一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法
阅读：5发布：2021-03-13
专利汇可以提供一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种靶向HPK1的gRNA以及针对HPK1基因的编辑方法。本发明所述HPK1gRNA和HPK1基因编辑方法能够敲除T细胞HPK1基因、增强T细胞杀伤活性、提高外周血单核细胞的Th1细胞因子 水 平，且敲除T细胞HPK1基因也可下调T细胞表面PD-1和TIM3的表达，可以抑制T细胞的衰竭。由此可见，本发明可用于制备 治疗 肿瘤 药物，特别是嵌合 抗原 受 体细胞 肿瘤靶向治疗(CAR-T、CAR-NK、CAR-NKT、CAR-γδT细胞治疗)方法。，下面是一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法专利的具体信息内容。
1.一种靶向HPK1的gRNA，其特征在于其靶向HPK1第二外显子，并能够与Cas9蛋白共同敲除HPK1基因。
2.如权利要求1所述靶向HPK1的gRNA，其特征在于所述gRNA能够与SEQ ID NO:1所示的序列配对。
3.如权利要求1或2所述靶向HPK1的gRNA的制备方法，包括：
(1)gRNA装载质粒的构建；
(2)gRNA的体外转录；
其中步骤(1)包括将合成gRNA编码链及互补链，将编码链及互补链退火形成的双链DNA插入pUC57载体中置于T7启动子控制下，构建获得pUC57kan-T7-gRNA；
步骤(2)包括将经过酶切、测序鉴定的gRNA装载质粒pUC57kan-T7-gRNA纯化，用T7 RNA kit体外转录试剂盒进行HPK1 gRNA/HPK1 gRNA体外转录，纯化转录产物获得gRNA。
4.如权利要求3所述靶向HPK1的gRNA的制备方法，其特征在于所述gRNA的双链DNA模板序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
5.一种组合物，其包括权利要求1或2所述靶向HPK1的gRNA和Cas9蛋白，所述组合物用于敲除外周血单核细胞HPK1基因、提高外周血单核细胞杀伤活性、和/或提高外周血单核细胞Th1细胞因子水平。
6.一种组合物，其包括权利要求1或2所述靶向HPK1的gRNA、Cas9蛋白、以及嵌合抗原受体，所述组合物用于敲除外周血单核细胞HPK1基因、提高外周血单核细胞杀伤活性、和/或提高外周血单核细胞Th1细胞因子水平。
7.如权利要求5或6所述组合物，其特征在于所述Cas9是重组表达的。
8.如权利要求7所述组合物，其特征在于所述Cas9通过以下方法制备：
(1)根据人Cas9蛋白的氨基酸序列，制备密码子优化后的全长人Cas9 cDNA；
(2)将步骤(1)的全长人Cas9 cDNA的5’端和3’端加入核定位信号，构建重组表达质粒；
(3)将重组表达质粒导入宿主细胞表达重组Cas9蛋白；
(4)纯化、浓缩重组表达的Cas9蛋白；
(5)切除纯化标签，回收160kD的Cas9蛋白。
9.一种敲除人外周血单核细胞HPK1基因、和/或增强人外周血单核细胞杀伤活性、和/或提高人外周血单核细胞的Th1细胞因子水平的方法，包括：
(1)制备权利要求1所述靶向HPK1的gRNA；
(2)制备Cas9蛋白；
(3)体外培养和扩增人外周血单核细胞；
(4)将步骤(1)的gRNA、步骤(2)的Cas9蛋白共转染步骤(3)的人外周血单核细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述人外周血单核细胞为T细胞、NK细胞或NKT细胞，优选的，所述人外周血单核细胞为CD3+ T细胞，更优选的，所述人外周血单核细胞还表达外源嵌合抗原受体。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于所述步骤(4)在共转染之后还包括鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率，优选的，其通过PCR酶切法和/或Western Blot法鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率包括以下操作：以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物进行PCR扩增，将PCR产物加热变性、退火复性后加入T7内切酶处理，琼脂糖凝胶电泳鉴定切割效率。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率包括以下操作：提取人外周血单核细胞总蛋白，进行SDS-PAGE，转膜，以抗HPK1抗体为一抗进行Western Blot。
14.如权利要求9所述的方法，其特征在于还包括步骤(5)使步骤(4)获得的共转染了gRNA和Cas9蛋白的人外周血单核细胞表达人源嵌合抗原受体(CAR)。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于所述人源嵌合抗原受体为CAR19。
16.如权利要求9至15任一所述方法制备的T细胞、NK细胞及NKT细胞。
17.权利要求1-2所述靶向HPK1的gRNA、权利要求5-8所述组合物在制备敲除外周血单核细胞HPK1基因的试剂、或在制备提高外周血单核细胞杀伤活性的试剂、或在制备提高外周血单核细胞Th1细胞因子水平的试剂、或在制备治疗肿瘤的药物中的用途，优选的治疗肿瘤的药物为治疗淋巴瘤以及实体瘤的药物中的用途。
18.权利要求16所述细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途，优选的治疗肿瘤的药物为治疗淋巴瘤以及实体瘤的药物中的用途。
19.如权利要求17或18所述用途，其特征在于，所述外周血单核细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞，优选为CD3+T细胞，更优选为表达外源人嵌合抗原受体的CD3+T细胞，最优选为嵌合针对CD19、BCMA、Integrin V6、MUC1、EGFRvIII、HER2、EGFR、GD2、Mesothelin等单链抗体的CD3+T细胞。
20.一种人工改造的外周血单核细胞或者一种用于治疗癌症的外周血单核细胞或者一种抑制衰竭、提高活性的外周血单核细胞，其特征在于，其中HPK1基因被敲除。
一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及癌症的免疫治疗，特别是涉及一种靶向HPK1的gRNA、HPK1基因编辑方法、以及经过基因编辑后外周血单核细胞，例如：T细胞、NK细胞及NKT细胞活性增强，PD-1和TIM3表达降低。
背景技术
[0002] 肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，近年来针对肿瘤的免疫疗法逐渐成为肿瘤治疗的研究热点。肿瘤免疫细胞疗法是对从人体内采集的免疫细胞进行体外修饰、培养和扩增，再回输到病人体内激发和增强机体自身免疫功能，从而达到抑制肿瘤生长、杀伤肿瘤细胞的效果。
[0003] 在诸多癌症免疫细胞治疗方法中，机理相对清楚、效果较为确切的是嵌合抗原受体T细胞肿瘤靶向治疗(CAR-T细胞治疗)方法和PD-1抑制剂疗法。CAR-T在内的细胞免疫疗法在血液学肿瘤治疗方面取得了显著的成功，但攻克实体瘤一直存在着障碍。其中主要的原因是T细胞衰竭、活性降低，对肿瘤杀伤力不足，因此发现新的T细胞体外修饰位点和修饰方法，提高T细胞活性和杀伤力，抑制T细胞衰竭是未来研究和技术发展的方向。
[0004] 造血祖细胞激酶1(hematopoietic progenitor kinase 1，hpk1or map4k1)是造血系统特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于哺乳动物ste20相关蛋白激酶的map4k家族。hpk1主要在造血组织和细胞中表达。大量研究结果表明，hpk1参与许多信号级联反应，包括mapk(mitogen-activated protein kinase)信号、抗原受体信号、凋亡信号、生长因子信号以及细胞因子信号等。hpk1存在3种激活方式，即丝氨酸磷酸化、苏氨酸磷酸化或酪氨酸磷酸化。1996年应用pcr技术首次将hpk1从小鼠造血祖细胞中克隆出来后，研究表明hpk1主要在造血组织和细胞中表达，目前对于hpk1的研究主要集中在造血系统。最新的研究表明hpk1与癌症可能存在相关性，Sawasdikosol S.等(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22477524)对小鼠模型的研究发现破坏T细胞、DC细胞的hpk1基因有助于抑制肺癌细胞生长，hpk1可望成为抗肿瘤免疫治疗的新靶点。US20160158360将抑制hpk1丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的hpk1拮抗剂与PD-1拮抗剂联合用于治疗癌症。然而，针对T细胞hpk1基因敲除的操作复杂、技术要求高、敲除效率低，现有技术中尚没有成功使用CRISPR/CAS技术敲除T细胞hpk1基因增强其杀伤活性的报道。
发明内容
[0005] 为解决上述问题，本发明采用CRISPR/Cas9技术经过多次试验获得了特异性靶向体外培养T细胞hpk1基因的gRNA及基因编辑方法，本发明所述方法操作简单、敲除效率高、增强T细胞肿瘤杀伤活性的效果确切，经过本发明所述方法修饰的T细胞具有广泛的临床应用前景。
[0006] 第一方面，本发明提供一种靶向HPK1的gRNA，其特征在于其靶向HPK1第二外显子，并能够与Cas9蛋白共同敲除HPK1基因。
[0007] 本发明所述靶向HPK1的gRNA能够识别并结合SEQ ID NO:1所示的靶序列。
[0008] 本发明所述靶向HPK1的gRNA模板序列如下：
[0009] F:5′-TAGG GACCTGGTGGCACTGAAGA -3′(SEQ ID NO:3)；
[0010] R:5′-AAAC TCTTCAGTGCCACCAGGTC-3′(SEQ ID NO:4)。
[0011] 第二方面，本发明提供所述靶向HPK1的gRNA的制备方法，包括：
[0012] (1)gRNA装载质粒的构建；
[0013] (2)gRNA的体外转录。
[0014] 其中步骤(1)包括合成gRNA编码链及互补链，将编码链及互补链退火形成的双链DNA插入质粒载体中；
[0015] 优选将gRNA的双链DNA模板插入pUC57载体中置于T7启动子控制下，构建获得pUC57kan-T7-gRNA；
[0016] 步骤(2)包括对gRNA装载质粒进行酶切、和/或测序鉴定，纯化，将纯化后的质粒进行体外转录，纯化转录产物获得gRNA；
[0018] 本发明所述gRNA的双链DNA模板序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
[0019] 第三方面，本发明提供一种组合物，其包括本发明所述靶向HPK1的gRNA和Cas9蛋白；所述组合物用于敲除外周血单核细胞HPK1基因、提高外周血单核细胞杀伤活性、和/或提高外周血单核细胞Th1细胞因子水平。
[0020] 本发明还提供一种组合物，其包括本发明所述靶向HPK1的gRNA、Cas9蛋白、以及嵌合抗原受体(CAR)；所述组合物用于敲除外周血单核细胞HPK1基因、提高外周血单核细胞杀伤活性、和/或提高外周血单核细胞Th1细胞因子水平。
[0021] 本发明所述组合物，其特征在于所述Cas9是重组表达的。
[0022] 本发明所述组合物，其特征在于所述Cas9是通过以下方法制备：
[0023] (1)根据人Cas9蛋白的氨基酸序列，制备密码子优化后的全长人Cas9cDNA；
[0024] (2)将步骤(1)的全长人Cas9cDNA的5’端和3’端加入核定位信号，构建重组表达质粒；
[0025] (3)将重组表达质粒导入宿主细胞表达重组Cas9蛋白；
[0026] (4)纯化、浓缩重组表达的Cas9蛋白；
[0027] (5)切除纯化标签，回收160kD的Cas9蛋白。
[0028] 第四方面，本发明提供一种敲除外周血单核细胞HPK1基因的方法，包括：
[0029] (1)制备靶向HPK1的gRNA；
[0030] (2)制备Cas9蛋白；
[0031] (3)体外培养和扩增人外周血单核细胞；
[0032] (4)将步骤(1)的gRNA、步骤(2)的Cas9蛋白共转染步骤(3)的人外周血单核细胞。
[0033] 本发明所述敲除外周血单核细胞HPK1基因的方法，优选所述人外周血单核细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞，更优选所述人外周血单核细胞为CD3+T细胞。
[0034] 本发明所述敲除外周血单核细胞HPK1基因的方法，优选所述人外周血单核细胞还表达外源嵌合抗原受体。
[0035] 本发明所述敲除外周血单核细胞HPK1基因的方法，还可以包括步骤(5)使步骤(4)获得的转染了gRNA和Cas9蛋白的CD3+人外周血单核细胞表达人源嵌合抗原受体CAR，优选所述人源嵌合抗原受体为CD19、BCMA、Integrin V6、MUC1、EGFRvIII、HER2、EGFR、GD2、Mesothelin。
[0036] 本发明所述敲除外周血单核细胞HPK1基因的方法，其特征在于所述步骤(4)还包括鉴定人外周血单核细胞HPK1基因敲除效率。
[0037] 本发明所述敲除T细胞HPK1基因的方法，优选通过PCR-酶切法和/或Western Blot法鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率。
[0038] 本发明所述敲除T细胞HPK1基因的方法，其特征在于鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率包括以下操作：以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物进行PCR扩展，将PCR产物加热变性、退火复性后加入T7内切酶处理，琼脂糖凝胶电泳鉴定切割效率。
[0039] 本发明所述敲除T细胞HPK1基因的方法，其特征在于鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率包括以下操作：提取人外周血单核细胞总蛋白，进行SDS-PAGE，转膜，以抗HPK1抗体为一抗进行Western Blot。
[0040] 第五方面，本发明提供一种增强外周血单核细胞杀伤活性的方法，包括：
[0041] (1)制备靶向HPK1的gRNA；
[0042] (2)制备Cas9蛋白；
[0043] (3)体外培养和扩增人外周血单核细胞；
[0044] (4)将步骤(1)的gRNA、步骤(2)的Cas9蛋白共转染步骤(3)的人外周血单核细胞。
[0045] 本发明所述增强外周血单核细胞杀伤活性的方法，优选所述人外周血单核细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞，更有选所述外周血单核细胞为CD3+T细胞。
[0046] 本发明所述增强外周血单核细胞杀伤活性的方法，优选所述人外周血单核细胞还表达外源嵌合抗原受体。
[0047] 本发明所述增强外周血单核细胞杀伤活性的方法，还可以包括步骤(5)使步骤(4)获得的转染了gRNA和Cas9蛋白的CD3+人外周血单核细胞表达人源CAR，优选所述人源嵌合抗原受体为CD19、BCMA、Integrin V6、MUC1、EGFRvIII、HER2、EGFR、GD2、Mesothelin。
[0048] 本发明所述增强外周血单核细胞杀伤活性的方法，其特征在于所述步骤(4)还包括鉴定人外周血单核细胞HPK1基因敲除效率。
[0049] 本发明所述增强外周血单核细胞杀伤活性的方法，优选通过PCR-酶切法和/或Western Blot法鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率。
[0050] 本发明所述增强外周血单核细胞杀伤活性的方法，其特征在于鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率包括以下操作：以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物进行PCR扩展，将PCR产物加热变性、退火复性后加入T7内切酶处理，琼脂糖凝胶电泳鉴定切割效率。
[0051] 本发明所述增强外周血单核细胞杀伤活性的方法，其特征在于鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率包括以下操作：提取人外周血单核细胞总蛋白，进行SDS-PAGE，转膜，以抗HPK1抗体为一抗进行Western Blot。
[0052] 第六方面，本发明提供一种提高外周血单核细胞Th1细胞因子分泌水平的方法，包括：
[0053] (1)制备靶向HPK1的gRNA；
[0054] (2)制备Cas9蛋白；
[0055] (3)体外培养和扩增人外周血单核细胞；
[0056] (4)将步骤(1)的gRNA、步骤(2)的Cas9蛋白共转染步骤(3)的人外周血单核细胞。
[0057] 本发明所述提高外周血单核细胞Th1细胞因子分泌水平的方法，优选所述人外周血单核细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞，更有选所述人外周血单核细胞为CD3+T细胞。
[0058] 本发明所述提高外周血单核细胞Th1细胞因子分泌水平的方法，优选所述人外周血单核细胞还表达外源嵌合抗原受体。
[0059] 本发明所述提高外周血单核细胞Th1细胞因子分泌水平的方法，还可以包括步骤(5)使步骤(4)获得的转染了gRNA和Cas9蛋白的CD3+人外周血单核细胞表达人源CAR，优选所述人源嵌合抗原受体为CAR19。
[0060] 本发明所述提高外周血单核细胞Th1细胞因子分泌水平的方法，其特征在于所述步骤(4)还包括鉴定人外周血单核细胞HPK1基因敲除效率。
[0061] 本发明所述提高外周血单核细胞Th1细胞因子分泌水平的方法，优选通过PCR-酶切法和/或Western Blot法鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率。
[0062] 本发明所述提高外周血单核细胞Th1细胞因子分泌水平的方法，其特征在于鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率包括以下操作：以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物进行PCR扩展，将PCR产物加热变性、退火复性后加入T7内切酶处理，琼脂糖凝胶电泳鉴定切割效率。
[0063] 本发明所述提高外周血单核细胞Th1细胞因子分泌水平的方法，其特征在于鉴定人外周血单核细胞HPK1基因的敲除效率包括以下操作：提取人外周血单核细胞总蛋白，进行SDS-PAGE，转膜，以抗HPK1抗体为一抗进行Western Blot。
[0064] 第七方面，本发明还提供一种外周血单核细胞，所述外周血单核细胞是通过本发明第三方面、第四方面、或第五方面所述方法制备的。
[0065] 本发明所述外周血单核细胞与未修饰的外周血单核细胞相比，缺失了HPK1基因、杀伤力更强、Th1细胞因子分泌水平更高。优选，还具有针对肿瘤的特异性。
[0066] 本发明所述外周血单核细胞优选为T细胞、NK细胞、NKT细胞，更有选所述外周血单核细胞为CAR-T细胞。
[0067] 第八方面，本发明还提供所述靶向HPK1的gRNA，含有靶向HPK1的gRNA和Cas9的组合物，或含有靶向HPK1的gRNA、Cas9和CAR的组合物制备试剂的用途。
[0068] 本发明所述用途包括制备敲除外周血单核细胞HPK1基因的试剂、制备提高外周血单核细胞杀伤活性的试剂、和/或制备提高外周血单核细胞Th1细胞因子水平的试剂中的用途。
[0069] 其中，所述外周血单核细胞为T细胞、NK细胞或NKT细胞，优选为CD3+T细胞，更优选为表达外源人嵌合抗原受体的CD3+T细胞，最优选为嵌合针对CD19、BCMA、Integrin V6、MUC1、EGFRvIII、HER2、EGFR、GD2、Mesothelin等单链抗体的的CD3+T细胞。
[0070] 第九方面，本发明提供所述靶向HPK1的gRNA、所述修饰后的外周血单核细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
[0071] 本发明所述的用途，其中所述治疗肿瘤的药物优选为治疗淋巴瘤的药物。
[0072] 与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
[0073] (1)操作简单，敲除效率高。本发明经过多次试验获得了位于T细胞基因组HPK1第二外显子上的一段靶序列，设计了能够高效靶向HPK1的gRNA，与其他敲除方法相比，本发明的方法操作简单、适用于体外培养的T细胞修饰；其他靶序列相比，本发明的靶序列特别适合CRISPR/Cas9基因编辑技术，能够通过CRISPR/Cas9技术对T细胞的HPK1进行高效敲除。
[0074] (2)T细胞活化程度高，杀肿瘤效果好。本发明经过修饰的T细胞不仅增殖速度更快，而且单位细胞的肿瘤杀伤活性更强；肿瘤杀伤活性的实验结果表明，在效靶比相同的情况下，本发明修饰的T细胞对肿瘤的杀伤活性高于、甚至显著高于PD1修饰的T细胞。
[0075] (3)能够与其它T细胞修饰技术联用，取得协同杀肿瘤的活性。本发明通过CRISPR/Cas9敲除HPK1基因的T细胞修饰技术与CAR-T技术联用具有协同效果，经过体外杀伤实验分析，本发明不仅优于单一CAR-T的技术效果，也优于CAR-T与PD-1敲除联用的技术效果。
[0076] (4)能够抑制T细胞的衰竭。本发明通过CRISPR/Cas9敲除T细胞的HPK1基因，经过流式细胞术实验分析，敲除HPK1后会引起PD1和TIM3表达水平的下调，由此可知，HPK1敲除可能会通过抑制T细胞的衰竭，提高T细胞杀伤靶细胞及分泌细胞因子的能力。附图说明
[0077] 通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
[0078] 图1：体外转录纯化的gRNA：
[0079] 泳道1为空白对照NC，
[0080] 泳道2为纯化的HPK1gRNA mRNA，
[0081] 泳道3为纯化的PD1gRNA mRNA。
[0082] 图2：重组表达纯化的Cas9蛋白：由左到右的顺序依次
[0083] 泳道1为蛋白质分子量marker，
[0084] 泳道2为浓缩后的重组Cas9蛋白(带GST标签)，
[0085] 泳道3为用凝血酶切除GST标签后的Cas9蛋白，
[0086] 泳道4为浓缩前的重组Cas9蛋白(带GST标签)。
[0087] 图3：T7E1酶切法检测基因敲除效率：
[0088] 泳道1为4×106个T cell+8μg Cas9 protein+8μg HPK1gRNA mRNA，[0089] 泳道2为4×106个T cell+8μg Cas9 protein+16μg HPK1gRNA mRNA，[0090] 泳道3为4×106个T cell+16μg Cas9 protein+8μg HPK1gRNA mRNA，[0091] 泳道4为4×106个T cell+16μg Cas9 protein+16μg HPK1gRNA mRNA，[0092] 泳道5为4×106个T cell+8μg Cas9 protein+8μg PD1gRNA mRNA，[0093] 泳道6为4×106个T cell+8μg Cas9 protein+16μg PD1gRNA mRNA，[0094] 泳道7为4×106个T cell+16μg Cas9 protein+8μg PD1gRNA mRNA，[0095] 泳道8为4×106个T cell+16μg Cas9 protein+16μg PD1gRNA Mrna。
[0096] 图4：Western blot检测基因敲除效率：
[0097] 结果显示与其他三组相比，CAR19+HPK1+/-T cell中HPK1的表达量显著降低。以β-actin作为内参。
[0098] 图5：流式细胞术检测CAR19的转染效率及PD1的表达：结果显示与单纯的CAR19 T cell相比，CAR19+HPK1+/-T cell表面的PD1受体显著降低；CAR19+HPK1+/-T cell表面的PD1受体的表达水平接近CAR19+PD1+/-T cell。
[0099] 图6：T细胞杀伤活性：
[0100] A：对人慢性髓系白血病细胞K562株的杀伤效果；
[0101] B：对淋巴母细胞样Raji细胞株的杀伤效果；
[0102] C：对人Burkkit淋巴瘤细胞株Daudi的杀伤效果。
[0103] 图7：T细胞产生的细胞因子检测：
[0104] A：IFN-γ含量检测；
[0105] B：IL-2含量检测。
具体实施方式
[0106] 下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0107] 实施例1 gRNA的设计与合成
[0108] 1、Guide RNA的设计
[0109] gRNA装载质粒为pUC57kan-T7-gRNA，设计靶向HPK1的gRNA，同时以靶向PD1的gRNA作为对照。特异性靶向HPK1的gRNA与基因组配对的序列为GACCTGGTGGCACTGAAGA(位于HPK1第二个外显子，SEQ ID NO:1)；特异性靶向PD1 gRNA与基因组配对的序列为GGCCAGGATGGTTCTTAGGT(位于PD1第一个外显子，SEQ ID NO:2)。
[0110] HPK1gRNA：F:5′-TAGG GACCTGGTGGCACTGAAGA-3′(SEQ ID NO:3)[0111] R:5′-AAAC TCTTCAGTGCCACCAGGTC-3′(SEQ ID NO:4)。
[0112] PD1gRNA：F:5′-TAGG GGCCAGGATGGTTCTTAGGT-3′(SEQ ID NO:5)[0113] R:5′-AAAC ACCTAAGAACCATCCTGGCC-3′(SEQ ID NO:6)。
[0114] 按上述序列合成gRNA编码链及互补链，分别将HPK1gRNA和PD1gRNA的两条DNA链退火形成的双链DNA模板插入pUC57质粒载体中置于T7启动子控制下，构建获得pUC57kan-T7-HPK1gRNA和pUC57kan-T7-PD1gRNA。
[0115] 2、Guid RNA体外转录为Messenger RNA
[0116] DraI酶切测序正确的质粒pUC57kan-T7-HPK1gRNA和pUC57kan-T7-PD1gRNA，得到gRNA转录模板后利用纯化试剂盒进行gRNA转录模板的纯化。将纯化后的产物用T7RNAkit转录试剂盒(Ambion_mMESSAGE_mMA-CHINE_T7)进行HPK1gRNA/HPK1gRNA体外转录并利用RNATM纯化试剂盒(MEGAclear kit，Ambion)将转录产物进行纯化。将纯化后的gRNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，通过NanoDrop 2000超微量分光光度计检测检测gRNA的浓度及纯度，分装，-80℃冻存备用。
[0117] 实施例2 Cas9蛋白的重组表达和纯化
[0118] Cas9的装载质粒为PGEX4T-1，通过PCR的方式得到密码子优化后的全长的人的cas9cDNA，模板为质粒PUC19-T7-CAS9，Cas9序列的5’和3’端都加入了核定位信号(NLS),以促进cas9蛋白的入核。
[0119] 质粒构建成功后，用E.col表达CAS9蛋白，过GST柱子纯化，浓缩收集蛋白，用凝血酶切除GST标签后，在160kd条带左右可见明显单一蛋白条带(图2)。
[0120] 实施例3人外周血单核细胞的体外扩增和转染
[0121] 通过使用 甲泛影钠溶液离心快速分离方法提取人外周血单核细胞。用CD3磁珠分选出CD3阳性的外周血单核细胞，并用CD3/28抗体激活T细胞，用含有100U/ml IL-2 LONZA-X-VIVO 15培养基在37℃/5％CO2的条件下培养细胞2天后进行细胞的病毒转染和电转。
[0122] cas9蛋白和gRNA mRNA按比例混合后，室温放置10分钟，同时4.0×106CD3+的T细胞(CD3/CD28抗体体外激活48小时后)转移到15ml离心管，500×g离心5分钟后，用400ul opti-medium(含有cas9和gRNA混合物)重悬，将细胞混合液转移到间隙为4mm的BTX电转杯中，冰上放置10分钟，将电转杯放置于BTX Gemini X2电穿孔仪中进行电转化，电转条件为500V，1ms。电转结束后，立刻将细胞悬液加到预热至37℃的含有IL-2(100IU/ml)的培养基(LONZA-X-VIVO 15)中，电转4小时后，按照感染比MOI值为10的量加入携带人源CAR19的病毒，并在培养基中加入终浓度为10mg/ml的聚凝胺Polybrene，加入病毒24小时后，细胞换液，之后每隔一天进行细胞传代。
[0123] 实施例4酶切法鉴定基因敲除效率
[0124] 细胞电转化3天后，收集细胞，提取细胞基因组。PCR扩增出带有突变位点(CRISPR/Cas9的靶点)的DNA片段。设计两对引物1#和2#，1#引物用来PCR扩增转化了HPK1gRNA的细胞基因组，2#引物用来PCR扩增转化了PD1gRNA的细胞基因组，两对引物序列如下：
[0125] 1#：F:5′-agcgagagtgaggaggggg-3′(SEQ ID NO:7)
[0126] R:5′-ttcatcaccagagataactccc-3′(SEQ ID NO:8)
[0127] 2#：F:5′-ccaccctctccccagtcctaccccctcctcacccctcct-3′(SEQ ID NO:9)[0128] R:5′-ggtccctccagacccctcgctccgggacccctgggctgc-3′(SEQ ID NO:10)[0129] 将扩增得到的PCR产物使用PCR仪进行加热变性、退火复性处理，设置程序如下：
[0130] 95℃3min，
[0131] 85℃1.5min(temperature decrease rate 0.1℃/s)，
[0132] 75℃1.5min(0.1℃/s)，
[0133] 65℃1.5min(0.1℃/s)，
[0134] …
[0135] 25℃1.5min(0.1℃/s),
[0136] 4℃。
[0137] 将处理后的PCR产物混合液中加入T7内切酶1(NEB)，37℃放置15分钟，琼脂糖凝胶电泳(2％的agarose gel)鉴定切割效率，结果如图3所示。
[0138] 实施例5 Western blot法检测基因敲除效率鉴定
[0139] 细胞电转3天后，收集细胞，提取细胞蛋白，做Western blot检测HPK1和β-Actin的表达，结果如图4所示。
[0140] 图4显示，与T细胞、CAR19+T细胞、CAR19+PD+/-T细胞相比，CAR19+HPK1+/-T cell中HPK1的表达量显著降低。
[0141] 实施例6流式检测Car19的转染效率及PD1的表达
[0142] 细胞转染病毒后7天，每组分别取1*106个细胞，4度避光孵育抗体后检测Car及HPK1的表达,结果如图5所示。
[0143] 图5显示，与单纯的CAR19T cell相比，CAR19+HPK1+/-T cell和CAR19+PD1+/-T cell表面的PD1受体表达量均显著降低。CAR19+HPK1+/-T cell和CAR19+PD1+/-T cell表面的PD1受体表达量水平接近，无显著差别。
[0144] 实施例7 T细胞杀伤实验
[0145] 效应细胞为前述经电转和病毒转染后的CD3+人T细胞,靶细胞分别为Raji、Daudi、6
K562人恶性淋巴瘤细胞系。取靶细胞100μl铺96孔板，24h后加入效应细胞100μl(1×10 个/ml)，每份样品做3个复孔。37℃，体积分数为5％的CO2培养箱中共同孵育12h收集上清，利用promega CytoTox Non-Radioactive细胞杀伤检测试剂盒检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的含量，在微型振荡器上振荡5min后，用酶标仪于490nm波长下检测，细胞杀伤功能按如下公式计算：
K562人恶性淋巴瘤细胞系。取靶细胞100μl铺96孔板，24h后加入效应细胞100μl(1×10 个/ml)，每份样品做3个复孔。37℃，体积分数为5％的CO2培养箱中共同孵育12h收集上清，利用promega CytoTox Non-Radioactive细胞杀伤检测试剂盒检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的含量，在微型振荡器上振荡5min后，用酶标仪于490nm波长下检测，细胞杀伤功能按如下公式计算：
[0146]
[0147] T细胞对三种人恶性淋巴瘤细胞系的杀伤效果如图6所示。图6中，CAR19+HPK1+/-T cell几乎在各种效靶比的情况下对三种人恶性淋巴瘤细胞系的杀伤效果都最好(除了对K562细胞系在效靶比5:1的条件下)。对Raji、Daudi两种细胞系在效靶比1:1、5:1，CAR19+HPK1+/-T cell的杀伤效果与其他各组差异显著；在效靶比10:1的条件下CAR19+HPK1+/-T cell的杀伤效果与其他各组差异极显著。
[0148] 实施例8 T细胞分泌细胞因子的检测
[0149] CAR19+CD3+人T细胞和三种靶细胞(Raji、Daudi、K562)按照2:1的数量比共培养12小时后，收集上清，分别用eBIOSCIENCE的Elisa检测试剂盒检测上清中IFN-γ和IL-2的含量，结果如图7所示。
[0150] 图7中，CAR19+HPK1+/-T cell对Raji、Daudi的杀伤效果高于其它各组。
[0151] CAR19+HPK1+/-T cell和CAR19+PD1+/-T cell对Raji的杀伤效果与其它组相比差异极显著。CAR19+HPK1+/-T cell对Daudi的杀伤效果与其它组相比差异极显著，CAR19+PD1+/-T cell对Daudi的杀伤效果与其它组相比差异显著。
[0152] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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