子，U1a启动子表达水平较弱[16-17]。国内还未见MPS 3A相关的基因治疗项目报道。为了彻底治愈MPS 3A疾病，使患者有药可医，有必要来开发新的药物。

[0007] 回顾MPS 3A的发病机制，位于17q25.3的SGSH基因发生突变导致机体不能合成出正确的SGSH蛋白导致了这种进行性疾病[18]，目前已发现了100种以上的SGSH基因突变与疾病快速或慢性的进展相关[19]。MPS 3A是一种常染色体隐性遗传病，当父母都是缺陷基因的携带者时，生下的孩子有25%的可能是患儿，50%的可能也是携带者。携带者的SGSH蛋白的酶活性会有降低，约为正常个体的50%左右，MPS 3A患者的酶活性一般为正常水平的10%或更低[20]。HS在动物组织中广泛存在并且结构多样，主要存在于大动脉、肝、肺和各种细胞膜的表面，与其对应同样也具有多种生物活性和功能，包括细胞的黏附、调控细胞生长和增殖、发育过程和血液凝固、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、血管发生、病毒入侵和肿瘤转移等等。此外，HS参与保护蛋白质不被降解，调控蛋白质通过基底膜转移，介导蛋白质内置等[21]。SGSH蛋白缺陷导致HS不能正常代谢从而在细胞和组织内累积，从而影响组织器官的正常生理功能，形成一系列的疾病。

[0008] 腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)因在腺病毒制品中发现而得名[22-23]。AAV是微小病毒科 (Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA[24]，其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒[25]，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在[26]时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态 ，而不产生子代病毒。

[0009] 最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)[27]。AAV2基因组长约4.7kb,基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”( inverted terminal repeat, ITR)，呈回文-发卡结构[28]。基因组中有两个大开放阅读框(ORF)，分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中[29-30]。

[0010] ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用[31]。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site，RBS)和末端解链位点trs(terminal resolution site)，能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口[32]。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用[33]。

[0011] AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区[34]。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs(terminal resolution site)和GAGY重复基序(repeat motif)特异性结合[35]，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。

[0012] 随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs(terminal resolution site)序列还能够使包装得到的重组AAV(recombinate AAV, rAAV)病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率[36-37]。包装得到的病毒成为scAAV(self-complementary AAV)病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV(single-stranded AAV)，即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织[38]。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导致大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能[39]。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性[40]，容易开发出稳定性较高的生物制品。

[0013] AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV1)为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统[41]，该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略[42-43]。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略[44]。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列(Inverted terminal repeat，ITR)/外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒[45]。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统[46]，使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒[47-48]以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略[49-50]。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。

[0014] 由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2017年04月，全球已经通过的基因治疗临床方案共2463个，所治疗的疾病主要是对人类健康威胁严重的、未被满足临床需求的各种疾病，具体包括遗传病、肿瘤、心血管疾病、感染性疾病、自身免疫疾病、中枢神经系统疾病、血液病、代谢疾病及其它各种难治性疾病等。而由于安全性及表达持久等优势，AAV载体越来越多地成为了基[51]因治疗的首选 。已通过的临床方案中，约7.4%使用了AAV载体作为基因的传递系统。详细信息可参考网站http://abedia.com/wiley/indications.php。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个AAV载体基因治疗药物[52]；B型血友病[53]和先天性黑矇症(RPE65基因突变引起)[54]的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。

[0015] 本发明中，我们选择AAV载体来携带SGSH基因表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因[55]，免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达[56]，避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过静脉注射具有较高的转导效率[57-61]，保证SGSH基因表达框能够在体内高效地表达。

[0016] 根据以上设计思路，我们制备得到单链rAAV-CA-SGSH及双链rAAV-CMR-SGSH病毒，并设计制备得到表达绿色荧蛋白的rAAV-CA-EGFP，rAAV-CMR-EGFP等对照病毒。将这些病毒分别等剂量注射至SGSH基因缺陷的模型小鼠体内，评价设计rAAV-CA-SGSH，rAAV-CMR-SGSH的有效性。结果显示， rAAV-CA-SGSH及rAAV-CMR-SGSH能够在模型小鼠体内持续稳定地长时间表达SGSH蛋白，显著提高模型小鼠体内的SGSH含量，水解细胞溶酶体中过多的硫酸乙酰肝素，使细胞中硫酸乙酰肝素的含量大幅下降，达到并维持正常水平。显示出巨大的治愈MPS IIIA疾病的潜力。

[0017]

[0018] 有鉴于此，本发明提供两种基于AAV载体的新型MPS IIIA疾病的基因治疗药物。药物由AAV载体携带SGSH基因表达框。SGSH基因为野生型人类SGSH基因。在基因表达框中， CA启动子及人为设计的CMR启动子调控SGSH基因的高效表达。基于上述设计，预期该药物通过静脉注射后能够在体内高效表达SGSH蛋白，显著提高细胞内SGSH蛋白的含量，参与水解溶酶体中过多的硫酸乙酰肝素，使细胞中硫酸乙酰肝素的含量大幅下降，达到并维持正常水平，从而达到治疗MPS IIIA的目的。

[0019] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了两种治疗MPS IIIA疾病的基因治疗药物，其特征在于，药物基于重组AAV载体，利用AAV载体通过静脉注射能高效地将药物效应元件导入体内，实现药物效应元件表达治疗作用产物蛋白SGSH的高效表达。为了实现SGSH蛋白的高效表达，根据不同血清型AAV的转导特点，静脉注射主要选择AAV9以突破血脑屏障的限制。

[0020] 本发明提供的治疗MPS IIIA疾病的基因治疗药物，其特征还在于，基于设计的SGSH基因表达框能够实现SGSH蛋白的高效表达。在野生型人SGSH基因序列的翻译起始密码子前添加Kozak序列5’-GCCACC-3’，提高蛋白翻译时的准确起始效率。分别采用CA启动子及人为设计的CMR启动子调控SGSH基因转录，CA启动子由人CMV病毒的增强子序列和鸡β-actin蛋白的基础启动子组成，使SGSH基因能够在多种细胞中高效转录。CMR启动子由人CMV病毒的增强子序列经结构优化组成，避免了传统CMV启动子在肝脏沉默的特性，能够在全身广泛性表达，并在肝脏具有较好的特异性。

[0021] 本发明提供的MPS IIIA疾病基因治疗药物，其特征在于，将该药物经静脉注射注射至SGSH基因缺陷模型小鼠体内后，能在小鼠体内高效持续稳定地表达SGSH蛋白，表达产生的SGSH蛋白参与细胞内的硫酸乙酰肝素的水解，降低其在细胞中的积累，并使其维持在正常水平。从而消除细胞中由硫酸乙酰肝素过多的积累导致的各种疾病症状，达到治疗目的.本发明提供的MPS IIIA疾病基因治疗药物，其特征还在于，一次给药就能够长期持续地使细胞高效表达SGSH蛋白，参与水解过多的硫酸乙酰肝素，使细胞中的硫酸乙酰肝素维持在正常水平。从而达到长时间的治疗效果。

[0022] 本发明用到的重要原始实验材料如下所示：pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System (Agilent Technologies，美国)，由本研究所购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。

[0023] pAAV-R2C9质粒，由本研究所构建保存。以AAV Helper Free System(Agilent Technologies，美国)中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV9外壳蛋白编码序列(GenBank ID： AY530579)替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C9质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C9质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C9质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒获得pAAV-R2C9质粒。pAAV-R2C9质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV9外壳蛋白。

[0024] pAAV-R2C5质粒，由本研究所构建保存。以AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV基因组（GenBank ID：NC_006152.1）中外壳蛋白编码序列Cap5（基因组中第2207至4381位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C5质粒序列。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C5质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C5质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI之间序列，获得pAAV-R2C5质粒。pAAV-R2C5质粒包含完整的AAV5的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV5病毒中提供病毒包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV5外壳蛋白。

[0025] pAAV-R2C10质粒，由本研究所构建保存。以AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAVrh10外壳蛋白编码序列（GenBank ID：AY243015.1）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C10质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C10质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C10质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII和PmeI酶切位点之间序列获得pAAV-R2C10质粒。pAAV-R2C10质粒包含完整的AAVrh10的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAVrh10病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAVrh10外壳蛋白。

[0026] 包装重组AAVDJ的包装系统采用Cell Biolabs公司AAV-DJ/8 Helper Free Packaging System(货号：VPK-400-DJ-8, Cell Biolabs)，操作过程参见说明书。

[0027] SGSH基因缺陷的模型小鼠：购自美国the  jackson  laboratory  (jax)，No.003780。由北京艾德摩生物技术有限公司代为繁育。6-10周龄的SGSH基因缺陷的纯合小鼠用于实验。对照小鼠，C57BL/6J小鼠，购自北京艾德摩生物技术有限公司，用作动物实验的野生型对照。

[0028]附图说明

[0029] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0030] 图1：pRDAV-CMV载体结构示意图。由北京五加和分子医学研究所有限公司惠赠，基于AAV载体pAAV2neo[62]构建而来。ITR，inverted terminal repeat，长度为145 bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。bGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。该载体含有多个限制性酶切位点。

[0031] 图2：pRDAV-CA载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145 bp的反向末端重复序列。CA promoter，人巨细胞病毒早期基因增强子序列、鸡β-actin启动子序列拼接。bGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。该载体含有多个限制性酶切位点。

[0032] 图3：pRDAV-CA-SGSH载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145 bp的反向末端重复序列。CA promoter，人巨细胞病毒早期基因增强子序列、鸡β-actin启动子序列拼接。SGSH：人乙酰肝素-N-硫酸酯酶的编码序列（coding sequence，CDS）。bGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Neo，新霉素抗性基因读框。

[0033] 图4：pscAAV-CMV载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，两侧的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子的序列。bGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。该载体含有多个限制性酶切位点。

[0034] 图5：pscAAV-CMR-SGSH载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，两侧的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的反向末端重复序列。CMR promoter，人为设计的启动子。SGSH：人乙酰肝素-N-硫酸酯酶的CDS。SV40 polyA，猴空泡病毒的的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。

[0035] 图6：pRDAV-CA-SGSH、pscAAV-CMR-SGSH质粒转染Huh-7细胞后蛋白表达检测结果。pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH转染Huh-7细胞。48 h后，消化收集细胞并提取Huh-7细胞总蛋白，取30 μg测定SGSH表达，方法为Western blotting。结果显示转染pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH后，细胞的SGSH蛋白条带明显，而空白细胞总蛋白中未检测到SGSH蛋白条带。泳道1，空白Huh-7细胞的SGSH蛋白及内参蛋白GAPDH；泳道2，转染pRDAV-CA-SGSH的Huh-7细胞的SGSH蛋白及内参蛋白GAPDH，泳道3，转染pscAAV-CMR-SGSH的Huh-7细胞的SGSH蛋白及内参蛋白GAPDH。

[0036] 图7：pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH质粒体外转染Huh-7细胞后SGSH酶活性检测结果。pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH质粒转染Huh-7细胞。48 h后，消化收集细胞提取Huh-7细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取30 μg测定SGSH酶活性。结果显示转染pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH质粒后，细胞的SGSH酶活性相比空细胞极显著上升。

[0037] 图8：rAAVDJ -CA-SGSH及rAAVDJ -CMR-SGSH感染Huh-7细胞后SGSH酶活性检测结果。rAAVDJ-SGSH及rAAVDJ -CMR-SGSH感染Huh-7细胞，MOI分别为2000及10,000 vector genome (GC)/cell。48 h后，提取细胞总蛋白，取30 μg测定SGSH酶活性。结果显示，感染rAAVDJ-SGSH后，Huh-7细胞相对于空白Huh-7细胞SGSH酶活性显著升高，当MOI为10,000 GC/cell时，SGSH的活性较显著高于MOI为2000 GC/cell。

[0038] 图9：pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH质粒水动力注射C57BL/6J野生型小鼠SGSH酶活性检测的结果。pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH质粒通过尾静脉水动力注射C57BL/6J野生型小鼠，加入未注射野生型C57BL/6J小鼠作为对照。18 h后处死小鼠，取肝脏，提取总蛋白后取30 μg测定SGSH酶活。结果表明，注射pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH质粒的小鼠肝脏SGSH酶活性显著升高。

[0039] 图10：rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH注射C57BL/6J野生型小鼠SGSH酶活性检测的结果。rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH通过尾静脉注射C57BL/6J野生型小鼠，剂量分别为1×1013 GC/kg与5×1013 GC/kg。同时加入注射PBS的野生型C57BL/6J小鼠作为对照。1个月后，将全部小鼠处死，分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等。提取总蛋白后，取30 μg测定SGSH酶活。结果表明，注射rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH的小鼠在各组织SGSH酶活性均有提高，肝和脾组织提升最为显著。剂量为5×1013 GC/kg时各组织SGSH酶活性均高于剂量为1×1013 GC/kg。scAAV9-CMR-SGSH相比rAAV9-CA-SGSH在多组织内酶活性提升更高。

[0040] 图11：rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH注射SGSH基因缺陷的模型小鼠后SGSH酶活性检测结果。rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH通过尾静脉注射SGSH基因缺陷的模型小鼠，剂量为5×1013 GC/kg。同时加入注射PBS的模型小鼠及野生型C57BL/6J小鼠作为对照。3个月后，将全部小鼠处死，分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等。提取总蛋白后，取30 μg测定SGSH酶活。结果表明，未注射病毒的模型小鼠各组织器官中SGSH酶活性极低几乎测不到，注射病毒的模型小鼠各组织器官SGSH酶活性显著升高，仅略低于野生型小鼠。在心脏与肝脏中的SGSH酶活性甚至超过未注射病毒的野生型小鼠。

[0041] 表1 rAAV9-SGSH注射SGSH基因缺陷的模型小鼠后病毒载量的检测结果。rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH通过尾静脉注射SGSH基因缺陷的模型小鼠，剂量为5×1012 vg/kg。同时加入未注射病毒的模型小鼠及野生型C57BL/6J小鼠作为对照。3个月后，将全部小鼠处死，分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等。提取总蛋白后，测定病毒载量。结果表明，未注射病毒的模型小鼠及野生型小鼠各组织器官几乎测不到病毒载量。而注射病毒的模型小鼠各组织器官病毒载量明显升高，其中肝脏中病毒载量最高。

[0042] 图12：rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH注射SGSH基因缺陷的模型小鼠后尿液GAG含量检测结果。rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH通过尾静脉注射SGSH基因缺陷的模型小鼠，剂量为5×1013 GC/kg。同时加入注射PBS的模型小鼠及野生型C57BL/6J小鼠作为对照。3个月后，取实验组及对照组的全部小鼠的尿液各200 μL，采用DMMB显色法测量小鼠尿液GAG含量。结果表明，注射病毒的模型小鼠尿液GAG含量明显下降。

[0043] 图13：rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH注射SGSH基因缺陷的模型小鼠后组织GAG含量检测结果。rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH通过尾静脉注射SGSH基因缺陷的模型小鼠，剂量为5×1013 GC/kg。同时加入注射PBS的模型小鼠及野生型C57BL/6J小鼠作为对照。3个月后，将全部小鼠处死，分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等。提取组织的GAG，采用DMMB显色法测量小鼠肝、脾GAG含量。结果表明，注射病毒的模型小鼠在各组织GAG含量明显下降。

[0044] 图14：rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH注射SGSH基因缺陷的模型小鼠后抓绳实验检测结果。rAAV9-CA-SGSH及scAAV9-CMR-SGSH通过尾静脉注射SGSH基因缺陷的模型小鼠，剂量为5×1013 GC/kg。同时加入注射PBS的模型小鼠及野生型C57BL/6J小鼠作为对照。3个月后，利用抓绳实验检测全部小鼠的四肢力量及平衡能力。结果表明，相比对照组模型小鼠，治疗组模型小鼠抓绳时间明显延长，与正常小鼠基本无差异。注射scAAV9-CMR-SGSH较注射rAAV9-CA-SGSH的模型小鼠抓绳时间更久。

[0045] 图15：rAAV9-CA-SGSH、scAAV9-CMR-SGSH与scAAV9.U1a.hSGSH注射SGSH基因缺陷的模型小鼠后SGSH酶活性比较。rAAV9-CA-SGSH、scAAV9-CMR-SGSH与scAAV9.U1a.hSGSH通过尾静脉注射SGSH基因缺陷的模型小鼠，剂量为5×1013 GC/kg。3个月后，将全部小鼠处死，分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等。提取总蛋白后，取30 μg测定SGSH酶活。结果表明，未注射病毒的模型小鼠各组织器官中SGSH酶活性极低，注射病毒的模型小鼠各组织器官SGSH酶活性显著升高，酶活性注射scAAV9-CMR-SGSH的模型小鼠高于注射rAAV9-CA-SGSH的模型小鼠高于注射scAAV9.U1a.hSGSH的模型小鼠。

[0046] 图16：AAV载体不同血清型注射SGSH基因缺陷的模型小鼠后SGSH酶活性比较。rAAV5-CA-SGSH、rAAV9-CA-SGSH、rAAVrh10-CA-SGSH、rscAAV5-CMR-SGSH、rscAAV9-CMR-
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SGSH、rscAAVrh10-CMR-SGSH，通过尾静脉注射SGSH基因缺陷的模型小鼠，剂量为5×10  GC/kg。3个月后，将全部小鼠处死，分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等。提取总蛋白后，取30 μg测定SGSH酶活。结果表明，未注射病毒的模型小鼠各组织器官中SGSH酶活性极低，注射病毒的模型小鼠各组织器官SGSH酶活性显著升高。各组织酶活性比较，载体血清型为AAV5低于血清型为AAVrh10低于AAV9.

[0047] 本发明公开了两种IIIA型粘多糖贮积症基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。

[0048] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1 质粒载体的构建
为了构建获得包装重组AAV病毒需要的pRDAV-CA-SGSH质粒，我们首先以公司保存的pRDAV-CMV (图1)为基础，用自主设计得到的CA启动子(SEQ ID No.1)替换pRDAV载体中的CMV启动子，得到pRDAV-CA载体。接下来，将人工合成的人类SGSH (SEQ ID No.2)序列克隆入pRDAV-CA载体的KpnI和EcoRI酶切位点之间，得到pRDAV-CA-SGSH和载体。

[0049] (1) pRDAV-CA载体构建将人巨细胞病毒早期基因增强子序列、鸡β-actin启动子序列拼接，得到CA启动子序列，序列信息见SEQ ID No.1。在CA启动子序列的两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成序列克隆入pUC57 simple载体(金斯瑞生物科技，南京)，得到pUC57-CA。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CA载体和pRDAV-CMV载体，回收CA片段和切去CMV启动子的pRDAV-CMV载体片段(约6.3kb)，两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物，大连)，筛选、鉴定后得到含有CA启动子的AAV质粒载体pRDAV-CA (图2)。

[0050] (2) pRDAV-CA-SGSH载体构建由金斯瑞生物科技有限公司合成人类SGSH基因的cDNA序列(GenBank: BC047318.1)，序列信息见SEQ ID No.2，并在合成序列的SGSH基因cDNA序列上下游分别加入KpnI及EcoRI酶切位点，合成后的序列克隆入pUC57 simple载体(金斯瑞生物科技，南京)，得到pUC57-SGSH载体。KpnI和EcoRI分别双酶切消化pUC57-SGSH载体和pRDAV-CA载体，回收SGSH片段和线性化的pRDAV-CA载体片段，两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物，大连)，筛选、鉴定得到pRDAV-CA-SGSH载体(图3)。

[0051] (3)pscAAV-CMV载体构建以AAV2基因组（GenBank No. AF043303）中的3’端ITR序列为基础，根据文献报道删除ITR序列中的trs序列和D序列[36]，得到ΔITR序列SEQ ID No3.。为方便克隆，合成pRDAV-CMV载体 BamHI至ApaI之间的序列，并使用ΔITR替换原有ITR序列，克隆入pMD18T载体。使用BamHI和ApaI消化该载体，回收402bp的含ΔITR片段。BamHI和ApaI消化pRDAV-CMV载体，回收6505bp骨架片段。连接两个片段得到pscAAV-CMV载体。(图4)
(4)pscAAV-CMR-SGSH载体构建
将人CMV病毒的增强子序列经结构优化得到的CM启动子并在启动子序列3’端引入人TATA盒结合蛋白相关因子1基因(GenBank: NG_012771.2)中第62804位至62890位的内含子序列，得到命名为CMR的启动子序列，序列信息见SEQ ID No4。合成的CMR启动子并在上下游分别引入XhoI与KpnI位点。使用XhoI与KpnI双酶切消化pscAAV-CMV载体回收6129bp的骨架片段，连接得到pscAAV-CMR。

[0052] 使用KpnI与BglII双酶切消化pRDAV-CA-SGSH载体回收1509bp的SGSH片段。合成猴空泡病毒的的多聚核苷酸加尾信号SV40 polyASEQ ID No5，在上下游分别加入BglII及BamHI位点。

[0053] 使用KpnI与BamHI双酶切消化pscAAV-CMR载体回收6214bp的骨架片段，将SGSH片段、SV40 polyA与其连接得到pscAAV-CMR-SGSH载体(图5)。

[0054] 实施例2 pRDAV-CA-SGSH载体的体外表达验证(1) SGSH蛋白的表达测定
将生长良好的Huh-7细胞均匀铺于六孔细胞培养板中的9个孔，待每孔的细胞密度达为
80%时，利用Lipofectamine2000 (Invitrogen, 美国)分别转染pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH 各3孔(详细过程参见说明书)。待转染48 h后，消化后收集细胞，采用反复冻融后离心的方式提取细胞总蛋白。利用Pierce BCA Protein Aaasy Kit (ThermoFisher, 美国)分别测定转染pRDAV-CA-SGSH、pscAAV-CMR-SGSH及空白细胞的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。

[0055] 在提取Huh-7细胞总蛋白后，采用Western Blotting检测细胞中SGSH蛋白的表达，方法详见《分子克隆》(第三版)。结果表明，几种细胞总蛋白上样量均为30 μg时，内参蛋白的表达量近似，空白的Huh-7细胞的SGSH蛋白条带不可见。转染的pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH质粒的Huh-7细胞检测显示SGSH蛋白条带明显，含量较高(图6)。

[0056] (2) SGSH蛋白的活性测定将生长良好的Huh-7细胞均匀铺于六孔细胞培养板中的9个孔，待每孔的细胞密度达为
80%时，利用Lipofectamine2000 (Invitrogen, 美国)分别转染pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH 各3孔(详细过程参见说明书)。待转染48 h后，消化后收集细胞，采用反复冻融后离心的方式提取细胞总蛋白。利用Pierce BCA Protein Aaasy Kit (ThermoFisher, 美国)分别测定转染pRDAV-CA-SGSH、pscAAV-CMR-SGSH及空白细胞的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。

[0057] 在提取细胞总蛋白后，将上述提取的蛋白分别取30 μg用于测定SGSH蛋白酶活，方法详见[63]。结果表明在Huh-7细胞中，空白Huh-7细胞的SGSH酶活性极低为0.76±0.16 nmol/17 h/mg protein。而转染pRDAV-CA-SGSH质粒的Huh-7细胞SGSH酶活性为13.86±0.34 nmol/17 h/mg protein，是空细胞的18.2倍，转染pscAAV-CMR-SGSH质粒的Huh-7细胞SGSH酶活性为14.02±0.69 nmol/17 h/mg protein，是空细胞的18.5倍(图7)。

[0058] 上述结果表明，所构建的pRDAV-CA-SGSH与pscAAV-CMR-SGSH质粒能够在细胞内有效的表达SGSH蛋白，而且表达的蛋白活性很高。

[0059] 实施例3 rAAV-SGSH的制备及检定(1) 不同血清型重组AAV病毒的包装
参照文献[64]，应用三质粒包装系统包装和纯化重组AAV病毒。简要地，AAV载体质粒(pRDAV-CA-SGSH或pscAAV-CMR-SGSH)、辅助质粒(pHelper)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV-R2C5、pAAV-R2C9或pAAV-R2C10)按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到rAAV5-CA-SGSH、rAAV9-CA-SGSH、rAAVrh10-CA-SGSH、rscAAV5-CMR-SGSH、rscAAV9-CMR-SGSH、rscAAVrh10-CMR-SGSH。

[0060] (2) rAAVDJ-SGSH的包装采用Cell Biolabs公司AAV-DJ/8 Helper Free Packaging System(货号：VPK-400-DJ-8，Cell Biolabs)，包装rAAVDJ-CA-SGSH及rAAVDJ-CMR-SGSH，操作过程参见说明书。

[0061] (3) 重组AAV病毒的滴度检测采用定量PCR方法测定制备得到rAAV基因组滴度。具体过程如下：
在CA启动子中设计两条引物CA-Q-F和CA-Q-R：
CA-Q-F：5’-CCCATAAGGTCATGTACTGGGCAT-3’ (SEQ ID No.6)
CA-Q-R：5’-GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGG-3’ (SEQ ID No.7)
在CMR启动子中设计两条引物CMR-Q-F和CMR-Q-R：
CMR-Q-F：5’-ttatatagacctcccaccgt-3’ (SEQ ID No.8)
CMR-Q-R：5’-taaatggcccgcctggctga-3’ (SEQ ID No.9)
以CA-Q-F和CA-Q-R为引物特异性地扩增CA启动子长度为175bp片段，引物由
Thermofisher Scientific合成。采用SYBR Green染料结合法，以1 μg/μL的pRDAV-CA-SGSH质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂(Takara，大连，中国)，使用荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500 fast，ABI)检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法[65]。

[0062] 以CMR-Q-F和CMR-Q-R为引物特异性地扩增CMR启动子长度为188bp片段，引物由Thermofisher Scientific合成。采用SYBR Green染料结合法，以1 μg/μL的pscAAV-CMR-SGSH质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂(Takara，大连，中国)，使用荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500 fast，ABI)检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法。

[0063] 实施例4 rAAVDJ-SGSH的体外表达验证在进行病毒体内表达研究前，需验证病毒的体外表达水平。由于rAAV9的体外表达极差，因此本研究采用rAAVDJ-SGSH进行病毒的体外表达研究。

[0064] 将生长良好的Huh-7细胞均匀铺于六孔细胞培养板中的16个孔，待每孔的细胞密度达为80%时，选1孔进行细胞计数，通过计算加入rAAVDJ-CA-SGSH及rAAVDJ-CMR-SGSH分别以MOI为2,000、10,000 GC/cell的剂量感染3孔的Huh-7细胞，另外三个孔的Huh-7细胞并不感染病毒，作为对照。待病毒感染48 h后，收集细胞，采用反复冻融的方式提取细胞总蛋白。利用Pierce BCA Protein Aaasy Kit (ThermoFisher, 美国)分别测定3组细胞的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。

[0065] 将上述提取的蛋白分别取30 μg用于测定SGSH蛋白酶活。结果表明，空白Huh-7细胞的SGSH酶活性极低，为0.65±0.05 nmol/17 h/mg protein。感染rAAVDJ-CA-SGSH的Huh-7细胞SGSH酶活性为增高明显。其中MOI为10,000 GC/cell时，Huh-7细胞的SGSH酶活性为
15.48±1.11 nmol/17 h/mg protein，而MOI为2,000 GC/cell时Huh-7细胞的SGSH酶活性为10.62±0.59 nmol/17 h/mg protein。感染rAAVDJ-CMR-SGSH的Huh-7细胞SGSH酶活性为增高明显。其中MOI为10,000 GC/cell时，Huh-7细胞的SGSH酶活性为18.53±0.50 nmol/17 h/mg protein，而MOI为2,000 GC/cell时Huh-7细胞的SGSH酶活性为11.54±0.75 nmol/17 h/mg protein (图8)。MOI为10,000时细胞SGSH酶活性显著高于MOI为2,000时。

[0066] 上述结果表明，rAAVDJ-SGSH感染细胞后能够有效表达SGSH蛋白，且表达的SGSH蛋白酶活性很高。

[0067] 实施例5 MPS 3A治疗药物在正常小鼠体内有效性评价实验(1)C57 BL/6J小鼠尾静脉水动力注射pRDAV-CA-SGSH、pscAAV-CMR-SGSH质粒
 6周龄C57 BL/6J小鼠共9只，随机分为3组。第1组小鼠每只尾静脉10s内注射溶于2 mL PBS的pRDAV-CA-SGSH质粒10μg。第2组小鼠每只尾静脉10s内注射溶于2 mL PBS的pscAAV-CMR-SGSH质粒10μg。第3组小鼠每只尾静脉10s内注射2 mL PBS。注射后18h处死全部小鼠，解剖分离肝脏，提取组织总蛋白。利用Pierce BCA Protein Aaasy Kit (ThermoFisher, 美国)分别测定3组的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。将提取的蛋白分别取30 μg用于测定SGSH蛋白酶活。结果如图9所示，正常小鼠肝脏SGSH酶活为1.58±0.28 nmol/17 h/mg protein，注射pRDAV-CA-SGSH质粒后小鼠肝脏SGSH酶活为2.61±0.57 nmol/17 h/mg protein。注射pscAAV-CMR-SGSH质粒的小鼠肝脏SGSH酶活为2.94±0.53 nmol/17 h/mg protein。结果表明，注射pRDAV-CA-SGSH及pscAAV-CMR-SGSH质粒的小鼠肝脏SGSH酶活性显著提升。

[0068] (2)C57 BL/6J小鼠尾静脉注射rAAV9-CA-SGSH和rscAAV9-CMR-SGSH6周龄C57 BL/6J野生小鼠共15只，随机分为5组。第1组小鼠每只尾静脉注射rAAV9-CA-SGSH，剂量为1×1013 GC/kg。第2组小鼠每只尾静脉注射rAAV9-CA-SGSH，剂量为5×1013 GC/kg。第3组小鼠每只尾静脉注射scAAV9-CMR-SGSH，剂量为1×1013 GC/kg。第4组小鼠每只尾静脉注射scAAV9-CMR-SGSH，剂量为5×1013 GC/kg。第5组小鼠每只尾静脉注射200 μL PBS作为对照。注射后1个月处死全部小鼠，解剖分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等，取等质量的不同组织，提取组织总蛋白。利用Pierce BCA Protein Aaasy Kit (ThermoFisher, 美国)分别测定各组的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。所有小鼠的不同组织均取30 μg总蛋白用于测定SGSH酶活性。结果如图10所示，注射病毒后的C57 BL/6J野生小鼠，各组织中的SGSH蛋白的活性显著或极显著高于未注射病毒的野生型小鼠。注射scAAV9-CMR-SGSH的小鼠在高剂量组和低剂量组SGSH酶活性均高于注射rAAV9-CA-SGSH的小鼠。

[0069] 以上结果表明我们设计的MPS 3A治疗药物经尾静脉注射进入小鼠体内后，能够有效地表达产生具有活性的SGSH蛋白。

[0070] 实施例6 MPS 3A治疗药物在模型小鼠体内有效性评价实验自美国jax购入SGSH基因突变的MPS IIIA模型小鼠后，请北京艾德摩生物技术有限公司代为繁殖，获得SGSH基因纯合突变的模型小鼠45只(4-6周龄)，并随机平均分为3组。其中
1组作为阴性对照组，每只仅注射200 μL PBS；另外两组作为实验组分别注射rAAV9-CA-SGSH和rscAAV9-CMR-SGSH，注射剂量为每只5×1013 GC/kg。另加入1组15只C57BL/6J野生小鼠(4-6周龄)作为对照。

[0071] (1) 静脉注射rAAV9-SGSH极大水平提高模型小鼠不同组织器官的SGSH蛋白活性注射病毒3个月后，将全部小鼠处死，分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等。取等质量的不同组织，采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白(Applygen Technologies Inc., P1250)，随后采用Pierce BCA Protein Aaasy Kit (ThermoFisher, 美国)分别测定总蛋白的量。所有小鼠的不同组织均取30 μg总蛋白用于测定SGSH酶活性。结果如图11所示，未注射病毒的模型小鼠各组织器官中SGSH的活性极低几乎检测不到。注射病毒后的模型小鼠，其心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠、肌肉、脑组织的SGSH酶活性均有显著上升。在各组织中显著或极显著高于未注射病毒的模型小鼠。在多组织中SGSH酶活性与野生型小鼠相比持平或略低，在心脏和肝脏中的SGSH酶活性甚至超过未注射病毒的野生型小鼠。注射scAAV9-CMR-SGSH相比注射rAAV9-CA-SGSH的模型小鼠在多组织SGSH酶活性要更高。

[0072] 这表明我们设计的病毒经尾静脉注射模型小鼠体内后，能够在多组织广泛有效地感染细胞并表达产生具有活性的SGSH蛋白。

[0073] (2)静脉注射rAAV9-SGSH的模型小鼠不同组织器官病毒载量的测定另一方面，注射病毒3个月后，将全部小鼠处死，分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、肠及肌肉组织等。取等质量的不同组织，采用血/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根北京., DP304)提取细胞总DNA。

[0074] 采用定量PCR方法测定制备得到rAAV基因组滴度。具体过程如下：在模型小鼠及野生型小鼠管家基因beta-Actin中设计两条引物beta-Actin-F和beta-Actin-R；在hSGSH基因中设计两条引物hSGSH-F和hSGSH-R；
beta-Actin-F：5’- GTCATCACTATTGGCAACGA-3’ (SEQ ID No.10)
beta-Actin-R：5’- CCTAAGAGAAGAGTGACAGA-3’ (SEQ ID No.11)
hSGSH-F：5’- aagtcagcgaggcctacgt -3’ (SEQ ID No.12)
hSGSH-R：5’-GATGGTCTTCGAGCCAAAGAT-3’ (SEQ ID No.13)
以beta-Actin-F和beta-Actin-R为引物特异性地扩增beta-Actin片段，hSGSH-F和hSGSH-R为引物特异性地扩增hSGSH片段。采用SYBR Green染料结合法，分别以10.815 ng/μL的小鼠基因组DNA及其10倍梯度稀释的样品为beta-Actin标准品；1×107 copies/μL pRDAV-CA-SGSH质粒DNA及其10倍梯度稀释的样品为hSGSH标准品。应用SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂，使用荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500 fast，ABI) 根据文献[66]所述，测定每个样品中的1个基因组拷贝中的病毒载量。操作过程参见SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂说明书。

[0075] 结果表明，未注射病毒的模型小鼠及野生型小鼠各组织器官几乎测不到病毒载量。而注射病毒的模型小鼠各组织器官病毒载量明显升高，其中肝脏中病毒载量最高，注射scAAV9-CMR-SGSH相比注射rAAV9-CA-SGSH的模型小鼠在多组织内载量略有提升(表1)。

[0076] (3)静脉注射rAAV9-SGSH的模型小鼠尿液GAG含量测定注射病毒3个月后，所有小鼠取尿200 μL，使用DMMB分光光度法检测尿液中GAG含量[67]。结果见图12。注射病毒的模型小鼠尿液中GAG含量显著低于未注射病毒的模型小鼠，略高于正常小鼠。注射scAAV9-CMR-SGSH相比注射rAAV9-CA-SGSH的模型小鼠尿液GAG含量略低。

[0077] 结果表明，注射病毒后，模型小鼠体内产生的SGSH蛋白能够有效的分解体内贮积的GAG，从而使尿液中GAG含量明显下降。

[0078] (4)静脉注射rAAV9-SGSH的模型小鼠组织GAG含量测定注射病毒3个月后，将全部小鼠处死，分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、肠及肌肉组织等。取等质量的不同组织，提取组织的GAG[68]。使用DMMB分光光度法检测组织中GAG含量。结果见图13。注射病毒的模型小鼠多组织中GAG含量显著低于未注射病毒的模型小鼠，略高于正常小鼠。注射scAAV9-CMR-SGSH相比注射rAAV9-CA-SGSH的模型小鼠多组织GAG含量无明显差异。

[0079] 结果表明，注射病毒后，模型小鼠体内产生的SGSH蛋白能够有效的分解组织内贮积的GAG，从而使组织中GAG含量减少，达到治疗的目的。

[0080] (5)静脉注射rAAV9-SGSH的模型小鼠抓绳实验测定注射病毒3个月后，对小鼠进行抓绳训练，离桌面40cm高，下铺海绵垫缓冲，每次训练
5min，每天训练3次，持续3天后检测。结果见图14。注射病毒的模型小鼠抓绳时间相比对照组模型小鼠显著提升。其中注射rAAV9-CA-SGSH的模型小鼠抓绳时间低于注射scAAV9-CMR-SGSH的模型小鼠及对照野生小鼠，注射scAAV9-CMR-SGSH的模型小鼠与对照野生小鼠抓绳时间无明显差异。

[0081] 实施例7 MPS 3A治疗药物与其他在研药物在模型小鼠体内有效性评价实验目前已有报道的MPS 3A基因治疗药物主要有法国Lysogene公司用于临床实验的AAVrh10-h.SGSH 以及美国Abeona公司用于临床实验的scAAV9.U1a.hSGSH。Lysogene公司的AAVrh10-h.SGSH采用血清型为AAVrh10的载体且采用颅内注射的方式给药与本发明差异较大，因此不予比较。主要对与本发明采用相同血清型且给药方式均为静脉注射的scAAV9.U1a.hSGSH进行比较。

[0082] scAAV9.U1a.hSGSH载体基因组含有AAV2末端重复序列，鼠小核RNA启动子U1a序列信息见SEQ ID No14，hSGSH编码序列序列信息见SEQ ID No15和来自牛生长激素基因的多腺苷酸化信号。应用三质粒包装系统包装和纯化重组AAV病毒。简要地，AAV载体质粒、辅助质粒(pHelper)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV-R2C9)按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到scAAV9.U1a.hSGSH。

[0083] SGSH基因纯合突变的模型小鼠(4-6周龄)共16只，随机平均分为4组。第1组小鼠每只尾静脉注射rAAV9-CA-SGSH，剂量为5×1013 GC/kg。第2组小鼠每只尾静脉注射scAAV9-CMR-SGSH，剂量为5×1013 GC/kg。第3组小鼠每只尾静脉注射scAAV9.U1a.hSGSH，剂量为5×13
10  GC/kg。第4组小鼠作为阴性对照组，每只注射200 μL PBS。另加入1组4只C57BL/6J野生小鼠(4-6周龄)作为对照。

[0084] 注射3个月后处死全部小鼠，解剖分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等。取等质量的不同组织，采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白(Applygen Technologies Inc., P1250)，随后采用Pierce BCA Protein Aaasy Kit (ThermoFisher, 美国)分别测定总蛋白的量。所有小鼠的不同组织均取30 μg总蛋白用于测定SGSH酶活性。结果如图15所示，3个治疗组在多组织内的SGSH酶活性均高于阴性对照的模型小鼠，按酶活性由高到低排序分别为：注射scAAV9-CMR-SGSH的模型小鼠高于注射rAAV9-CA-SGSH的模型小鼠高于注射scAAV9.U1a.hSGSH的模型小鼠。

[0085] 测得的注射scAAV9.U1a.hSGSH的模型小鼠酶活性数值与文献报道存在较大差异，分析原因为检测方法及检测条件不同导致。

[0086] 实施例8 AAV载体不同血清型对MPS基因药物的体内有效性影响实验比较不同血清型的AAV载体对MPS基因药物的体内有效性的影响。SGSH基因纯合突变的模型小鼠(4-6周龄)共28只，平均分为7组，实验组共6组分别注射rAAV5-CA-SGSH、rAAV9-CA-SGSH、rAAVrh10-CA-SGSH、rscAAV5-CMR-SGSH、rscAAV9-CMR-SGSH、rscAAVrh10-CMR-SGSH，剂量为5×1013 GC/kg。对照组1组每只注射200 μL PBS。另加入1组4只C57BL/6J野生小鼠(4-6周龄)作为对照。

[0087] 注射病毒3个月后，将全部小鼠处死，分离每只小鼠的脑组织、心脏、肝脏、脾、肺、肾、小肠及肌肉组织等。取等质量的不同组织，采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白(Applygen Technologies Inc., P1250)，随后采用Pierce BCA Protein Aaasy Kit (ThermoFisher, 美国)分别测定总蛋白的量。所有小鼠的不同组织均取30 μg总蛋白用于测定SGSH酶活性。结果如图16所示，未注射病毒的模型小鼠各组织器官中SGSH酶活性极低，注射病毒后模型小鼠各组织器官SGSH酶活性显著升高。注射不同血清型AAV载体各组织酶活性比较，血清型为AAV5时最低，显著低于血清型为AAV9，血清型为AAVrh10时略低于AAV9.参考文献1. Hopwood J J, Morris C P. Molecular Biology & Medicine, 1990, 7(5):381.
2. Iozzo R V. Annual Review of Biochemistry, 1998, 67(1):609-652.
3. Jurecka A,  Ługowska A, Golda A, et al. Journal of Applied Genetics, 
2015, 56(2):205-210.
4. Gilkes J A, Heldermon C D. Pediatric Endocrinology Reviews Per, 2014, 
12 Suppl 1:133-140.
5. Heron B, Mikaeloff Y, Froissart R, Caridade G, Maire I, Caillaud C, et al. Am J Med Genet A 2011;155A:58-68.
6. Buhrman D, Thakkar K, Poe M, Escolar ML. Inherit Metab Dis 2014;37:
431-7.
7. Shapiro, Elsa G., et al. J Pediatr 170(2016):278-287.
8. Rumsey RK, Rudser K, Delaney K, Potegal M, Whitley CB, Pediatr 2014;
164:1147-51
9. James R A, Singh‐Grewal D, Lee S, et al. Journal of Paediatrics & Child Health, 2016, 52(3):262-271.
10. Valstar MJ, Neijs S, Bruggenwirth HT, Olmer R, Ruijter GJ, Wevers RA,et al. Ann Neurol 2010;68:876-87
11. Zelei T, Csetneki K, Vokó Z, et al. Orphanet Journal of Rare 
Diseases, 2018, 13(1):53.
12.Cleary, M. A., and J. E. Wraith. Archives of Disease in Childhood 69.3(1993):403-406.
13.Sivakumur, P., and J. E. Wraith. Journal of Inherited Metabolic 
Disease 22.7(1999):849-50.
14.Abbott, N. J., et al. Neurobiology of Disease 37.1(2010):13.
15.Scarpa, M., et al. Molecular Genetics & Metabolism (2017).
16.Tardieu, M., et al. Collaborative Congress of the European-Society-for-Gene- and-Cell-Therapy 2013:A23-A24.
17.Duncan, F. J., et al. Molecular Therapy the Journal of the American Society of Gene Therapy 23.4(2015):638-47.
18.Potegal M, Yund B, Rudser K, Ahmed A, Delaney K, Nestrasil I, et al. Clin Exp Neuropsychol 2013;35:608-16.
19：Sidhu, N. S., et al. Acta Crystallographica 70.5(2014):1321–1335.
20.Yogalingam G, Hopwood JJ. Hum Mutat 2001;18:264-81
21.姜笃银, 付小兵, and 盛志勇.中国病理生理杂志 21.5(2005):1020-1025.
22. Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756.
23. Hoggan MD, et al. Proc Natl Sci USA. 1966; 55: 1467-1474.
24. Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1969; 64: 863-869.
25. Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005; 5(3): 265-271.
26. Chiorini JA, et al. Curr Top Microbiol Immunol. 1996; 218:25-33.
27. Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756.
28. Lusby E, et al. J Virol. 1980; 34: 402-409.
29. Samulski RJ, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1982; 79: 2077-2081.
30. Laughlin CA, et al. Gene. 1983; 23: 65-73.
31. Xiao X, et al. J Virol. 1997; 71(2): 941-948.
32. Linden RM, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93(15): 7966-7972.
33. Ashktorab H, et al. J Virol. 1989; 63(7): 3034-3039.
34. Srivastava A, et al. J Virol. 1983; 45(2): 555-564.
35. Hüser D, et al. PLoS Pathog. 2010; 6(7): e1000985.
36. Wang Z, et al. Gene Ther. 2003;10(26):2105-2111.
37. McCarty DM, et al. Gene Ther. 2003;10(26):2112-2118.
38. Wu Z, et al. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.
39. Samaranch L, et al. Hum Gene Ther. 2012; 23(4): 382-389.
40. Gruntman AM, et al. Hum Gene Ther Methods. 2015; 26(2): 71-76.
41. Yuan Z, et al. Hum Gene Ther, 2011,22(5):613-624.
42. 伍志坚，吴小兵等。科学通报，1999，44(5)：506-509。

[0088] 43. Conway JE, et al. Gene Ther, 1999,6:986-993.44. Wustner JT, et al. Mol Ther, 2002,6(4):510-518.
45. Booth MJ,et al. Gene Ther,2004,11:829-837.
46. Thomas DL, et al. Gene Ther,2009,20:861-870.
47. Chen H. Mol Ther.2008;16(5):924-930.
48. Galibert L,et al.J Invertebr Pathol, 2011,107 Suppl:S80-93.
49. Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2014;25:212-222.
50. Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2015;26(10):688-697.
51.Bryant LM, et al. Hum Gene Ther Clin Dev. 2013, 24(2): 55-64.
52. Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012; 20(10): 1831-1832.
53. Kay MA, et al. Nat Genet. 2000; 24(3): 257-261.
54. Jacobson SG, et al. Arch Ophthalmol. 2012; 130(1): 9-24.
55. Salgenik M, et al. Microbiol Spectr. 2015; 3(4).
56. Chen ZY, et al. Mol Ther. 2001; 3(3): 403-410.
57. Wang Z, et al. Nat Biotechnol. 2005;23:321-328.
58. Bish LT, et al. Hum Gene Ther. 2008;19:1359-1368.
59. Zincarelli C, et al. Mol Ther. 2008;16:1073-1080.
60. Prasad KM, et al. Gene Ther. 2011;18:43-52.
61. Rebuffat A, et al. Hum Gene Ther.2010;21(4):463-477.
62. Zhou Q, et al. Sci Rep. 2017; doi: 10.1038/s41598-017-04054-4.
63. Karpova EA. et al. J Inherit Metab Dis. 1996; 19: 278-285
64. Chiorini JA, et al. J Virol. 1994, 68(2): 797-804.
65.Bishop BM, et al. FEBS Lett. 1996, 397(1): 97-100.
66.Duncan FJ, et al. Mol Ther. 2015; 23(4): 638-647.
67. Ch V D L, Versteeg E M, Veerkamp J H, et al. Analytical Biochemistry, 
1994, 221(2):356.
68. Gemst J J V, Loeven M A, Graaf M J J D, et al. Plos One, 2016, 11(11):e0167336.
核苷酸和氨基酸序列表SEQ ID
No.1：CA启动子
5’-attgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattacccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcg-3’
No.2：SGSH cDNA序列
5’-atgagctgccccgtgcccgcctgctgcgcgctgctgctagtcctggggctctgccgggcgcgtccccggaacgcactgctgctcctcgcggatgacggaggctttgagagtggcgcgtacaacaacagcgccatcgccaccccgcacctggacgccttggcccgccgcagcctcctctttcgcaatgccttcacctcggtcagcagctgctctcccagccgcgccagcctcctcactggcctgccccagcatcagaatgggatgtacgggctgcaccaggacgtgcaccacttcaactccttcgacaaggtgcggagcctgccgctgctgctcagccaagctggtgtgcgcacaggcatcatcgggaagaagcacgtggggccggagaccgtgtacccgtttgactttgcgtacacggaggagaatggctccgtcctccaggtggggcggaacatcactagaattaagctgctcgtccggaaattcctgcagactcaggatgaccggcctttcttcctctacgtcgccttccacgacccccaccgctgtgggcactcccagccccagtacggaaccttctgtgagaagtttggcaacggagagagcggcatgggtcgtatcccagactggaccccccaggcctacgacccactggacgtgctggtgccttacttcgtccccaacaccccggcagcccgagccgacctggccgctcagtacaccaccgtaggccgcatggaccaaggagttggactggtgctccaggagctgcgtgacgccggtgtcctgaacgacacactggtgatcttcacgtccgacaacgggatccccttccccagcggcaggaccaacctgtactggccgggcactgctgaacccttactggtgtcatccccggagcacccaaaacgctggggccaagtcagcgaggcctacgtgagcctcctagacctcacgcccaccatcttggattggttctcgatcccgtaccccagctacgccatctttggctcgaagaccatccacctcactggccggtccctcctgccggcgctggaggccgagcccctctgggccaccgtctttggcagccagagccaccacgaggtcaccatgtcctaccccatgcgctccgtgcagcaccggcacttccgcctcgtgcacaacctcaacttcaagatgccctttcccatcgaccaggacttctacgtctcacccaccttccaggacctcctgaaccgcactacagctggtcagcccacgggctggtacaaggacctccgtcattactactaccgggcgcgctgggagctctacgaccggagccgggacccccacgagacccagaacctggccaccgacccgcgctttgctcagcttctggagatgcttcgggaccagctggccaagtggcagtgggagacccacgacccctgggtgtgcgcccccgacggcgtcctggaggagaagctctctccccagtgccagcccctccacaatgagctgtga-3’NO.3ΔITR
5’-ccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggacagatccc-3’
NO.4:CMR启动子
5’-tctcgagcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccggactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaacCGCTcgaccggtgtgagtgagtgatttgatctaaatgcctttttgtaatcaagtgactgtgtgtgtgtgtatctgagtgcctgattcttttcatcacag-3’
NO.5:SV40polyA
5’-cagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttag-3’
NO.6: CA-Q-F
5’-cccataaggtcatgtactgggcat-3’
NO.7: CA-Q-R
5’-gttcccatagtaacgccaataggg-3’
No.8:CMR-Q-F
5’-ttatatagacctcccaccgt-3’
No.9:CMR-Q-R
5’-taaatggcccgcctggctga-3’
NO.10: beta-Actin-F
5’- gtcatcactattggcaacga-3’
NO.11: beta-Actin-R
5’- cctaagagaagagtgacaga-3’
NO.12: hSGSH-F
5’- aagtcagcgaggcctacgt -3’
NO.13: hSGSH-R
5’-gatggtcttcgagccaaagat-3’
NO.14:U1a 启动子
5’-cactatggaggcggtactatgtagatgagaattcaggagcaaactgggaaaagcaactgcttccaaatatttgtgatttttacagtgtagttttggaaaaactcttagcctaccaattcttctaagtgttttaaaatgtgggagccagtacacatgaagttatagagtgttttaatgaggcttaaatatttaccgtaactatgaaatgctacgcatatcatgctgttcaggctccgtggccacgcaactc-3’
NO.15:hSGSH CDNA序列
atgagctgccccgtgcccgcctgctgcgcgctgctgctagtcctggggctctgccgggcgcgtccccggaacgcactgctgctcctcgcggatgacggaggctttgagagtggcgcgtacaacaacagcgccatcgccaccccgcacctggacgccttggcccgccgcagcctcctctttcgcaatgccttcacctcggtcagcagctgctctcccagccgcgccagcctcctcactggcctgccccagcatcagaatgggatgtacgggctgcaccaggacgtgcaccacttcaactccttcgacaaggtgcggagcctgccgctgctgctcagccaagctggtgtgcgcacaggcatcatcgggaagaagcacgtggggccggagaccgtgtacccgtttgactttgcgtacacggaggagaatggctccgtcctccaggtggggcggaacatcactagaattaagctgctcgtccggaaattcctgcagactcaggatgaccggcctttcttcctctacgtcgccttccacgacccccaccgctgtgggcactcccagccccagtacggaaccttctgtgagaagtttggcaacggagagagcggcatgggtcgtatcccagactggaccccccaggcctacgacccactggacgtgctggtgccttacttcgtccccaacaccccggcagcccgagccgacctggccgctcagtacaccaccgtcggccgcatggaccaaggagttggactggtgctccaggagctgcgtgacgccggtgtcctgaacgacacactggtgatcttcacgtccgacaacgggatccccttccccagcggcaggaccaacctgtactggccgggcactgctgaacccttactggtgtcatccccggagcacccaaaacgctggggccaagtcagcgaggcctacgtgagcctcctagacctcacgcccaccatcttggattggttctcgatcccgtaccccagctacgccatctttggctcgaagaccatccacctcactggccggtccctcctgccggcgctggaggccgagcccctctgggccaccgtctttggcagccagagccaccacgaggtcaccatgtcctaccccatgcgctccgtgcagcaccggcacttccgcctcgtgcacaacctcaacttcaagatgccctttcccatcgaccaggacttctacgtctcacccaccttccaggacctcctgaaccgcaccacagctggtcagcccacgggctggtacaaggacctccgtcattactactaccgggcgcgctgggagctctacgaccggagccgggacccccacgagacccagaacctggccaccgacccgcgctttgctcagcttctggagatgcttcgggaccagctggccaagtggcagtgggagacccacgacccctgggtgtgcgcccccgacggcgtcctggaggagaagctctctccccagtgccagcccctccacaatgagctgtga