发明领域

本发明涉及一种包括白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳 苗和乙型肝炎表面抗原的四价联合疫苗(以下称DTwPH联合疫苗)及 其制备方法。

在世界卫生组织(WHO)的扩大免疫计划(EPI)中，推荐同时接种抗 白喉、破伤风和百日咳的DTP联合疫苗作为几乎全世界国家婴儿使用 的基本疫苗。在东南亚、中亚、非洲和南美东南亚最为普遍的乙肝感 染，被认为是肝癌的一种潜在起因。然而，乙肝感染也可通过免疫来 预防，因此WHO积极开展全世界乙肝疫苗接种活动。

最近，为了消除单独接种具有不同接种程序的DTP联合疫苗和乙 肝疫苗的麻烦，以及将这些疫苗以降低的价格供应给不发达国家以增 加其疫苗接种率，现已有商业化的包括白喉类毒素、破伤风类毒素、 无细胞百日咳和HBsAg的联合疫苗产品(DTaPH)(欧洲专利公布号 0642355B1，6月15日，1998；韩国专利公布号1992-0009729，绿十字 公司)。

                 发明背景

与DTwPH联合疫苗的制备相关进行了积极研究，以解决这种联 合疫苗药物制备中遇到的问题，在保留HBsAg免疫原性的同时防止毒 性的增加。

在联合疫苗药物制备中发生的问题包括单个疫苗溶液的聚集和疫 苗对玻璃贮藏瓶的粘附。这里，术语“聚集”指形成轻微摇动不能使 其悬浮的固体物质，术语“粘附”指DTwPH联合疫苗颗粒结合到贮 藏玻璃瓶壁上，结合很牢固，轻微摇动不能使其分离。DTwPH联合 疫苗中的聚集是由各疫苗吸附溶液和百日咳杆菌之间尤其是用作吸附 剂的氢氧化铝凝胶和百日咳杆菌之间的静电引力引起的。这种粘附由 DTwPH联合疫苗颗粒和玻璃瓶壁之间长期的反应引起。因为DTwPH 联合疫苗长期贮存，聚集和粘附现象使联合疫苗产品的稳定性严重降 低。

DTwPH联合疫苗由于吸附剂和蛋白过量而具有毒性增加的问题。 此外，因为HBsAg与其它抗原相容性差，与同时接种两种单独的疫苗 DPT联合疫苗和乙肝疫苗相比，其免疫原性降低(WHO总部，白喉- 破伤风-百日咳-乙肝四价疫苗非正式会议，1992)。

因此，本发明目的是有效防止上述“聚集”和“粘附”现象，也 提供一种新的DTwPH联合疫苗及其制备方法，可保留HBsAg的免疫 原性，使其与同时接种单独的三价DTP联合疫苗和单一抗原乙肝疫苗 具有相同的几何平均抗体滴度(ab GMT)和有效抗体生成率。

                  发明详述

本发明提供了一种新的四价DTwPH联合疫苗，包括白喉类毒素、 破伤风类毒素、全细胞百日咳和HBsAg，其中白喉类毒素和破伤风类 毒素吸附于磷酸铝凝胶(AlPO4)，HBsAg吸附于氢氧化铝凝胶 (Al(OH)3)。

本发明也提供了DTwPH联合疫苗的制备方法，包括(a)在制备最 终的DTwPH联合疫苗组合物之前，调节吸附白喉类毒素的磷酸铝凝 胶溶液、吸附破伤风类毒素的磷酸铝凝胶溶液、吸附HBsAg的氢氧化 铝凝胶溶液和百日咳贮备溶液的pH范围为6.5-7.5；(b)将调整了pH 的白喉类毒素和破伤风类毒素吸附溶液混合；和(c)将在步骤(b)中获 得的混合物与调整了pH的HBsAg吸附溶液和灭活百日咳贮备液混 合。

本发明也提供了联合疫苗贮藏方法，包括将明胶加入普通联合疫 苗或上述DTwPH联合疫苗，或使用硅涂层的玻璃瓶作为联合疫苗的 贮藏瓶。优选明胶的浓度范围为0.1-0.7w/v％。

以下将更详细地描述本发明的结构和作用。

本发明使用的白喉类毒素贮备液通过培养白喉杆菌 (Corynebacterium diphtheriae)Park Willium株制备。将产生的培 养上清过滤、沉淀及福尔马林去毒后纯化，获得适当的白喉类毒素贮 备液。可使用上述以外的菌株和方法来获得适当的白喉类毒素贮备液。

破伤风类毒素贮备液通过培养破伤风杆菌(Clostridium tetani) Harvard株制备。将产生的培养上清液过滤、沉淀及福尔马林去毒后 纯化，获得适当的白喉类毒素贮备液。可使用上述以外的菌株和方法 来获得适当的白喉类毒素贮备液。

百日咳贮备液通过培养百日咳杆菌(Bordetella pertussis)制备。 将产生的培养液离心。获得的百日咳沉淀悬浮在盐水中并通过处理灭 活，获得适当的灭活百日咳贮备液。可使用上述以外的菌株和方法来 获得适当的百日咳贮备液。

HBsAg从重组酵母培养物通过匀浆提取。来自重组酵母的HBsAg 经过一系列的分离方法，包括离子层析、超滤、透析、超速离心、凝 胶过滤层析等，获得适当的HBsAg贮备液。可通过使用上述以外的方 法获得适当的HBsAg，也可利用来自血浆的HBsAg。

本发明使用的适当的吸附剂包括氢氧化铝和磷酸铝凝胶。氢氧化 铝和磷酸铝凝胶可以购买或用已知方法制备。

本发明中用于贮藏联合疫苗的硅涂层瓶通过将玻璃瓶浸泡在35％ 聚甲基硅氧烷(Dow Corning 365硅乳剂)的1∶40稀释液中，然后将玻璃 瓶在310℃加热干燥10分钟来制造。任何用上述以外的方法制造的硅 涂层玻璃瓶和市售的硅涂层玻璃瓶都可使用。

根据本发明的DTwPH联合疫苗通过分别将白喉类毒素、破伤风 类毒素和HBsAg贮备液吸附到铝凝胶上，并将上述溶液与百日咳贮备 液混合，调整每种单一抗原疫苗的浓度到适当的水平来制备。白喉类 毒素贮备液和破伤风类毒素贮备液吸附于磷酸铝凝胶，HBsAg贮备液 吸附于氢氧化铝凝胶。

根据本发明的DTwPH联合疫苗中单一抗原疫苗浓度为：白喉类 毒素20-50Lf/mL、破伤风类毒素4-20Lf/mL、百日咳10-24OU/mL、 HBsAg10-30μg/mL。氢氧化铝凝胶的浓度为15-35μgAl/mL。总的铝凝 胶浓度为550-1000μgAl/mL。术语“氢氧化铝凝胶的浓度”或“铝凝 胶的浓度”指铝凝胶中铝的浓度。

图1为放大100X的照片，显示不同氢氧化铝浓度下百日咳杆菌用 氢氧化铝凝胶的聚集程度。氢氧化铝凝胶和百日咳杆菌混合时，因静 电引力发生聚集。为了使氢氧化铝凝胶和百日咳杆菌之间的聚集减至 最少，确定氢氧化铝凝胶的浓度被认为是一个重要因素。当百日咳杆 菌终浓度为24OU/mL，在氢氧化铝凝胶浓度35μgAl/mL时没有观察 到聚集，如图1(a)所示。在氢氧化铝凝胶浓度不低于35μgAl/mL时， 氢氧化铝凝胶和百日咳杆菌开始聚集，在氢氧化铝浓度不低于 200μgAl/mL时聚集程度加重，如图1(b)所示。

因此，吸附HBsAg的氢氧化铝凝胶浓度优选范围在 15-35μgAl/mL(基于最终联合疫苗组合物)。白喉类毒素吸附溶液在中 性pH下不带电或带负电，在弱酸性pH下带正电。同时，百日咳杆菌 吸附溶液在中性pH下表面带负电。因此，当百日咳贮备液和白喉类 毒素吸附溶液在pH调整到范围6.5-7.5时(用pH计测量，Zeta-Meter 系统3.0，NJB PACIFIC INC.，美国)，可通过静电斥力防止混合溶液 中的聚集。

当将白喉类毒素、破伤风类毒素和HBsAg吸附溶液和百日咳杆菌 溶液的pH调整为6.5-7.5范围并将它们混合在一起时，最终的DTwPH 联合疫苗组合物pH为6.5-7.5，因此可防止各抗原疫苗之间的聚集。

通过上述方法制备的根据本发明的DTwPH联合疫苗符合各个单 一抗原疫苗的生物学制备标准(韩国食品和药品管理，1999)，具有降低 的毒性。另外，在DTwPH联合疫苗中HBsAg的免疫原性是稳定的。 在这里，免疫原性的稳定性指在4℃贮藏3个月后HBsAg的免疫原性 与初始水平保持不变或轻微增加，没有明显的降低。

疫苗在贮藏过程中不期望的聚集或对玻璃瓶壁的粘附，可通过向 普通联合疫苗或根据本发明的DTwPH联合疫苗中加入高粘度物质 (如0.1-0.7w/v％的明胶)，或通过使用硅涂层的玻璃瓶贮藏来防止。 这样，普通联合疫苗或根据本发明的DTwPH联合疫苗在贮藏过程中 保持为白色稳定悬浮液。在这里，贮藏稳定性指贮藏在温度为2-8℃ 的冷藏室，联合疫苗保持为白色悬浮液，而没有疫苗的聚集和对贮藏 瓶的粘附。

                     图表简述

图1为放大100X的照片，显示不同氢氧化铝浓度下百日咳杆菌用 氢氧化铝凝胶的聚集程度。

图2为蛋白杂交照片，显示白喉类毒素吸附溶液的吸附程度。

图3为光学显微镜拍摄的放大100X的照片，显示使用硅涂层的玻 璃瓶贮藏对DTwPH联合疫苗中聚集程度的影响。

                      实施例

本发明将通过下列实施例更详细地来描述。下列实施例是用于阐 述的，而不是用来限制本发明的范围。 实施例1：制备白喉类毒素贮备液

本发明使用的白喉类毒素贮备液通过培养白喉杆菌Park Willium 株制备。向产生的培养上清液加入终浓度为6％的福尔马林，并在36℃ 放置28天用来去毒，然后通过超滤、透析、硫酸铵沉淀、凝胶过滤层 析纯化，然后透析获得白喉类毒素贮备液。 实施例2：制备破伤风类毒素贮备液

破伤风类毒素贮备液通过培养破伤风杆菌Harvard株制备。向产 生的培养液中加入终浓度为0.45％的福尔马林，并在36℃放置28天 用来去毒，然后通过微滤、超滤、透析、硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析 纯化，然后透析获得破伤风类毒素贮备液。 实施例3：制备全细胞百日咳贮备液

百日咳贮备液通过培养百日咳杆菌来制备。将产生的培养液离心。 获得的百日咳沉淀悬浮在盐水中并在56℃处理30分钟灭活，以获得 适当的百日咳贮备液。 实施例4：制备HBsAg贮备液

HBsAg通过培养重组多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)来 制备。产生的培养物匀浆后进行细胞提取，然后经离子层析、超滤、 透析、超离和凝胶过滤层析获得适当的HBsAg贮备液。 实施例5：制备白喉类毒素和破伤风类毒素吸附溶液

白喉类毒素和破伤风类毒素贮备液通过搅拌混合吸附于磷酸铝凝 胶(pH5.5)，需要时用等渗盐水稀释。可适当调整吸附溶液最终的蛋白 和类毒素浓度。在该实施例中，白喉类毒素溶液的浓度调整至大约280 Lf/mL，破伤风类毒素溶液的浓度调整至大约50Lf/mL。相应的吸附 溶液pH为5.5-6.0。通过高效液相色谱(HPLC)和蛋白杂交分析可观察 到白喉类毒素吸附在磷酸铝凝胶上。蛋白杂交分析的结果显示于图2。 在图2中，泳道1为分子量标记，泳道2、3和4分别为0.025Lf/mL、 0.05Lf/mL和0.10Lf/mL的白喉类毒素溶液。泳道5为0.4Lf/mL的 白喉类毒素吸附溶液离心上清(相当于100％解吸的白喉类毒素)。制备 的白喉类毒素和破伤风类毒素吸附溶液贮藏在温度为2-8℃的冷藏室 中。 实施例6：制备HBsAg吸附溶液

为了增加免疫原性，将HBsAg吸附于氢氧化铝凝胶。搅拌混合 HBsAg贮备液与氢氧化铝凝胶，使HBsAg贮备液吸附在凝胶上，如 果需要并用等渗盐水稀释。氢氧化铝凝胶的浓度调整为60μgAl/mL， HBsAg贮备液的浓度调整为72μg/mL。通过HPLC和蛋白杂交分析可 观察到HBsAg吸附在氢氧化铝凝胶上。制备的HBsAg吸附溶液贮藏 在温度为2-8℃的冷藏室中。 实施例7：制备DTwPH联合疫苗

将实施例5和6中制备的吸附溶液和百日咳贮备液(192OU/mL)混 合，获得最终的DTwPH联合疫苗组合物。为了防止百日咳贮备液和 吸附溶液混合物中由于静电引力发生的聚集，在混合前将各溶液的pH 调至7.1。

首先，白喉类毒素吸附溶液和破伤风类毒素吸附溶液混合，HBsAg 吸附溶液和灭活百日咳贮备液加入该混合物中制备DTwPH联合疫苗 组合物。接下来将磷酸铝凝胶加入DTwPH联合疫苗组合物中，调整 总的铝凝胶浓度至预期水平。各贮备溶液的浓度可通过加入盐水或磷 酸缓冲液调整。加入0.05-0.1％mg/mL的硫柳汞作为防腐剂。如果需 要则加入3-6mg/mL的2-苯氧基乙醇。最终的DTwPH联合疫苗组合 物具有表1所示的pH为7.1的组成。

表1     成分     数量     白喉类毒素(Lf/mL)     40     破伤风类毒素(Lf/mL)     15     百日咳杆菌(OU/mL)     24     HBsAg(μg/mL)     24     氢氧化铝凝胶(μgAl/mL)     20     磷酸铝凝胶(μgAl/mL)     780 实验实施例1：DTwPH联合疫苗中HBsAg的免疫原性试验

为了测定实施例7中制备的DTwPH联合疫苗中HBsAg的免疫原 性，30只4-5周龄的ICR小鼠腹部皮下免疫该联合疫苗。4周后抽血， 测定该免疫原性试验的几何平均抗体滴度(Ab GMT)和具有有效抗体 滴度的小鼠百分数。在此，Ab GMT指不低于1mIU/mL的小鼠抗体 滴度的几何平均数，具有有效抗体滴度的小鼠百分数指抗体滴度不低 于10mIU/mL的小鼠占所有实验小鼠中的百分数。

作为同时处理的对照组，对小鼠在不同位点皮下免疫0.5-mL抗原 组成与实施例1相同的三联DTwP联合疫苗(40Lf/mL白喉类毒素、 15Lf/mL破伤风类毒素和24OU/mL百日咳杆菌)和0.5-mL单一抗原 乙肝疫苗(24μg/mL)，然后用上面描述的相同方法对HBsAg对行免疫 原性试验。

如表2所示，与同时免疫单独的疫苗一样，DTwPH联合疫苗显示 了稳定的HBsAg免疫原性(在Ab GMT和具有有效抗体滴度的小鼠百 分数)。

表2  DTwPH联合疫苗 同时免疫单独的疫苗 HBsAg的免疫原性 Ab GMT(mIU/mL)     372     354 具有有效抗体滴度 的小鼠百分数(％)     90     93

实验实施例2：DTwPH联合疫苗的效力试验

实施例7中制备的DTwPH联合疫苗中白喉类毒素、破伤风类毒 素、全细胞百日咳和HBsAg各自的效力试验根据韩国食品和药品管理 的生物药物效力要求(1999，122-130白喉、破伤风、百日咳吸附联合疫 苗；和310-313乙肝疫苗)进行。

结果为白喉类毒素2-4单位/mL、破伤风类毒素4单位/mL或更高、 全细胞百日咳10IU/mL。HBsAg的效力等于或大于参考品(使用绿十 字公司的标准)。显然，DTwPH联合疫苗符合生物药物的效力要求。

实施例8：明胶的使用

为了增加实施例7中制备的DTwPH联合疫苗组合物的粘度，加 入终浓度为0.6w/v％的明胶。结果在2-8℃贮藏3个月后没有观察到 疫苗的聚集和对玻璃瓶壁的粘附。

实施例9：硅涂层玻璃瓶的使用

将实施例7中制备的0.5ml DTwPH联合疫苗组合物分装到一只硅 涂层的玻璃瓶(3mL)和一只没有涂层的玻璃瓶中，在2-8℃贮藏3个月 或更长时间。结果没有观察到疫苗对硅涂层的玻璃瓶壁的粘附。剧烈 摇动这两只瓶子后，用显微镜在100X(Axioplan，Carl Zeiss Co.，德国) 观察疫苗组合物的稳定状态。贮藏在硅涂层玻璃瓶中的DTwPH联合 疫苗组合物在贮藏过程中维持了初始的均质分散状态，如图3(a)所示。 相反，在没有硅涂层的玻璃瓶中观察到了DTwPH联合疫苗的聚集， 如图3(b)所示。

                    工业适用性

如上所述，疫苗的聚集和对贮藏玻璃瓶的粘附能够通过在调整氢 氧化铝凝胶浓度和各吸附溶液和百日咳贮备液的pH后制备DTwPH 联合疫苗，或通过向DTwPH联合疫苗中加入明胶，或使用硅涂层的 玻璃瓶贮藏来防止。

将白喉类毒素和破伤风类毒素吸附到磷酸铝凝胶上、将HBsAg吸 附到氢氧化铝凝胶上，并调整各成分浓度之后制备DTwPH联合疫苗， 可保持DTwPH联合疫苗中HBsAg的免疫原性，各成分的效力可满足 生物学制备标准的要求(韩国食品和药物管理，1999)。

此外，其它单一抗原疫苗如流感嗜血杆菌b型(Hib)疫苗或灭活脊 髓灰质炎疫苗可加入DTwPH联合疫苗制品中，或可在同时免疫注射 前立即与其混合。