用于基因转移和基因治疗的腺病毒复合物专利检索-基因治疗遗传学专利检索查询-专利查询网

用于基因转移和基因 治疗的腺病毒复合物

阅读：39发布：2020-05-13

专利汇可以提供用于基因转移和基因治疗的腺病毒复合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及可以通过靶向神经降压肽受体来用于基因转移和基因治疗的腺病毒复合物。本发明的复合物由于高的细胞内基因转移效率和由神经降压肽受体特异性结合产生的靶特异性从而具有优异的抗肿瘤效果，几乎没有肝毒性和免疫原性，形成稳定的复合物，具有低免疫原性，并因此即使在体内环境中在血液中也具有低的损失。因此，本发明的复合物可以有效地用于基因治疗。，下面是用于基因转移和基因治疗的腺病毒复合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.基因递送系统，其包含：
腺病毒(Ad)、聚乙二醇(PEG)和神经降压肽受体特异性结合肽(NT)。
2.权利要求1所述的基因递送系统，其中所述神经降压肽受体特异性结合肽与PEG缀合。
3.权利要求1所述的基因递送系统，其中所述PEG在Ad衣壳表面上与交联剂缀合。
4.权利要求1所述的基因递送系统，其中所述神经降压肽受体特异性结合肽由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
5.权利要求1所述的基因递送系统，其中所述Ad包含选自饰胶蛋白聚糖基因的碱基序列和编码Wnt3a/β-联蛋白信号传导抑制蛋白的碱基序列的一个或更多个碱基序列。
6.权利要求1所述的基因递送系统，其与过表达神经降压肽受体的肿瘤特异性结合。
7.用于基因递送的组合物，其包含：
权利要求1所述的基因递送系统。
8.用于基因治疗的复合物，其包含：
腺病毒(Ad)、聚乙二醇(PEG)和神经降压肽受体特异性结合肽(NT)。
9.权利要求8所述的复合物，其中所述神经降压肽受体特异性结合肽与PEG缀合。
10.权利要求8所述的复合物，其中所述PEG在Ad衣壳表面上与交联剂缀合。
11.权利要求8所述的复合物，其中所述神经降压肽受体特异性结合肽由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
12.权利要求8所述的复合物，其与过表达神经降压肽受体的肿瘤特异性结合。
13.权利要求8所述的复合物，其还包含：
治疗基因。
14.权利要求8所述的复合物，其包含Ad，所述Ad包含饰胶蛋白聚糖基因的碱基序列和编码Wnt3a/β-联蛋白信号传导抑制蛋白的SEQ ID NO：3的碱基序列；与所述Ad的衣壳缀合的PEG；以及与所述PEG缀合的神经降压肽受体特异性结合肽。
15.药物组合物，其包含：
治疗有效量的权利要求8所述的用于基因治疗的复合物。
16.权利要求15所述的药物组合物，其还包含治疗基因。
17.权利要求15所述的药物组合物，其为抗癌(抗肿瘤)组合物。
18.权利要求15所述的药物组合物，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、血癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼黑素瘤、子宫肉瘤、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、结直肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、小肠赘生物、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾细胞癌、软组织肿瘤、尿道癌、前列腺癌、支气管癌或白血病。
19.制备用于基因治疗的复合物或基因递送系统的方法，其包括：
通过使Ad、PEG和交联剂以1mol：1×105mol或更大的Ad∶PEG的比和1mol∶1×105mol或更大的Ad∶3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)交联剂的比进行反应来制备腺病毒-聚乙二醇(Ad-PEG)缀合物。
20.治疗癌症的方法，其包括：
向对象施用药学有效量的权利要求8所述的用于基因治疗的复合物。

说明书全文

用于基因转移和基因 治疗的腺病毒复合物

技术领域

[0001] 本发明涉及可以通过靶向神经降压肽受体来用于基因递送和基因治疗的腺病毒复合物。

背景技术

[0002] 已知胰腺癌是非常具有侵袭性的、恶性的并且难以治愈。尽管胰腺癌的发病率低于其他癌的发病率，但胰腺癌是由癌症引起死亡的第四大常见原因[1]。根据美国国家癌症研究所(U.S.National Cancer Institute)的报告，由于胰腺癌是非特异性的，具有出现较晚的早期症状，并且在早期转移，因此在2002年至2008年期间所有诊断为胰腺癌的患者的5年存活率为5.8％，并且几乎所有患者中的90％在诊断后一年内死亡。因此，患有胰腺癌的患者的预后非常差[2，3]。

[0003] 用于治疗胰腺癌的常规方法(包括免疫疗法、化学疗法和放射疗法)的不良的预后是由于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的异常和过度形成，其诱导肿瘤细胞周围[4-7]非常高的结缔组织形成。在胰腺癌中，整个肿瘤体积的几乎90％由胰腺基质和ECM组成，并且充当治疗剂有效分散到肿瘤组织中的第一个障碍[8]。此外，最近的研究显示ECM促进成分例如I型胶原蛋白成为肿瘤生长、耐药性和转移的促进因子[9，10]。由于常规疗法在胰腺癌治疗中的这样的障碍和限制，因此需要通过靶向ECM以改善胰腺癌治疗的临床结果来减轻胰腺癌的新的治疗方式。

[0004] 由于优异且有效的体内基因递送，腺病毒(Ad)介导的基因治疗是一种有前景的癌症治疗策略，其已得到论文的充分证明。特别地，溶瘤腺病毒(oncolytic adenovirus，oAd)具有用于癌症基因治疗的有利特征，例如肿瘤中的自体增殖、被感染的癌细胞的裂解和邻近细胞的继发性感染。oAd表达基因疗法已被广泛研究，因为它能够通过靶位点中的病毒复制诱导特定基因的癌症选择性表达和扩增以及癌细胞的继发性感染。然而，仅用野生型Ad(裸Ad)，在广泛扩散的晚期转移癌的治疗中存在显著的限制。为了完全移除在宿主中广泛扩散的癌症，需要全身性Ad施用，但是这样的方法面临主要障碍。特别地，裸Ad具有高免疫原性并诱导相当大的抗病毒免疫应答，从而使得利用Ad特异性中和抗体(Ab)和其他血液成分例如血小板和红细胞快速从血液中除去Ad[13]。此外，αVβ5-和凝血因子X介导的Ad摄取到库普弗细胞和肝细胞两者中导致Ad在肝中的非特异性吸收、低肿瘤靶效率和严重的肝毒性[14，15]。为了克服oAd用于临床治疗的限制，需要组合病毒和非病毒载体的特别设计的Ad混合系统[18，19]。

[0005] 病毒载体和非病毒载体的组合可分为涉及物理作用或化学缀合的两种类型的方法。两种方法均可以用于降低免疫原性并隐藏Ad天然向性，这在体内是有利的[20]。然而，由于阳离子聚合物与阴离子血清蛋白之间的非特异性电荷相互作用，因此物理结合的Ad纳米复合物对于全身施用是不理想的，这可能引起血液中的快速降解和结构不稳定，从而促进[21]凝聚。化学缀合的Ad可形成更稳定的纳米复合物，其可以耐受血液循环，隐藏肝组织的Ad的天然向性，并且因此可以降低抗病毒免疫应答。

[0006] 作为一个值得注意的实例，Ad的PEG化自20世纪90年代末以来已被用于保护Ad免受蛋白质水解和宿主免疫应答[23-26]。然而，通过PEG的这样的保护方法可阻断Ad有效内化到宿主细胞中，因为内源性纤维的掩蔽可以抑制与CAR相互作用，从而降低Ad进入效率[18，21]。

[0007] 因此，由于使用化学修饰的Ad在基因递送和基因治疗的临床应用方面仍然存在许多限制，因此开发这样的Ad复合物在该领域中仍然是一个挑战，在所述Ad复合物中Ad在体内长时间存在，同时保持治疗能力，并且其在血液循环环境中不消失并由于优异的Ad细胞内摄取而没有免疫应答和副作用例如肝毒性而具有治疗效果。

发明内容

[0008] 技术问题

[0009] 因此，本发明的发明人设计了靶向部分缀合的PEG以用于诱导Ad的组织特异性递送，以克服由Ad的不稳定性、高免疫原性和低的体内基因递送效率导致的使用Ad的基因疗法的限制。本发明的发明人提供了PEG化的Ad复合物，其中Ad衣壳被靶向部分缀合的PEG包被以降低Ad的免疫原性并提高组织特异性。本发明的发明人证实，由于复合物的稳定性和靶特异性提高，复合物可以在细胞中引入基因方面获得优异的效率和治疗效果的提高，并且同时通过降低Ad的免疫原性和减少诱导肝毒性来解决副作用的问题，并因此完成了本发明。

[0010] 技术方案

[0011] 本发明提供了包含Ad、聚乙二醇(PEG)和神经降压肽受体特异性结合肽(NT)的基因递送系统以及包含其的用于基因递送的组合物。

[0012] 此外，本发明提供了用于基因治疗的复合物，其包含Ad、PEG和神经降压肽受体特异性结合肽(NT)。

[0013] 此外，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的用于基因治疗的复合物。

[0014] 此外，本发明提供了用于治疗对象的方法，所述方法包括向有治疗需要的对象施用药学有效量的基因递送系统、用于基因治疗的复合物、用于基因递送的组合物或药物组合物。

[0015] 此外，本发明提供了用于制备基因递送系统或用于基因治疗的复合物的方法，所述方法包括使Ad与PEG缀合。

[0016] 有益效果

[0017] 本发明的Ad复合物可具有优异的抗肿瘤效果，这是由于高的细胞内基因递送效率和由神经降压肽受体特异性结合引起的靶特异性，几乎无肝毒性和免疫原性，和具有稳定性，以及由于低的免疫原性，即使在体内环境中在血液中也具有低损失。因此，本发明的复合物可以有效地用于基因治疗。附图说明

[0018] 图1是用于本发明的一个示例性实施方案的Ad结构的图。

[0019] 图2是示出了根据本发明的一个示例性实施方案制备的PEG-神经降压肽(NT)缀合物的1HNMR分析结果的图。

[0020] 图3是示出了根据本发明的一个示例性实施方案制备的PEG-神经降压肽(NT)缀合物的MLDI-TOF分析结果的图。

[0021] 图4A和4B是示出了通过建立用于制备Ad-PEG-NT复合物的最佳条件的DTSSP交联剂的浓度来确认基因递送效率的结果的图。

[0022] 图5A和5B是示出了根据建立用于制备Ad-PEG-NT复合物的最佳条件的DTSSP交联剂和PEG的浓度的复合物的基因递送效率的图。

[0023] 图6A、6B和6C是确认根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad-PEG-NT复合物的尺寸分布和表面电荷的图。

[0024] 图7A、7B、7C、7D、7E、7F和7G是示出了确认多种细胞系中神经降压肽受体表达水平的结果的图。

[0025] 图8A和8B是示出了确认根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物的神经降压肽受体特异性细胞内引入效率的结果的图。

[0026] 图9是示出了确认根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物的细胞内递送是否是由于神经降压肽受体特异性结合的结果的图。

[0027] 图10A、10B、10C、10D和10E是示出了确认根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物的癌细胞杀伤能力的结果的图。

[0028] 图11A、11B、11C、11D和11E是示出了确认根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物的病毒产生能力的结果的图。

[0029] 图12A和12B示出了根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物诱导的免疫应答，其中图12A是示出了确认固有免疫应答的结果的图，图12B是示出了确认适应性免疫应答的结果的图。

[0030] 图13是示出了分析根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物的药代动力学特征的结果的图。

[0031] 图14A、14B和14C示出了确认由根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物引起的胰腺癌原位模型中的抗肿瘤效果的结果。

[0032] 图15A、15B、15C和15D示出了确认根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物的每个器官的体内分布和肝毒性的结果。

[0033] 图15E示出了确认根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物是否保留在肝组织中的结果。

[0034] 图16示出了确认根据本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物的抗肿瘤效果的结果。

[0035] 图17是示出了在人胰腺癌组织中过表达的胶原蛋白分布的图像。

[0036] 图18示出了根据施用按照本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物确认肿瘤组织中胶原蛋白分布的变化的结果。

[0037] 图19示出了根据施用按照本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物确认肿瘤组织中Wnt和β-联蛋白表达的变化的结果。

[0038] 图20示出了根据施用按照本发明的一个示例性实施方案制备的Ad复合物确认肿瘤组织中与Wnt/β-联蛋白信号传导有关的标志物的变化的结果。

具体实施方式

[0039] 本发明涉及包含生物相容性聚合物和与神经降压肽受体特异性结合的配体的Ad复合物，并且更具体地涉及包含Ad、PEG和神经降压肽受体特异性结合肽(NT)的Ad复合物。

[0040] 此外，本发明提供了用于制备Ad复合物的方法。

[0041] Ad复合物可为基因递送系统以便在细胞中递送靶基因。

[0042] Ad复合物可为用于基因治疗的复合物，其包含靶基因以在细胞中表达基因。

[0043] 在下文中，将进一步详细描述本发明。

[0044] 本发明提供了一种Ad复合物，其包含Ad、PEG和神经降压肽受体特异性结合肽(NT)。

[0045] 本文中使用的术语“Ad复合物”是指用作基因递送载体的Ad与化学或物理上不同于Ad的组分之间的结合。

[0046] 由于中等基因组大小、容易操作、高滴度、大范围的靶细胞和高感染性，因此“腺病毒(Ad)”被用作基因递送载体。基因组的两端各自包含100bp至200bp的反向末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，其是DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的E1区(E1A和E1B)编码调节转录和宿主细胞基因转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)编码参与病毒DNA复制的蛋白质。

[0047] 在目前开发的Ad载体中，广泛使用E1区缺失的复制缺陷型Ad。同时，从常规Ad载体中移除E3区，并因此提供外源基因插入位点(Thimmappaya，B.等，Cell，31：543-551(1982)；和Riordan，J.R.等，Science，245：1066-1073(1989))。同时，将待递送到细胞中的靶核苷酸序列特异性地插入到缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，并且优选E1B区)或E3区中，并且更具体地，插入到缺失的E1区中。

[0048] 本文中关于基因组序列使用的术语“缺失”的含义不仅包括相应序列的部分缺失，而且还包括相应序列的完全缺失。

[0049] 此外，由于Ad可包装约105％的野生型基因组，因此可额外包装约2kb的遗传信息(Ghosh-Choudhury等，EMBO J.，6：1733-1739(1987))。因此，插入到Ad中的上述外源序列可另外与Ad基因组结合。Ad具有42种不同的血清型和A-F亚组。在这些中，亚组C中包含的5型Ad是获得本发明的Ad载体的最合适的起始材料。5型Ad的生物化学和遗传信息是公知的。由Ad递送的外源基因以与附加体相同的方式复制并且相对于宿主细胞具有非常低的遗传毒性。

[0050] 术语“神经降压肽受体特异性结合肽(NT)”是指可以与神经降压肽受体1(neurotensin receptor 1，NTR)特异性结合的配体。神经降压肽受体1是在癌细胞中过表达的受体之一，并且特别是在胰腺癌、乳腺癌和头颈癌细胞中显著过表达且在正常胰腺细胞中不存在或很少表达的高度癌症选择性标志物[33]。

[0051] 肽(NT)在类型方面不受限制并且可包含SEQ ID NO：1或2的碱基序列，并且更具体地由所述碱基序列组成。由于本发明的Ad复合物包含与神经降压肽受体特异性结合的神经降压肽(NT)，因此Ad复合物对于癌细胞，并且特别是过表达神经降压肽受体(NTR)的肿瘤细胞具有高靶向性，具有低的病毒向肝中的非特异性摄取和优异的向靶位点的基因递送效率。

[0052] NTR特异性结合肽可为PEG结合(缀合)肽。具体地，NTR特异性结合肽可与PEG的末端缀合，并因此可存在于本发明的复合物的最外层表面上。当NTR特异性结合肽存在于根据本发明的复合物的表面上时，其对靶细胞或组织具有优异的递送效率。

[0053] 根据本发明的一个示例性实施方案，通过实验证实，包含NTR特异性结合肽的复合物相对于神经降压肽受体表达细胞具有比不含所述肽的复合物更高的基因递送效率。

[0054] 因此，本发明的Ad复合物可能对神经降压肽受体的过表达具有特异性。

[0055] “聚乙二醇(PEG)”可为生物相容性聚合物之一，并且PEG可与Ad缀合。具体地，PEG可与Ad衣壳表面结合(缀合)，并且这样的结合可通过PEG化形成。更优选地，PEG可在一端与NTR特异性结合肽结合并且可在另一端与Ad结合。

[0056] 结合可使用交联剂进行，并且用于本发明的交联剂可为可以带来存在于Ad衣壳中的胺基与PEG之间的结合的任一种而没有限制。在一个实例中，交联剂可为但不限于3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)或二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)。

[0057] 根据本发明的一个示例性实施方案，交联剂可为DTSSP。当DTSSP用作交联剂时，为了PEG与Ad之间的结合，相对于1mol的Ad，可包含1×105mol或更多的PEG和1×105mol或更多的DTSSP交联剂。在通过满足上述范围制备的Ad复合物中，由于衣壳区域通过使80％或更多的病毒衣壳的胺基与PEG结合而被完全掩蔽(masking)，因此免疫原性可显著降低，复合物的平均颗粒尺寸可保持在100nm至200nm，因此复合物的细胞内摄取效率得到进一步提高。

[0058] 本发明的复合物还可包含通过Ad递送到细胞中的靶基因。

[0059] 本文中使用的术语“靶基因”是指全部和部分基因，并且可被递送到细胞中用于治疗、预防或诊断疾病。靶基因优选是在细胞中表达后表现出治疗或预防效果的治疗基因(多核苷酸序列)。基因的类型不限于靶标疾病的类型，只要基因可包含在本发明的复合物中即可。本发明的复合物可包含用于基因表达的单独的启动子。此外，本发明的复合物可包含一个或更多个靶基因。

[0060] 优选地，基因是诱导癌细胞死亡并最终使肿瘤降解的癌症治疗基因，并且包括肿瘤抑制基因、免疫相关基因、抗原基因、自杀基因、细胞毒性基因、细胞抑制基因、促凋亡基因和抗血管生成基因，但是本发明不限于此。

[0061] 本文中使用的术语“肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)”是指在靶细胞中表达以抑制肿瘤表型或诱导细胞死亡的核苷酸序列。可用于实施本发明的肿瘤抑制基因包括p53基因、APC基因、DPC-4/Smad4基因、BRCA-1基因、BRCA-2基因、WT-1基因、视网膜母细胞瘤基因(Lee等，Nature，1987，329，642)、MMAC-1基因、腺瘤性息肉病卷蛋白(adenomatous polyposis coil protein)(美国专利公开第5,783,666号)、缺失的结肠癌(DCC)基因、MMSC-2基因、NF-1基因、位于染色体3p21.3上的鼻咽癌抑制基因(Cheng等，Proc.Nat.Acad.Sci，95：3042-3047(1998))、MTS1基因、CDK4基因、NF-1基因、NF-2基因和VHL基因。

[0062] 本文中使用的术语“免疫相关基因(immune-related gene)”是指调节免疫相关因子表达的所有基因，例如编码以下的基因：细胞因子(例如干扰素-α、-β、-δ和-γ)；白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-23)和集落刺激因子(例如GM-CSF和G-CSF)；趋化因子组(单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-3α、MIP-3β、趋化因子(ELC)、巨噬细胞炎性蛋白4(MIP-4)、巨噬细胞炎性蛋白5(MIP-5)、LD78β、RANTES、SIS-ε(p500)、胸腺和活化调节趋化因子(TARC)、嗜酸性细胞活化趋化因子、I-309、人蛋白HCC-1/NCC-2、人蛋白HCC-3、鼠蛋白C10等)；和共刺激因子(costimulatory factor：T细胞活化所需的辅助分子，例如B7.1和B7.2)。

[0063] 本文中使用的术语“抗原基因(antigenic gene)”是指在靶细胞中表达以产生能够在免疫系统中被识别的细胞表面抗原蛋白的核苷酸序列。这样的抗原基因的实例包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、HER-2、PSA(prostate specific antigen，前列腺特异性抗原)和p53(Levine，A.，国际专利申请公开第WO94/02167号)。为了便于被免疫系统识别，抗原基因可与I型MHC抗原结合。

[0064] 本文中使用的术语“细胞毒性基因(cytotoxic gene)”是指在细胞中表达并表现出毒性作用的核苷酸序列。这样的细胞毒性基因的实例包括编码假单胞菌外毒素(exotoxin)、蓖麻毒素、白喉毒素等的核苷酸序列。

[0065] 术语“细胞抑制基因(cytostatic gene)”是指在细胞中表达以在细胞周期期间暂停细胞周期的核苷酸序列。这样的细胞抑制基因的实例可包括p21、视网膜母细胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白基因、编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的基因(例如，p16、p15、p18和p19)以及生长停滞特异性同源异型框(growth arrest specific homeobox，GAX)基因(WO97/16459和WO96/30385)，但是本发明不限于此。

[0066] 本文中使用的术语“促凋亡基因(pro-apoptotic gene)”是指被表达以诱导程序性细胞死亡的核苷酸序列。这样的促凋亡基因的实例包括p53、Ad E3-11.6K(来源于Ad2和Ad5)或Ad E3-10.5K(来源于Ads)、Ad E4基因、Fas配体、TNF、TRAIL、p53基因和编码胱天蛋白酶的基因。

[0067] 本文中使用的术语“抗血管生成基因(anti-angiogenic gene)”是指被表达以从细胞中释放抗血管生成因子的核苷酸序列。抗血管生成因子的实例包括血管抑素、血管内皮生长因子(VEGF)的阻遏物，例如Tie2(PNAS，1998，95，8795-800)和内皮抑素。

[0068] 此外，由于可以用于治疗多种类型的疾病的许多治疗基因是用于辅助抗肿瘤效果的手段，因此它们可通过本发明的Ad递送，例如，松弛素基因已被限定为适用于本发明人的Ad基因治疗，编码Wnt3a/β-联蛋白信号传导抑制剂(Wnt诱饵蛋白)或饰胶蛋白聚糖基因的核苷酸序列也是可以通过基因递送系统递送到细胞中的基因。

[0069] 上述核苷酸序列可从DNA序列数据库例如GenBank获得。

[0070] 根据本发明的一个示例性实施方案，基因可为编码饰胶蛋白聚糖基因和sLRP6E1E2的碱基序列，所述sLRP6E1E2是用于阻断Wnt3a/β-联蛋白信号传导的激动剂。用于表达饰胶蛋白聚糖基因和Wnt3a/β-联蛋白信号传导抑制蛋白(sLRP6E1E2)的复合物相对于在复合物表面的肽中过表达神经降压肽受体的胰腺癌细胞具有优异的靶向性，在胰腺癌中过表达的细胞外基质通过复合物中包含的饰胶蛋白聚糖基因而显著减少，并因此表现出优异的癌细胞杀伤能力。

[0071] 在这样的方面，本发明的复合物可为溶瘤Ad复合物，其表达饰胶蛋白聚糖基因和Wnt3a/β-联蛋白信号传导抑制蛋白并用于NTR过表达和ECM过表达肿瘤细胞治疗，并且该复合物还可包含另一个靶基因的核苷酸序列以及编码饰胶蛋白聚糖基因和Wnt3a/β-联蛋白信号传导抑制蛋白的核苷酸。用于表达饰胶蛋白聚糖基因和Wnt抑制蛋白的溶瘤Ad复合物可以以异常过大的量减少ECM例如存在于胰腺癌中的胶原蛋白，并且由于在肿瘤中优异的复制能力，可能在NTR过表达和ECM过表达的肿瘤细胞的治疗中特别有效。特别地，由于异常存在的ECM，其他治疗组分未适当地扩散，因此难以治疗肿瘤细胞。因此，更重要的是本发明的复合物对于治疗这样的癌具有优异的治疗效果。

[0072] 在本发明的一个方面，Ad复合物可将来源于外来生物体的靶基因递送到细胞中，并且在这样的方面，本发明的复合物可为基因递送系统。

[0073] 本文中使用的术语“基因递送系统”是指用于将外源基因递送至例如靶细胞或组织的部分的手段。可使用基因递送系统，同时待递送的靶基因与上述基因表达调控序列可操作地连接。本文中使用的术语“可操作地连接(operatively linked)”是指基因表达调控序列(例如，启动子、信号序列或转录调节因子结合位点阵列)与不同核酸序列之间的功能性结合，并且因此，调控序列调节另一个核酸序列的转录和/或翻译。与本发明的基因表达调控序列可操作连接的靶基因没有特别限制。

[0074] 在本发明的另一方面，基因递送系统可与可药用佐剂一起用于基因疗法或治疗，并且根据这样的方面，本发明可提供用于基因递送的组合物，其包含基因递送系统。

[0075] 用于基因递送的组合物还可包含本发明领域中通常包含的用于基因递送的组分。

[0076] 在本发明的又一个方面，将Ad复合物递送到癌细胞中，由此通过表达包含在Ad中的基因而具有直接的癌细胞杀伤作用，并且在这样的方面，本发明的Ad复合物可为用于基因治疗的复合物。

[0077] 用于基因治疗的复合物还可包含治疗基因。

[0078] 根据本发明的一个示例性实施方案，为了在体外和体内测量关于表达NTR的胰腺癌细胞的目标效率和治疗效率，本发明人制备了与PEG-NT交联的非复制型和癌细胞特异性复制型Ad两者，并且证明了Ad在表达NTR的胰腺癌细胞中表现出更高的基因引入效率。此外，制备了能够表达饰胶蛋白聚糖基因和可溶性Wnt诱饵受体(sLRP6E1E2)两者以通过降解异常ECM以及抑制Wnt/β-联蛋白和TGF-β1信号传导来使胰腺癌治疗中的期望的治疗效果最大化的复合物，并且通过实验证实，该复合物能够下调胰腺癌中的ECM合成、化学抗性和上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)，并且具有优异的胰腺癌治疗效果。

[0079] 在本发明的又一个方面，Ad复合物可与可药用佐剂一起用于基因疗法或治疗的递送，并且根据这样的方面，本发明可提供包含Ad复合物的药物组合物。

[0080] 药物组合物还可包含治疗基因。

[0081] 无论疾病的类型如何，可应用包含治疗有效量的本发明的Ad复合物的药物组合物。具体地，由于可根据另外包含的多种药物活性成分将包含本发明的复合物的药物组合物应用于多种疾病，因此包含该复合物的药物组合物可应用于多种用途而不限于疾病的类型。药物活性成分在类型方面不受限制，并且可与本发明的复合物一起包含在组合物中或者在包含在本发明的复合物中的同时包含在组合物中。例如，药物活性成分可为治疗基因。因此，包括治疗有效量的本发明的复合物的任何类型的药物组合物均包括在本发明中，而不管疾病的类型如何。

[0082] 如上所述，尽管本发明的药物组合物不限于疾病的类型，但本发明的复合物具有对过表达神经降压肽的肿瘤细胞呈特异性的特性，并且根据这样的方面，药物组合物优选用于抗癌治疗。在这方面，药物组合物可为抗癌(抗肿瘤)药物组合物。

[0083] 此外，除了本发明的复合物以外，组合物还可包含具有抗癌或抗炎活性的活性成分。

[0084] 本文中使用的术语“治疗有效量”是指足以实现药物作用的量。

[0085] 包含在本发明的组合物中的可药用载体通常用于制剂中，并且可为但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油。除了上述组分以外，本发明的药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂和防腐剂。

[0086] 在本发明的又一方面，本发明提供了用于治疗对象的方法，所述方法包括向有治疗需要的对象施用药学有效量的Ad复合物或药物组合物。

[0087] 本发明的药物组合物可肠胃外，例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或局部施用。本发明的药物组合物可腹膜内施用以治疗卵巢癌，并且施用到门静脉中以治疗肝癌。可将药物组合物直接注射到肿瘤块中以治疗乳腺癌，并通过灌肠剂直接注射以治疗结肠癌。

[0088] 本文中使用的术语“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理的利益/风险比治疗疾病的量。本发明的药物组合物的合适的剂量可根据例如制备方法、施用方法、患者的年龄、体重和性别、疾病症状的严重程度、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率和反应灵敏度的因素而变化，并且用于期望治疗的有效剂量可由具有普通技能的医生容易地确定和规定。本发明的药物组合物包含1×101VP/ml至1×1050VP/ml的Ad复合物，并且通常可每隔一天注射。然而，考虑到患者的年龄、疾病的严重程度等，可改变施用的具体剂量和次数。

[0089] 本文中使用的术语“对象”包括动物，例如马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊和狗、或人，其患有症状可以通过施用根据本发明的治疗组合物来缓解的疾病。当将本发明的药物组合物施用于对象时，可有效地预防和治疗疾病。根据本发明的治疗方法可以是治疗除人以外的动物的方法，但本发明不限于此。也就是说，如果人患有其症状可以通过施用本发明的组合物来缓解的疾病，则本发明的组合物甚至可充分用于治疗人疾病。

[0090] 根据可以由本领域普通技术人员容易地实施的方法，本发明的药物组合物可在使用可药用载体和/或赋形剂配制之后通过单位剂量包装或多剂量包装来制备。在此，本发明的药物组合物的剂型可为在油或水性介质中的溶液剂、混悬剂或乳剂、提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂，并且本发明的组合物还可包含分散剂或稳定剂。

[0091] 本发明的药物组合物可独立使用或与其他常规化学或放射疗法组合使用，并且这样的组合疗法可更有效地用于癌症治疗。可以与本发明的组合物一起使用的化学治疗药物包括顺铂、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤。可以与本发明的组合物一起使用的放射疗法包括X射线辐射和γ射线辐射。

[0092] 根据本发明的又一方面，本发明提供了用于制备Ad复合物的方法。

[0093] 所述制备方法包括通过Ad、PEG和交联剂的反应进行缀合。

[0094] 在缀合步骤中，与Ad反应的PEG可在一端与神经降压肽受体特异性肽缀合。

[0095] 在缀合步骤中，Ad可以以1mol∶1×105mol的摩尔比(Ad∶PEG)与PEG反应。

[0096] 在缀合步骤中，Ad可以以1∶1×105mol或更大，或者以1∶1×105mol或更大至3×105mol或更小的比与交联剂反应。

[0097] 最优选地，基于1mol的Ad，可以1×105mol或更多的PEG和1×105mol或更多的交联剂进行反应。当反应在该范围内进行时，Ad复合物可具有优异的神经降压肽受体依赖性靶向性并且可以是稳定的。

[0098] 因此，本发明提供了通过上述制备方法制备的Ad复合物。

[0099] 在下文中，将结合实施例更详细地描述本发明。提供这些实施例仅是为了更全面地描述本发明，并且对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围不限于这些实施例。

[0100] [实施例]

[0101] 1.实验准备和统计分析

[0102] 1-1.细胞培养

[0103] 人胰腺癌细胞系(PANC-1、MIA PaCa-2和AsPC-1)、肺腺癌细胞系(A549)和Ad5 E1转化的胚胎肾细胞系(HEK293)购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC，Manassas，VA)。人正常胰腺细胞(NPC)购自Applied Biological Materials Inc.(ABM，Richmond，加拿大)，并储存在Prigrow I培养基(ABM)中。将AsPC-1细胞储存在RPMI-1640(Gibco BRL，Grand Island，NY)中，将其他细胞在含有10％胎牛血清(FBS，Gibco BRL)的高浓度葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco BRL)中在37℃、5％CO2培养箱中培养。从患者收集的胰腺癌组织从汉阳大学医学院(Hanyang University Medical School)获得。按照汉阳大学机构审查委员会(Institutional Review Board)批准的方案使肿瘤组织经受免疫组织化学。所有与人体组织有关的实验均按照赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)的原则进行。

[0104] 1-2.统计分析

[0105] 结果以平均值±SD表示。通过双尾Student T-检验(SPSS 13.0 软件；SPSS，Chicago，IL)和单向方差分析(单向ANOVA)确定统计显著性。*P＜0.05、**P＜0.01或***P＜0.001的差异表明统计显著性。

[0106] 2.Ad的结构和PEG-NT的制备

[0107] 2-1.Ad的结构

[0108] 使用表达绿色荧光蛋白(GFP)的复制缺陷型Ad(dE1/GFP)确认神经降压肽受体依赖性递送效率。为了制造其增殖受HRE-E2F-mTERT(HEmT)启动子调控并表达能够抑制Wnt3a/β-联蛋白信号传导的饰胶蛋白聚糖基因(饰胶蛋白聚糖，DCN)和sLRP6E1E2(LRP)的[38-40]oAd(oAd/DCN/LRP) ，使用具有突变的E1A和E1B 19kDa位点的视网膜母细胞瘤结合位点缺失的Ad E1穿梭载体(pDE1sp1B/Rd19)作为模板质粒。首先，通过将HEmT启动子插入到pDE1sp1B/Rd19中来制造pDE1sp1B/HEmT-Rd19 Ad E1穿梭载体。为了插入DCN表达盒，使用BglII将饰胶蛋白聚糖基因与pCA14/DCN分开，并与pDE1sp1B/HEmT-Rd19连接，从而制备pDE1sp1B/HEmT-Rd19/DCN Ad E1。为了与线性Ad dE1-k35同源重组，通过用经XmnI处理的pDE1 sp1B/HEmT-Rd19/DCN Ad E1穿梭载体转化大肠杆菌(E.coli)BJ5183来制造HEmT-Rd19-k35/DCN oAd质粒。之后，使用pCA14-LRP载体构建表达LRP的Ad E3穿梭载体(pSP72dE3-LRP)[36]。将新构建的pSP72dE3-LRP在大肠杆菌BJ5183中用表达DCN的oAd载体(HEmT-Rd19-k35/DCN)线性化，并用于转化，由此制造oAd/DCN/LRP溶瘤Ad。将合适的同源重组Ad质粒DNA用PacI裂解，并转染到293细胞中以制造oAd/DCN/LRP oAd。将复制缺陷型dE1/GFP和具有复制能力的oAd/DCN/LRP分别递送至293细胞和A549细胞，并使用CsCl梯度离心纯化。

[0109] 使用分光光度计在260nm(OD260)处计算病毒颗粒(VP)的数量。在此，吸光度1(OD260＝1)相当于1.1×1012VP/mL。纯化的病毒在-8℃下储存直至使用。

[0110] 2-2.NT-缀合的聚乙二醇(PEG-NT)的制备

[0111] 通过将3mg异双功能PEG(Mal-PEG-NH2，3.5kDa；JenKem Technology，Plano，TX)溶解在1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(1.0mL)中来制备1μM溶液，然后添加2.33mg NT(Anygen，Gwangju，Korea)。NT1由氨基酸Cys-Glu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu组成，并且末端半胱氨酸与PEG的马来酰亚胺反应，由此形成PEG-NT缀合物。将这样的反应混合物在室温下搅拌24小时，使用Slide-A-LyzerTM盒(3.5kDa截留分子量；Thermo Scientific，Rockford，IL)在4℃下用蒸馏水/去离子水透析过夜，然后冻干以制备PEG-NT。通过1HNMR和基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)证实PEG-NT缀合。

[0112] 此外，为了证实根据神经降压肽的类型的效果，通过与上述相同的方法将NT2(Cys-Arg-Arg-Pro-Try-Ile-Leu)与PEG缀合。

[0113] 参照图2和3所示，根据1HNMR结果和MALDI-TOF分析可以确认，PEG-NT是结合良好的。

[0114] 在下文中，除非另外特别指出，否则所使用的神经降压肽是NT1，其被命名为NT。

[0115] 3.Ad与PEG-NT的缀合

[0116] 根据先前报道的方法13进行Ad与PEG-NT的缀合。

[0117] 在1×PBS缓冲液中以1∶105的摩尔比(Ad∶DTSSP)将Ad(1×1011VP/mL)和3，3-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)交联剂(Thermo Scientific)预活化。在将所得溶液在室温下保持30分钟之后，添加NH2-PEG-NT(Ad∶PEG-NT的摩尔比为1∶105)。将反应混合物在室温下孵育2小时，然后使用过量的游离L-赖氨酸淬灭。最后，为了除去未反应的试剂，通过超滤(Amicon Ultra Centrifugal Filter；Millipore，Billerica，MA)纯化产物。

[0118] 4.建立用于形成Ad-PEG-NT缀合物的DTSSP的最佳条件

[0119] 在Ad的PEG化中，根据每DTSSP浓度的PEG化比较PANC-1细胞中的引入效率，所述DTSSP是允许PEG与表达GFP的Ad缀合的交联剂。转化后48小时，通过流式细胞术(BD Bioscience)观察GFP表达。为了进一步分析与Ad表面的PEG缀合程度，用不同浓度的交联剂(DTSSP∶Ad的摩尔比：1 ×104、l×105、3×105)处理表达GFP的复制缺陷型Ad(dE1/GFP)，然5
后在室温下与1×10mol PEG缀合30分钟。转染到胰腺癌细胞系(PANC-1)中48小时后，为了定量分析转移到细胞中的病毒的GFP表达，进行FACS分析。根据通常已知的方法，使用荧光胺(fluorescamine，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)量化dE1/GFP-PEG纳米复合物的经修饰的赖氨酸残基[42]。使用荧光分光光度计(PerkinElmer，Waltham.MA)测量荧光。

[0120] 如图4A和4B所示，可以确认，随着DTSSP浓度的增加，Ad细胞内引入效率降低，并且还可以确认，当DTSSP浓度为1×105或更大时，PEG化的Ad细胞内引入效率降低98％或更多。此外，作为通过荧光胺分析定量分析PEG结合到Ad表面上的程度的结果，可以确认，当DTSSP浓度为1×105或更大时，80％或更多的胺基在病毒衣壳上PEG化。尽管DTSSP浓度较高，但未显著地表现出差异。因此，当Ad表面PEG化，并且交联剂与Ad的摩尔比为1×105至3×105时，可以确认，Ad表面几乎完全被掩蔽。因此，通过在上述范围内形成复合物来进行实验。

[0121] 5.建立Ad和PEG缀合(PEG-NT)的最佳条件以形成Ad-PEG-NT缀合物

[0122] 为了确定形成最终的Ad-PEG-NT复合物的DTSSP与PEG-NT的最佳比，将复合物用两种浓度的DTSSP(1×105和3×105)固定，在所述浓度下在上文中验证了效率，使dE1/GFP与多种浓度的PEG或PEG-NT(1×104、1×105或1×106)反应，然后用于治疗其中神经降压肽受体过表达的人胰腺癌细胞(PANC-1)以比较细胞内引入效率。

[0123] 具体地，将PANC-1细胞以5×104个细胞/孔的密度接种在24孔板中24小时。之后，通过以200MOI处理dE1/GFP、dE1/GFP-PEG或dE1/GFP-PEG-NT来进行转化，培养后48小时，确认GFP表达的程度。使用荧光显微镜(Olympus IX81；Olympus Optical，Tokyo，日本)检测GFP表达，并使用ImageJ软件(版本1.50b；美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)，Bethesda，MD)进行半定量分析。半定量分析的图像以表示为GFP水平的相对变化的三个不同数字图像的平均光密度表示。

[0124] 如图5A和5B所示，当DTSSP和PEG-NT的处理浓度为1×105时，可以确认，GFP表达效5
率高，并且特别地，在PEG(或PEG-NT)浓度为1×10的条件下，可以确认，形成了Ad-PEG-NT复合物，并且最高度表现出NTR依赖性靶向性。

[0125] 6.Ad-PEG-NT复合物的物理化学特征

[0126] 6-1.复合物的理化特征的确认

[0127] 使用Zetasizer 3000HS(Malvern Instrument Inc.，Worcestershire，UK)和He-Ne激光束(633nm，固定散射角：90°)在室温下测量裸dE1/GFP、dE1/GFP-PEG或dE1/GFP-PEG-NT(dE1/GFP∶PEG或PEG-NT的摩尔比为1∶1×105)的平均颗粒尺寸和表面电荷。最终尺寸计算为5个独立结果的平均值。

[0128] 如图6A所示，野生型Ad的平均颗粒尺寸为101.5±5.1nm，并且当PEG或PEG-NT结合时，可以确认，平均尺寸分别逐渐增加至109.2±3.3nm或119.7±3.9nm。随着颗粒尺寸的增加，表面电荷也增加。特别地，可以确认，裸Ad的表面电荷为-26.4±0.5mV，并且PEG或PEG-NT结合复合物的表面电荷为-24.7±0.7或-19.2±0.3mV。因此，可以确认，本发明的Ad-PEG-NT复合物具有用于递送至细胞的合适的尺寸并且稳定地形成。

[0129] 6-2.根据肽类型的复合物的物理化学特性

[0130] 可以确认，复合物的物理化学特性随着神经降压肽的类型而改变。使用野生型Ad作为对照组，并且在制备了其中Ad、Ad-PEG和神经降压肽结合的Ad-PEG-NT1和Ad-PEG-NT2之后，测量尺寸和表面电荷。

[0131] SEQ ID NO：1

[0132] NT 1：Cys-Glu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu

[0133] SEQ ID NO：2

[0134] NT2：Cys-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu

[0135] 如图6B和6C所示，野生型Ad的尺寸为约100nm，并且其中附接PEG的Ad-PEG的尺寸增加至约108nm。在靶向材料(NT1或NT2)结合复合物的情况下，Ad-PEG-NT1的尺寸为118nm，并且Ad-PEG-NT2的尺寸为约115nm。与Ad相比，当PEG、NT2或NT1结合时，可以确认，颗粒尺寸依次增加。作为表面电荷测量的结果，可以确认，裸Ad的表面电荷值为-27mV，并且由于PEG的结合，负电荷略微下降至约-23mV。然而，当附接靶向基团时，Ad-PEG-NT1的表面电荷为-19mV，Ad-PEG-NT2的表面电荷为-21mV，并且因此可以确认，其表面电荷比仅PEG结合或裸Ad的表面电荷高。

[0136] 7.人癌细胞中NTR的表达水平

[0137] 7-1.PANC-1、MIA PaCa-2、A549和AsPC-1中的NTR表达

[0138] 通过流式细胞术确认人癌细胞(PANC-1、MIA PaCa-2、A549和AsPC-1)表面上的NTR表达水平。通过胰蛋白酶-EDTA处理收集细胞，并用含有1％FBS的PBS(pH 7.4)洗涤。之后，将细胞(3×105)与NTR特异性一抗(Ab，Abcam，Cambridge，UK)一起在4℃下孵育1小时。将细胞用PBS/1％FBS洗涤两次，并与二抗(PE标记的山羊抗小鼠IgG；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)一起在4℃下孵育40分钟。在用PBS/1％FBS洗涤两次之后，为了分析，将染色的细胞重悬于0.5ml的1×PBS中。使用仅用二抗染色的每种类型的细胞作为阴性对照。用Cell Quest软件(BD Bioscience)使用FACSCalibur分析仪(BD Bioscience，San Jose，CA)进行流式细胞术。在每个样品中对约10,000个细胞事件进行计数。

[0139] 如图7A、7B、7C、7D、7E和7F所示，可以确认，NTR在胰腺癌细胞系(PANC-1和MIA PaCa-2)中分别以约72％和67％的非常高的水平表达，在另一种胰腺癌细胞系例如AsPC-1中以约15％的低水平表达。可以确认，NTR在肺癌细胞系A549中以约41％表达，并且在正常胰腺细胞(NPC)中几乎不表达。因此，由该实验结果，根据NTR表达程度将细胞系分为三种类型(高表达-高、中等表达-中等、低表达和阴性-阴性)，然后进行以下的实验。

[0140] 7-2.U343、BXPC3、MCF7、WRL-68和HDF细胞中的NTR表达

[0141] 此外，为了确认多种癌细胞(U343、BXPC3和MCF7)和正常细胞(HDF和WRL-68)中神经降压肽受体1(NTR1)的表达程度，进行FACS分析。将3×105个每种类型的细胞用NTR1特异性抗体(Abcam)在4℃下处理1小时，用PBS(1％FBS)洗涤两次，并用二抗(PE-标记的山羊抗小鼠IgG；Santa Cruz)在4℃下洗涤40分钟。洗涤两次后，用固定剂(1％多聚甲醛)处理细胞，对每个细胞系进行FACS分析以确认NTR1是否表达。作为阴性对照，使用仅用二抗处理的细胞系。

[0142] 如图7G所示，可以确认，在多种癌细胞系中的脑肿瘤细胞系U343中，最大数量的细胞，即90％或更多的细胞表达NTR1，并且在胰腺癌细胞系BXPC3中，约19％的细胞表达NTR1。此外，可以确认，即使在乳腺癌细胞系MCF7中，约15％的细胞表达NTR1。已经证实，在正常细胞例如HDF和WRL-68中，约18％和30％的细胞分别表达NTR1。

[0143] 8.NTR依赖性(特异性)细胞内引入效率的确认

[0144] 8-1.Ad-PEG-NT复合物的NTR特异性基因递送效率的确认

[0145] 为了确认Ad-PEG-NT复合物的NTR特异性基因递送效率，使表达GFP的Ad与PEG和PEG-NT结合，并且用于分别以100MOI和500MOI处理根据NTR表达分为三种类型的多种癌细胞系和正常胰腺细胞系，然后在48小时之后比较GFP表达的程度。

[0146] 具体地，在递送之前，将每种细胞系以5×104个细胞/孔的密度接种在24孔板中经24小时。之后，将dE1/GFP∶DTSSP和dE1/GFP∶PEG或PEG-NT的浓度比固定为1∶1×105。用裸dE1/GFP、dE1/GFP-PEG或dE1/GFP-PEG-NT以100MOI(相对于PANC-1、MIAPaCa-2、A549和AsPC-1细胞)或500MOI(相对于NPC)处理细胞用于转化。经病毒处理的细胞在含有5％FBS的新鲜培养基中培养。在37℃下转化24小时后，使用荧光显微镜(Olympus Optical)观察细胞。

[0147] 如图8A所示，可以确认，当一般地处理与PEG缀合的Ad-PEG时，细胞内引入效率显著降低，但由于靶向基团的结合，GFP表达效率是NTR依赖性地增加的。可以确认，NTR高表达细胞系例如PANC-1和MIA PaCa-2表现出由靶向基团引起的最高靶向性，并且与经Ad-PEG处理的组相比，NTR低表达细胞系和NTR阴性细胞系的靶向性几乎没有差异。因此，可以确认，在该实验中制造的Ad-PEG-NT复合物对NTR具有靶向性，并且具有比仅PEG化的Ad更高的细胞内摄取效率。

[0148] 8-2.根据NT1和NT2的NTR依赖性细胞内引入效率的确认

[0149] 为了比较Ad-PEG-NT的神经降压肽受体特异性基因递送效率和根据多种癌细胞系中神经降压肽的类型(NT1或NT2)的递送效率，用表达GFP的复制缺陷型Ad(dE1/GFP)、PEG化的Ad(dE1/GFP-PEG)以及dE1/GFP-PEG-NT1和dE1/GFP-PEG-NT2纳米复合物处理多种类型的癌细胞系。将每种癌细胞系(PANC-1、MIA PaCa-2、U343、MCF7、HT-29、HT1080或A549)的8×104个细胞接种在24孔板中，并且在24小时之后，以适合于每种细胞系的浓度进行病毒处理(对于PANC-1和MIA PaCa-2为30MOI；对于U343为20MOI；对于MCF7为100MOI；对于HT-29、HT1080和A549为50MOI)。处理后48小时，使用荧光显微镜比较分析GFP表达程度。

[0150] 如图8B所示，与野生型Ad中的GFP表达相比，可以确认，由于Ad表面的掩蔽，用PEG化的Ad复合物处理的癌细胞系中的荧光表达程度通过抑制非特异性细胞内感染而非常显著地降低。然而，当用Ad-PEG-NT纳米复合物处理癌细胞时，与Ad-PEG的处理相比，可以观察到在所有癌细胞中GFP荧光表达程度增加。此外，作为确认根据NT1或NT2类型的基因递送效率的差异的结果，在胰腺癌细胞系(PANC-1和MIA PaCa-2)和脑肿瘤细胞系(U343)中，可以确认，NT1比NT2具有略高的GFP表达。因此，根据该研究，可以确认，由于Ad的PEG化引起的Ad介导的基因递送效率降低可以通过神经降压肽受体靶向来恢复。

[0151] 8-3.竞争测定

[0152] 此外，为了证实提高的Ad-PEG-NT复合物的细胞内引入效率是否不论CAR如何均由与NTR直接结合引起，进行了竞争测定。

[0153] 具体地，将MIAPACA-2细胞以每孔1×105个细胞接种在24孔板中。在第二天，在用裸dE1/GFP或dE1/GFP-PEG-NT转化之前，添加包含在无血清DMEM中的Ad knob蛋白(0.2μg/mL或1μg/mL)和神经降压肽(2μg/mL或10μg/mL)以封闭存在于细胞表面上的每种受体，并将细胞在4℃下孵育1小时。在37℃下用100MOI的Ad或Ad-PEG-NT复合物处理NTR高表达细胞系MIA PaCa-2 48小时，然后使用荧光显微镜(Olympus Optical)观察。通过流式细胞术量化GFP表达并使用Cell Quest软件(BD Bioscience)进行分析。

[0154] 如图9所示，作为对野生型Ad的受体(即CAR)具有特异性的knob蛋白处理的结果，野生型Ad的细胞内引入效率以浓度依赖性方式显著降低(0.2μg/mL-76％，1μg/mL-92％)，而可以确认，当处理Ad-PEG-NT复合物时，细胞内引入效率几乎不降低。同样地，作为NTR特异性神经降压肽(NT)处理的结果，野生型Ad的GFP表达程度几乎不降低，而作为Ad-PEG-NT处理的结果，可以确认，GFP表达程度以NT浓度依赖性方式(2μg/mL-60％，10μg/mL-89％)降低。因此，由结果可以确认，Ad-PEG-NT复合物通过细胞的神经降压肽和神经降压肽受体(NTR)之间的直接结合被引入细胞中。

[0155] 9.oAd-PEG-NT复合物的NTR特异性癌细胞杀伤能力和病毒产生能力的验证[0156] 9-1.癌细胞杀伤能力的确认

[0157] 在使用具有复制能力的Ad(oAd/DCN/LRP)制造oAd-PEG-NT复合物之后，为了确认NTR特异性癌细胞杀伤能力，用处于不同MOI的裸oAd/DCN/LRP、oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT纳米复合物感染在24孔板中生长至70％汇合的PANC-1(高NTR表达)、MIA PaCa-2(中等NTR表达)、A549(低NTR表达)和正常NPC(阴性)，随后进行MTT分析。具体地，感染后2天，将200μl MTT溶液(PBS中的2mg/ml3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物；Sigma-Aldrich)添加到各孔中，并将细胞在37℃下孵育4小时。之后，除去上清液，将沉淀物溶解在1.0mL二甲基亚砜中。使用微板读数仪在540nm处检测板。通过与上述相同的方法作为阴性对照来分析经PBS处理的细胞组的细胞生存力。

[0158] 如图10A、10B、10C、10D和10E所示，野生型Ad在所有癌细胞系中均表现出与病毒浓度成比例的有效的癌细胞杀伤能力(PANC-1 200 MOI：53％MIA PaCa-2 100MOI：87％，A549 10MOI：66％，AsPC-1 20 MOI：59％)。作为PEG化的结果，观察到，非特异性细胞内感染通过封闭Ad表面而受到抑制，因此癌细胞杀伤能力大大降低(PANC-1200MOI：24％MIA PaCa-2
100MOI：28％，A549 10MOI：9％，AsPC-1 20MOI：11％)。然而，作为与神经降压肽受体的目标组(NT)结合在一起的结果，可以确认，通过PEG结合降低的癌细胞杀伤能力得以恢复。具体地，可以确认，在具有低或阴性NTR表达的细胞系中没有差异，但随着NTR表达程度的增加，癌细胞杀伤能力也恢复(PANC-1 200MOI：62％，MIA PaCa-2 100MOI：74％，A549 10MOI：
42％)。

[0159] 9-2.病毒产生的分析

[0160] 此外，处理具有复制能力的Ad后36小时，进行实时Q-PCR以定量分析在每个细胞系中产生的病毒的量。

[0161] 将癌细胞(PANC-1、MIA PaCa-2、A549和AsPC-1)或正常胰腺细胞(NPC)接种在12孔板中并生长至约60％至70％汇合。感染前24小时，将各孔中的培养基用新鲜的无血清DMEM更换，然后用裸oAd/DCN/LRP、oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT处理细胞(PANC-1：100 MOI，MIA PaCa-2：100MOI，A549：10MOI，AsPC-1：20MOI，和NPC：100MOI)。感染后36小时，全部收集上清液和细胞，并使混合物经历三次冷冻和解冻循环。通过实时定量PCR(TaqMan PCR detection；Applied Biosystems，Foster City，CA)测量Ad基因组的拷贝数[43]。使每个样品在ABI 7500序列检测系统(Applied Biosystems)中扩增40个循环，连同连续荧光监测一起。分析所有的样品三次，并使用SDS 19.1 软件包(Applied Biosystems)处理数据。

[0162] 如图11A、11B、11C、11D和11E所示，根据用oAd-PEG-NT处理的具有高NTR表达的细胞系(PANC-1和MIAPaCa-2)与用oAd-PEG复合物处理的细胞系之间产生的病毒数量进行比较的结果，可以确认，病毒产生能力分别提高了550倍和842倍。在具有中等NTR表达的细胞系(即A549)中，当处理oAd/DCN/LRP-PEG-NT时，可以确认，与oAd/DCN/LRP-PEG相比，病毒产生能力提高了9倍。然而，在具有低或几乎没有NTR表达的细胞系中，可以确认，病毒产生能力几乎没有差异。因此，作为本研究的结果，可以确认，本发明的病毒复合物具有优异的细胞内基因递送效率和癌细胞杀伤能力，这对于具有高NTR表达的癌细胞系是特异的，并且具有优异的病毒产生能力，因此可以确认，该复合物更适用于治疗癌症。

[0163] 10.确认免疫应答是否由oAd-PEG-NT复合物诱导

[0164] 10-1白细胞介素-6(IL-6)和中和抗体的分析

[0165] 当全身施用Ad时，由于在身体内发生免疫应答，因此Ad迅速失活并在身体内消失。由于病毒表面被封闭，因此本研究中使用的PEG化的Ad可大大减少免疫应答的诱导。因此，确认当全身施用Ad-PEG-NT复合物时在身体内诱导的针对野生型Ad的固有或适应性免疫应答是否降低。

[0166] 首先，为了确认每种类型的Ad对急性固有应答的影响，测量从以1×1010VP/小鼠静脉内注射有裸oAd/DCN/LRP、oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT的小鼠(n＝3)获得的血清IL-6。注射后6小时收集血清样品，通过酶联免疫吸附测定(ELISA；R&D Systems，Minneapolis，MN)定量分析血清中产生的促炎性细胞因子IL-6水平。

[0167] 如图12A所示，作为PBS(对照)处理的结果，产生了48.5pg/mL的IL-6，而作为非PEG化的Ad(oAd/DCN/LRP)处理的结果，测量IL-6水平为143.2pg/mL，这与PBS处理结果相比增加了三倍。然而，当处理PEG化的oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT时，可以确认，以非常类似于PBS的水平产生IL-6(分别为53.6pg/mL或57.8pg/mL)。因此，由于本发明的PEG化的结构，由病毒诱导免疫应答可大为降低。

[0168] 此外，为了确认是否避免针对Ad的适应性免疫应答，检测中和抗体的产生。在将1×1010VP的裸oAd/DCN/LRP、oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT静脉内注射到雄性BALB/c小鼠(Charles River Korea Inc.，Seoul，Korea)中之后14天，进行裸oAd/DCN/LRP、oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT的另一次注射以产生中和抗体。第二次注射后14天，从小鼠的眶后丛收集全血。之后，处理小鼠血清以在56℃下灭活补体45分钟，然后在-20℃下储存。对于中和保护测定，用与dE1/GFP混合的无血清DMEM处理从用裸oAd/DCN/LRP、oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT处理的小鼠获得的每批次的热失活血清以准备1∶50稀释度，并在37℃下孵育20分钟以允许反应。随后，用经血清处理的dE1/GFP处理A549细胞。A549细胞在24孔板中以100MOI生长至80％汇合，并在37℃下孵育2小时。洗涤细胞，并与含有5％FBS的1mL无血清培养基一起孵育48小时，随后进行分析。

[0169] 随着由已注射到小鼠中的病毒产生的中和抗体的量的增加，由于抑制GFP病毒活性，因此防止了细胞内摄取，并且因此中和抗体产生的量可以从GFP表达程度估计。因此，使用荧光显微镜(Olympus Optical)测量递送，并且通过流式细胞术和Cell Quest软件(BD Bioscience)分析细胞。

[0170] 如图12B所示，通过与从经裸oAd/DCN/LRP处理的组获得的血清反应，与经PBS处理的组(对照)相比，GFP表达降低了82％。然而，通过与从经oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物处理的组获得的血清反应，可以确认，与对照组相比，GFP表达分别降低了约4％或13％。因此，通过实验可以确认，通过全身施用本发明的oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物可以有效地避免免疫应答。

[0171] 11.药代动力学谱的分析

[0172] 对于全身施用后的有效癌症治疗，注射的Ad需要更长时间保持在血液中而不消失并且被递送至靶癌症组织，并且出于该原因，进行实验以确认Ad-PEG-NT复合物是否比野生型Ad更长久地存在于血液中。

[0173] 以1×1010VP静脉内注射PBS(对照)、裸oAd(裸oAd/DCN/LRP)、oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT后5、10、20、30、60和360分钟，收集100μl来自BALB/c小鼠的眶后从的全血，通过实时定量PCR(Q-PCR)确认随着时间的推移存在于血液中的病毒(n＝3)的剩余量。从全血的等分试样中提取含有Ad DNA的总DNA，并重悬于蒸馏水/去离子水中，以使得最终体积为50μl。使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)根据制造商的方案进行总DNA的提取。通过实时定量PCR(TaqMan PCR检测；Applied Biosystems)测量Ad基因组的拷贝数[43]。如上所述扩增样品并分析三次。数据通过SDS 19.1软件包(Applied Biosystems)处理。

[0174] 如图13所示，可以确认，从注射裸oAd后5分钟，病毒在血液中迅速消失，只保留注射的病毒量的6.5％，并且注射后6小时，病毒几乎消失。然而，当注射PEG化的Ad(oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT)时，甚至注射后5分钟，可以确认，保留第一次注射量的94％的病毒(oAd/DCN/LRP-PEG)或99％的病毒(oAd/DCN/LRP-PEG-NT)。甚至注射后6小时，观察到在血液中保留比裸oAd多15倍(oAd/DCN/LRP-PEG)和11倍(oAd/DCN/LRP-PEG-NT)的病毒。因此，可以看出，本发明的病毒复合物在身体内保持更长时间并在癌症治疗中表现出治疗效果。

[0175] 12.oAd-PEG-NT复合物在胰腺原位模型中增强的抗肿瘤效果的确认

[0176] 作为oAd-PEG-NT复合物的全身施用的结果，首先，制造胰腺癌原位模型以确认对胰腺癌的抗肿瘤效果。在原位模型的情况下，很难目视观察到抗肿瘤效果，并且因此试图通过光学成像技术实时确认萤光素酶信号的变化。首先，制造通过巨细胞病毒启动子表达萤火虫萤光素酶的慢病毒以感染胰腺癌细胞系MIA PaCa-2，导致产生MIAPaCa-2/fluc，其是表达萤光素酶的稳定细胞系。

[0177] 将每个5周龄雄性裸鼠(n＝5；Charles River Korea Inc.)腹部左侧的皮肤和肌肉消毒并用无菌的微型剪刀穿孔以从腹腔中取出整个胰腺和脾，然后将5×106个/100μl的MIA PaCa-2/fluc细胞注射到胰腺中。14天后，用氧气中的2％异氟烷麻醉小鼠，并且为了光学成像，腹膜内注射D-萤光素(150mg/kg，Caliper，Hopkinton，MA)，并且注射后15分钟，使用生物发光成像(IVIS；Xenogen，Alameda，CA)鉴定肿瘤的产生。在从整个主体部分中除去总通量[光子/秒(p/s)]的背景之后，体内生物发光信号被计算为由俯卧位小鼠和仰卧位小鼠产生的信号的总和。将小鼠(约1×108p/s)随机分为4组，并且每隔一天施用200μL PBS、裸oAd/DCN/LRP(2×1010VP)、oAd/DCN/LRP-PEG(2×1010VP)或oAd/DCN/LRP-PEG-NT(2×1010VP)的静脉内注射三次。通过第一次施用后每五天进行一次的成像来确认肿瘤生长。注射后第46天，收集肿瘤，并测量肿瘤的长度和宽度，由此测量其体积。使用以下方程式测量肿瘤体积：

[0178] 体积＝0.523L(W)2。

[0179] 如图14A、14B和14C所示，从直至第25天的观察结果，可以确认，oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物显示出最低的萤光素酶信号强度，表明oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物表现出比PBS(对照)高5.6倍，比裸oAd/DCN/LRP高2.7倍，以及比oAd/DCN/LRP-PEG高2倍的治疗效果。此外，第一次病毒注射后46天，作为通过从小鼠中提取肿瘤来测量尺寸的结果，如同萤光素酶3
成像结果，可以确认，用oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物处理的肿瘤的尺寸为98±9.2mm ，这是与其他对照的尺寸(PBS：287±78.8mm3，oAd/DCN/LRP：221.3±26.9mm3，oAd/DCN/LRP-PEG：
182.7±18mm3)相比最小的值，表明优异的肿瘤治疗效果。

[0180] 13.oAd-PEG-NT复合物的体内分布的确认

[0181] 13-1.体内分布的确认

[0182] 为了检查根据野生型Ad对CAR的向性的对肿瘤的低靶向性，由此引起的非特异性摄取到肝中和肝毒性是否可以通过PEG化和存在NT靶向基团来克服，通过Q-PCR确认体内分布。

[0183] 具体地，将1×1010VP的野生型oAd/DCN/LRP、oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物静脉内注射到携带MIA PaCa-2肿瘤的小鼠中每天3次(n＝3)，并且单独注射PBS作为对照组(n＝3)。第三次注射每种复合物后24小时，收获小鼠的各器官(胃、心、脑、肾、肌肉、肺、脾、前列腺、胰腺和肝)和肿瘤，使用QIAamp DNABlood Mini试剂盒(Qiagen)提取DNA，并通过Q-PCR定量分析存在于肿瘤和器官组织中的病毒的量。

[0184] 如图15A所示，可以确认，与裸Ad相比，oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT复4 3
合物施用的组显示出在肝中的积累减小2.9×10或9.4×10倍，并且与裸Ad相比，oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物施用的组显示出在肿瘤中的积累增加1.5×102或
1.0×103倍。特别地，oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物显示出比oAd/DCN/LRP-PEG复合物高6.7倍的肿瘤靶向性。这样的结果表示，将复合物递送至肿瘤的效率(其由于PEG化的oAd的EPR作用而增强)高于裸oAd/DCN/LRP的效率，并且可以确认，由于通过NT的肿瘤特异性靶向，非特异性递送至肝减少，并且向肿瘤的递送效率提高，导致通过本发明的复合物进一步提高治疗基因的靶特异性。

[0185] 13-2.体内毒性的确认

[0186] 此外，为了确认肝毒性，静脉内注射1×1010VP的裸oAd/DCN/LRP、oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物，并且单独注射PBS作为对照组(n＝3)。注射后72小时，收获血液用于确认存在于血清中的天冬氨酸转氨酶(ALT)和丙氨酸转氨酶(AST)的表达程度。

[0187] 如图15B所示，可以确认，与PBS对照组相比，经裸oAd/DCN/LRP处理的组显示出肝毒性因子的表达增加37.3倍(ALT)和12.3倍(AST)。然而，可以确认，oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物施用的组显示出与PBS对照组相似水平的肝毒性因子的表达。因此，可以看出，本发明的复合物具有降低的对肝的非特异性递送率以显著降低肝毒性，并且因此复合物的安全性大大提高。

[0188] 如图15C和15D所示，证实了这样的结果与用于确认抗肿瘤效果的实验的结果一致，在所述实验中第一次病毒注射后35天，提取小鼠的肝，然后通过H&E染色从形态变化确认肝毒性。可以确认，在经裸oAd/DCN/LRP处理的组中，由于肝毒性，肝的尺寸显著减小，并且免疫细胞的摄取大大增加。然而，oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物施用的组在来自PBS对照组的肝的形态和组织学变化上几乎没有差异。

[0189] 此外，为了鉴定肝组织中Ad的存在，第一次病毒注射后35天，将提取的肝用10％福尔马林固定，进行石蜡包埋，并切成5μm切片。之后，将切片用Ad六邻体特异性抗体(Santa Cruz Biotechnology)免疫染色以观察组织学变化。

[0190] 如图15E所示，在所有组中未鉴定到在肝组织中存在Ad。

[0191] 14.通过组织学和免疫组织化学分析确认oAd-PEG-NT复合物的抗肿瘤效果[0192] 14-1.通过H&E、PCNA、E1A或TUNEL染色确认抗肿瘤效果

[0193] 为了确认Ad的复制和增殖及其治疗效果，进行组织学染色(H&E或M&T)、免疫组织化学染色(PCNA或E1A)或TUNEL测定。

[0194] 为了分析，收集肝和脾。最后一次注射后46天，将肝和脾用10％福尔马林固定，进行石蜡包埋，并切成5μm切片。每个切片通过苏木精和伊红(H&E)染色。

[0195] 静脉内注射PBS、裸oAd/DCN/LRP(2×1010VP)、oAd/DCN/LRP-PEG(2×1010VP)或oAd/DCN/LRP-PEG-NT(2×1010VP)三次后72小时，从小鼠收获MIA PaCa-2肿瘤组织。将肿瘤组织用10％福尔马林固定，进行石蜡包埋，并切成5μm切片。将肿瘤组织用H&E(细胞质和细胞核)和Masson三色/苦味酸天狼猩红染色，并使用显微镜观察。

[0196] 肿瘤切片用增殖细胞核抗原(PCNA)特异性抗体(Dako，Glostrup，Denmark)免疫染色，并确认对肿瘤细胞增殖的影响。根据制造商的方案(Merck，Darmstadt，德国)进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)分析。肿瘤切片也用Ad E1A-特异性抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)免疫染色，并用于确认病毒增殖。此外，肿瘤切片分别用Wnt特异性抗体(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)、β-联蛋白特异性抗体(Cell Signaling Technology)和波形蛋白特异性抗体(Cell Signaling Technology)染色，并进行分析以确认Ad复合物在肿瘤中的治疗效果。

[0197] 如图16所示，首先根据H&E染色，可以确认，在PBS和裸oAd/DCN/LRP处理的组中，在大多数组织中观察到癌细胞，但在oAd/DCN/LRP-PEG和oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物处理的组中，大部分癌细胞被杀伤，并且高度表现出肿瘤组织中的坏死。此外，作为肿瘤组织中的PCNA染色以验证抑制肿瘤组织的细胞增殖和由病毒引起的增殖的程度的结果，可以确认，在经oAd-PEG-NT复合物处理的组中PCNA表达显著降低。随后，作为进行以确认Ad在肿瘤中复制的E1A染色的结果，在经野生型oAd处理的组中未证实病毒复制，但在经oAd/DCN/LRP-PEG和oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物处理的组中证实了E1A表达。特别可以确认，在经oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物处理的组中最高度地表现出E1A表达，这对应于抗肿瘤效果。此外，为了验证由肿瘤组织中的病毒复制引起的癌细胞杀伤能力，由TUNEL测定的结果，可以确认，对应于抗肿瘤效果，oAd/DCN/LRP-PEG或oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物比经裸oAd/DCN/LRP处理组具有更高的癌细胞杀伤能力。特别地，在经oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物处理的组中，证实了根据病毒复制的最高癌细胞杀伤能力。

[0198] 14-2.通过M&T和苦味酸天狼猩红染色确认肿瘤组织中胶原蛋白分布的变化[0199] 人胰腺癌是一种难治的癌症，其中由于异常过表达的ECM，治疗剂的渗透和扩散很困难，并且如图17所示，根据M&T染色，可以确认，胶原蛋白在人胰腺癌组织中过表达并分布(图17)。同样地，为了通过减少在癌组织中过表达的ECM来使治疗剂的作用最大化，在该研究中，使用了已知显著降低ECM表达的表达饰胶蛋白聚糖基因(DCN)的Ad。对于根据病毒复制和增殖的DCN表达的结果，进行了两种类型的胶原蛋白染色方法(M&T和苦味酸天狼猩红)以证实ECM表达是否在肿瘤中减少。

[0200] 如图18所示，可以确认，在制备成表达饰胶蛋白聚糖基因的本发明的病毒复合物的情况下，由于在肿瘤中的强烈复制和增殖，表现出胶原蛋白表达的显著降低。

[0201] 15.通过Wnt、β-联蛋白和波形蛋白染色确认Wnt3a/β-联蛋白信号传导的减少[0202] 作为在该研究中使用的具有复制能力的病毒，使用表达能够抑制参与癌症增殖和转移的Wnt3a/β-联蛋白信号传导的sLRP6E1E2的病毒。因此，为了确认由病毒复制和增殖产生的强烈的抗肿瘤效果是否是通过抑制肿瘤中的Wnt3a/β-联蛋白信号传导而获得的结果，如14-1中所述进行Wnt、β-联蛋白和波形蛋白染色，然后观察。

[0203] 如图19和20所示，可以确认，对应于抗肿瘤效果，在经oAd-PEG-NT复合物处理的组中，Wnt、β-联蛋白和波形蛋白表达显著降低。因此，从该研究的结果可以看出，经oAd/DCN/LRP-PEG-NT复合物处理的组中的优异的抗肿瘤效果是由避免由PEG化引起的免疫应答、根据血液中剩余量的增加的递送效率的提高、由NT引起的胰腺癌靶向性增强、以及根据所使用的oAd的复制和增殖表达治疗基因引起的。

[0204] [参考文献]

[0205] [1]D.Yadav，A.B.Lowenfels，The epidemiology of pancreatitis and pancreatic cancer，Gastroenterology，144(2013)1252-1261.

[0206] [2]A.Jemal，R.Siegel，E.Ward，Y.Hao，J.Xu，M.J.Thun，Cancer statistics，2009，CA Cancer J Clin，59(2009)225-249.

[0207] [3]D.Laheru，B.Biedrzycki，E.M.Jaffee，Development of a cytokine-modified allogeneic whole cell pancreatic cancer vaccine，Methods Mol Biol，980(2013)175-203.

[0208] [4]J.P.Neoptolemos，D.D.Stocken，H.Friess，C.Bassi，J.A.Dunn，H.Hickey，H.Beger，L.Fernandez-Cruz，C.Dervenis，F.Lacaine，M.Falconi，P.Pederzoli，A.Pap，D.Spooner，D.J.Kerr，M.W.Buchler，C.European Study Group for Pancreatic，A randomized trial of chemoradiotherapy and chemotherapy after resection of pancreatic cancer，The New Englandjournal of medicine，350(2004)1200-1210.[0209] [5]D.G.Haller，Future directions in the treatment of pancreatic cancer，Seminars in oncology，29(2002)31-39.

[0210] [6]D.P.Ryan，C.G.Willett，Management oflocally advanced adenocarcinoma of the pancreas，Hematol Oncol Clin North Am，16(2002)95-103.

[0211] [7]H.L.Kaufman，J.Di Vito，Jr.，H.Horig，Immunotherapy for pancreatic cancer：current concepts，Hematol Oncol Clin North Am，16(2002)159-197，viii.[0212] [8]P.Phillips，Pancreatic stellate cells and fibrosis，in：P.J.Grippo，H.G.Munshi(Eds.)Pancreatic Cancer and Tumor Microenvironment，Trivandrum(India)，2012.

[0213] [9]Y.Shintani，M.A.Hollingsworth，M.J.Wheelock，K.R.Johnson，Collagen I promotes metastasis in pancreatic cancer by activating c-Jun NH(2)-terminal kinase l and up-regulating N-cadherin expression，Cancer research，66(2006)11745-11753.

[0214] [10]M.Erkan，J.Kleeff，A.Gorbachevski，C.Reiser，T.Mitkus，I.Esposito，T.Giese，M.W.Buchler，N.A.Giese，H.Friess，Periostin creates a tumor-supportive microenvironment in the pancreas by sustaining fibrogenic stellate cell activity，Gastroenterology，132(2007)1447-1464.

[0215] [11]F.Kreppel，S.Kochanek，Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers：a scientificreview and technical gnide，Mol Ther，16(2008)16-29.

[0216] [12]I.K.Choi，Y.S.Lee，J.Y.Yoo，A.R.Yoon，H.Kim，D.S.Kim，D.G.Seidler，J.H.Kim，C.O.Yun，Effect of decorin on overcoming the extracellular matrix barrier for oncolytic virotherapy，Gene therapy，17(2010)190-201.

[0217] [13]P.H.Kim，J.H.Sohn，J.W.Choi，Y.Jung，S.W.Kim，S.Haam，C.O.Yun，Active targeting and safety profile of PEG-modified adenovirus conjugated with herceptin，Biomaterials，32(2011)2314-2326.

[0218] [14]M.D.Wheeler，S.Yamashina，M.Froh，I.Rusyn，R.G.Thurman，Adenoviral gene delivery can inactivate Kupffer cells：role of oxidants in NF-κB activation and cytokine production，Journal of Leukocyte Biology，69(2001)622-630.[0219] [15]A.H.Baker，S.A.Nicklin，D.M.Shayakhmetov，FX and Host Defense Evasion Tactics by Adenovirus，Mol Ther，21(2013)1109-1111.

[0220] [16]T.Nakamura，K.Sato，H.Hamada，Reduction of Natural Adenovirus Tropism to the Liver by both Ablation of Fiber-Coxsackievirus and Adenovirus Receptor Interaction and Use of Replaceable Short Fiber，J Virol，77(2003)2512-2521.[0221] [17]J.Kim，Y.Li，S.W.Kim，D.S.Lee，C.-O.Yun，Therapeutic efficacy of a systemically delivered oncolytic adenovirus-Biodegradable polymer complex，Biomaterials，34(2013)4622-4631.

[0222] [18]C.O.Yun，Current advances in adenovirus nanocomplexes：more specificity and less immunogenicity，BMB Rep，43(2010)781-788.

[0223] [19]J.W.Choi，J.S.Lee，S.W.Kim，C.O.Yun，Evolution of oncolytic adenovirus for cancer treatment，Adv Drug Deliv Rev，64(2012)720-729.[0224] [20]P.H.Kim，J.Kim，T.I.Kim，H.Y.Nam，J.W.Yockman，M.Kim，S.W.Kim，C.O.Yuun，Bioreducible polymer-conjugated oncolytic adenovirus for hepatoma-specific therapy via systemic administration，Biomaterials，32(2011)9328-9342.[0225] [21]D.Kasala，J.W.Choi，S.W.Kim，C.O.Yun，Utilizing adenovirus vectors for gene delivery in cancer，Expert Opin Drug Deliv，11(2014)379-392.[0226] [22]C.Delgado，G.E.Francis，D.Fisher，The uses and properties of PEG-linked proteins，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，9(1992)249-304.

[0227] [23]H.Mok，D.J.Palmer，P.Ng，M.A.Barry，Evaluation of polyethylene glycol modification of first-generation and helper-dependent adenoviral vectors to reduce innate immune responses，Mol Ther，11(2005)66-79.

[0228] [24]R.Alemany，K.Suzuki，D.T.Curiel，Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice，J Gen Virol，81(2000)2605-2609，

[0229] [25]K.Doronin，E.V.Shashkova，S.M.May，S.E.Hofherr，M.A.Barry，Chemical modification with high molecular weight polyethylene glycol reduces transduction of hepatocytes and increases efficacy of intravenously delivered oncolytic adenovirus，Human gene therapy，20(2009)975-988.

[0230] [26]C.R.O′Riordan，A.Lachapelle，C.Delgado，V.Parkes，S.C.Wadsworth，A.E.Smith，G.E.Francis，PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo，Human gene therapy，10(1999)1349-1358.

[0231] [27]J.Lanciotti，A.Song，J.Doukas，B.Sosnowski，G.Pierce，R.Gregory，S.Wadsworth，C.O′Riordan，Targeting adenoviral vectors using heterofunctional polyethylene glycol FGF2 conjugates，MolTher，8(2003) 99-107.

[0232] [28]Y.Eto，J.Q.Gao，F.Sekiguchi，S.Kurachi，K.Katayama，H.Mizuguchi，T.Hayakawa，Y.Tsutsumi，T.Mayumi，S.Nakagawa，Neutralizing antibody evasion ability of adenovirus vector induced by the bioconjugation of methoxypolyethylene glycol succinimidyl propionate(MPEG-SPA)，Biol Pharm Bull，27(2004)936-938.

[0233] [29]K.Ogawara，M.G.Rots，R.J.Kok，H.E.Moorlag，A.M.Van Loenen，D.K.Meijer，H.J.Haisma，G.Molema，A novel strategy to modify adenovirus tropism and enhance transgene delivery to activated vascular endothelial cells in vitro and in vivo，Human gene therapy，15(2004)433-443.

[0234] [30]Y.Eto，J.Q.Gao，F.Sekiguchi，S.Kurachi，K.Katayama，M.Maeda，K.Kawasaki，H.Mizuguchi，T.Hayakawa，Y.Tsutsumi，T.Mayumi，S.Nakagawa，PEGylated adenovirus vectors containing RGD peptides on the tip of PEG show high transduction efficiency and antibody evasion ability，J Gene Med，7(2005)604-612.

[0235] [31]J.M.Kuldo，S.A.Asgeirsdottir，P.J.Zwiers，A.R.Bellu，M.G.Rots，J.A.Schalk，K.I.Ogawara，C.Trautwein，B.Banas，H.J.Haisma，G.Molema，J.A.Kamps，Targeted adenovirus mediated inhibition of NF-kappaB-dependent inflammatory gene expression in endothelial cells in vitro and in vivo，Journal of controlled release：official journal of the Controlled Release Society，166(2013)57-65.

[0236] [32]J.G.Wang，N.N.Li，H.N.Li，L.Cui，P.Wang，Pancreatic cancer bears overexpression of neurotensin and neurotensin receptor subtype-1 and SR 48692 counteracts neurotensin induced cell proliferation in human pancreatic ductal carcinoma cell line PANC-1，Neuropeptides，45(2011)151-156.

[0237] [33]J.C.Reubi，B.Waser，H.Friess，M.Buchler，J.Laissue，Neurotensin receptors：a new marker for human ductal pancreatic adenocarcinoma，Gut，42(1998)546-550.

[0238] [34]S.Dupouy，N.Mourra，V.K.Doan，A.Gompel，M.Alifano，P.Forgez，The potential use of the neurotensin high affinity receptor 1as a biomarker for cancer progression and as a component of personalized medicine in selective cancers，Biochimie，93(2011)1369-1378.

[0239] [35]S.Shimizu，J.Tsukada，T.Sugimoto，N.Kikkawa，K.Sasaki，H.Chazono，T.Hanazawa，Y.Okamoto，N.Seki，Identification of a novcl therapeutic target for head and neck squamous cell carcinomas：a role for the neurotensin-neurotensin receptor 1 oneogenic signaling pathway，Intemational journal of cancer.Journal international du cancer，123(2008)1816-1823.

[0240] [36]J.S.Lee，M.W.Hur，S.K.Lee，W.I.Choi，Y.G.Kwon，C.O.Yun，A novel sLRP6E1E2 inhibits canonical Wnt signaling，epithelial-to-mesenchymal transition，and induces mitochondria-dependent apoptosis in lung cancer，PloS one，7(2012)e36520.

[0241] [37]P.Astudillo，J.Larrain，Wnt signaling and cell-matrix adhesion，Current molecular medicine，14(2014)209-220.

[0242] [38]J.Cui，W.Jiang，S.Wang，L.Wang，K.Xie，Role of Wnt/beta-catenin signaling in drug resistance of pancreatic cancer，Current pharmaceutical design，18(2012)2464-2471.

[0243] [39]K.J.Kim E，Shin HY，Lee H，Yang JM，Kin J，Sohn JH，Kim H，Yun co，AdmTERTD19，a Conditional Replication Competent Adenovirus Driven bythe Human Telomerase Promoter，Selectively Replicates in and Elicits Cytopathic Effect in a Cancer Cell-Specific Manner，(2003).

[0244] [40]O.J.Kwon，P.H.Kim，S.Huyn，L.Wu，M.Kim，C.O.Yun，A hypoxia-and {alpha}-fetoprotein-dependent oncolytic adenovirus exhibits specific killing of hepatocellular carcinomas，Clin Cancer Res，16(2010)6071-6082.

[0245] [41]Immunological data from cancer patients treated with Ad5 3-E2F-Δ24-GMCSF suggests utility for tumor immunotherapy，(2014).

[0246] [42]M.L.Read，T.Etrych，K.Ulbrich，L.W.Seymour，Characterisation of the binding interaction between poly(L-lysine)and DNA using the fluorescamine assay in the preparation of non-viral gene delivery vectors，FEBS letters，461(1999)96-100.

[0247] [43]J.Kim，P.H.Kim，H.Y.Nam，J.S.Lee，C.O.Yun，S.W.Kim，Linearized oncolytic adenoviral plasmid DNA delivered by bioreducible polymers，Journal of controlled release：official journal of the Controlled Release Society，158(2012)451-460.

[0248] [44]Y.Jung，H.J.Park，P.H.Kim，J.Lee，W.Hyung，J.Yang，H.Ko，J.H.Sohn，J.H.Kim，Y.M.Huh，C.O.Yun，S.Haam，Retargeting of adenoviral gene delivery via Herceptin-PEG-adenovirus conjugates to breast cancer cells，Journal of controlled release：officialjouurnal of the Controlled Release Society，123(2007)164-171.

[0249] [45]M，Pasca di Magliano，A.V.Biankin，P.W.Heiser，D.A.Cano，P.J.Gutierrez，T.Deramaudt，D.Segara，A.C.Dawson，J.G.Kench，S.M.Henshall，R.L.Sutherland，A.Dlugosz，A.K.Rustgi，M.Hebrok，Common activation of canonical Wnt signaling in pancreatic adenocarcinoma，PloS one，2(2007)e1155.

[0250] [46]R.Alemany，D.T.Curiel，CAR-binding ablation does not change biodistribution and toxicity of adenoviral vectors，Gene thcrapy，8(2001)1347-1353.

[0251] [47]W.E.Naugler，M.Karin，The wolf in sheep′s clothing：the role of interleukin-6 in immunity，inflammationand cancer，Trends MolMed，14(2008)109-119.[0252] [48]O.J.Kwon，E.Kang，J.W.Choi，S.W.Kim，C.O.Yun，Therapeutic targeting of chitosan-PEG-folate-complexed oncolytic adenovirus for active and systemic cancer gene therapy，Journal of controlled release：official journal of the Controlled Release Society，169(2013)257-265.

[0253] [49]X.F.Fei，Q.B.Zhang，J.Dong，Y.Diao，Z.M.Wang，R.J.Li，Z.C.Wu，A.D.Wang，Q.Lan，S.M.Zhang，Q.Huang，Development of clinically rclevant orthotopic xenograft mouse model of mctastatic lung cancer and glioblastomathrough surgical tumor tissues injection with trocar，J Exp Clin Cancer Res，29(2010)84.

[0254] [50]I.Dmitriev，V.Krasnykh，C.R.Miller，M.Wang，E.Kashentseva，G.Mikheeva，N.Belousova，D.T.Curiel，An adenovirus vector with genetically modified fibers demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus receptor-independent call entry mechanism，Journal of virology，72(1998)9706-9713.

[0255] [51]C.R.Miller，D.J.Buchsbaum，P.N.Reynolds，J.T.Douglas，G.Y.Gillespie，M.S.Mayo，D.Raben，D.T.Curiel，Differential susceptibility of primary and established human glioma cells to adenoviruus infection：targeting via the epidermal growth factor receptor achieves fiber receptor-independent gene transfer，Cancer research，58(1998)5738-5748.

[0256] [52]R.S.Everett，B.L.Hodges，E.Y.Ding，F.Xu，D.Serra，A.Amalfitano，Liver toxicities typically induced by first-generation adenoviral vectors can be reduced by use of E1，E2b-deleted adenoviral vectors，Human gene therapy，14(2003)1715-1726.

[0257] [53]M.Johnson，S.Huyn，J.Burton，M.Sato，L.Wu，Differentialbiodistribution of adenoviral vector in vivo as monitored by bioluminescence imaging and quantitative polymerase chain reaction，Human gene therapy，17(2006)1262-1269.[0258] [54]J.N.Lozier，M.E.Metzger，R.E.Donahue，R.A.Morgan，Adenovirus-Mediated Expression of Human Coagulation Factor IX inthe Rhesus Macaque Is Associated With Dose-Limiting Toxicity，Blood，94(1999)3968-3975.

[0259] [55]D.A.Muruve，M.J.Barnes，I.E.Stillman，T.A.Libermann，Adenoviral gene therapy leads to rapid induction of multiple chemokines and acute neutrophil-dependent hepatic injury in vivo，Human gene therapy，10(1999)965-976.[0260] [56]C.O.Yun，Overcoming the extracellular matrix barrier to improve intratumoral spread andtherapeutic potential of oncolytic virotherapy，Curr Opin Mol Ther，10(2008)356-361.

[0261] [57]I.K.Choi，R.Strauss，M.Richter，C.O.Yun，A.Lieber，Strategies to increase drug penetration in solid tumors，Frontiers in oncology，3(2013)193.

标题	发布/更新时间	阅读量
用于在体基因治疗的基因编辑组合物或试剂盒	2020-05-13	6
早老综合征所致ALT肿瘤的特有p53突变蛋白-p53N236S及其应用	2022-02-02	3
治疗血友病的治疗产品以及利用其治疗血友病的方法	2021-02-04	6
LINC00702及其在调控心血管系统中的应用	2021-08-09	3
抑制ALCAM基因表达的siRNA序列及其应用	2022-12-27	3
一种构建独特调节方式下特异性杀灭HIV感染细胞的新型重组HIV载体的方法	2022-05-19	4
基于108个基因的胃癌腹膜转移预测模型及其应用	2021-11-02	5
结合EPHB4、抑制血管发生和肿瘤生长的抗体	2020-07-23	2
CFHR1基因型、高密度脂蛋白上CFHR1及氧化磷酸胆碱的测定试剂盒及测定方法	2021-12-13	2
一种食管癌相关基因	2020-09-14	3

用于基因转移和基因治疗的腺病毒复合物

用于基因转移和基因治疗的腺病毒复合物

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：