近年来，关于癌治疗，基因治疗引人注目，到目前为止提出 了各种各样的基因治疗法，并进行了临床试验。其中，对于使用 载体细胞的基因治疗，由Freeman等人进行了临床试验。该基因 治疗使用通过逆转录病毒导入了HSV-tk基因的卵巢癌细胞PA -1作为载体细胞，进行了用于卵巢癌治疗、以及恶性间皮瘤治疗 目的的临床试验(参照下面的非专利文献1、2)。另外，Culver 等人使用小鼠NIH-3T3细胞作为载体细胞，对脑肿瘤进行了临床 试验(参照下面的非专利文献3)。然而，如果考虑到对人适用的 癌治疗，作为载体细胞要求使用来自人的细胞。
还有Coukos等人进行了使用卵巢癌细胞PA-1作为载体细胞 的基因治疗(参照下面非专利文献4)。该基因治疗构建了在肿瘤 细胞中进行特异增殖的溶瘤病毒(oncolytic virus)，使该病毒感 染载体细胞(产毒细胞)，然后将该载体细胞给予到肿瘤部位。作 为溶瘤病毒使用单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，对于裸鼠的卵巢癌 腹腔内播散性转移模型，进行给予到腹腔内的动物实验(参照下 面的专利文献1、2)。
然而，上述的卵巢癌细胞PA-1虽然是增殖能力高、操作容易 的细胞，但细胞质小、容易破坏。因此，即使通过逆转录病毒导 入HSV-tk基因，HSV-tk基因在肿瘤部位的表达少，所以在 Freeman等人的临床试验中，对卵巢癌和恶性间皮瘤没有获得充 分的抗肿瘤效果。
在使用溶瘤病毒HSV-1的癌基因治疗中，作为载体细胞使用 PA-1时，与单独溶瘤病毒HSV-1疗法相比也没有获得明显的抗 肿瘤效果。利用病毒进行癌基因治疗的问题在于由于血中的中和 抗体的原因而不能多次给予病毒。可以认为使用PA-1时，由于细 胞脆弱，病毒产生量也少，因此在通过细胞间相互作用(cell to cell interaction)感染靶肿瘤细胞之前，细胞被破坏掉，进而病毒直 接被中和抗体灭活，不能获得抗肿瘤效果。
另外在细胞性免疫基因治疗的临床试验中，作为载体细胞有 时使用患者自身的癌细胞或成纤维细胞(fibroblast)，这种情况 下，由于直至获得稳定的细胞系需要时间，手术困难，以及基因 导入因个体不同而存在差异，不稳定，所以很难获得稳定的效果。

发明要解决的课题
本发明正是要解决这样的以往问题而进行的，所以本发明的 目的在于挑选出在使用溶瘤病毒的癌基因治疗中能够获得强力抗 肿瘤效果的新的载体细胞，以及确立使用所得到的载体细胞等而 可获得显著抗肿瘤效果的新的癌基因治疗法以及提供在该治疗法 使用的新的癌基因治疗药物。
用于解决课题的手段
本发明者鉴于上述课题进行了不断研究，结果发现(1)通过 使用特定的细胞株作为载体细胞，与以往的载体细胞相比，可获 得强力的抗肿瘤效果，以及(2)预先给予病毒实施免疫处理后， 通过给予感染了溶瘤病毒的载体细胞，诱导·引起生物体的CTL反 应，可在体内(in vivo)获得显著的抗肿瘤效果等，至此完成本 发明。
即，本发明的癌基因治疗药物(换言之，癌治疗用药剂试剂 盒)配合了：为诱导生物体对载体细胞的给予所产生的CTL反应 而给予的免疫处理用病毒，和用于在给予前用溶瘤病毒感染并使 该病毒作用于生物体的肿瘤细胞的载体细胞。
本发明的免疫处理用病毒和溶瘤病毒最好是从腺病毒、疱疹 病毒、HIV病毒等慢病毒、逆转录病毒、呼肠病毒、水泡性口炎 病毒(VSV)、或其它的溶瘤病毒中选择。其中由于使用腺病毒可 获得如下面所述那样的良好结果，所以特别理想。
另外，本发明的溶瘤病毒最好是根据治疗对象癌的种类等而 含有1A1.3B启动子(IAI.3B启动子)、中期因子启动子、β—HCG 启动子、SCCA1启动子、cox-2启动子、PSA启动子、或其它肿 瘤特异性启动子。而在本发明中溶瘤病毒只要是感染靶肿瘤细胞 能够增殖的就可以，例如腺病毒，在其范畴内包括野生型腺病毒。 其它溶瘤病毒，如ONYX公司的E1B基因缺失型的溶瘤腺病毒、或 UAB大学的E1A基因部分缺损型的Ad5-△24腺病毒等不含有肿 瘤特异性启动子的也可以。
作为本发明的免疫处理用病毒最好使用非增殖型的病毒和/ 或用紫外线等灭活的病毒。通过用紫外线等灭活，可以将从免疫 处理用病毒的给予至载体细胞给予的期间缩短。
本发明的载体细胞最好从A549细胞、293细胞、SW626细胞、 HT—3细胞(HT—III细胞)、或其它的来自人的癌细胞或正常细胞 中选择，此外也可以使用Crucell公司的PER.C6细胞等市售的细 胞系。上述A549细胞、293细胞、SW 626细胞和HT—3细胞由于 可以获得如下所述那样的良好的结果，所以作为载体细胞更理想， 另外如下面所述那样，在这些细胞中A549细胞的使用特别理想。
本发明的癌基因治疗药物(癌治疗用药剂试剂盒)可认为是 配合了免疫处理用病毒和载体细胞的药物，或在其中再添加溶瘤 病毒而配合了3者的试剂盒的构成，还可含有下面的(1)～(4) 物质中1或2种以上物质。
(1)端胶原(atelocollagen)
(2)在给予前，使载体细胞感染的GM-CSF(granulocyte -macrophage colony stimulating factor：粒细胞·巨噬细胞集 落刺激因子)表达载体
(3)铁剂
(4)卟啉化合物(例如，5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid：ALA))
另外，在给予免疫处理用病毒的同时、或在给予前后，最好 是给予用于肿瘤免疫的来自患者肿瘤细胞或认为对与它类似的抗 原进行提示的一般可获得的放射线照射的肿瘤细胞，本发明的癌 基因治疗药物也可以含有用于肿瘤免疫的这些进行了放射线照射 的肿瘤细胞。
本发明的癌基因治疗方法的特征是：为了诱导生物体对载体 细胞的给予所产生的CTL反应而对人给予免疫处理用病毒，经过 规定期间后，至少给予人一次用溶瘤病毒感染并用于使该病毒作 用于肿瘤细胞的载体细胞。
在本发明的癌基因治疗方法中，最好是将从给予免疫处理用 病毒至给予载体细胞的期间大致定在2周～13周(更优选3周以上4 周或其以下)。另外最好是(1)免疫处理用病毒的给予量为：对 于对该病毒呈抗体阴性的患者定在大约105病毒粒子～1011病毒粒 子，而另一方面对于对该病毒呈抗体阳性的患者定在大约102病毒 粒子～107病毒粒子，(2)通过载体细胞1次给予溶瘤病毒的给予 量大约定在109病毒粒子～1014病毒粒子，(3)溶瘤病毒对载体细 胞的感染量大约定在0.1病毒粒子/细胞(viral particle/cell：以 下称为“vp/cell”)～2000vp/cell(优选5vp/cell～500vp/cell)。
另外在本发明的癌基因治疗方法中，最好是采用下述(1)～ (5)的方法。
(1)通过肿瘤内给予方式给予载体细胞。
(2)与载体细胞一起给予端胶原。
(3)给予用溶瘤病毒和GM-CSF表达载体感染的载体细胞。
(4)与载体细胞一起给予铁剂和/或卟啉化合物(例如5- 氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid：ALA))。
(5)在给予免疫处理用病毒的同时、或在其前后，给予用于 肿瘤免疫的肿瘤细胞。
发明的效果
本发明的癌基因治疗药物是配合了预先给予的免疫处理用病 毒和之后给予的载体细胞这2种药剂的药物，通过预先给予腺病毒 等病毒来实施免疫处理，然后给予用溶瘤病毒感染的载体细胞， 该病毒感染靶肿瘤细胞而带来直接的抗肿瘤效果，进一步诱导生 物体对感染靶细胞的CTL反应，在体内可以获得显著的抗肿瘤效 果。
另外，作为载体细胞，通过使用在体外和体内都被证实了具 有很高的抗肿瘤效果的A549细胞等细胞株，可以获得比以往载体 细胞更强力的抗肿瘤效果。
附图说明
图1是表示通过IC50的细胞数对使用各种细胞株作为载体细 胞时对卵巢癌细胞HEY的增殖抑制效果进行研究的结果的图表。
图2是表示在单独使用溶瘤病毒的情况和使用载体细胞的情 况下，在病毒抗体存在下，通过IC50的抗腺病毒抗体的抗体效价 对卵巢癌细胞HEY的增殖抑制效果进行研究的结果的图表。
图3表示对于以溶瘤腺病毒感染的293细胞等，在病毒抗体存 在下，通过IC50的抗腺病毒抗体的抗体效价对卵巢癌细胞HEY的 增殖抑制效果进行研究的结果的图表。
图4对于293细胞、A549细胞、SW 626细胞、HT—3细胞各载 体细胞，在病毒抗体存在下，通过细胞数对卵巢癌细胞HEY的增 殖抑制效果进行研究的结果的图表。
图5表示使用将人卵巢癌细胞RMG-1移植到裸鼠皮下形成 的10-15mm巨大肿瘤模型，对以溶瘤腺病毒感染的载体细胞的 体内抗肿瘤效果进行研究的结果的图表。
图6表示使用将人卵巢癌细胞PA-1移植到裸鼠皮下形成的 10-15mm巨大肿瘤模型，对以溶瘤腺病毒感染的载体细胞的体 内抗肿瘤效果进行研究的结果的图表。
图7是表示使用免疫功能正常的皮下肿瘤模型小鼠 ((C57BL/6×C3/He)F1小鼠)对本发明的癌基因治疗药物的体内 抗肿瘤效果进行研究的结果的图表。
图8是通过显微镜对腺病毒的给予所引起的A549细胞的细胞 融合进行观察的图。
图9是通过显微镜对作为对照没有给予腺病毒的A549细胞进 行观察的图。
图10(a)是通过RT-PCR对1～21个的人手术标本中的中期 因子(MK)mRNA表达进行研究的结果，(b)是用同样的方法通 过RT-PCR对中期因子mRNA在恶性神经胶质瘤的4个细胞株中 的表达进行研究的结果，(c)是通过免疫印迹法解析对中期因子 在上述各细胞株中的表达进行研究的结果。
图11是表示使用长度不同的2个中期因子启动子，对启动子在 上述各细胞株中的活性进行比较的结果的图表。
图12(a)是表示此次设计的含有中期因子启动子的溶瘤腺病 毒的构造的模式图，(b)是用3种腺病毒感染上述各细胞株，通过 免疫印迹法解析对E1A蛋白在各个细胞株中的表达进行研究的结 果。
图13(a)是对3种腺病毒引起的癌细胞增殖抑制效果进行比 较研究的结果，(b)是对腺病毒的E3区对增殖抑制效果的影响进 行研究的结果，(c)是对腺病毒在直径5mm裸鼠皮下移植模型中 的抗肿瘤效果进行研究的结果。
图14是表示用含有中期因子启动子的溶瘤病毒感染载体细 胞，将该病毒感染载体细胞对直径10-15mm巨大肿瘤的抗肿瘤 效果与单独给予病毒的情况进行比较的结果的图表。
图15是表示对Fe对腺病毒AdE3-1A1.3B对于卵巢癌细胞 PA-1增殖抑制效果的影响进行研究的结果的图表。
图16是表示对ALA对腺病毒AdE3-1A1.3B对于卵巢癌细胞 PA-1增殖抑制效果的影响进行研究的结果的图表。
图17是表示对Fe和ALA都存在下对腺病毒AdE3-1A1.3B对 于卵巢癌细胞PA-1增殖抑制效果的影响进行研究的结果的图表。
图18(a)是用免疫功能正常的皮下肿瘤模型小鼠 ((C57BL/6×C3/He)F1小鼠)，研究本发明癌基因治疗药物(免疫 处理用病毒没有用UV处理的场合)的体内抗肿瘤效果的结果，(b) 是表示对供该实验使用的各小鼠的存活率进行长期间观察的结果 的图表。
图19是对于从免疫处理用病毒的给予至载体细胞的给予的给 予间隔进行研究的结果，(a)是对各小鼠的肿瘤体积进行观察的 结果，(b)是对各组小鼠的存活率进行观察的结果。
图20是表示对通过使用经UV灭活处理的腺病毒UV-Ad-β -gal作为免疫处理用病毒能否缩短上述给予间隔进行研究的结 果图表(存活·曲线)。
图21是表示对使用上述UV-Ad-β-gal作为免疫处理用病 毒时的该病毒的给予量进行研究的结果的图表(肿瘤生长曲线)。
图22是对肿瘤免疫的效果进行研究的结果，(a)是对各小鼠 的肿瘤体积进行观察的结果，(b)是对各组小鼠的存活率进行观 察的结果。各组小鼠数为n＝5。图中，对照“SCC7”“OVHM” 是不进行肿瘤免疫，而将1×106个扁平上皮癌细胞SCC7或卵巢癌 细胞OVHM进行皮下移植，给予AdE3-1A1.3B感染载体细胞 A549的小鼠的结果。“OVHM-RT+Ad-β-gal→SCC7，OVHM” 是在用放射线照射的OVHM进行肿瘤免疫和通过Ad-β-gal诱导 对腺病毒的CTL后，做成SCC7或OVHM的皮下肿瘤，给予AdE3 -1A1.3B感染载体细胞A549的小鼠的结果。
图23是表示对用非小细胞性肺癌细胞A549细胞进行肿瘤免 疫的效果进行研究的结果的图表(存活·曲线)。各组小鼠数为n ＝10。图中，对照“OVHM”是不进行肿瘤免疫，而将1×106个卵 巢癌细胞OVHM进行皮下移植，给予AdE3-1A1.3B感染载体细 胞A549的小鼠的结果。图中“AdE3-IAI.3B-感染A549→ OVHM”是将感染AdE3-1A1.3B并经放射线照射的A549细胞106 个进行皮下免疫，将1×106个卵巢癌细胞OVHM进行皮下移植，给 予AdE3-1A1.3B感染载体细胞A549的小鼠的结果。
图24是表示将端胶原与载体细胞一起给予时，研究是否可改 善由于副作用导致的死亡率的结果的图表。图中括弧内的N表示小 鼠数。
图25是对于给予1-3次没有经UV灭活处理的腺病毒Ad-β -gal，在抗腺病毒抗体存在下的抗肿瘤效果进行研究的结果，(a) 是对各小鼠的肿瘤体积进行观察的结果、(b)是对各组小鼠的存 活率进行观察的结果。作为载体细胞使用A549细胞和293细胞的 混合物。各组小鼠数为n＝5。
图26是对于给予1-3次没有经UV灭活处理的腺病毒Ad-β -gal，在抗腺病毒抗体存在下的抗肿瘤效果进行研究的结果，(a) 是对各小鼠的肿瘤体积进行观察的结果、(b)是对各组小鼠的存 活率进行观察的结果。作为载体细胞只使用A549细胞。各组小鼠 数为n＝5。
图27是对于给予用腺病毒AdE3-1A1.3B和GM-CSF表达 载体感染的载体细胞(A549细胞)，并且与该载体细胞一起给予 端胶原时的体内抗肿瘤效果进行研究的结果，(a)是对各小鼠的 肿瘤体积进行观察的结果、(b)是对各组小鼠的存活率进行观察 的结果。图中“Ad-β-gal”前的“×1”“×2”“×3”分别表示给 予1次、2次、3次腺病毒Ad-β-gal。各组小鼠数为n＝5。
图28是对于在给予载体细胞时向腹腔内给予铁剂的情况下的 体内抗肿瘤效果进行研究的结果，(a)是对各小鼠的肿瘤体积进 行观察的结果、(b)是对各组小鼠的存活率进行观察的结果。图 中“Ad-β-gal”前的“×1”“×2”“×3”分别表示给予1次、2 次、3次腺病毒Ad-β-gal。各组小鼠数为n＝5。
图29是表示在对载体细胞A549进行的放射线处理中，使用裸 鼠对所照射的放射线量进行研究的结果的图表。
图30是表示在对(C57BL/6×C3/He)F1小鼠进行OVHM皮下 移植的实验中，对于用不同的放射线量对载体细胞A549进行放射 线处理时的抗肿瘤效果进行研究的结果的图表。
图31是表示对于溶瘤病毒对载体细胞A549的感染量进行研 究的结果的图表。
图32是对利用卵巢癌细胞OVHM进行肿瘤免疫的效果进行研 究的结果，(a)是对各小鼠的肿瘤体积进行观察的结果、(b)是 对各组小鼠的存活率进行观察的结果。图中“A549”是不进行肿 瘤免疫，给予3次AdE3-1A1.3B感染载体细胞A549的小鼠、 “OVHM-RT→A549”是通过放射线照射的OVHM进行肿瘤免 疫后，给予3次AdE3-1A1.3B感染载体细胞A549的小鼠、各组小 鼠数为n＝5。

以下就本发明的一个实施方式进行说明。
〔1〕本发明的癌基因治疗药物中使用的载体细胞等
首先就本发明癌基因治疗药物中使用的载体细胞进行说明。 载体细胞可以从例如以下(1)～(4)的细胞中选择。
(1)A549细胞
(2)293细胞
(3)SW 626细胞
(4)HT—3细胞(HT—III细胞)
图1是表示为了找出可在癌基因治疗药物使用的有效的载体 细胞，本发明者进行载体细胞筛选的结果，更具体讲，是表示制 备用溶瘤病毒感染各种候选细胞株的癌基因治疗药物，研究各个 癌细胞增殖抑制效果的结果的图表。溶瘤病毒使用腺病毒AdE3- 1A1.3B(IAI.3B)。该腺病毒AdE3-1A1.3B是含有E1A基因和 E3基因、而且在E1A基因上游含有作为肿瘤特异性启动子的卵巢 癌特异性1A1.3B启动子(IAI.3B启动子)的腺病毒。使该腺病毒 AdE3-1A1.3B以500vp/cell对各种候选细胞株感染2天后，将各 细胞添加到培养到第2天的卵巢癌细胞HEY中，研究该癌细胞 HEY在培养第5天的增殖抑制效果。
图1的图表纵轴表示得到的有关各种候选细胞株的50％增殖 抑制效果(IC50)的细胞数，细胞数越少的细胞株，增殖抑制效 果越高。如该图表示的那样，在此次调查的癌细胞株中，293细胞、 A549细胞、SW 626细胞、HT—3细胞(HT—III细胞)依次表现出 很高的增殖抑制效果。293细胞、A549细胞和SW626细胞与以往 作为载体细胞使用的PA-1细胞相比，大约表现出高出100倍左右 的增殖抑制效果。HT—3细胞也表现出与SW 626细胞同等程度的 高的增殖抑制效果。
另外，制备使溶瘤腺病毒感染上述的293细胞、A549细胞、S W626细胞和HT—3细胞的癌基因治疗药物，对于各治疗药在足量 的抗腺病毒中和抗体存在下(Ab(+))的癌细胞增殖抑制效果进 行研究。结果如图4表示的那样，表明即使在抗体存在下，使用上 述4种细胞作为载体细胞的癌基因治疗药物无论那一个都表现出 强的癌细胞增殖抑制效果。以往利用病毒进行癌基因治疗的难点 是由于抗体的产生所导致的不能多次给予，而使用上述4种细胞作 为载体细胞时，即便在抗体存在下也能够在体外获得强力的增殖 抑制效果。另外，如图4所示的那样，使用上述4种细胞中的A549 细胞作为载体细胞时，表现出最强的增殖抑制效果。即，在足量 抗腺病毒中和抗体存在下给予腺病毒感染A549细胞，尽管有抗体 存在，靶癌细胞的增殖也几乎完全被抑制。
另外，在使用直径10-15mm的巨大裸鼠皮下肿瘤模型的体 内实验中，作为载体细胞使用上述的A549细胞、293细胞和SW626 细胞时，也表现出强力的抗肿瘤效果(参照图5和图6)。而有关这 些实验的详细情况在下面的实施例中进行说明。
如上所述，在用溶瘤病毒感染载体细胞后得到的癌基因治疗 药物中，通过使用A549细胞、293细胞、SW 626细胞、HT—3细 胞中的任一个作为载体细胞，都可以获得很高的抗肿瘤效果。
对上述4种细胞进行说明，A549细胞是非小细胞性肺癌细胞 株，有关其详细情况在例如论文Giard，D.J.，Aaronson，S.A.， Todaro，G.J.，Arnstein，P.，Kersey，J.H.，Dosik，H.，and Parks，W.P.In vitro cultivation of human tumors： establishment of cell lines derived from a series of solid tumors，J.Natl.Cancer Inst.，51：1417-1423，1973.等中有记 载。293细胞是来自人胎儿肾的细胞，是在试验研究中经常用作腺 病毒产生细胞的细胞株。有关293细胞在例如论文Xie QW，et al. Complementation analysis of mutants of nitric oxide synthase reveals that the active site requires two hemes. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：4891-4896，1996.等中有说明。 SW 626细胞是大肠癌卵巢转移株，有关其详细资料在例如论文 Fogh J，et al.Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors.J.Natl.Cancer Inst.58： 209-214，1977.等有记载。HT—3细胞是子宫颈部扁平上皮癌细 胞，有关其详细情况在例如论文Fogh J，et al.Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors.J.Natl.Cancer Inst.58：209-214，1977.中有记载。 这4种细胞株无论那一个都可从ATCC(American Type Culture Collection)等细胞保存机构获得，此外也可以使用市售的产品。
A549细胞作为载体细胞使用时具有很多优点，如(1)可产 生高效力的溶瘤腺病毒，是非常坚韧的细胞，容易操作，(2)在 抗腺病毒抗体存在下，最强力抑制癌细胞的增殖，(3)，A549细 胞由于原本是II型的肺胞上皮细胞，所以一感染腺病毒等病毒就放 出分泌颗粒，该性质被认为在癌治疗中起到有利作用，(4)感染 腺病毒后，A549细胞也难以受到CTL产生的杀细胞效果等。因此， 在上述4种细胞中，使用A549细胞是特别理想的。
另外作为载体细胞也可以并用多种细胞。在下面的实施例中， 作为载体细胞通过并用A549细胞和293细胞，证实了强力的癌治 疗效果。因此当并用多种细胞时可以在癌治疗中利用各细胞的特 征、优点，很理想。例如，SW 626细胞由于粘连(adhere)需要 比较长的时间，所以一投到腹腔内，不只是停留在局部而是向整 个周围扩散，认为非常适合卵巢癌等的腹腔内治疗。另外SW 626 细胞病毒，其产生量的峰值比A549细胞或293细胞等更迟，所以 具有作用时间比较长的特征。
如上所述，载体细胞最好使用上述4种细胞(即A549细胞、 293细胞、SW 626细胞、HT—3细胞)。但是可用作载体细胞的细 胞并不限定于上述4种细胞，作为载体细胞也可以使用其它的细 胞、例如，PA-1细胞(特别是使用疱疹病毒作为溶瘤病毒的场合 等)、成纤维细胞(fibroblast)、其它的来自人的癌细胞或正常细 胞、来自患者的癌细胞等。
在本发明的癌基因治疗药物中，作为使上述载体细胞感染的 溶瘤病毒，可以使用以往用于基因导入的病毒载体，例如腺病毒、 腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2 型(HSV-2)、HIV病毒(爱滋病毒)等慢病毒或小鼠白血病病 毒等逆转录病毒、呼肠病毒、水泡性口炎病毒(VSV)等，其它 的溶瘤病毒也可以。溶瘤病毒只要是增殖型病毒载体、并能够在 靶肿瘤细胞或肿瘤组织中特异增殖、具有改变病毒基因、融解·杀 伤靶细胞的细胞溶菌作用的病毒就可以，例如腺病毒的情况下， 只要是含有对于其增殖所必需的E1A或E1B区的病毒就可以。
本发明的癌基因治疗药物几乎可以适用于所有恶性肿瘤，可 成为治疗对象的癌的种类可列举例如卵巢癌、扁平上皮癌(子宫 颈部癌、皮肤癌、头颈部癌、食道癌、肺癌等)、消化器官癌(大 肠癌、胰癌、肝癌、胃癌等)、成神经细胞瘤、脑肿瘤、乳癌、精 巢癌、前列腺癌等。另外通过使用腺病毒34，35型等可感染血液细 胞的病毒，本发明的癌基因治疗药物也适用于血液性恶性肿瘤。
可以根据治疗对象的癌的种类而选择导入溶瘤病毒的肿瘤特 异性启动子的种类。例如，对于卵巢癌可以使用1A1.3B启动子、 对于脑肿瘤、恶性神经胶质瘤等可以使用中期因子启动子、对于 精巢癌可使用β—HCG启动子、对于扁平上皮癌可使用SCCA1启动 子和SCCA2启动子、对于大肠癌可使用CEA启动子、对于前列腺 癌可使用PSA启动子、对于肝癌可使用AFP启动子。当然，也可 以使用其它的众所周知的肿瘤特异性启动子，例如，对各种恶性 肿瘤发挥启动子活性、并具有宽的作用谱的cox-2启动子以及其 它骨钙素启动子等各种癌特异性启动子。上述中期因子启动子对 于除了脑肿瘤、恶性神经胶质瘤之外的各种恶性肿瘤都可以使用， 在这点上具有与cox-2启动子同样宽的作用谱。
关于所使用的各启动子序列的长度等，只要可获得肿瘤特异 性启动子活性就没有特别限定。上述1A1.3B启动子根据国际公开 第03/025190号论文和文献Cancer Research 63，2506-2512， 2003记载进行设计、制备，可以插入到病毒基因组。上述的中期 因子启动子、β—HCG启动子、SCCA1启动子分别根据国际公开第 02/10368号论文、国际公开第01/90344号论文、国际公开第00 /60068号论文的记载进行设计·制备，可以插入到病毒基因组。
关于上述SCCA1启动子在论文Biochimica et Biophysica Acta 91522(2001)1-8，Molecular cloning of human squamous cell carcinoma antigen 1 gene and characterization of its promoter，Katsuyuki Hamada，Hiroto Shinomiya， Yoshihiro Asano，Toshimasa Kihana，Mari Iwamoto，Yasushi Hanakawa，Koji Hashimoto，Susumu Hirose，Satoru Kyo， Masaharu Ito中进行了详细的说明。
例如，制作溶瘤腺病毒时，可以通过在作为腺病毒增殖必需 基因的初期基因E1A或E1B的上游插入肿瘤特异性启动子或与初 期基因E1A或E1B启动子置换而构建。在使用HSV-1、HSV-2、 逆转录病毒、呼肠病毒、水泡性口炎病毒(VSV)等腺病毒以外 的病毒时，同样可以通过在病毒增殖必需基因的上游插入肿瘤特 异性启动子或与该基因的启动子置换而构建。
当然，溶瘤病毒只要是在靶肿瘤细胞或肿瘤组织中具有特异 增殖的性质，就并不一定必须含有肿瘤特异性启动子。例如，也 可以使用ONYX公司的E1B基因缺失型溶瘤腺病毒，或UAB大学 的E1A基因部分缺损型的Ad5-△24腺病毒等不含有肿瘤特异性 启动子的溶瘤病毒。另外作为溶瘤病毒也可以使用野生型腺病毒， 或其一部分基因缺失后的病毒。
用溶瘤病毒感染载体细胞的方法可以按照常规方法进行，并 没有特别限定，例如将载体细胞加到平皿中，然后添加可使所有 细胞都感染的量的溶瘤病毒，于95％O2、5％CO2、37℃、胎牛血 清FCS(-)、RPMI培养基的条件下培养6小时至36小时左右使其 感染的方法比较简便。在下面的实施例中，A549细胞、SW626细 胞、HT—3细胞用这种方法培养，从而感染溶瘤病毒，而对于293 细胞，则在FCS(+)10％、DMEM培养基的条件下进行培养， 从而感染溶瘤病毒。另外，胎牛血清FCS在感染3-6小时时用FCS (-)条件，当感染时间在上述时间以上时，置于FCS(-)状 态3-6小时，之后加FCS10％为好。
溶瘤病毒对载体细胞的感染量和感染时间可以根据治疗对象 的肿瘤大小·种类、载体细胞的种类·给予量、所使用的溶瘤病毒 的种类、本基因治疗药物的给予方法等选择最适的量和时间。虽 然没有特别限定，但作为一个例子，当载体细胞使用A549细胞时， 腹腔内给予时设定为约5-250vp/cell、大约6-24小时，肿瘤内 给予时设定为约5-500vp/cell、大约12-24小时；当使用SW626 细胞时，腹腔内给予时设定为约250-2000vp/cell、大约6-24小 时，肿瘤内给予时设定为约100-500vp/cell、大约12-24小时； 当使用293细胞时，肿瘤内注给予时定为约5-50vp/cell、大约12 -24小时，腹腔内给予时设定为约0.1-10vp/cell、大约6-24小 时。如此，载体细胞的种类、给予方法不同，相应的感染量·感染 时间也不同，在上述例子中，腹腔内给予时，可以在约0.1- 2000vp/cell、大约6-24小时的范围，当肿瘤内给予时，可以在 约5-500vp/cell、大约12-24小时的范围分别设定感染量·感染 时间。
用溶瘤病毒感染载体细胞、制备病毒感染载体细胞时，也可 以在使用之前以不感染溶瘤病毒的状态保存载体细胞。另一方面 在将用溶瘤病毒感染、并经放射线照射的载体细胞冷冻，在医疗 现场将它解冻后做成使用的制品形态时，最好保存用病毒感染的 载体细胞。载体细胞的保存例如可以在液氮中或-150℃左右的温 度保存。另外，溶瘤病毒可以在例如-80℃左右的温度保存。
使用时通过上述方法，用溶瘤病毒感染载体细胞，将得到的 病毒感染载体细胞直接或与惯用医药制剂载体一起给予人(或小 鼠、大鼠等实验动物)。如下面叙述的那样，给予载体细胞时，最 好是配合端胶原、铁剂、卟啉化合物中的1或2个以上化合物后与 载体细胞同时给予。另外，为了提高CTL反应，最好给予用溶瘤 病毒和GM-CSF表达载体都感染的载体细胞，譬如用病毒载体双 重感染的载体细胞。
在给予下面的免疫处理用病毒之后，经过规定期间后给予载 体细胞。载体细胞使用癌细胞时，最好是在病毒感染前或感染后 进行放射线照射。在下面的实施例中，载体细胞使用A549细胞、 SW 626细胞、HT—3细胞时，在将这些细胞给予裸鼠前，分别于 120-400Gy、20-40Gy、20-40Gy下进行放射线照射。对A549 细胞的放射线照射量进行研究的结果表明如果是120Gy以上，就 没有观察到细胞增殖(图29)，所以照射量最好是设定为120Gy～ 600Gy(更优选150Gy～400Gy)左右。
载体细胞最好是作为非口服剂给予，但也可以作为口服剂使 用。以非口服剂给予可以是体内法、间接体内法中的任一种。运 用体内法时，要根据肿瘤的大小·种类、症状的左右、患者的年龄、 体重等调整用量(换言之，病毒感染载体细胞的给予量)，例如， 可以通过静脉注射、点滴静脉注射、肿瘤内注射、腹腔注射那样 的腔内注射等来给予，载体细胞最好是通过肿瘤内注射的方法给 予。这样的注射剂可以按照常规方法制造，作为稀释剂一般使用 生理盐水、细胞培养液等。还可根据需要，加入杀菌剂、防腐剂、 稳定剂、等渗剂、止痛剂等。这些制剂中的病毒感染载体细胞的 配合量没有特别限定，可以任意设定。
当然，上述的病毒感染载体细胞也可以经数次给予患者，或 分为多个疗程，对于每一个疗程的给予次数、给予间隔等可以任 意设定。
如上述那样，病毒感染载体细胞的给予量可以根据肿瘤的大 小·种类、症状的程度、患者的年龄、体重等决定，通常情况下， 可以将1次载体细胞的给予量设定为大约107细胞数～1010细胞 数，将通过载体细胞给予溶瘤病毒的1次给予量设定在大约109病 毒粒子～1014病毒粒子。
载体细胞的种类可以根据治疗对象的癌的种类等适当选择。 另外也可以通过基因重组技术改变载体细胞，例如变得容易与靶 肿瘤细胞结合那样，在载体细胞的细胞表面人为使特定蛋白质等 表达，也可以进行使仙台病毒感染载体细胞等处理。
溶瘤病毒通过细胞间相互作用(cell to cell interatcion)，由 载体细胞到靶肿瘤细胞进行感染，可以在肿瘤细胞内进行特异增 殖，发挥融解·杀伤肿瘤细胞的细胞溶菌作用。利用病毒的癌基因 治疗难点在于由于抗体的产生而导致不能多次给予，而使用载体 细胞由于通过细胞间相互作用可以做到直接感染靶肿瘤细胞，所 以可多次给予，预期有强力的抗肿瘤效果。
〔2〕本发明的癌基因治疗药物及其适合的使用例
本发明的癌基因治疗药物配合了为诱导生物体对载体细胞的 给予所产生的CTL反应而给予的免疫处理用病毒和用溶瘤病毒感 染并使该病毒作用于生物体的肿瘤细胞的载体细胞，即，是一种 配合了预先给予的免疫处理用病毒和之后给予的载体细胞这2种 药剂的药物，通过预先给予腺病毒等病毒来实施免疫处理(预先 免疫(immunization))后，给予用溶瘤病毒感染的载体细胞， 可诱导·引起生物体的CTL反应，在体内可获得显著的抗肿瘤效 果。
实际上在使用免疫功能正常的同系的模型小鼠的实验中，本 发明的癌基因治疗药物表现出显著的抗肿瘤效果。下面将进行详 细叙述，将卵巢癌细胞OVHM向(C57BL/6×C3/He)F1小鼠进行皮 下移植，然后局部注射用导入了卵巢癌特异性启动子的溶瘤腺病 毒感染的载体细胞(A549细胞)，在3个月前预先用腺病毒(Ad -β-gal)实施免疫处理的小鼠中，在给予开始后3-4日就表现 出明显的抗肿瘤效果，9日后肿瘤完全消失，淋巴节转移也消失(参 照以下图7和图18)。
因此，尽管有抗体产生，在有了免疫力的小鼠中获得更强力 而且显著的抗肿瘤效果，可以认为这是由于免疫处理用腺病毒的 给予诱导·引起了生物体的CTL反应(通过细胞损伤性T细胞的细 胞损伤活性)的缘故。即，以往的利用病毒的癌基因治疗难点在 于由于抗体而产生而不能多次给予，而本发明的癌基因治疗药物 通过利用生物体的免疫机构，攻击感染病毒的靶肿瘤细胞，可以 说是将它变成了武器。
免疫处理用病毒和溶瘤病毒最好是使用同种类病毒。对于免 疫处理用病毒最好使用非增殖型病毒和/或灭活的病毒，对非增 殖型病毒再通过紫外线照射等破坏DNA进行灭活就更好。例如， 免疫处理用病毒使用腺病毒时，可以使用E1区缺失的病毒和/或 经紫外线照射破坏DNA灭活的病毒。如此，对于免疫处理用病毒 也可以使用将增殖型病毒经紫外线照射等灭活后的病毒。
在下面的实施例中，作为免疫处理用病毒，使用E1区缺失， 整合了在巨细胞病毒(CMV)启动子的调控下编码β-半乳糖苷酶 (β-gal)的LacZ基因的腺病毒(Ad-β-gal)。当然，作为免 疫处理用病毒并不受此限定，也可以是增殖型腺病毒经紫外线 (UV)灭活的病毒，最好是对没有整合LacZ基因以及其它任何基 因、只有PolyA序列的非增殖型腺病毒(Ad-PolyA)进行紫外线 照射灭活后使用。
在本发明的癌基因治疗药物中，免疫处理用病毒的给予量虽 然可以根据患者的抗病毒抗体效价、肿瘤的大小·种类、症状程度、 患者年龄、体重等适当选择，但最好是根据抗病毒抗体为阳性， 还是阴性来改变给予量。例如，作为免疫处理用病毒和溶瘤病毒 使用5型腺病毒时，对于对该腺病毒为抗体阴性(-)的患者，将 免疫处理用病毒的给予量大约定在105病毒粒子～1011病毒粒子， 而对于对该腺病毒为抗体阳性(+)的患者，将免疫处理用病毒 的给予量大约定在102病毒粒子～107病毒粒子。免疫处理用病毒 的给予方法虽然没有特别限定，但最好是通过皮内注射或皮下注 射的方法给予。
另外，在实验等中，对小鼠、大鼠等动物给予本发明的癌基 因治疗药物时，考虑体重差别后，可以按照给予人时的大约1000 分之一的量设定各药剂的给予量。
从给予免疫处理用病毒至给予载体细胞的期间大约设定在2 周～3个月，希望尽可能缩短期间。在下面的实施例中，通过对免 疫处理用病毒(腺病毒)进行紫外线照射灭活，已经可以将上述 期间缩短到3周～4周左右。
有关病毒感染载体细胞的给予量等前面已叙述过，可将通过 载体细胞一次给予溶瘤病毒的给予量大约设定在109病毒粒子～ 1014病毒粒子，将溶瘤病毒对载体细胞的感染量大约设定在 0.1vp/cell～2000vp/cell(优选5vp/cell～500vp/cell，更优选 150vp/cell～400vp/cell)。
在给予免疫处理用病毒的同时、或在其前后，最好给予用于 肿瘤免疫的肿瘤细胞(癌细胞)。即，在通过免疫处理用病毒进行 免疫的同时、或在其前后，最好利用肿瘤细胞进行接种(疫苗)(通 过给予预先进行了放射线、乙醇、甲醛等处理的肿瘤细胞，可做 到提高生物体对治疗对象肿瘤细胞的免疫应答)。
作为上述接种(疫苗)(肿瘤免疫)中使用的肿瘤细胞，希望 使用来自患者的肿瘤细胞，也可以使用被认为对与此细胞类似的 抗原进行提示的一般可获得的肿瘤细胞。在下面的实施例中，在 研究对卵巢癌(OVHM)治疗效果的实验中，肿瘤免疫中使用与 治疗对象肿瘤细胞种类不同的肿瘤细胞(扁平上皮癌细胞SCC7或 肺癌细胞A549细胞)时也证实了良好的癌治疗效果。
在上述接种(疫苗)(肿瘤免疫)中，肿瘤细胞的给予量没有 特别限定，例如，可以设定在大约105细胞数～1010细胞数。对肿 瘤细胞的放射线照射量最好设定在120Gy～600Gy(更优选 200Gy～500Gy)左右，肿瘤细胞的给予方法最好是使用皮内注 射或皮下注射的方法给予。
另外，为了提高在治疗对象癌中的病毒产生量，可以给予铁 剂和/或给予卟啉化合物。作为卟啉化合物如5-氨基酮戊酸(5 -aminolevulinic acid：ALA)、血卟啉(hematoporphyrin)、 光卟啉(photofrin)等。作为铁剂，口服剂如硫酸亚铁(FeSO4)、 柠檬酸亚铁、静脉注射用铁剂如硫酸软骨素铁、含糖氧化铁。给 予方法没有特别限定，最好是与本发明的癌基因治疗药物一起以 注射剂或口服剂形式给予。
实际上通过给予铁剂(Fe)和/或5-氨基酮戊酸(ALA)， 可以显著亢进溶瘤腺病毒AdE3-1A1.3B的癌细胞增殖抑制效果 (参照图15-17和图28)。
最好是与载体细胞一起给予端胶原(通过用胃蛋白酶处理等 只将胶原的末端肽键切断，使分子量变小，成为水溶性蛋白)。如 下面的实施例给出的那样，当将端胶原与载体细胞同时给予时， 由副作用所导致的死亡率锐减(图24)。这可以认为是在溶瘤腺病 毒的扩散被端胶原抑制的同时，发生了对抗腺病毒抗体的封闭的 缘故。
因此，通过将端胶原与载体细胞同时给予，可抑制副作用， 溶瘤病毒的高给予成为可能。端胶原可以使用市售品(例如，株 式会社高研的制品)，或使用胶原经胃蛋白酶处理等制造的产品。 端胶原最好是与载体细胞一起混在注射液中给予，药液中浓度为 0.01—3.0％(w/v)左右被认为可充分发挥效果。(在下面的实施 例中，即使药液中为0.1—0.2％的低浓度也充分证实了效果。)
另外，如上所述，为了提高免疫反应，最好给予不仅感染溶 瘤病毒、而且还感染GM-CSF表达载体的载体细胞，譬如双重感 染病毒载体的载体细胞(或也可以采用同时给予使两载体分别感 染的载体细胞的方法)。
对于GM-CSF表达载体最好使用与溶瘤病毒同种类的病毒 载体。例如，使用腺病毒作为溶瘤病毒时，对于GM-CSF表达载 体可以使用E1区缺失、整合了编码GM-CSF(granulocyte- macrophage colony stimulating factor：粒细胞·巨噬细胞集落 刺激因子)的GM-CSF基因的腺病毒。
因此当使病毒载体感染载体细胞时，将溶瘤病毒和GM-CSF 表达载体两者合起来的感染量大约定为5病毒粒子/细胞～2000 病毒粒子/细胞。
实际上通过使用GM-CSF表达载体证实了非常好的癌治疗 效果(图27)。
另外，也可考虑取代使用GM-CSF表达载体，使用将GM- CSF蛋白与载体细胞一起混在注射液或经静脉全身给予的方法。
本发明的癌基因治疗药物的使用方法显然并不限定于上述的 方法，可以考虑各种各样的使用例子。例如，为了提高溶瘤病毒 的感染力，也可以将本发明的癌基因治疗药物与其它的抗癌剂或 放射线照射等并用。
关于本发明的癌基因治疗药物的较佳使用例，分为(1)对于 免疫处理用病毒的抗体为阴性的患者情况，(2)该抗体为阳性的 患者情况进行说明。
上述(1)的情况，对于免疫处理用病毒，例如，将上述的非 增殖型腺病毒经紫外线照射灭活后使用。给予量大约定为105vp至 1011vp左右。在给予免疫处理用病毒的同时，给予大约105个至1010 个用于肿瘤免疫的用200Gy左右进行放射线处理的来自患者的肿 瘤细胞(癌细胞)。免疫处理用病毒和肿瘤细胞的给予方法采用皮 内注射或皮下注射。
在给予免疫处理用病毒和肿瘤细胞后大约3-4周后，通过肿 瘤内注射给予载体细胞。载体细胞的给予量定为例如每1次1×107 个—1×1010个左右。使用A549细胞作为载体细胞，经150Gy至 400Gy左右放射线处理后给予。溶瘤病毒和GM-CSF表达载体使 用腺病毒，分别按照250vp/cell左右、5-20vp/cell左右使载体细 胞感染。注射液中按照液中浓度大约为0.1-0.2％那样混合端胶原 后注射。另外同时将铁(Fe)按照40-100mg左右进行静脉注射。 或同时将ALA按照2-2000mg给予到肿瘤内。
将以上操作作为1次，给予1-6次载体细胞等。当多次给予时， 可以连日或每隔2、3日注射。
患者为抗体阳性的上述(2)的情况，除了将免疫处理用病毒 的给予量定为大约105vp或其以下以外，与上述(1)同样，给予 本发明的癌基因治疗药物。
作为本发明的癌基因治疗药物的具体例子，可举例如(1)配 合了免疫处理用病毒和载体细胞的药，(2)以及再配合使载体细 胞感染的溶瘤病毒的药，(3)在上述(1)或(2)的配合中再配 合端胶原的药，(4)在上述(1)～(3)的配合中再配合GM- CSF表达载体的药，(5)在上述(1)～(4)的配合中再配合用 于提高病毒产生量的铁剂和/或卟啉化合物的药，(6)在上述 (1)～(5)的配合中再配合用于肿瘤免疫而给予的肿瘤细胞的 药，(7)在上述(1)～(6)的配合中配合保存、感染·培养、医 药制剂的制备等必需的化合物(试剂、缓冲液、酶等)、或容器(反 应用、感染·培养用、保存用等)等的药。
实施例
以下参照附图，对本发明的实施例进行说明，但本发明并不 限定于这些实施例。
〔实施例1：载体细胞的筛选以及在抗体存在下的抗肿瘤效 果〕
为了在已有的癌细胞株中筛选作为载体细胞发挥强力的癌细 胞增殖抑制效果的细胞株，进行以下实验。
作为使载体细胞感染的溶瘤病毒使用腺病毒AdE3-1A1.3B (IAI.3B)。该腺病毒AdE3-1A1.3B含有E1A基因和E3基因，而 且是在E1A基因上游含有作为肿瘤特异性启动子的卵巢癌特异性 1A1.3B启动子(IAI.3B启动子)的腺病毒。使该腺病毒AdE3- 1A1.3B对各种载体细胞按照500vp/cell感染2日后，将该载体细胞 加到培养到第2天的卵巢癌细胞株HEY中，在培养第5天调查该细 胞株HEY的体外增殖抑制效果。
上述实验结果如图1所示。图1的图表纵轴表示得到的有关各 种候选细胞株的50％增殖抑制效果(IC50)的细胞数，细胞数越 少的细胞株，其增殖抑制效果越高。如该图表示的那样，在此次 研究的癌细胞株中，293细胞、A549细胞、SW 626细胞、HT—3 细胞(HT—III细胞)依次表现出很高的增殖抑制效果。293细胞、 A549细胞和SW 626细胞与以往作为载体细胞使用的PA-1细胞 相比，表现出高出大约100倍左右的增殖抑制效果。HT—3细胞也 表现出与SW 626细胞同等程度的高的增殖抑制效果。
然后，在单独使用溶瘤病毒的场合下和使用载体细胞的场合 下，对在病毒抗体存在下增殖抑制效果怎样变化进行了研究。载 体细胞使用293细胞，使上述腺病毒AdE3-1A1.3B感染该293细 胞2日，将得到的腺病毒AdE3-1A1.3B感染293细胞和其细胞上 清(AdE3-1A13B 293 cell+SUPT)在抗腺病毒抗体存在下加到 12孔板中。各孔中前一天加有5万个左右的卵巢癌细胞株HEY。对 于抗腺病毒抗体，将具有600倍抗体效价的抗体稀释为各种各样的 抗体效价后使用。同样，作为单独使用溶瘤病毒的场合，将腺病 毒AdE3-1A1.3B在抗腺病毒抗体存在下按照1孔1000vp/cell加 到12孔板中。然后对于在各个场合下培养到第5天的癌细胞(HEY 细胞)的增殖抑制效果进行研究。
上述实验结果如图2所示。该图表的纵轴表示得到50％的增殖 抑制效果(IC50)时的抗腺病毒抗体的稀释度。即，使用293细 胞时，即使稀释5倍左右(120倍的抗体效价)也可获得50％的增 殖抑制效果，单独使用腺病毒的场合通过稀释600倍左右(1倍的 抗体效价)可获得50％的增殖抑制效果。因此使用载体细胞时显 示出即使在抗体效价高的条件下也能发挥增殖抑制效果。
同样在抗腺病毒抗体存在下，研究在(1)腺病毒感染293细胞 的上清和细胞成分(AdE3-1A13B 293 cell+SUPT)、(2)含有腺 病毒的细胞上清(AdE3-1A13B，SUPT)、(3)含有腺病毒的细胞 上清经0.2μm过滤膜处理(AdE3-1A13B，SUPT，filter)、(4)单 独使用腺病毒(AdE3-1A13B)等的各个场合下对HEY细胞的增 殖抑制效果。研究结果如图3所示。该图表的纵轴表示获得50％增 殖抑制效果(IC50)时的抗腺病毒抗体的稀释度。如该图表示的 那样，使用载体细胞(293细胞)的场合与其它场合相比可获得更 强力的抗肿瘤效果。
另外在与上述同样的实验中，对于293细胞、A549细胞、SW 626细胞、HT—3细胞的各载体细胞，在具有600倍抗体效价的抗 腺病毒抗体存在下(Ab(+))、或不存在下(Ab(-))研究对癌 细胞株HEY细胞的增殖抑制效果。其结果如图4所示。该图表的纵 轴表示培养第5天的癌细胞数。如该图所示那样，在上述4种细胞 中，使用A549细胞作为载体细胞时，表现出最强力的增殖抑制效 果。即在足量的抗腺病毒中和抗体存在下给予腺病毒感染A549细 胞，靶癌细胞的增殖尽管在抗体存在下也几乎完全被抑制。至于 另外3种细胞在抗体存在下也获得了充分的增殖抑制效果。
利用病毒进行癌基因治疗的难点在于由于抗病毒的中和抗体 的产生而不能多次给予，通过使用载体细胞，利用细胞间相互作 用可直接感染靶癌细胞，从而可以多次给予。另外，通过使用上 述4种细胞作为载体细胞，可以获得强力的抗肿瘤效果。
〔实施例2：裸鼠皮下肿瘤模型中的体内抗肿瘤效果〕
以下，使用裸鼠皮下肿瘤模型，对用上述腺病毒AdE3- 1A1.3B感染的各载体细胞的体内抗肿瘤效果进行研究。在实验 中，将人卵巢癌细胞RMG-1移植到出生后5周的裸鼠皮下，4周 后、对于变成直径约10-15mm的巨大肿瘤，向肿瘤内注射6次各 载体细胞，观察肿瘤体积的变化。观察的结果如图5的图表所示。 图表中、黑方块的“对照”是肿瘤内注射6次PBS缓冲液的结果、 黑圆的“AdE3-1A1.3B”是按照1只小鼠1×1010病毒粒子给予上 述腺病毒AdE3-1A1.3B的结果、黑三角是按照1只小鼠1×107个 给予用腺病毒AdE3-1A1.3B以250vp/cell感染的SW 626细胞的 结果、黑菱形是按照1只小鼠1×107个给予用腺病毒AdE3- 1A1.3B以25vp/cell感染的293细胞的结果、白方块是按照1只小鼠 1×107个给予用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的293细胞 的结果。如该图表示的那样，使用293细胞和A549细胞作为载体 细胞时，给予后经过50天，直径约10-15mm的巨大肿瘤完全消 退。SW 626细胞表现出98％的增殖抑制效果。
将人卵巢癌细胞PA-1移植到出生后5周的裸鼠皮下进行与 上述同样的实验。其结果如图6所示。如该图所示那样，使用293 细胞和A549细胞作为载体细胞，直径约10-15mm的巨大肿瘤完 全消退。SW 626细胞使得5只小鼠中的4只的肿瘤完全消失。
〔实施例3：在具有免疫力的皮下肿瘤模型小鼠中的体内抗肿 瘤效果〕
以下，使用免疫功能正常的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠对本发 明的癌基因治疗药物的体内抗肿瘤效果进行研究。在本实验中， 对有关如下场合的抗肿瘤效果进行研究：(1)对同系的模型小鼠皮 下移植同种卵巢癌细胞OVHM，对移植10日后形成的5-10mm皮 下肿瘤，向肿瘤内给予6次用上述腺病毒AdE3-1A1.3B以 250vp/cell感染的放射线处理(放射线治疗)后的A549细胞的场 合，(2)通过给予作为免疫处理用病毒的腺病毒，对出生后7周的同 系的模型小鼠进行预先免疫，免疫3个月后，与上述(1)的场合同样， 皮下移植卵巢癌细胞OVHM，移植10日后，向肿瘤内给予6次用上 述腺病毒AdE3-1A1.3B以250vp/cell感染的放射线处理后的 A549细胞的场合，(3)作为对照，向肿瘤内给予6次PBS缓冲液的 场合等。
图7的图表给出了上述实验结果。图表中，黑方块的“对照” 是上述(3)的对照场合的结果，黑圆的“Ad(-)→A549”是上述(1) 的未给予免疫处理用腺病毒时的结果，黑三角的“Ad(+)→A549” 是上述(2)的给予免疫处理用腺病毒时的结果。另外，免疫处理用 腺病毒使用不含有E1基因的非增殖型腺病毒，更具体讲使用在 CMV启动子的下游插入了LacZ基因的腺病毒。如该图表示的那 样，在预先没有用腺病毒免疫的上述(1)的情况下，与对照相比表 现出20％的抗肿瘤效果，与此相反，在预先用腺病毒实施免疫处 理的上述(2)的情况下，在给予开始后3-4日表现出明显抗肿瘤效 果，9日后肿瘤完全消失，淋巴节转移也消失。因此，可以认为尽 管有抗体产生，在有了免疫力的小鼠中获得更强力而且显著的抗 肿瘤效果是由于免疫处理用腺病毒的给予而诱导·引起生物体的 CTL反应的缘故。
溶瘤病毒通过细胞间相互作用，由载体细胞到靶肿瘤细胞进 行感染，在肿瘤细胞内进行特异增殖，可以发挥融解·杀伤肿瘤细 胞的细胞溶菌作用，在本发明的癌基因治疗药物中，认为通过预 先给予免疫处理用腺病毒，诱导生物体排除感染了溶瘤腺病毒的 靶肿瘤细胞的强的CTL反应，可诱导腺病毒感染肿瘤细胞的完全 自然排除。
作为腺病毒感染靶肿瘤细胞的感染方法之一，可以考虑腺病 毒引起的细胞融合。图8给出了向加入了A549细胞的孔中按照每1 细胞10000病毒粒子加入经紫外线照射灭活的腺病毒，培养过夜后 通过显微镜观察的结果。如该图中箭头表示的那样，通过加入腺 病毒引起细胞融合，在各处看到多核细胞。在没有给予腺病毒的 A549细胞中没有观察到这样的变化(参照图9)。
除了细胞融合以外，作为可考虑的感染方法，认为通过载体 细胞附着靶细胞，再通过局部的腺病毒的猝发或通过含有腺病毒 的载体细胞片段可做到使腺病毒感染靶肿瘤细胞。无论那一种方 法，在感染了病毒的靶肿瘤细胞中，含有肿瘤特异性启动子的腺 病毒增加，成为强力的免疫原(或通过对感染了腺病毒的靶肿瘤 细胞所含有的癌特异性肽进行二次抗原识别)，认为通过CTL反应 可以排除肿瘤细胞。
〔实施例4：使用中期因子启动子时的抗肿瘤效果〕
接下来对使用中期因子启动子时的抗肿瘤效果进行研究。图 10(a)是通过RT-PCR对中期因子(MK)mRNA在1～21个人 手术标本中的表达进行研究的结果。如该图表示的那样，证实中 期因子mRNA在成神经胶质细胞瘤(glioblastoma)、称为未分化 星形细胞瘤(anaplastic astrocytoma)的恶性神经胶质瘤 (malignant glioma)和弥散性星形细胞瘤(diffuse astrocytoma)中过量表达。因此，确认中期因子在脑肿瘤等很多 癌中过量表达。
图10(b)是用与上述同样的方法，通过RT-PCR对中期因 子mRNA在恶性神经胶质瘤的4个细胞株中的表达进行研究的结 果。如该图表示的那样，证实在4个细胞株中，在U87MG中没有 表达，在U251MG、LN319、U373MG中中期因子mRNA过量表 达。
图10(c)是通过免疫印迹法解析对中期因子蛋白在上述各细 胞株中的表达进行研究的结果，证实与mRNA同样在U87MG没有 表达，中期因子蛋白在U251MG、LN319、U373MG过量表达。
然后进行中期因子的启动子分析。在实验中，比较了长度不 同的2个中期因子启动子(600个碱基与2300个碱基)的活性。将 在各个启动子的下游插入了虫荧光素酶基因的质粒(pGL3- MK600和pGL3-MK2300)导入上述各细胞株，通过研究各个细 胞株的虫荧光素酶活性来评价启动子活性。其结果如图11表示的 那样，在恶性神经胶质瘤细胞株中，长度为600个碱基的启动子表 现出比长度为2300个碱基的启动子更高的启动子活性。
图12(a)是表示此次设计的含有中期因子启动子的溶瘤(细 胞溶菌型)腺病毒构造的模式图。长度为600个碱基或2300个碱 基的中期因子启动子被导入到552bp的位置。
图12(b)是使3种腺病毒感染上述各细胞株，通过免疫印迹 法解析对E1A蛋白在各个细胞株中的表达进行研究的结果。如该 图表示的那样，用含有长度为600个碱基的中期因子启动子的腺病 毒(AdMK600)感染时，只在表达中期因子的U251MG、LN319、 U373MG中观察到腺病毒的E1A蛋白的表达。与此相反，使用野 生型的腺病毒(AdWild)时，在包括正常脑细胞在内的所有细胞 中都可观察到E1A蛋白的表达，使用对照病毒AdLacZ时，无论在 那一个细胞中都没有观察到E1A蛋白的表达。
图13(a)是对3种腺病毒产生的癌细胞增殖抑制效果进行比 较研究的结果。使用野生型的腺病毒(AdWild)时，在所有细胞 中都表现出强的增殖抑制效果，而使用含有中期因子启动子的腺 病毒(AdMK600和AdMK2300)时，只在表达中期因子的 U251MG、LN319、U373MG中表现出增殖抑制效果，这些值与 中期因子mRNA的表达量、启动子活性密切相关。另外，与含有 长度为2300个碱基的中期因子启动子的腺病毒AdMK2300相比， AdMK600表现出强的增殖抑制效果。
图13(b)是研究腺病毒的E3区对增殖抑制效果的影响的结 果，如该图表示的那样，含有E3区的AdMK600表现出比没有E3 区的腺病毒(AdMK600—ΔE3)强10倍左右的增殖抑制效果。
图13(c)是对腺病毒在肿瘤直径5-10mm左右大小的裸鼠 皮下移植模型中的抗肿瘤效果进行研究的结果。图中，黑菱形是 给予野生型腺病毒AdWild的结果，黑方块是给予含有中期因子启 动子的腺病毒AdMK600的结果，黑三角是给予插入了LacZ基因的 腺病毒Ad-β-gal的结果，黑圆是只给予PBS缓冲液的结果。如 该图表示的那样，在不表达中期因子的U87MG中只有野生型腺病 毒表现出抗肿瘤效果，而在表达中期因子的U373MG中， AdMK600和AdWild都带来肿瘤的完全消失，在只注射了PBS缓 冲液的对照和注射AdLacZ的模型之间没有看到大的差异。
另外，使含有上述中期因子启动子的腺病毒(Ad-MK600) 感染载体细胞，将该病毒感染载体细胞的抗肿瘤效果与单独给予 Ad-MK600的场合进行了比较。实验中使用293细胞和A549细胞 作为载体细胞。将上述U373MG细胞移植到5周龄裸鼠中，3周后 获得10-15mm的巨大肿瘤后，给予病毒感染载体细胞或只给予 Ad-MK600，给予4周后比较肿瘤体积的大小。结果如图14所示。 图中，“Ad-MK600”是单独给予Ad-MK600的结果、“293” “A549”是分别给予使用293细胞、A549细胞作为载体细胞的病 毒感染载体细胞的结果。如该图表示的那样，给予病毒感染载体 细胞时肿瘤完全消失了。另外单独给予Ad-MK600时与对照 (control)之间几乎看不到差别。
由到此为止的实验结果可以证实通过使用A549细胞、293细 胞等作为载体细胞，使用含有1A1.3B启动子或中期因子启动子的 腺病毒作为溶瘤病毒，实际上对卵巢癌、恶性神经胶质瘤表现出 良好的治疗效果。中期因子启动子对除了恶性神经胶质瘤之外的 各种恶性肿瘤都可以使用，可以认为对除了恶性神经胶质瘤以外 的癌治疗都有效。
〔实施例5：Fe和ALA对腺病毒AdE3-1A1.3B的增殖抑制效 果的影响〕
将卵巢癌细胞HEY按照10000/well加到12孔平皿后，次日按 照50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml的各浓度加入FeSO4，向 所有孔中加入细胞损伤型腺病毒AdE3-1A1.3B，5日后以IC50对 腺病毒的增殖抑制效果进行评价。评价结果如图15所示。图中纵 轴相对地表示在各场合下的IC50的病毒给予量(vp/cell)。如该图 表示的那样，在并用FeSO450μg/ml和腺病毒时，比单独使用腺病 毒表现出约20倍的增殖抑制效果，当并用FeSO45μg/ml和腺病毒 时比单独使用腺病毒表现出约8倍的增殖抑制效果。
接下来将卵巢癌细胞HEY按照10000/well加到12孔平皿后， 次日按照50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml的各浓度加入5- 氨基酮戊酸(ALA)，向所有孔中加入细胞损伤型腺病毒AdE3- 1A1.3B，5日后以IC50对腺病毒的增殖抑制效果进行评价。评价 结果如图16所示。图中纵轴相对地表示在各场合下的IC50的病毒 给予量(vp/cell)。如该图表示的那样，在并用ALA50μg/ml和腺 病毒时，比单独使用腺病毒表现出约100倍的增殖抑制效果。
另外将卵巢癌细胞HEY按照10000/well加到12孔平皿后，次 日按照50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml的各浓度加入FeSO4， 向所有孔中加入细胞损伤型腺病毒AdE3-1A1.3B和5-氨基酮 戊酸(ALA)50μg/ml、或作为对照单独加入腺病毒，5日后以IC50 对腺病毒的增殖抑制效果进行评价。评价结果如图17所示。图中 纵轴相对地表示在各场合下的IC50的病毒给予量(vp/cell)。如该 图表示的那样，在并用FeSO450μg/ml、ALA50μg/ml和腺病毒时， 比单独使用腺病毒表现出约1000倍的增殖抑制效果，当并用 FeSO45μg/ml、ALA50μg/ml和腺病毒时比单独使用腺病毒表现 出约700倍的增殖抑制效果，当并用FeSO40.5μg/ml、ALA 50μg/ml和腺病毒时比单独使用腺病毒表现出约200倍的增殖抑制 效果。
如上所述，显然ALA和Fe对溶瘤腺病毒AdE3-1A1.3B的增 殖抑制效果具有显著的亢进。其理由在于，通过β-gal分析表明 提高腺病毒的感染能力，通过PFU分析表明腺病毒的产生量增加， 显然ALA和Fe可提高腺病毒的感染力，使产生量增加，即随着腺 病毒对癌细胞内的感染力的增加和在细胞内的产生量的增加，显 著提高了抗肿瘤效果。
以前就知道ALA是卟啉代谢物，被整合到癌细胞中，作为其 代谢物的原卟啉IX容易蓄积，由于该代谢物具有光敏作用，与准 分子染料激光器(excimer dye laser)并用，一直用于表面性癌 的PDT治疗(photodynamic therapy)。
上述原卟啉IX通过与Fe结合形成血红素，在细胞内形成细胞 色素等血红素蛋白。该血红素蛋白在细胞内线粒体参与呼吸系统， 在ATP产生中起作用，参与蛋白合成。因此，血红素蛋白由于参 与用于腺病毒感染时产生腺病毒的蛋白合成，所以认为这些卟啉 代谢亢进与腺病毒产生的增加有关联的可能性高。
因此，在本发明的癌基因治疗药物、癌基因治疗方法中，通 过并用这些Fe和/或ALA等卟啉化合物，预期可进一步提高治疗 效果。即，通过并用Fe和/或ALA等卟啉化合物，可直接增加抗 肿瘤效果，甚至在抗体存在下的感染抑制状态下，通过靶细胞的 腺病毒产生的增加所导致的CTL反应的亢进，在同系的小鼠模型 中抗肿瘤效果提高，认为在人中也会呈现出同样的良好的抗肿瘤 效果。
另外在使用溶瘤病毒的癌基因治疗中，即使不使用载体细胞 的场合，预期通过并用Fe和/或ALA等卟啉化合物，也可提高治 疗效果。
〔实施例6：使用本发明的癌基因治疗药物的癌治疗法的最优 化研究〕
为了谋求使用本发明的癌基因治疗药物的癌治疗法的最优 化，进行了以下一系列实验。
首先与图7所示实验同样，使用免疫功能正常的皮下肿瘤模型 小鼠((C57BL/6×C3/He)F1小鼠)，对本发明的癌基因治疗药物的 体内抗肿瘤效果进行了研究。在本实验中，通过给予免疫处理用 病毒预先对出生后5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠进行免疫处 理，免疫12周后，按照1只小鼠1×106个皮下移植卵巢癌细胞 OVHM，形成5-10mm的肿瘤后，向肿瘤内给予用上述腺病毒 AdE3-1A1.3B以250vp/cell感染的A549细胞(Ad-A549)。作 为免疫处理用病毒使用不含有E1基因的非增殖型的腺病毒，更具 体讲，丝焊用在CMV启动子的下游插入了LacZ基因且未经紫外线 等灭活处理的腺病毒Ad-β-gal，将该Ad-β-gal按照每只小鼠 11×1010vp进行皮内给予。另外，载体细胞A549细胞经用200Gy 进行放射线处理后，按照1只小鼠1次5×106个向肿瘤内共计给予6 次。
图18(a)、(b)给出了上述实验结果。各图表中，“Ad-β- gal→Ad-A549”是上述实验结果，“Ad-A549”是只给予载体 细胞的结果，“Ad-β-gal”是没有给予免疫处理用病毒，作为治 疗只给予Ad-β-gal的结果，“对照”是给予PBS缓冲液的结果。 各组小鼠数为n＝5。(a)的图表是在较短期观察各小鼠的肿瘤体 积的结果，(b)的图表是长期观察各组小鼠存活率的结果。如这 些图表示的那样，确认“Ad-β-gal→Ad-A549”具有强力的体 内抗肿瘤效果。
然后对从免疫处理用腺病毒给予至载体细胞给予的给予间隔 进行研究。本实验除了对该给予间隔进行各种各样的改变以及用 腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染载体细胞A549细胞以外， 其它与图18所示实验同样地进行。
图19(a)、(b)给出了上述实验结果。各图表中“2-4w”、 “5-9w”、“10-15w”、“16-22w”为分别将上述给予间隔设定 为2-4周、5-9周、10-15周、16-22周的间隔的实验结果，各 组小鼠数为n＝5。如这些图表示的那样，将上述给予间隔设定为 10-15周时可获得最好的抗肿瘤效果。如本实验那样，当作为免 疫处理用病毒使用未经灭活处理的腺病毒Ad-β-gal时，在给予 该病毒后大约10-15周，认为由T细胞引起的CTL反应与由中和抗 体引起的感染抑制相比处于优势。
如果考虑临床应用，上述给予间隔希望是较短期间。因此， 通过使用灭活处理的腺病毒Ad-β-gal作为免疫处理用病毒，研 究能否将上述给予间隔缩短。研究结果如图20所示那样，可知当 作为免疫处理用病毒使用紫外线(UV)照射灭活处理的腺病毒UV -Ad-β-gal时，将上述给予间隔设定在4周或3周时可获得良好 的抗肿瘤效果，即，通过对免疫处理用病毒进行灭活处理，可以 将上述给予间隔缩短到3-4周左右。
上述实验除了作为免疫处理用病毒使用灭活处理的腺病毒 UV-Ad-β-gal、将上述UV-Ad-β-gal按照每只小鼠 1×107vp进行皮内给予、将上述给予间隔设定为3周、4周、5周或 6周以及使腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染载体细胞A549 细胞方面以外，其它与图18所示实验同样地进行。各组小鼠数为n ＝10。
图21是对将上述UV-Ad-β-gal作为免疫处理用病毒使用 时的该病毒的给予量进行研究的结果。在该实验中，在1×106vp 至1×1011vp范围改变上述UV-Ad-β-gal的给予量。另外，除了 上述给予间隔设定为6周以外，其它与图20所示实验同样地进行。 其结果表明UV-Ad-β-gal给予量为1×107vp时可获得最好的 抗肿瘤效果(根据该结果，在图20所示的实验中，将UV-Ad-β -gal的给予量设定为1×107vp)。
图22(a)、(b)是对肿瘤免疫(tumor vaccination)效果进 行研究的结果。将上述UV-Ad-β-gal按照每只小鼠1×107vp进 行皮内给予，10日后将用于肿瘤免疫的经放射线照射的卵巢癌细 胞OVHM1×106个进行皮下移植。同时将扁平上皮癌细胞SCC7或 卵巢癌细胞OVHM1×106个进行皮下移植，向形成了5-10mm肿 瘤的小鼠肿瘤内给予6次每次5×106个AdE3-1A1.3B感染A549 细胞的小鼠(图中，“OVHM-RT+Ad-β-gal→SCC7”、“OVHM -RT+Ad-β-gal→OVHM”)与对照(图中，不进行肿瘤免疫 而对SCC7肿瘤进行载体细胞治疗的“SCC7”，不进行肿瘤免疫而 对OVHM肿瘤进行载体细胞治疗的“OVHM”)相比，肿瘤的成长 ·增殖被显著抑制，特别是对使用经放射线照射的OVHM进行了肿 瘤免疫、形成OVHM肿瘤的小鼠使用载体细胞进行治疗时，所有 小鼠中肿瘤都消失，没有看到复发。
图23是对使用非小细胞性肺癌细胞A549细胞进行的肿瘤免 疫效果进行研究的结果。在该实验中，将用腺病毒AdE3-1A1.3B 以100vp/cell感染的经放射线处理后的A549细胞按照每只小鼠 1×106个进行皮下移植，移植40日后皮下移植1×106个卵巢癌细胞 OVHM。该小鼠(图中，“AdE3-1A1.3B-感染A549→OVHM”) 与对照(图中，没有进行肿瘤免疫而形成OVHM肿瘤，通过载体 细胞进行治疗的“OVHM”)相比，肿瘤的成长·增殖被显著抑制， 存活率大大改善。
由以上结果可知即使用不同种类的癌细胞进行肿瘤免疫，也 具有抗肿瘤效果。
接下来对将载体细胞和端胶原一起给予时的效果进行研究。 在该实验中，将5×106个用腺病毒AdE3-1A1.3B以规定量感染的 A549细胞给予出生后5-10周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠，此时 混合注入端胶原使其最终浓度达到0.1％，研究是否可改善由于腺 病毒的给予所带来的副作用引起的死亡率。研究结果如图24所示。 图中右侧条是将端胶原与用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell或 250vp/cell感染的A549细胞一起给予的结果，左侧和中央条分别 是给予用腺病毒AdE3-1A1.3B分别以5vp/cell、50vp/cell感染的 A549细胞的结果(没有混合注入端胶原)。如该图表示的那样， 同时给予端胶原时，由副作用引起的死亡率锐减，还可增加给予 量。这可认为是端胶原抑制腺病毒的扩散，并且发生了对抗腺病 毒中和抗体的封闭的缘故。
由以上结果可知通过同时给予端胶原与载体细胞，可以抑制 副作用，可给予高容量的腺病毒。
然后，对给予1次、2次、3次未经灭活处理的上述腺病毒Ad -β-gal、由于猝发效果使得各个血中抗腺病毒抗体增加了的小 鼠中的抗肿瘤效果进行了研究。在该实验中，给予出生后5周的 (C57BL/6×C3/He)F1小鼠1次、2次或3次腺病毒Ad-β-gal(每 次隔3周，1次给予1×1010vp)，然后，按照1只小鼠1×106个皮下移 植卵巢癌细胞OVHM，形成5-10mm肿瘤后，将放射线处理后的 载体细胞给予到肿瘤内。作为载体细胞单独使用A549细胞、或将 A549细胞和293细胞混合使用。
A549细胞和293细胞的混合物，对每只小鼠向肿瘤内注射用 腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549细胞各3.75×106 个，以及用腺病毒AdE3-1A1.3B以10vp/cell感染的293细胞各 3.75×106个，此为一次，共计向肿瘤内注射6次。结果如图25(a)、 (b)所示。而单独使用A549细胞的场合，每只小鼠向肿瘤内注 射用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549细胞各 7.5×106个，此为一次，共计向肿瘤内给予6次。其结果如图26(a)、 (b)所示。在图25和图26中，“×1”“×2”“×3”分别是给予1次、 2次、3次腺病毒Ad-β-gal的结果。如这些图表示的那样，通过 多次给予腺病毒Ad-β-gal，即使在抗腺病毒抗体阳性的小鼠中， 也可确认载体细胞产生的抗肿瘤效果。另外在此次实验中，与单 独使用A549细胞相比，将A549细胞和293细胞混合后作为载体细 胞使用成绩更好。
图27(a)、(b)是对给予不仅用腺病毒AdE3-1A1.3B，而 且用GM-CSF表达载体感染的载体细胞(A549细胞)，并且与该 载体细胞一起给予端胶原时的体内抗肿瘤效果进行研究的结果。 在该实验中，与图26所示实验同样地，向出生后5周的 (C57BL/6×C3/He)F1小鼠给予1次、2次或3次(每次隔3周，1次 给予1×1010vp)腺病毒Ad-β-gal，然后按照1只小鼠1×106个皮 下移植卵巢癌细胞OVHM，形成5-10mm肿瘤后，将放射线处理 后的载体细胞给予到肿瘤内。其中，载体细胞(A549细胞)在用 腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的同时，还用GM-CSF表 达载体(在缺失了腺病毒的E1基因的部位的CMV启动子下游插入 了GM-CSF基因的载体)以10vp/cell感染。将这样制备的经放射 线处理后的A549细胞按照1次7.5×106个与端胶原(浓度0.1％)一 起给予到肿瘤内，向肿瘤内共计给予3次(×3)。
图27(a)、(b)中，“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+GMCSF” 是上述实验结果，“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B”是按照1次 7.5×106个给予只用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的载 体细胞(A549细胞)，向肿瘤内共计给予6次(×6)的结果。如该 图表示的那样，使用“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+GMCSF” 时，尽管给予3次，但与给予6次“AdE3-1A1.3B”相比，给予 腺病毒Ad-β-gal 1次、2次、3次的任一场合都可看到非常强的 体内抗肿瘤效果。
由以上结果可知对载体细胞不仅感染溶瘤腺病毒，而且还感 染GM-CSF表达载体，对癌治疗是非常有效的。
图28(a)、(b)是对在给予载体细胞时还向腹腔内给予铁剂 时的效果进行研究的结果。在该实验中，与图27所示实验同样， 向出生后5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠注射1次、2次或3次(每 次隔3周，1次注射1×1010vp)腺病毒Ad-β-gal，然后，按照1 只小鼠1×106个皮下移植卵巢癌细胞OVHM，形成5-10mm肿瘤 后，将放射线处理后的载体细胞给予到肿瘤内。其中，给予载体 细胞时，向腹腔内给予作为铁剂的铁葡聚糖(Fe-Dextran) 0.01mg。载体细胞使用用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染 的A549细胞，1次7.5×106个向肿瘤内共计给予3次(×3)(每次还 给予铁剂)。
图28(a)、(b)中，“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+Fe”是 上述实验结果，“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B”是按照1次 7.5×106个给予用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的载体 细胞(A549细胞)，向肿瘤内共计给予6次(×6)的结果。如该图 表示的那样，使用“Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+Fe”时，尽 管只是3次，但给予1次、2次、3次腺病毒Ad-β-gal的任一情况 下的载体细胞的治疗与使用AdE3-1A1.3B感染载体细胞6次的 治疗相比，可确认非常强的体内抗肿瘤效果。
由以上结果可知在给予载体细胞时一起给予铁剂对癌治疗是 非常有效的。
接下来，在载体细胞给予前对载体细胞进行的放射线处理中， 对照射的放射线量进行了研究。实验中使用出生后5周的裸鼠，对 A549细胞用不同的放射线量进行放射线处理后，按照每只小鼠 1×107个进行皮下移植，观察肿瘤的形成·成长。其结果如图29所 示。如该图表示的那样，通过将照射的放射线量定在120Gy以上， 可抑制肿瘤的形成·成长。
图30给出了在使用(C57BL/6×C3/He)F1小鼠的实验中，用不 同的放射线量对载体细胞(A549细胞)进行放射线处理时的抗肿 瘤效果的研究结果。在该实验中，向出生后5周的 (C57BL/6×C3/He)F1小鼠给予1×1010vp腺病毒UV-Ad-β- gal，注射5周后，按照每只小鼠1×106个皮下移植卵巢癌细胞 OVHM，形成5-10mm的肿瘤后，向肿瘤内给予以放射线量50Gy、 100Gy、200Gy或400Gy进行放射线处理的载体细胞。载体细胞使 用用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549细胞，每1次 7.5×106个、共计向肿瘤内给予6次。其结果表明在放射线处理中， 照射的放射线量400Gy可获得比200Gy更良好的结果。
图31给出了有关溶瘤病毒对载体细胞的感染量的研究结果。 在该实验中，将腺病毒Ad-β-gal按照1×1010vp给予到出生后5 周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠，给予4周后，按照1只小鼠1×106 个皮下移植卵巢癌细胞OVHM，形成5-10mm肿瘤后，向肿瘤内 给予以放射线量250Gy进行放射线处理的载体细胞。另外，腺病 毒AdE3-1A1.3B对载体细胞(A549细胞)的感染量定在 100vp/cell、250vp/cell或500vp/cell中的任一个，1次给予7.5×106 个载体细胞，向肿瘤内共计给予6次。进一步，在给予载体细胞时， 同时向肿瘤内给予端胶原(浓度0.1％)。其结果可知上述感染量为 250vp/cell时可获得最好结果，如果设定在150-400vp/cell左右 效果也很好。
图32(a)、(b)是在与图31所示实验同样的实验中对肿瘤免 疫效果进行研究的结果。在该实验中，将腺病毒Ad-β-gal按照 1×1010vp给予到出生后5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠中，给予4 周后，按照1只小鼠1×106个皮下移植为了肿瘤免疫而以放射线量 80Gy进行放射线处理的卵巢癌细胞OVHM-RT。然后再皮下移 植1×106个卵巢癌细胞OVHM，形成5-10mm肿瘤后，向肿瘤内 给予以放射线量250Gy进行放射线处理的载体细胞。载体细胞使 用用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549细胞，1次 7.5×106个，共计肿瘤内给予3次。另外，在给予载体细胞时，一 并向肿瘤内给予端胶原(浓度0.1％)。其结果表明进行肿瘤免疫的 小鼠(图中，“OVHM-RT→A549”)，与没有进行肿瘤免疫的小 鼠(图中，“A549”)相比，肿瘤的成长·增殖被显著抑制，存活 率大大改善。
由以上结果可知，在使用本发明癌基因治疗药物时，通过并 用肿瘤免疫，可以获得良好的抗肿瘤效果。
产业上的可利用性
如上所述，本发明的癌基因治疗药物几乎可以适用于所有的 恶性肿瘤，预期对卵巢癌、扁平上皮癌(子宫颈部癌、皮肤癌、 头颈部癌、食道癌、肺癌等)、消化器官癌(大肠癌、胰癌、肝癌、 胃癌等)、成神经细胞瘤、脑肿瘤、乳癌、精巢癌、前列腺癌等各 种癌有强力的抗肿瘤效果。
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