一种细胞免疫疫苗及其制备方法
专利汇可以提供一种细胞免疫疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种细胞免疫 疫苗 及其制备方法。该疫苗是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与单一或多种病原体或其部分组分，或病料共培养后得到的免疫细胞。本发明的疫苗具有以下优点：1)免疫性高；2)安全性高；3)广谱性高；4)保护效果显著。此外，单核/巨噬细胞、树突状细胞的分离、纯化及体外培养方法简单，可大量获得，因而该疫苗的制备方法简单、成本低廉，具有工业化生产的可行性。本发明的疫苗及其制备方法将在医学、动物生产领域，特别是各种自体免疫 疾病 的 预防 与免疫 治疗 方面发挥重要作用，应用前景广阔。，下面是一种细胞免疫疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。
1、一种细胞免疫疫苗，是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与经纯化的单一或多种 病原体或其部分组分，或未经纯化的病料共培养后得到的免疫细胞。
2、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述病原体为致病微生物、寄生 虫，或者是灭活的致病微生物或寄生虫；所述病源体的部分组分为病原体的蛋白质或 RNA。
3、根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述病料为肿瘤细胞。
4、一种制备权利要求1所述疫苗的方法，是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与单 一或多种病原体或其部分组分，或病料在36-38℃下共培养24-72h，清洗细胞，得到 疫苗；所述单核/巨噬细胞或树突状细胞与病原体的比例为1∶1-10000，所述单核/ 巨噬细胞或树突状细胞与病料的比例为1∶1-10000。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述单核/巨噬细胞或树突状细胞 来源于动物的外周血、骨髓、组织，或经体外诱导分化获得。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述单核/巨噬细胞或树突状细胞 的体外诱导分化方法为：将单个核细胞用添加有浓度为10-100μg/mL细胞因子的 RPMI1640或TCM199完全培养液在36-38℃下培养1-10d，得到单核/巨噬细胞或树突 状细胞；所述细胞因子为GM-CSF、M-CSF、IL-4和IL-6中的一种或几种。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述单个核细胞来源于哺乳动物 或鸟类动物；所述哺乳动物为人、牛、猪、犬、猫或鹿，所述鸟类动物为鸡、鸵鸟或 孔雀。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：对单个核细胞进行纯化的方法为： 对单个核细胞用RPMI1640或TCM199完全培养液在36-38℃下培养5-7d，待细胞贴壁 后，移走悬浮细胞，得到纯化的单个核细胞。
9、根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于：所述病原体为致病微生 物、寄生虫，或者是灭活的微生物或寄生虫；所述病源体的部分组分为病原体的蛋白 质或RNA。
10、根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于：所述共培养培养基为 添加体积百分浓度8-12％血清的RPMI1640或TCM199完全培养基。
技术领域
本发明涉及疫苗及其制备方法，特别是涉及一种在细胞水平上对多种传染性疾病 具有预防保护作用的疫苗及其制备方法。
背景技术
此外，利用高致死性病原体实施的恐怖袭击，会对人类社会造成巨大的恐慌与威 胁，比如炭疽的使用，已经给美国及其它国家敲响了警钟，为此各国政府积极研究生 物防恐措施，其中，新型的免疫接种与治疗方法将在生物反恐中发挥重要作用。
预防接种是预防传染性疾病的主要方法，为人类医学的发展和畜牧生产水平的提 高起到了巨大的推动作用，现在依然是抗病的重要手段与方法。目前进行疫苗研究的 主要对象是引发疾病的致病源(或病源体等)，但由于病原体的突变速度较快，研制 疫苗的速度远远滞后，往往造成疾病流行早期的无法控制，为此将付出惨痛代价。另 外，由于超强毒株的出现，通过病原体对新宿主的适应或定向突变，还会引发跨物种 的传播与流行。迫切需要一种新的预防接种方法，以应对新病源体的突变与疾病的流 行，将在应战生物恐怖袭击、提前发现病原体的生物学特性、进行超早期预防接种等 方面发挥重要作用。
众所周知，机体对病原体的防御主要通过三个方面实现：一、通过表皮与粘膜等 防止病原体侵入机体；二、利用免疫细胞消灭侵入的病原体，也被称为非特异性免疫； 三、利用病原体特异性标志在细胞与体液两个方面进行特异性免疫，又被称为获得性 免疫。预防接种主要是引发特异性免疫，同时利用免疫细胞的记忆性，实现免疫接种 后长期有效的目的。
在诱发免疫反应的过程中，首先是病原体侵入机体，机体内的上皮细胞、单核/ 巨噬细胞等具有抗原呈递功能的细胞将病原体吞噬、消化，在MHC I和MHC II的协 同作用下，将分离出的抗原片段运送到细胞表面，之后呈递给T细胞，诱发细胞与体 液免疫反应。在抗原呈递过程中，单核/巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cell， DC)和B细胞的呈递效率较高，因此也被称为专职抗原呈递细胞。
单核细胞由骨髓的造血干细胞分化而来，在血液中停留一段时间后进入不同的组 织后，或保持单核细胞特性(如单核细胞侵润)，或分化成巨噬细胞。组织内的巨噬 细胞依据其所在组织的类型不同其名字也有不同，在上皮组织中的叫朗格汉斯细胞， 在肺组织中的巨噬细胞叫做肺巨噬细胞，在肝脏被称为枯否(Kupffer)细胞等等。 一般认为除少数单核细胞或低分化的巨噬细胞外，成熟的巨噬细胞很少有或没有增殖 能力，并不断被骨髓前体细胞分化的细胞所补充。
发明内容
本发明所提供的细胞免疫疫苗，是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与纯化的单一 或多种病原体或其部分组分，或未经纯化的病料共培养后得到的免疫细胞。
所述病原体可以是致病微生物(包括病毒)、寄生虫，或者是灭活的微生物或寄 生虫；所述病源体的部分组分可为病原体的蛋白质或RNA。所述病料可为肿瘤细胞等。
本发明的第二个目的是提供一种上述细胞免疫疫苗的制备方法。
本发明所提供的细胞免疫疫苗的制备方法，是将单核/巨噬细胞或树突状细胞与 单一或多种病原体或其部分组分，或病料在36-38℃下共培养24-72h，清洗细胞，得 到疫苗；所述单核/巨噬细胞或树突状细胞与病原体的比例为1∶1-10000，所述单核/ 巨噬细胞或树突状细胞与病料的比例为1∶1-10000。
在上述疫苗的制备方法中，所述单核/巨噬细胞或树突状细胞可直接来源于动物 的外周血、骨髓、组织，或经体外诱导分化间接获得。
其中，单核/巨噬细胞或树突状细胞的体外诱导分化方法可为：将单个核细胞用 添加有浓度为10-100μg/mL细胞因子的RPMI1640或TCM199完全培养液在37℃下培 养1-10d，得到单核/巨噬细胞或树突状细胞；所述细胞因子为GM-CSF、M-CSF、IL-4 和IL-6中的一种或几种。
所述单个核细胞的来源是广泛的，即具有单个核细胞的动物均可，包括人、牛、 猪、犬、猫、鹿等哺乳动物，以及鸡、鸵鸟、孔雀等鸟类动物。
可采用常规方法进行单个核细胞的分离，例如：静脉采血，用体积百分浓度为 2.5-5％的肝素纳或2.5-5％的柠檬酸钠溶液抗凝血，再从抗凝血中用淋巴细胞分离液 通过密度梯度离心法分离得到单个核细胞。所述淋巴细胞分离液可采用市售的即可。
为获得更纯的单个核细胞，可对单个核细胞进行纯化，纯化方法可为：对单个核 细胞进行体外培养，待细胞贴壁后，移走悬浮细胞，得到纯化的单个核细胞。
所述单个核细胞的体外培养条件可为：用RPMI1640或TCM199等完全培养液在 36-38℃下培养1-7d。
所述病原体可以是致病微生物(包括病毒)、寄生虫，或者是灭活的微生物或寄 生虫；所述病源体的部分组分可为病原体的蛋白质、RNA等。
所述共培养培养基采用添加体积百分浓度8-12％血清的常规动物细胞培养基即 可。所述血清可为胎牛血清等，动物细胞培养基可为RPMI1640或TCM199等完全培养 基。
本发明疫苗在使用时，可将其回输至皮下、淋巴结、肌肉、血液、粘膜等可以引 发免疫反应的相关部位，通过诱发体内免疫反应达到对疾病预防和/或治疗的作用。
本发明提供了一种细胞免疫疫苗及其制备方法。该疫苗是将单核/巨噬细胞或树 突状细胞与纯化的单一或多种病原体或其部分组分，或病料共培养，在体外条件下实 现了抗原呈递，回输体内后可诱发免疫反应，达到对疾病预防和/或治疗的作用。本 发明的疫苗具有以下优点：1)免疫性高，该疫苗可强烈地引发特异性抗体产生，抗 体效价可达到1∶10-100000；2)安全性高，检测了体外攻击24小时后病原体在单核 /巨噬细胞内的消化情况，结果没有发现存活的病原体；3)广谱性高，动物机体的特 异性免疫都是通过单核/巨噬细胞或树突状细胞来实现的，因此该疫苗适用于除了攻 击免疫细胞的病原体之外的所有致病生物；4)单核/巨噬细胞或树突状细胞具有自动 处理与加工抗原的能力，比人为筛选的抗原表位更加准确，速度更快，可以说是抗原 加工的自动化处理机器，因此用该疫苗处理未知病原体，可作为疾病爆发初期的一种 预防手段；4)疗效显著，对鸡白痢病、猪丹毒病等均具有较好的治疗效果。此外， 单核/巨噬细胞、树突状细胞的分离、纯化及体外培养方法简单，可大量获得，因而 该疫苗的制备方法简单、成本低廉，具有工业化生产的可行性。本发明的疫苗及其制 备方法将在医学、动物生产领域，特别是各种自体免疫疾病的预防与免疫治疗方面发 挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
说明书附图
图1为将纯化单个核细胞的吖啶橙(AO)染色、姬姆萨染色和CD14间接免疫荧光 染色鉴定结果
具体实施方式
实施例1、鸡白痢病疫苗的制备及其检测
一、制备疫苗
1、单个核细胞的获取与纯化
1)单个核细胞的分离
从鸡中分离单个核细胞，具体方法为：将鸡翅下静脉采血部位消毒，静脉采血， 加入体积百分浓度为5％的肝素钠溶液抗凝血，再从抗凝血中用淋巴细胞分离液(购 自Cedarlane公司)通过密度梯度离心法分离得到单个核细胞。
2)单个核细胞的纯化
将单个核细胞用RPMI1640完全培养液在37℃、5％CO2保和湿度培养箱中培养 8-24h，待细胞贴壁后，移走悬浮细胞，对贴壁细胞进行吖啶橙(AO)染色、姬姆萨染 色和CD14间接免疫荧光染色鉴定，结果如图1所示(a-1为新分离的单个核细胞(还 有其它一些细胞)进行吖啶橙染色的结果，三种箭头标识的细胞从上到下分别为单个 核细胞、粒细胞、淋巴细胞，a-2为荧光显微镜下的观察结果。b-1为培养7d的单个 核细胞进行姬姆萨染色的结果，b-2为部分放大。c-1为培养7d的单个核细胞进行CD14 间接免疫染色的结果，c-2为荧光显微镜下的观察结果(标尺为30μm))，表明获 得了纯度较高的单个核细胞。
3)单核/巨噬细胞的获得
将纯化的单个核细胞用RPMI1640完全培养液在37℃下培养5天，得到单核/巨噬 细胞。
3、鸡白痢病疫苗的制备
取鸡白痢沙门氏菌与单核/巨噬细胞按1000∶1的比例混合，用添加体积百分浓 度10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基在37℃的CO2培养箱中共培养1h，洗去未被 消化的病原体，分两组，分别继续培养1h(A组)、24h(B组)小时，得到已吞噬病 菌的免疫细胞，可作为鸡白痢病疫苗。
二、效价测定
将步骤一获得的B组免疫细胞按1000个/只的剂量回输到鸡的皮下部位，以诱发 免疫反应。注射后14d，用ELISA法检测免疫鸡的抗体效价，结果达到1∶10-100000， 表明用本发明方法制备的鸡白痢病疫苗可诱发机体的免疫反应。
三、安全性检测
将步骤一获得的A、B两组免疫细胞用PBS洗涤3次，然后加入1mL 1％Triton-X 100裂解细胞膜释放胞内菌，然后稀释100倍，取200μl涂布于营养肉汤琼脂平板(购 于北京奥博星生物技术责任有限公司)上，24小时后计数菌落数。结果A出现菌落，而 B组没有发现菌落，说明病原体已经被免疫细胞所消化，没有相应的病原体产生，证 明用本发明方法制备的疫苗具有较高的生物安全性。
四、免疫效果检测
将步骤一获得的B组免疫细胞按1000个/只的剂量回输到未接触过鸡白痢沙门氏 菌的健康鸡个体，使其获得免疫记忆。然后用浓度为107个/mL的沙门氏菌攻毒，结果 获得100％保护，表明用本发明方法制备的鸡白痢沙门氏菌疫苗对鸡白痢病具有较好 的效果。
实施例2、猪丹毒疫苗的制备及其检测
一、制备疫苗
1、单个核细胞的获取与纯化
1)单个核细胞的分离
从猪中分离单个核细胞，具体方法为：将猪前腔静脉采血部位消毒，静脉采血， 加入体积百分浓度为5％的柠檬酸钠溶液抗凝血，再从抗凝血中用淋巴细胞分离液通 过密度梯度离心法分离得到单个核细胞。
2)单个核细胞的纯化
将单个核细胞用RPMI1640完全培养液在37℃培养箱中培养24-48h，待细胞贴壁 后，移走悬浮细胞，对贴壁细胞进行吖啶橙(AO)染色、姬姆萨染色和CD14间接免疫 荧光染色鉴定，鉴定结果表明获得了纯度较高的单个核细胞。
3)单核/巨噬细胞的获得
将纯化的单个核细胞用RPMI1640完全培养液在37℃下培养7天，得到单核/巨噬 细胞。
2、猪丹毒疫苗的制备
取猪丹毒杆菌与单核/巨噬细胞按10000∶1的比例混合，用添加体积百分浓度10 ％胎牛血清的RPMI1640完全培养基在37℃的CO2培养箱中共培养1h，洗去未被消化 的病原体，继续培养24h，得到已吞噬病菌的免疫细胞，可作为猪丹毒疫苗。
二、效价测定
将步骤一获得的免疫细胞按1000个/只的剂量回输到猪的淋巴结，以诱发免疫反 应。注射后14d，用ELISA法检测免疫猪的抗体效价，结果达到1∶10-100000，表明 用本发明方法制备的猪丹毒疫苗可诱发机体的免疫反应。
三、安全性检测
将步骤一获得的免疫细胞用PBS洗涤3次，然后加入1mL 1％Triton-X 100裂解 细胞膜释放胞内菌，然后稀释100倍，取200μl涂布于营养肉汤琼脂平板上，24h后 计数菌落数。结果没有发现菌落，说明病原体已经被免疫细胞所消化，没有相应的病 原体产生，证明用本发明方法制备的疫苗具有较高的生物安全性。
四、免疫效果检测
将步骤一获得的免疫细胞按1000个/只的剂量回输到未感染猪丹毒杆菌猪的淋巴 结，使其获得免疫记忆。然后用107个/mL的猪丹毒杆菌攻毒，发现获得保护，表明用 本发明方法制备的猪丹毒疫苗对猪丹毒病具有较好的效果。
实施例3、牛结核病疫苗的制备及其检测
一、制备疫苗
1、单个核细胞的获取与纯化
1)单个核细胞的分离
从牛中分离单个核细胞，具体方法为：将人静脉采血部位消毒，静脉采血，加入 体积浓度为5％的柠檬酸钠溶液抗凝血，再从抗凝血中用淋巴细胞分离液通过密度梯 度离心法分离得到单个核细胞。
2)单个核细胞的纯化
将单个核细胞用TCM199完全培养液在37℃培养箱中培养24-72h，待细胞贴壁后， 移走悬浮细胞，对贴壁细胞进行吖啶橙(AO)染色、姬姆萨染色和CD14间接免疫荧光 染色鉴定，鉴定结果表明获得了纯度较高的单个核细胞。
3)树突状细胞的获得
将纯化的单个核细胞用50μg/mL GM-CSF的TCM199完全培养液在37℃下培养3天， 得到树突状细胞。
2、牛结核病疫苗的制备
取牛结核分枝杆菌与树突状细胞按100∶1的比例混合，用添加体积百分浓度10 ％胎牛血清的TCM199完全培养基在37℃的CO2培养箱中共培养1h，洗去未被消化的 病原体，继续培养48h小时，得到已吞噬病菌的免疫细胞，可作为牛结核病疫苗。
二、效价测定
将步骤一获得的免疫细胞按1000个/只的剂量回输到牛的淋巴结，以诱发免疫反 应。注射后14d，用ELISA法检测免疫牛的抗体效价，结果达到1∶10-1000000，表 明用本发明方法制备的牛结核病疫苗可诱发机体的免疫反应。
三、安全性检测
将步骤一获得的免疫细胞用PBS洗涤3次，然后加入1mL 1％Triton-X 100裂解 细胞膜释放胞内菌，然后稀释100倍，取200μl涂布于营养肉汤琼脂平板上，24小时 后计数菌落数。结果没有发现菌落，说明病原体已经被免疫细胞所消化，没有相应的 病原体产生，证明用本发明方法制备的疫苗具有较高的生物安全性。
四、免疫效果检测
将步骤一获得的免疫细胞按1000个/只的剂量回输到未曾感染牛结核分枝杆菌的 健康牛牛淋巴结，使其获得免疫记忆。然后用浓度为107个/mL的牛结核分枝杆菌攻毒， 发现牛获得免疫保护，表明用本发明方法制备的牛结核病疫苗对牛结核病具有较好的 效果。
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