【技术领域】：

本发明属于生物医药技术与恶性肿瘤的基因治疗技术领域。

【背景技术】：

恶性肿瘤本质上是一种多基因异常疾病，由于多数原癌基因和抑癌基因属于信号转 导通路中的重要组分，通过激活一种或多种原癌基因的表达及抑癌基因的突变缺失从而使肿瘤细 胞逃避了正常生长调控机制，自主进行增殖和侵袭、出现恶性表型。近乎所有的肿瘤的发病机理 均涉及了原癌基因的过表达和抑癌基因的突变等多环节、多通路的异常(Mischel PS，et al.Brain Pathol，2003；13：52-61)。目前，有关胶质瘤的分子病理学机制与恶性进展的研究中，以表皮生长因 子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)为代表的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase， RTK)信号转导通路在胶质瘤的恶性进展过程中起着关键作用，已日益受到关注。EGFR由3个 主要区域组成：一个N端细胞外区域，一个疏水的跨膜区和一个C端细胞内区域：细胞结构域内 包括酪氨酸激酶结构域和ATP结合位点；细胞外结构是多种多肽生长因子的配体结合点；其最重 要的配体是表皮生长因子(EGF)和转移生长因子α(TGFα)(Sasaki AT，et al.J Cell Biol，2004，167：505-518.)。分子遗传学研究表明：EGFR的突变、扩增与过表达是恶性胶质瘤、尤 其是原发性胶质母细胞瘤早期和主要分子事件；细胞外配体结合区与EGF和TGFα结合形成同源 或异源二聚体，可以导致细胞内酪氨酸激酶被激活；或当EGFR胞外区缺失突变、不需与配体结 合而持续激活，则胞内区酪氨酸残基自磷酸化转为活性形式导致激酶级联反应。该通路主要通过 下游的磷酸磷脂酰肌醇-3羟基激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)通路和Ras通路在胶质 瘤的发生、发展过程中发挥作用。

近年的研究发现，一些小的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)可以高效、特异地促使体 内特定基因mRNA降解，诱使细胞出现特定基因缺失的表型，这种技术即RNA干扰(RNA interference，RNAi)。在RNAi作用的起始阶段中外源性或内源性的双链RNA被Dicer酶切割为 19～21bp的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)；随后siRNA与核酶复合 物结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)；RISC激活后通 过碱基配对定位到同源mRNA转录本上并切割mRNA，从而部分或完全抑制目的基因的表达 (ZhangH，et al.EMBO J，2002；21：5875-5885.Kawasaki H，et al..Nucleic Acids Res，2003；31：981-987.)。 另一方面，细胞在RNA依赖性RNA聚合酶作用下，可以siRNA为引物、以mRNA为模板，合 成出mRNA的互补链，从而使mRNA也变成了dsRNA，然后在Dicer酶的作用下再次被裂解成 siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个链式反应，细胞内的siRNA大 大增加，显著增加了对基因表达的抑制。

从RNAi的作用机制中可见，这种基因表达调控方法属于转录后的调节并具有明显优势：RNAi 基因抑制效果确切，应用微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量下降90％以上、甚至可 以达到基因敲除的效果；其次，RNAi抑制具有严格的序列特异性，治疗的针对性强，因而应用此 项技术能够同时抑制同一基因的多个靶点或多个不同基因而不致相互干扰；同时，RNAi的作用 具有级联式放大效应和高穿透性更适合恶性肿瘤的实验研究；此外，RNAi序列识别的特异性即或 对由野生型点突变形成的癌基因也能够产生准确有效的封闭效果而对野生型基因没有影响 (Zhen，et al.Int J Oncol.2007 Nov；31(5)：1111-7.)。在对多种肿瘤细胞系实验中也证实：肿瘤细胞中均 存在着RNAi的机制，化学合成、质粒/病毒或其他方式介导的RNAi可以有效地抑制内源性RNA 的表达(Gondi CS，et al.Clin Cancer Res.2007 Jul 15；13(14)：4051-60.Gondi CS，，et al.Neuron Glia Biol. 2004 May；1(2)：165-176)。因此，RNAi技术在肿瘤的基因治疗上具有光明的应用前景，并被认为是 反义基因治疗时代之后的又一个划时代的进步。由于RNAi的研究在近几年出现了突破性进展， 它连续三次被Science评为年度十大科学成就之一(2001-2003)。

【发明内容】：

本发明目的是提供一种基于RNAi技术的多基因联合基因治疗质粒载体。

本发明提供的体内抑制胶质瘤生长的方法是基于RNAi技术的联合基因治疗质粒载体，运用该 方法可以在大鼠的实验条件下抑制人源性胶质瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡。

1)本发明提供了四种用于产生siRNA的DNA序列

DNA序列1

SEQ ID NO.1

5′-GATCCAGGAATTAAGAGAAGCAACAATGTTGCTTCTCTTAATTCCA-3’

SEQ ID NO.2

3’-GTCCTTAATTCTCTTCGTTGTATACAACGAAGAGAATTAAGGATTCGA-5`

DNA序列2

SEQ ID NO.3

5′-GATCCGCGTGATGAGTTGCACGGTGGAGGTGAGGCCTCACCTCCACCGTGCAACTCATCACGC A-3’

SEQ ID NO.4

3’-GCGCACTACTCAACGTGCCACCTCCACTCCAAGTTCTGCGGAGTGGAGGTGGCACGTTGAGTAGTGCG AAAAAACTCGAGTTCGA-5’

DNA序列3

SEQ ID NO.5

5′-GATCCGTGGAATGAACCACTGGAATTTAAATTCCAGTGGTTCATTCCA-3’

SEQ ID NO.6

3’-GCACCTTACTTGGTGACCTTAAATTTAAGGTCACCAAGTAAGGTTCGA-5’

DNA序列4

SEQ ID NO.7

5′-GATCCAGGGACCAGTACATGAGGACAGTCCTCATGTACTGGTCCCA-3’

SEQ ID NO.8

3’-GTCCCTGGTCATGTACTCCTGCAGGAGTACATGACCAGGGATTCGA-5’

包含上述四组DNA序列的组合的质粒为本发明的保护范围，具体如下：质粒为DNA序列-1、 DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/Pgenesil-1。质粒DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列 3、DNA序列4/Pgenesil-1的通用结构如图2示。质粒构建方法为如下，最终在Pgenesil-1中形成 的酶切位点顺序为-HindIII-DNA序列1-BamHI-U6启动子-EcoRI-DNA序列2-BamHI-U6启动子 -EcoRI-DNA序列3-BamHI-U6启动子-EcoRI-DNA序列4-BamHI-U6启动子-BssHII-XbaI-NotI -PstI。

2))本发明在发明1的基础上将DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/Pgenesil-1 质粒的EGFP切除，插入人源PTEN或者p53或者Cx43基因(上述三种基因序列可以在公共数据 库中查询，非本发明发现)。包含上述四组DNA序列的任何组合以及与人源PTEN或者p53或者 Cx43基因组合的质粒为本发明的保护范围。具体质粒为DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、 DNA序列4/人源PTEN或者p53或者Cx43基因/Pgenesil-1。

本发明的优点和积极效果：

本发明与传统单靶点和多靶点抑癌基因治疗相比，基于RNAi技术、靶向EGFR信号通路的 联合基因治疗的质粒在体外能显著的提高基因治疗的效果。

【附图说明】：

图1质粒构建图谱，在Pgenesil-1中形成的酶切位点顺序为-HindIII-DNA序列1-BamHI-U6启 动子-EcoRI-DNA序列2-BamHI-U6启动子-EcoRI-DNA序列3-BamHI-U6启动子-EcoRI-DNA序 列4-BamHI-U6启动子-BssHII-XbaI-NotI-PstI。

图2是酶切鉴定分析目的基因片段DNA序列1+2与目的基因片段DNA序列3+4连接成功。

图3是酶切鉴定分析目的基因片段联合RNAi与Cx43表达质粒连接成功。

图4是酶切鉴定分析目的基因片段联合RNAi与PTEN表达质粒连接成功。

图5是酶切鉴定分析目的基因片段联合RNAi与p53表达质粒连接成功。

图6U251裸鼠皮下荷瘤模型组织病理分析结果。(1对照组；2：对照质粒组；3：-8：不同组合 治疗组)

【具体实施方式】：

实施例1针对癌基因的多基因RNAi质粒载体的构建：构建一个载体编码4条siRNA的质 粒载体。

一.实验材料

1.目的基因：EGFR、PI3Kp110、K-RAS。DNA序列1-4。所用酶类：T4DNA Ligase、SacI、 SalI、EcoRI、PstI、XbaI、HindIII、BamHI等(购自NEB公司)。

表1、设计用于RNAi的目的基因序列

  序列编码   GenBank NO.   SEQ ID NO.1   NM-005228   SEQ ID NO.2   NM-005228   SEQ ID NO.3   NM-005228   SEQ ID NO.4   NM-005228   SEQ ID NO.5   NM 006219.1   SEQ ID NO.6   NM 006219.1   SEQ ID NO.7   M54968   SEQ ID NO.8   M54968

2.线性化的PEGFP6-1、Pgenesil-1、PEGFP6-3、PEGFP6-4质粒载体：

①PEGFP6-1的MCS如下：

-HindIII-Insert DNA-BamHI-U6启动子-EcoRI-SacI-KpnI-SalI-BssHII- XbaI-NotI-PstI-

②Pgenesil-1的MCS如下：

-HindIII-Insert DNA-BamHI-U6启动子-EcoRI-SalI-XbaI-

③PEGFP6-3的MCS如下：

-HindIII-Insert DNA-BamHI-U6启动子-BssHII-XbaI-NotI-PstI-

④PEGFP6-4的MCS如下：

-HindIII-Insert DNA-BamHI-U6启动子-EcoRI-PstI-

用BamHI和HindIII双酶切以上四种质粒，1％Agase凝胶电泳回收大片段，即为线 性化质粒载体；以上四种质粒载体除MCS不同外，其余序列完全一样。

3.所用酶类：T4 DNA Ligase、SacI、SalI、EcoRI、PstI、XbaI、HindIII、BamHI等(购 自NEB公司)。

二.实验方法

1.单链目的基因片段的退火连接：

各用50ul annealing buffer溶解上述合成2OD单链目的基因片段。

各取2ul(即2ulDNA序列1-1+2ulDNA序列1-2)+16ul annealing buffer混匀。

94℃水浴退火自然冷却至室温。

各取1ul退火产物+99ul H2O做100倍稀释。

2.稀释退火片段分别与线性化PEGFP6-1、Pgenesil-1、PEGFP6-3、PEGFP6-4质粒载体的连 接。

①其连接反应如下：

DNA序列1稀释退火片段与PEGFP6-1载体的连接

DNA序列2稀释退火片段与Pgenesil-1载体的连接

DNA序列3稀释退火片段分别与PEGFP6-1、PEGFP6-4载体的连接

DNA序列4稀释退火片段与PEGFP6-3载体的连接

②其连接反应条件如下：

稀释退火片段    1ul

线性化质粒载体    1ul

10×Ligase Buffer 1ul

T4 DNA Ligase     1ul

H2O               6ul

22℃水浴反应过夜。

3.各取5ul过夜连接产物转化感受态细胞DH5a，分别涂布于含Kanar抗性(终浓度为 20ug/ml)的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。

4.从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含Kanar抗性(终浓度为20ug/ml)的 LB培养液中，37℃恒温摇床(250rpm)培养过夜。

5.用试剂盒小量提取质粒(中鼎公司)，并分别做酶切鉴定：

①DNA序列1质粒用EcoRI做酶切鉴定：

DNA         8.5ul

10xH Buffer 1ul

EcoRI       0.5ul

37℃水浴反应3h

1％Agase凝胶电泳，电泳图谱如下：

经酶切分析：因为质粒载体PEGFP6-1里面本来只有一个EcoRI的酶切位点，而DNA序 列1-2质粒能被EcoRI酶切出一条约400bp的DNA条带，说明目的基因片段已经插入到 质粒载体PEGFP6-1里。

②DNA序列2、DNA序列4质粒分别用SacI做酶切鉴定：

DNA           8.5ul

10×L Buffer  1ul

SacI          0.5ul

37℃水浴反应3h

1％Agase凝胶电泳，电泳图谱如下：

经酶切分析：因为质粒载体Pgenesil-1和PEGFP6-3里面本来是没有SacI的酶切位点的， 而DNA序列2-6、DNA序列4-14质粒均能够被SacI所酶切，说明目的基因片段 已经分别插入到上述两个质粒载体里。

③DNA序列3质粒分别用SaII做酶切鉴定：

DNA            8.5ul

10xH Buffer    1ul

SaII           0.5ul

37℃水浴反应3h

1％Agase凝胶电泳，电泳图谱如下：

6.挑取克隆正确的质粒转化菌液DNA序列1-2、DNA序列2-6、DNA序列3-8、DNA序列 4-14去测序。

经测序结果分析：均为插入正确的克隆质粒，而且质量均符合设计标准。

7.质粒DNA序列1-2、DNA序列2-6的SacI+SalI双酶切分别回收大片段和小片段：

①先用SacI酶切

DNA            5ul

10xL Buffer    2ul

SacI           1ul

H2O            12ul

37℃水浴反应过夜。

各加入2ul 5M Nacl，混匀，再加入51ul酒精，混匀。

-70℃冰箱放置15min，15000rpm离心15min，

70％酒精洗涤两遍，然后用17ul H2O充分溶解。

②再用SalI酶切

上步反应物   17ul

10xH Buffer  2ul

SaII         1ul

37℃水浴反应过夜。

1％Agase凝胶电泳

用胶回收试剂盒(中鼎公司)分别回收DNA序列1-2大片段和DNA序列2-6小片段(U6启 动子+DNA序列2约400bp)

8.质粒DNA序列3-8、DNA序列4-14的SacI+XbaII双酶切分别回收大片段和小片段：

①先用SacI酶切

DNA            5ul

10xL Buffer    2ul

SacI           1ul

H2O            12ul

37℃水浴反应过夜。

加入2ul 5M Nacl，混匀，再加入51ul酒精，混匀。

-70℃冰箱放置15min，15000rpm离心15min，

70％酒精洗涤两遍，然后用15ul H2O充分溶解。

②再用XbaI酶切

上步反应物   15ul

10xM Buffer  2ul

0.1％BSA     2ul

XbaI         1ul

37℃水浴反应过夜。

1％Agase凝胶电泳

用胶回收试剂盒(中鼎公司)分别回收DNA序列3-8大片段和DNA序列4-14小片段(U6启 动子+DNA序列4约400bp)

9.回收小片段与回收大片段的连接：

①DNA序列1-2回收大片段与DNA序列2-6回收小片段的连接

②DNA序列3-8回收大片段与DNA序列4-14回收小片段的连接

连接反应条件如下：

回收小片段            4ul

回收大片段            4ul

10xLigase Buffer      1ul

T4 DNA Ligase         1ul

22℃水浴反应过夜。

10.各取5ul过夜连接产物转化感受态细胞DH5a，分别涂布于含Kanar抗性(终浓度为 20ug/ml)的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。

11.从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含Kanar抗性(终浓度为20ug/ml)的 LB培养液中，37℃恒温摇床(250rpm)培养过夜。

12.用试剂盒小量提取质粒(中鼎公司)，并用BamHI做酶切鉴定：

DNA             8.5ul

10xK Buffer     1ul

BamHI           0.5ul

37℃水浴反应3h

13.质粒DNA序列1+2-1、DNA序列3+4-4的SalI+PstI双酶切分别回收大片段和小片段(约 800bp)

DNA            6ul

10xH Buffer    2ul

SalI           1ul

PstI           1ul

H2O            10ul

37℃水浴反应过夜。

1％Agase凝胶电泳

用胶回收试剂盒(中鼎公司)分别回收DNA序列1+2-1大片段和DNA序列3+4-4小片段 (DNA序列3+U6启动子+DNA序列4+U6启动子约800bp)

14.质粒DNA序列1+2-1、DNA序列3-10的SalI+PstI双酶切分别回收大片段和小片段(约 400bp)

DNA           6ul

10xH Buffer   2ul

SalI          1ul

PstI          1ul

H2O           10ul

37℃水浴反应过夜。

1％Agase凝胶电泳

15.回收小片段与回收大片段的连接：

①DNA序列1+2-1回收大片段与DNA序列3+4-4回收小片段的连接

②DNA序列1+2-1回收大片段与DNA序列3-10回收小片段的连接

连接反应条件如下：

回收小片段             4ul

回收大片段             4ul

10xLigase Buffer       1ul

T4 DNA Ligase          1ul

22℃冰浴反应过夜。

16.各取5ul过夜连接产物转化感受态细胞DH5a，分别涂布于含Kanar抗性(终浓度为 20ug/ml)的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。

17.从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含Kanar抗性(终浓度为20ug/ml)的 LB培养液中，37℃恒温摇床(250rpm)培养过夜。

18.用试剂盒小量提取质粒(中鼎公司)，并用HindIII+PstI做酶切鉴定：

DNA            7ul

10xM Buffer    2ul

HindIII        0.5ul

PstI           0.5ul

H2O            10ul

37℃水浴反应3h

实施例2DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/人源PTEN或者p53或者 Cx43基因/Pgenesil-1的构建

1、合成PCR引物：

P53-1：5′-CTAGCTAGCTAGCCGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT-3′

P53-2：5′-GAAGATCTTCTTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTGT-3′

CX43-1：5′-CTAGCTAGCTAGCCACCATGGGTGACTGGAGCGCCTTAG-3′

CX43-2：5′-CCGCTCGAGCTTCAGATCTCCAGGTCATCAGGCCGA-3′

PTEN-1：5′-GGGGTACCCGCCACCATGACAGCCATCATCAAAGAGAT-3′

PTEN-2：5′-CCGCTCGAGCGGTTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATG-3′

表2、设计用于PCR引物的基因序列

  序列编码   GenBank NO.   P53   NM 000546.3   Cx43   NP 000156.1   PTEN   NP 000305.3

2、DNA质粒：Pcp53-SN3、PbluescriptR-cx43、pGz21 & Xz-PTEN

3、所用酶类：Taq HS、NheI、XhoI、BglII、KpnI

实验步骤：

1、用TP53基因分别替代表达载体里的EGFP基因：

①PCR扩增TP53基因：分别以TP53-1、TP53-2为上下游引物，以质粒Pcp53-SN3为模板， 90℃ 45s 58℃ 45s 72℃ 60s 30cycles PCR扩增TP53基因。

PCR反应条件：

10×PCR Buffer    5ul

10mM dNTP Mix     2ul

10uM TP53-1       1ul

10uM TP53-2       1ul

Taq HS            0.5ul

Pcp53-SN3         0.5ul

H2O               40ul

PCR反应结束后，1％Agarose凝胶电泳回收目的TP53基因片段，用胶回收试剂盒回收， 用30ul H2O洗脱。

②质粒Pgenesil-1、HK+HK、DNA序列1+2、DNA序列1+2+3、DNA序列1+2+3+4、基因 TP53的NheI和BglII酶切：

①先用NheI酶切

DNA            5ul

10xM Buffer    2ul

NheI           1ul

H2O            12ul

37℃水浴反应过夜。

各加入2ul 5M Nacl，混匀，再加入51ul酒精，混匀。

-70℃冰箱放置30min，15000rpm离心15min，

用70％酒精洗涤沉淀两次，然后各用17ul H2O充分溶解。

②再用BglII酶切

上步反应物    17ul

10xH Buffer   2ul

BglII         1ul

37℃水浴反应过夜。

1％Agarose凝胶电泳，用胶回收试剂盒(中鼎公司)分别回收质粒Pgenesil-1、HK+HK、DNA 序列1+2、DNA序列1+2+3、DNA序列1+2+3+4、基因TP53 NheI+BglII大片段。

③基因TP53分别与质粒Pgenesil-1、HK+HK、DNA序列1+2、DNA序列1+2+3、DNA序 列1+2+3+4

NheI+BglII酶切回收大片段的连接：

其连接反应条件如下：

回收TP53基因片段      4ul

回收质粒酶切大片段    4ul

10xLigase Buffer      1ul

T4 DNA Ligase         1ul

22℃水浴反应过夜。

④各取5ul连接产物转化感受态细胞DH5a，分别涂布于含Kanar抗性的LB平板上，37℃ 恒温培养箱培养过夜。

⑤从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含Kanar抗性的LB培养液中，37℃恒 温摇床培养过夜。

⑥用试剂盒小量提取质粒(中鼎公司)，并分别用NheI+BglII做酶切鉴定：

酶切反应条件：

DNA            7ul

10xM Buffer    2ul

NheI           0.5ul

BglII  0.5ul

H2O    10ul

37℃水浴反应3h.

2、用CX43基因分别替代表达载体里的EGFP基因：

①PCR扩增CX43基因：分别以CX43-1、CX43-2为上下游引物，以质粒PbluescriptR-cx43 为模板，90℃ 45s 58℃ 45s 72℃ 60s 30cycles PCR扩增CX43基因。

PCR反应条件：

10×PCR Buffer      5ul

10mM dNTP Mix       2ul

10uM CX43-1         1ul

10uM CX43-2         1ul

Taq HS              0.5ul

PbluescriptR-cx43   0.5ul

H2O                 40ul

PCR反应结束后，1％Agarose凝胶电泳回收目的CX43基因片段，用胶回收试剂盒回收， 用30ul H2O洗脱。

②质粒Pgenesil-1、HK+HK、DNA序列1+2、DNA序列1+2+3、DNA序列1+2+3+4、基因 CX43的NheI和XhoI酶切：

①先用NheI酶切

DNA            5ul

10xM Buffer    2ul

NheI           1ul

H2O            12ul

37℃水浴反应过夜。

各加入2ul 5M Nacl，混匀，再加入51ul酒精，混匀。

-70℃冰箱放置30min，15000rpm离心15min，

用70％酒精洗涤沉淀两次，然后各用17ul H2O充分溶解。

②再用XhoI酶切

上步反应物     17ul

10xH Buffer    2ul

XhoI           1ul

37℃水浴反应过夜。

1％Agarose凝胶电泳，用胶回收试剂盒(中鼎公司)分别回收质粒Pgenesil-1、HK+HK、DNA 序列1+2、DNA序列1+2+3、DNA序列1+2+3+4、基因CX43 NheI+XhoI酶切大片段。

③基因CX43分别与质粒Pgenesil-1、HK+HK、DNA序列1+2、DNA序列1+2+3、DNA序 列1+2+3+4

NheI+XhoI酶切回收大片段的连接：

其连接反应条件如下：

回收CX43基因片段      4ul

回收质粒酶切大片段    4ul

10xLigase Buffer      1ul

T4 DNALigase          1ul

22℃水浴反应过夜。

④各取5ul连接产物转化感受态细胞DH5a，分别涂布于含Kanar抗性的LB平板上，37℃ 恒温培养箱培养过夜。

⑤从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含Kanar抗性的LB培养液中，37℃恒 温摇床培养过夜。

⑥用试剂盒小量提取质粒(中鼎公司)，并分别用NheI+XhoI做酶切鉴定：

酶切反应条件：

DNA            7ul

10xM Buffer    2ul

NheI           0.5ul

XhoI           0.5ul

H2O            10ul

37℃水浴反应3h.

3、用PTEN基因分别替代表达载体里的EGFP基因：

①合成DNA引物片段tdEGFP-1、tdEGFP-2的退火：

分别用50ul annealing buffer溶解2OD的tdEGFP-1、tdEGFP-2 DNA引物 对应各取2ul(即2ul tdEGFP-1+2ul tdEGFP-2)+16ul annealing buffer混匀

94℃退火自然冷却至室温。

取1ul退火产物+99ulH2O做100倍稀释

②质粒Pgenesil-1、HK+HK、DNA序列1+2、DNA序列1+2+3、DNA序列1+2+3+4的NheI 和XhoI酶切：

①先用NheI酶切

DNA            5ul

10xM Buffer    2ul

NheI           1ul

H2O            12ul

37℃水浴反应过夜。

各加入2ul 5MNacl，混匀，再加入51ul酒精，混匀。

-70℃冰箱放置30min，15000rpm离心15min，

用70％酒精洗涤沉淀两次，然后各用17ul H2O充分溶解。

②再用XhoI酶切

上步反应物      17ul

10xH Buffer     2ul

XhoI            1ul

37℃水浴反应过夜。

1％Agarose凝胶电泳，用胶回收试剂盒(中鼎公司)分别回收质粒Pgenesil-1、HK+HK、DNA 序列1+2、DNA序列1+2+3、DNA序列1+2+3+4 NheI+XhoI酶切大片段。

③稀释退火产物tdEGFP分别与质粒Pgenesil-1、HK+HK、DNA序列1+2、DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4 NheI+XhoI酶切回收大片段的连接：

其连接反应条件如下：

稀释退火产物tdEGFP    4ul

回收质粒酶切大片段    4ul

10xLigase Buffer    1ul

T4 DNA Ligase       1ul

22℃水浴反应过夜。

④各取5ul连接产物转化感受态细胞DH5a，分别涂布于含Kanar抗性的LB平板上，37℃ 恒温培养箱培养过夜。

⑤从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含Kanar抗性的LB培养液中，37℃恒 温摇床培养过夜。

⑥用试剂盒小量提取质粒(中鼎公司)，并分别用NheI+XhoI做酶切鉴定：

酶切反应条件：

DNA            7ul

10xM Buffer    2ul

NheI           0.5ul

XhoI           0.5ul

H2O            10ul

37℃水浴反应3h..

其亚克隆成功的质粒分别命名为质粒tdPgenesil-1、tdHK+HK、tdDNA序列1+2、tdDNA 序列1+2+3、tdDNA序列1+2+3+4

⑦PCR扩增PTEN基因：分别以PTEN-1、PTEN-2为上下游引物，以质粒pGz21&Xz-PTEN 为模板，90℃ 45s 55℃ 45s 72℃ 60s 30cycles PCR扩增PTEN基因。

PCR反应条件：

10×PCR Buffer     5ul

10mM dNTP Mix      2ul

10uM PTEN-1        1ul

10uM PTEN-2        1ul

Taq HS             0.5ul

pGz21&Xz-PTEN      0.5ul

H2O                40ul

PCR反应结束后，1％Agarose凝胶电泳回收目的PTEN基因片段，用胶回收试剂盒回收， 用30ul H2O洗脱。

⑧质粒tdPgenesil-1、tdHK+HK、tdDNA序列1+2、tdDNA序列1+2+3、tdDNA序列1+2+3+4、 基因PTEN的KpnI和XhoI酶切：

①先用KpnI酶切

DNA             5ul

10xL Buffer     2ul

KpnI            1ul

H2O             12ul

37℃水浴反应过夜。

各加入2ul 5M Nacl，混匀，再加入51ul酒精，混匀。

-70℃冰箱放置30min，15000rpm离心15min，

用70％酒精洗涤沉淀两次，然后各用17ul H2O充分溶解。

②再用XhoI酶切

上步反应物   17ul

10xH Buffer  2ul

XhoI         1ul

37℃水浴反应过夜。

1％Agarose凝胶电泳，用胶回收试剂盒(中鼎公司)分别回收质粒tdPgenesil-1、tdHK+HK、 tdDNA序列1+2、tdDNA序列1+2+3、tdDNA序列1+2+3+4、基因PTEN KpnI+XhoI 大片段。

⑨基因PTEN分别与质粒tdPgenesil-1、tdHK+HK、tdDNA序列1+2、tdDNA序列1+2+3、 tdDNA序列1+2+3+4 KpnI+XhoI酶切回收大片段的连接：

其连接反应条件如下：

回收PTEN基因片段        4ul

回收质粒酶切大片段      4ul

10xLigase Buffer        1ul

T4 DNA Ligase           1ul

22℃水浴反应过夜。

⑩各取5ul连接产物转化感受态细胞DH5a，分别涂布于含Kanar抗性的LB平板上，37℃ 恒温培养箱培养过夜。

从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含Kanar抗性的LB培养液中，37℃恒 温摇床培养过夜。

用试剂盒小量提取质粒(中鼎公司)，并分别用KpnI+XhoI做酶切鉴定：

酶切反应条件：

DNA            7ul

10xM Buffer    2ul

KpnI           0.5ul

XhoI           0.5ul

H2O            10ul

37℃水浴反应3h

实施例3、DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/人源PTEN或者p53或 者Cx43基因/Pgenesil-1质粒的疗效实验

材料方法

一、材料

1.人脑胶质母细胞瘤细胞U251。

2.转染剂为Lipofectamine2000。

3.BALB/c-nu(SPF)雌性裸小鼠，4-6周龄，体重15-18克，共40只，购自中国医学科学院 医学实验动物研究所实验动物繁育场。饲养条件：SPF级无菌层流室中，恒温(22℃-25℃)、 恒湿(55±5％)饲养，所用食物和水均灭菌处理。

二、方法

1.细胞培养

细胞基及培养条件：含10％FBS的DMEM培养基，培养基的总体积约为培养瓶容积的1/10， 培养条件为37℃，5％CO2湿润培养。

2.瘤细胞悬液接种

对数生长期的U251胶质母细胞瘤细胞经0.125％胰酶消化，1000rpm×10分钟常温离心去上 清，以PBS离心洗涤2次；计算细胞数，调整细胞浓度至5×107/ml，将细胞悬浮于无血清DMEM 培养液中，制成细胞悬液。然后用带6号针头的注射器抽取细胞悬液200μl，接种于裸鼠双侧腋 部、鼠鼷部皮下。该组接种裸鼠3只，为第一代荷瘤裸鼠，用于再进行裸鼠肿瘤异体移植。

3.瘤组织块接种

经细胞接种成功的移植瘤(直径约7mm)，进行裸鼠肿瘤异体移植。断颈处死荷瘤裸鼠，在 无菌条件下，解剖切取适当大小的肿瘤组织，立即放入无血清DMEM中，修剪肿瘤组织，去除 脂肪和坏死肿瘤组织，并用无血清DMEM洗涤，将其剪成1mm3大小的瘤组织块待接种用。接 种前，用碘酊和75％乙醇消毒接种部位的皮肤，先用消毒的剪刀在要接种的裸鼠左侧鼠鼷部皮肤 处剪一小口，而后用无菌镊夹取一小瘤块，沿皮肤破口处塞入皮下接种。最后，75％乙醇消毒皮 肤破口。

4.动物分组：

第一代荷瘤裸鼠的肿瘤经过异体移植，能在裸鼠中形成生长速度稳定的肿瘤。本研究采用稳 定成瘤的第八代荷瘤裸鼠的皮下肿瘤作为瘤源。64只动物随机分为8组，每组8只，分别是U251 对照组、空载质粒治疗组(1)、单EGFR靶点的RNAi治疗组(2)、EGFR联合PIK3CB的RNAi 治疗组(3)、EGFR、PIK3CB和K-RAS联合RNAi治疗组(4)、EGFR、PIK3CB和KRAS联合 RNAi与Cx43联合治疗组(5)、EGFR、PIK3CB和KRAS联合RNAi与p53联合治疗组(6)、 EGFR、PIK3CB和KRAS联合RNAi与PTEN联合治疗组(7)。

5.疗效试验

1)治疗时机的选择：

瘤组织块接种约两周后，待皮下肿瘤体积长至50～100mm3时，即肿瘤直径在5mm左右时， 原位注射质粒-Lipofectamine2000混合物，进行肿瘤的治疗实验。

2)治疗方法，时间间隔及剂量：从第一次治疗开始，每四天进行一次治疗，连续3次。具体 方法如下：(1)浓度为2μg/μl的质粒5μl和10μl Lipofectamine2000混匀后，室温放置30min。(2) 裸鼠皮下肿瘤1～1.5cm范围内局部皮肤碘酒、酒精消毒。(3)无菌微量注射器吸取，距肿瘤5mm 左右进针，皮下潜行至肿瘤，多点缓慢注射，每只裸鼠每次注射总量为15μl质粒-Lipofectamine2000 混合物。

6.肿瘤生长情况观察：瘤组织块接种约一周后，可看到裸鼠皮下成瘤，每隔3天用游标卡尺测 量一次肿瘤的长径(a)及宽径(b)，肿瘤体积计算公式如下：V＝(ab2)/2

7.实验结果：与传统单靶点和多靶点抑癌基因治疗相比，基于RNAi技术、靶向EGFR信 号通路的联合基因治疗的质粒在体外能显著的提高基因治疗的效果。

表3、不同治疗组肿瘤体积增长速度平均值(mm3/天)

第一组：Pgenesil-1对照质粒治疗组

第二组：质粒DNA序列-1、DNA序列2/Pgenesil-1质粒治疗组

第三组：质粒DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3 Pgenesil-1质粒治疗组

第四组：质粒DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/Pgenesil-1质粒治疗组

第五组：质粒DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/人源Cx43基因/Pgenesil-1质粒治疗组

第六组：质粒DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/人源PTEN Pgenesil-1质粒治疗组

第七组：质粒DNA序列-1、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/人源p53/Pgenesil-1质粒治疗组

序列表

<110>天津医科大学总医院

<120>基于RNAi技术的多基因联合基因治疗的质粒载体

<160>8

<210>1

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gatccaggaa ttaagagaag caacatttca agacgatgtt gcttctctta attccttttt 60

tgaattca              68

<210>2

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gtccttaatt ctcttcgttg taaagttctg ctacaacgaa gagaattaag gaaaaaaact 60

taagttcga             69

<210>3

<211>85

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gatccgcgtg atgagttgca cggtggaggt gaggttcaag acgcctcacc tccaccgtgc 60

aactcatcac gcttttttga gctca             85

<210>4

<211>85

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcgcactact caacgtgcca cctccactcc aagttctgcg gagtggaggt ggcacgttga 60

gtagtgcgaa aaaactcgag ttcga            85

<210>5

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gatccgtgga atgaaccact ggaatttcta tggaacaaat tccagtggtt cattccattt  60

tttgtcgaca              70

<210>6

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcaccttact tggtgacctt aaagatacct tgtttaaggt caccaagtaa ggtaaaaaac  60

agctgttcga             70

<210>7

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gatccaggga ccagtacatg aggactttca agacgagtcc tcatgtactg gtcccttttt  60

ttgagctca                     69

<210>8

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gtccctggtc atgtactcct gaaagttctg ctcaggagta catgaccagg gaaaaaaact    60

cgagttcga              69