治疗或预防肿瘤的药物、肿瘤全细胞疫苗及其制备方法和用途
阅读：713发布：2020-05-12
专利汇可以提供治疗或预防肿瘤的药物、肿瘤全细胞疫苗及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 治疗 或 预防 肿瘤 的药物、肿瘤全细胞 疫苗 及其制备方法和用途，属于 生物 工程 领域和生物免疫学领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种治疗或预防肿瘤的效果较好的药物和肿瘤 全细胞疫苗 。本发明药物包含肿瘤全细胞疫苗、阳离子脂质体和编码白细胞介素-15基因的重组质粒。本发明药物具有肿瘤预防免疫和抗肿瘤免疫治疗的双重作用，其作用持久，治疗或预防肿瘤的效果显著。，下面是治疗或预防肿瘤的药物、肿瘤全细胞疫苗及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于包括如下组分：肿瘤全细胞疫苗、阳离子脂质体和编码白细胞介素-15的重组质粒。
2.根据权利要求1所述的预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述的肿瘤全细胞疫苗为灭活的具有特异性和主动性激发生物体主动免疫机能的肿瘤细胞疫苗。
3.根据权利要求2所述的预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述的肿瘤全细胞疫苗包含至少一种能激活生物体特异性抗肿瘤T淋巴细胞的活性成分；其中，所述的活性成分为蛋白质、多肽、脂类、蛋白质多肽复合物、DNA分子、RNA分子、肿瘤相关抗原、特异性肿瘤抗原中至少一种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于所述的肿瘤全细胞疫苗由下述方法制备而成：肿瘤细胞经过细胞灭活至细胞增殖活性被抑制；其中，所述的肿瘤细胞为能特异性的诱导、激活机体主动免疫，增强生物体预防肿瘤和抗肿瘤免疫的自体细胞、同源细胞系细胞或具有交叉抗原的异体肿瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述的肿瘤细胞为肺癌细胞、肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、肾癌细胞、鼻咽癌细胞、皮肤癌细胞、食道癌细胞、黑色素瘤细胞中至少一种。
6.根据权利要求4或5所述的预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：细胞灭活的方法为微波细胞灭活法，电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法，高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法，酶学消化细胞灭活法中至少一种。
7.根据权利要求1～6任一项所述的预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：
所述的阳离子脂质体为DOTAP、DOTMA、DOSPA、DOGS中至少一种；阳离子脂质体和IL-15重组质粒DNA的重量配比为1～15∶1，所述的阳离子脂质体和IL-15重组质粒DNA的重量配比优选为3∶1。
8.根据权利要求1～7任一项所述的治疗或预防肿瘤的药物，其特征在于：所述的IL-15重组质粒DNA包括：
1)、根据编码IL-15的基因构建的重组质粒DNA；或
2)、根据编码IL-15的基因序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有IL-15基因功能的基因构建的重组质粒DNA；或
3)、在生物体内被吸收转染后能分泌具有IL-15生物活性的质粒。
9.根据权利要求1～8任一项所述的治疗或预防肿瘤的药物，其特征在于：所述的治疗或预防肿瘤的药物的制剂为试剂盒，其包括包装在空间独立的制剂单元中的顺序给药的肿瘤全细胞疫苗、阳离子脂质体和编码白细胞介素-15的重组质粒。
10.权利要求1～9任一项所述的药物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
11.更具权利要求9所述的用途，其特征在于：所述药物中的肿瘤全细胞疫苗皮下注射
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肿瘤疫苗数目为1×10 ～1×10 个/次。
12.制备肿瘤全细胞疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：
a、取肿瘤细胞，经胰酶或EDTA消化、分离，得到细胞沉淀；
b、a步骤所得细胞沉淀灭活至细胞增殖活性被抑制。
13.根据权利要求12所述的制备肿瘤全细胞疫苗的方法，其特征在于：a步骤中所述的肿瘤细胞的来源为肿瘤细胞株或细胞系，或来源于生物体的肿瘤组织；其中，当肿瘤细胞的来源为肿瘤细胞株或细胞系时，按如下方法准备肿瘤细胞：取状态良好、处于对数生长期的肿瘤细胞进行培养传代，达到所需细胞数后进入肿瘤全细胞疫苗制备程序；
当肿瘤细胞的来源为生物体的肿瘤组织时，按如下方法准备肿瘤细胞：在无菌条件下取肿瘤新鲜、血供好的未坏死部分，放入盛有含小牛或胎牛血清的DMEM/F12中在4℃下保存，用含青霉素、链霉素的PBS溶液清洗，通过酶消化法、差速贴壁法或差速消化法分离得到纯化的肿瘤细胞，将纯化的肿瘤细胞移入含小牛或胎牛血清的DMEM等培养基的培养瓶中，然后放入37℃，5％CO2恒温培养箱培养，2～3d后，细胞铺满瓶底80～90％时传代，达到所需细胞数后进入肿瘤全细胞疫苗制备程序。
14.根据权利要求12或13所述的制备肿瘤全细胞疫苗的方法，其特征在于：
所述a步骤采用下述方法进行分离：取肿瘤细胞，加质量浓度为0.25％的胰酶或质量浓度为0.02％的EDTA消化至细胞收缩变圆后加入含10％血清的常规培养基终止消化，并吹打使细胞分散脱落，收集液体，离心，弃上清液，得到细胞沉淀；
所述b步骤中采用下述方法进行细胞灭活：微波细胞灭活法，电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法，高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法，酶学消化细胞灭活法中至少一种。
15.根据权利要求12～14任一项所述的制备肿瘤全细胞疫苗的方法，其特征在于：b步骤中采用下述方法进行细胞灭活：a步骤所得细胞沉淀用重悬溶液重悬，离心后弃上清液，加入质量浓度为1％的戊二醛固定7-8h，然后用相应的重悬溶液洗涤，离心，所得细胞沉淀再次重悬后于5％CO2，37℃的培养箱中放置1.5～2.5h，然后再用相应的重悬溶液洗涤，离心，重复3次，重悬后即得细胞疫苗，保存备用；其中，所述的重悬溶液为生理盐水NS或磷酸盐PBS缓冲液。
16.由权利要求12～15任一项所述的方法制备的肿瘤全细胞疫苗。
治疗或预防肿瘤的药物、肿瘤全细胞疫苗及其制备方法和
用途
技术领域
背景技术
[0002] 恶性肿瘤具有多种免疫逃逸机制，包括肿瘤细胞抗原特异性低和/或肿瘤抗原破坏、或缺乏一些免疫辅助因子的表达等，使得现有肿瘤疫苗的临床治疗效果不佳。此外在肿瘤的进展期，肿瘤细胞具有高度异质性，极易发生突变而逃避免疫系统的监督，突变导致肿瘤抗原表型消失，继而也使针对该抗原的免疫治疗效果降低。为了使肿瘤疫苗疗效实现最优化，常采用细胞因子(如IL-12，GM-CSF)等作为佐剂以增强免疫效应。白细胞介素15(IL-15)是近年发现的一个重要的诱导抗肿瘤免疫反应的细胞因子，参与对多种组织细胞的调节，是目前机体免疫功能调节的研究新热点。但是未见有以IL-15作为疫苗佐剂使用的报道。
发明内容
[0003] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种预防和/或治疗肿瘤的药物组合物。
[0004] 本发明预防和/或治疗肿瘤的药物组合物包括如下组分：肿瘤全细胞疫苗(Whole-cell vaccine；Whole cell vaccine)、阳离子脂质体(Liposome)和编码白细胞介素-15(Interleukin 15，IL-15)的重组质粒。
[0005] 其中，所述的肿瘤全细胞疫苗优选为灭活的具有特异性和主动性激发生物体主动免疫机能的肿瘤细胞疫苗。
[0006] 进一步的，所述的肿瘤全细胞疫苗包含至少一种能激活生物体特异性抗肿瘤T淋巴细胞的活性成分；其中，所述的活性成分为蛋白质、多肽、脂类、蛋白质多肽复合物、DNA分子、RNA分子、肿瘤相关抗原、特异性肿瘤抗原中至少一种。
[0007] 其中，本发明预防和/或治疗肿瘤的药物组合物中所述的肿瘤全细胞疫苗优选由下述方法制备而成：肿瘤细胞经过细胞灭活至细胞增殖活性被抑制；其中，所述的肿瘤细胞为能特异性的诱导、激活机体主动免疫，增强生物体预防肿瘤和抗肿瘤免疫的自体细胞、同源细胞系细胞或具有交叉抗原的异体肿瘤细胞。包括良性、恶性肿瘤，可为原发性或者继发性甚至转移的肿瘤细胞。其组织来源可为上皮组织、间叶组织、血液组织等。所述的肿瘤细胞可以为肺癌细胞、肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、肾癌细胞、鼻咽癌细胞、皮肤癌细胞、食道癌细胞、黑色素瘤细胞中至少一种。
[0008] 进一步的，上述的细胞灭活可以采用如下方法：微波细胞灭活法，电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法，高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法，酶学消化细胞灭活法中至少一种。
[0009] 其中，本发明药物中的阳离子脂质体和编码白细胞介素-15的重组质粒可以作为疫苗佐剂使用。
[0010] 其中，本发明预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，所述的阳离子脂质体为双链季铵盐型表面活性剂，如：DOTAP(N-[1-(2，3-dioleoyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammonium methylsulfate；1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化铵)、DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOSPA(3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸铵)或DOGS(双十八烷基酰胺甘氨酰精胺)中至少一种；阳离子脂质体和IL-15重组质粒DNA的重量配比优选为1～15∶1，所述的阳离子脂质体和IL-15重组质粒DNA的重量配比更优选为3∶1。
[0011] 其中，本发明治疗或预防肿瘤的药物，所述的LI-15重组质粒DNA包括：
[0012] 1)、根据编码IL-15的基因构建的重组质粒DNA；或
[0013] 2)、根据编码LI-15的基因序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有IL-15基因功能的基因构建的重组质粒DNA；或
[0014] 3)、在生物体内被吸收转染后能分泌具有IL-15生物活性的质粒。
[0015] 其中，上述的治疗或预防肿瘤的药物的制剂优选为试剂盒，其包括包装在空间独立的制剂单元中的顺序给药的肿瘤全细胞疫苗、阳离子脂质体和编码白细胞介素-15的重组质粒。进一步的，为了使本发明药物治疗或预防肿瘤的效果最好，本发明药物使用时将脂质体和IL-15重组质粒按照比例混合，以无沉淀为标准。皮下注射、肿瘤内部或瘤周注射、淋巴结内或周围注射等使用时，肿瘤全细胞疫苗先单独注射使用，后将脂质体与质粒的混合物注射，不混合在一起注射使用。还可视具体情况与已诱导的致敏T淋巴细胞、B-7、GM-CSF、γ-干扰素(INFγ)等联合使用。
[0016] 其中，IL-15重组质粒DNA可以采用下述方法制备：
[0017] 重组质粒经酶切和测序测定正确后，用质粒抽提试剂盒进行大量制备，具体如下：
[0018] 1)细菌培养：质粒接种于含100μg/ml Amp的LB培养液中，37℃振荡培养过夜；
[0020] 3)重悬：在细菌沉淀中加入125ml Buffer P1，反复振荡，吹打直至菌体完全重悬；
[0021] 4)裂解：加入125ml Buffer P2，轻柔而彻底地颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物，室温放置5min；
[0022] 5)中和：加入125ml冰预冷的Buffer P3，立即彻底而温和地颠倒离心瓶数次，充分混匀内容物，直至白色絮状物形成，而裂解物不再粘稠。然后在冰上放置30min，冰浴期间应间或混匀样品数次；
[0023] 6)沉淀杂蛋白：4℃，20000rpm/min离心样品30min，小心收集上清液到另一干净离心管中；
[0024] 7)收集质粒溶液：将收集的上清液再离心15min，4℃，25000rpm/min，小心将上清液全部收集于500ml的玻璃容器中，同时取样电泳检查。
[0025] 8)去内毒素：加入30ml Buffer ER，混匀后冰浴30min；
[0026] 9)平衡柱子：在Qiagen-tip 10000中加入75ml Buffer QBT，让其自然流空；
[0027] 10)样品上柱：将样品倒入柱子里，让其自然地进入柱子中；
[0028] 11)反复洗柱：用600ml Buffer QC洗柱；
[0029] 12)样品洗脱：用75ml Buffer QN将柱子里的质粒DNA样品洗脱下来，收集在没有内毒素污染的离心管里；
[0030] 13)沉淀质粒：在洗脱下来的DNA样品中加入0.70体积(约52.5ml)处于室温的异丙醇，混匀后即在4℃，15000rpm离心30min，小心弃上清；
[0031] 14)洗涤沉淀：用10ml无内毒素的处于室温的70％乙醇洗涤DNA沉淀，15000rpm/min离心样品10min，小心顷弃上清；
[0033] 16)为进一步去除内毒素，将溶解的质粒从第(8)步开始重复，再次过柱纯化；
[0034] 17)用无内毒素的生理盐水溶解质粒DNA，采用紫外分光光度仪测定OD 260/280读数，测定质粒DNA浓度和纯度的测定。分装后-20℃冻存。
[0035] 其中，阳离子脂质体可以采用常规方法制备，比如采用下述方法制备DOTAP阳离子脂质体：
[0036] 1)将DOTAP(D6182)按1∶1的摩尔比加入DOPE(Dioleylphosphatidyl-ethanolamine)中，然后溶解于氯仿和甲醇的混合物(氯仿和甲醇的体积比为3∶1)；
[0037] 2)再将上述混合物放入充满氮气的圆底烧瓶内的薄片上进行干燥，采用高度真空法去除掉残余的氯仿和甲醇；
[0038] 3)经上述过程制备的脂质体放入5％的葡萄糖溶液中进行水合；
[0039] 4)在近距离超声破碎仪中进行处理直至完全增溶；
[0041] 6)制备好的阳离子脂质体(浓度3mg/ml)保存在4℃的条件下备用。
[0042] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述的药物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。所述的肿瘤可以为人体脑胶质瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、肝癌、头颈部癌、胰腺癌或肾细胞癌等。
[0043] 其中，所述药物中的肿瘤全细胞疫苗皮下注射肿瘤疫苗数目为1×105～1×108个/次。
[0044] 其中，本发明药物引入生物体内的途径包括：皮下单点注射、皮下多点注射、静脉注射、瘤周注射、瘤内注射、胸腔注射、腹腔注射、蛛网膜下腔注射、淋巴结内或周围注射、肌肉注射等。上述途径可视具体情况单独运用，必要时联合运用。
[0045] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种制备肿瘤全细胞疫苗的方法，该方法包括如下步骤：
[0046] a、取肿瘤细胞，经胰酶或EDTA消化、分离，得到细胞沉淀；
[0047] b、a步骤所得细胞沉淀灭活至细胞增殖活性被抑制。
[0048] 进一步的，a步骤中所述的肿瘤细胞的来源可以为肿瘤细胞株或细胞系，或来源于生物体的肿瘤组织；其中，
[0049] 当肿瘤细胞的来源为肿瘤细胞株或细胞系时，按如下方法准备肿瘤细胞：取状态良好、处于对数生长期的肿瘤细胞进行培养传代，达到所需细胞数后进入肿瘤全细胞疫苗制备程序；
[0050] 当肿瘤细胞的来源为生物体的肿瘤组织时，按如下方法准备肿瘤细胞：在无菌条件下取肿瘤新鲜、血供好的未坏死部分，放入盛有含小牛或胎牛血清的DMEM/F12中在4℃下保存，用含青霉素、链霉素的PBS溶液清洗，通过酶消化法、差速贴壁法或差速消化法分离得到纯化的肿瘤细胞，将纯化的肿瘤细胞移入含小牛或胎牛血清的DMEM等培养基的培养瓶中，然后放入37℃，5％CO2恒温培养箱培养，2～3d后，细胞铺满瓶底80～90％时传代，达到所需细胞数后进入肿瘤全细胞疫苗制备程序。
[0051] 进一步的，上述a步骤优选采用下述方法进行分离：取肿瘤细胞，加质量浓度为0.25％的胰酶或质量浓度为0.02％的EDTA消化至细胞收缩变圆后加入含10％血清的常规培养基终止消化，并吹打使细胞分散脱落，收集液体，离心，弃上清液，得到细胞沉淀。
[0052] 其中，上述b步骤中可以采用下述方法进行细胞灭活：微波细胞灭活法，电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法，高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法，酶学消化细胞灭活法中至少一种。进一步的，上述b步骤中优选采用下述方法进行细胞灭活：a步骤所得细胞沉淀用重悬溶液重悬，离心后弃上清液，加入质量浓度为1％的戊二醛固定7-8h，然后用相应的重悬溶液洗涤，离心，所得细胞沉淀再次重悬后于5％CO2，37℃的培养箱中放置1.5～2.5h，然后再用相应的重悬溶液洗涤，离心，重复3次，重悬后即得细胞疫苗，保存备用；其中，所述的重悬溶液为生理盐水NS或磷酸盐PBS缓冲液。
[0053] 更进一步的，为了使离心效果更好，上述步骤中离心时的离心速度优选为1300～1700rpm/min(离心速度更优选为1500rpm/min)，离心时间优选为2～4min(离心时间更优选为3min)。
[0054] 本发明所要解决的第四个技术问题是提供由上述的方法制备的肿瘤全细胞疫苗。
[0055] IL-15结构和功能与IL-2相似，而IL-15对NK细胞的分化发育和功能调节尤其密切，也是记忆性免疫细胞的生长和调节因子。此外，对T、B细胞的刺激作用IL-15也较IL-2强。因此，以IL-15作为免疫佐剂，能更好地增强主动性免疫反应，减少免疫负调节，并增强免疫记忆。目前已上市的自体源性细胞免疫疗法药物，是利用患者自身肿瘤细胞成分致敏自身树突状细胞制成的个体化免疫。本发明是将培养肿瘤细胞株灭活处理使瘤细胞丧失致瘤性，并保留其免疫原性，以此作为全细胞肿瘤疫苗，同时联合IL-15作为免疫佐剂，目的在于建立一种长效的，“按需给药”的治疗方法，这种细胞疫苗联合细胞因子的特异性主动性免疫是机体自身建立的一种针对肿瘤抗原的长效的主动性防御机制，符合“按需给药”的治疗模式，能够达到较佳的治疗效果。
[0056] 本发明药物能促进生物体内提高免疫能力，特别是针对肿瘤细胞的T淋巴细胞和+ +NK细胞等。相关实验发现，本发明药物治疗的小鼠肿瘤中，CD4 的T细胞、CD8 的T细胞、B细胞(CD24)、NK(CD57)细胞的标记物均明显表达增多，表明其诱导、放大并增强了生物体内的特异性免疫应答。因此，通过全细胞疫苗联合IL-15质粒进行预防或治疗，后者能激发+ +
CD4 的T细胞、CD8 的T细胞、B细胞、NK细胞的表达，从而加强放大肿瘤细胞疫苗在肿瘤预防免疫和抗肿瘤免疫治疗中的作用，进一步加强了生物体的特异性抗肿瘤免疫应答。
CD4 的T细胞、CD8 的T细胞、B细胞、NK细胞的表达，从而加强放大肿瘤细胞疫苗在肿瘤预防免疫和抗肿瘤免疫治疗中的作用，进一步加强了生物体的特异性抗肿瘤免疫应答。
[0057] 本发明中所述制备预防或治疗肿瘤药物的方法，类似的方法可制备人类肿瘤细胞疫苗并治疗人体肿瘤。本发明适用于医疗领域，特别是预防或治疗肿瘤，亦适用于术后肿瘤残留或不能外科切除的肿瘤。本发明中作为疫苗的细胞可来自同一人类或非人类生物个体，也可来自不同的人类或者非人类生物个体。本发明药物治疗或预防肿瘤的效果显著，为本领域提供了一种新的选择，具有广阔的应用前景。附图说明
[0058] 图1为皮下胶质瘤治疗性实验肿瘤体积曲线。横坐标为处理后的天数，纵坐标为肿瘤体积。
[0059] 图2为建模成功后，C6/Wistar肿瘤治疗后MRI特征及体积变化情况图。
[0060] 图3为颅内C6/Wistar胶质瘤治疗后体积生长曲线图。横坐标为处理后的天数，纵坐标为肿瘤体积。
[0061] 图4为颅内C6/Wistar胶质瘤治疗后生存曲线图。横坐标为处理后的天数，纵坐标为存活率(％)。
[0062] 图5为建模成功后，9L/F344肿瘤治疗后MRI特征及体积变化情况图。
[0063] 图6为颅内F344/9L胶质瘤大鼠体积生长曲线图。横坐标为处理后的天数，纵坐标为肿瘤体积。
[0064] 图7为颅内9L/F344胶质瘤治疗后生存曲线图。横坐标为处理后的天数，纵坐标为存活率(％)。
[0065] 图8LL2小鼠肺癌模型治疗后体积生长曲线图。横坐标为处理后的天数，纵坐标为肿瘤体积。
[0066] 图9LL2小鼠肺癌模型治疗后生存曲线图。横坐标为处理后的天数，纵坐标为存活率(％)。
具体实施方式
[0067] 下面对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因对本发明限制。
[0068] 本发明预防和/或治疗肿瘤的药物组合物包括如下组分：肿瘤全细胞疫苗(Whole-cell vaccine；Whole cell vaccine)、阳离子脂质体(Liposome)和编码白细胞介素-15(Interleukin 15，IL-15)的重组质粒。
[0069] 其中，所述的肿瘤全细胞疫苗优选为灭活的具有特异性和主动性激发生物体主动免疫机能的肿瘤细胞疫苗。
[0070] 进一步的，所述的肿瘤全细胞疫苗包含至少一种能激活生物体特异性抗肿瘤T淋巴细胞的活性成分；其中，所述的活性成分为蛋白质、多肽、脂类、蛋白质多肽复合物、DNA分子、RNA分子、肿瘤相关抗原、特异性肿瘤抗原中至少一种。
[0071] 其中，本发明预防和/或治疗肿瘤的药物组合物中所述的肿瘤全细胞疫苗优选由下述方法制备而成：肿瘤细胞经过细胞灭活至细胞增殖活性被抑制；其中，所述的肿瘤细胞为能特异性的诱导、激活机体主动免疫，增强生物体预防肿瘤和抗肿瘤免疫的自体细胞、同源细胞系细胞或具有交叉抗原的异体肿瘤细胞。包括良性、恶性肿瘤，可为原发性或者继发性甚至转移的肿瘤细胞。其组织来源可为上皮组织、间叶组织、血液组织等。所述的肿瘤细胞可以为肺癌细胞、肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、肾癌细胞、鼻咽癌细胞、皮肤癌细胞、食道癌细胞、黑色素瘤细胞中至少一种。
[0072] 进一步的，上述的细胞灭活可以采用如下方法：微波细胞灭活法，电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法，高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法，酶学消化细胞灭活法中至少一种。
[0073] 其中，本发明药物中的阳离子脂质体和编码白细胞介素-15的重组质粒可以作为疫苗佐剂使用。
[0074] 其中，本发明预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，所述的阳离子脂质体为双链季铵盐型表面活性剂，如：DOTAP(N-[1-(2，3-dioleoyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammonium methylsulfate；1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化铵)、DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOSPA(3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸铵)或DOGS(双十八烷基酰胺甘氨酰精胺)中至少一种，当然，制备脂质体时还可以加入脂质伴侣(如：DOPE)等辅料；阳离子脂质体和IL-15重组质粒DNA的重量配比优选为1～15∶1，所述的阳离子脂质体和IL-15重组质粒DNA的重量配比更优选为3∶1。
[0075] 其中，本发明治疗或预防肿瘤的药物，所述的IL-15重组质粒DNA包括：
[0076] 1)、根据编码IL-15的基因构建的重组质粒DNA；或
[0077] 2)、根据编码IL-15的基因序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有IL-15基因功能的基因构建的重组质粒DNA；或
[0078] 3)、在生物体内被吸收转染后能分泌具有IL-15生物活性的质粒。
[0079] 其中，上述的治疗或预防肿瘤的药物的制剂优选为试剂盒，其包括包装在空间独立的制剂单元中的顺序给药的肿瘤全细胞疫苗、阳离子脂质体和编码白细胞介素-15的重组质粒。进一步的，为了使本发明药物治疗或预防肿瘤的效果最好，本发明药物使用时将脂质体和IL-15重组质粒按照比例混合，以无沉淀为标准。皮下注射、肿瘤内部或瘤周注射、淋巴结内或周围注射等使用时，肿瘤全细胞疫苗先单独注射使用，后将脂质体与质粒的混合物注射，不混合在一起注射使用。还可视具体情况与已诱导的致敏T淋巴细胞、B-7、GM-CSF、γ-干扰素(INFγ)等联合使用。
[0080] 其中，IL-15重组质粒DNA可以采用下述方法制备：
[0081] 重组质粒经酶切和测序测定正确后，用质粒抽提试剂盒进行大量制备，具体如下：
[0082] 1)细菌培养：质粒接种于含100μg/ml Amp的LB培养液中，37℃振荡培养过夜；
[0083] 2)收获细菌：4℃离心30min，4000rpm，弃上清，敞开瓶口并倒置使上清全部流尽，称重；
[0084] 3)重悬：在细菌沉淀中加入125ml Buffer P1，反复振荡，吹打直至菌体完全重悬；
[0085] 4)裂解：加入125ml Buffer P2，轻柔而彻底地颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物，室温放置5min；
[0086] 5)中和：加入125ml冰预冷的Buffer P3，立即彻底而温和地颠倒离心瓶数次，充分混匀内容物，直至白色絮状物形成，而裂解物不再粘稠。然后在冰上放置30min，冰浴期间应间或混匀样品数次；
[0087] 6)沉淀杂蛋白：4℃，20000rpm/min离心样品30min，小心收集上清液到另一干净离心管中；
[0088] 7)收集质粒溶液：将收集的上清液再离心15min，4℃，25000rpm/min，小心将上清液全部收集于500ml的玻璃容器中，同时取样电泳检查。
[0089] 8)去内毒素：加入30ml Buffer ER，混匀后冰浴30min；
[0090] 9)平衡柱子：在Qiagen-tip 10000中加入75ml Buffer QBT，让其自然流空；
[0091] 10)样品上柱：将样品倒入柱子里，让其自然地进入柱子中；
[0092] 11)反复洗柱：用600ml Buffer QC洗柱；
[0093] 12)样品洗脱：用75ml Buffer QN将柱子里的质粒DNA样品洗脱下来，收集在没有内毒素污染的离心管里；
[0094] 13)沉淀质粒：在洗脱下来的DNA样品中加入0.70体积(约52.5ml)处于室温的异丙醇，混匀后即在4℃，15000rpm离心30min，小心弃上清；
[0095] 14)洗涤沉淀：用10ml无内毒素的处于室温的70％乙醇洗涤DNA沉淀，15000rpm/min离心样品10min，小心顷弃上清；
[0096] 15)凉干溶解：敞开离心管口，放置10～20min，直到乙醇蒸发殆尽，用适量的灭菌的无内毒素的生理盐水溶解质粒DNA，并检测质粒的纯度；
[0097] 16)为进一步去除内毒素，将溶解的质粒从第(8)步开始重复，再次过柱纯化；
[0098] 17)用无内毒素的生理盐水溶解质粒DNA，采用紫外分光光度仪测定OD 260/280读数，测定质粒DNA浓度和纯度的测定。分装后-20℃冻存。
[0099] 其中，阳离子脂质体可以采用常规方法制备，比如采用下述方法制备DOTAP阳离子脂质体：
[0100] 1)将DOTAP(D6182)按1∶1的摩尔比加入DOPE(Dioleylphosphatidyl-ethanolamine)中，然后溶解于氯仿和甲醇的混合物(氯仿和甲醇的体积比为3∶1)；
[0101] 2)再将上述混合物放入充满氮气的圆底烧瓶内的薄片上进行干燥，采用高度真空法去除掉残余的氯仿和甲醇；
[0102] 3)经上述过程制备的脂质体放入5％的葡萄糖溶液中进行水合；
[0103] 4)在近距离超声破碎仪中进行处理直至完全增溶；
[0104] 5)将制备的脂质体通过聚碳酸酯膜进行滤过，形成单层小囊泡形态；
[0105] 6)制备好的阳离子脂质体(浓度3mg/ml)保存在4℃的条件下备用。
[0106] 本发明还提供了上述的药物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。所述的肿瘤可以为人体脑胶质瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、肝癌、头颈部癌、胰腺癌或肾细胞癌等。
[0107] 其中，所述药物中的肿瘤全细胞疫苗皮下注射肿瘤疫苗数目为1×105～1×108个/次。
[0108] 其中，本发明药物引入生物体内的途径包括：皮下单点注射、皮下多点注射、静脉注射、瘤周注射、瘤内注射、胸腔注射、腹腔注射、蛛网膜下腔注射、淋巴结内或周围注射、肌肉注射等。上述途径可视具体情况单独运用，必要时联合运用。
[0109] 本发明还提供了一种制备肿瘤全细胞疫苗的方法，该方法包括如下步骤：
[0110] a、取肿瘤细胞，经胰酶或EDTA消化、分离，得到细胞沉淀；
[0111] b、a步骤所得细胞沉淀灭活至细胞增殖活性被抑制。
[0112] 进一步的，a步骤中所述的肿瘤细胞的来源可以为肿瘤细胞株或细胞系，或来源于生物体的肿瘤组织；其中，
[0113] 当肿瘤细胞的来源为肿瘤细胞株或细胞系时，按如下方法准备肿瘤细胞：取状态良好、处于对数生长期的肿瘤细胞进行培养传代，达到所需细胞数后进入肿瘤全细胞疫苗制备程序；
[0114] 当肿瘤细胞的来源为生物体的肿瘤组织时，按如下方法准备肿瘤细胞：在无菌条件下取肿瘤新鲜、血供好的未坏死部分，放入盛有含小牛或胎牛血清的DMEM/F12中在4℃下保存，用含青霉素、链霉素的PBS溶液清洗，通过酶消化法、差速贴壁法或差速消化法分离得到纯化的肿瘤细胞，将纯化的肿瘤细胞移入含小牛或胎牛血清的DMEM等培养基的培养瓶中，然后放入37℃，5％CO2恒温培养箱培养，2～3d后，细胞铺满瓶底80～90％时传代，达到所需细胞数后进入肿瘤全细胞疫苗制备程序。
[0115] 进一步的，上述a步骤优选采用下述方法进行分离：取肿瘤细胞，加质量浓度为0.25％的胰酶或质量浓度为0.02％的EDTA消化至细胞收缩变圆后加入含10％血清的常规培养基终止消化，并吹打使细胞分散脱落，收集液体，离心，弃上清液，得到细胞沉淀。
[0116] 其中，上述b步骤中可以采用下述方法进行细胞灭活：微波细胞灭活法，电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法，高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法，酶学消化细胞灭活法中至少一种。进一步的，上述b步骤中优选采用下述方法进行细胞灭活：a步骤所得细胞沉淀用重悬溶液重悬，离心后弃上清液，加入质量浓度为1％的戊二醛固定7-8h，然后用相应的重悬溶液洗涤，离心，所得细胞沉淀再次重悬后于5％CO2，37℃的培养箱中放置1.5～2.5h，然后再用相应的重悬溶液洗涤，离心，重复3次，重悬后即得细胞疫苗，保存备用；其中，所述的重悬溶液为生理盐水NS或磷酸盐PBS缓冲液。
[0117] 更进一步的，为了使离心效果更好，上述步骤中离心时的离心速度优选为1300～1700rpm/min(离心速度更优选为1500rpm/min)，离心时间优选为2～4min(离心时间更优选为3min)。
[0118] 本发明还提供了由上述的方法制备的肿瘤全细胞疫苗。
[0119] 实施例本发明治疗或预防肿瘤的药物的制备
[0120] 1、IL-15的制备及方法(hIL-15质粒的扩增与纯化)
[0121] 重组质粒经酶切和测序测定正确后，用Qiagen公司的EndofreeTM plasmid Giga试剂盒进行大量制备。方法参考操作手册进行。步骤如下(下述各种Buffer的用量，适合于2.5L细菌培养物)：
[0122] 1)细菌培养：质粒接种于含100μg/ml Amp的LB培养液中，37℃振荡培养过夜；
[0123] 2)收获细菌：4℃条件下4000rpm/min离心30分钟，弃上清，敞开瓶口并倒置使上清全部流尽，称重；
[0124] 3)重悬：在细菌沉淀中加入125ml Buffer P1，反复振荡，吹打直至菌体完全重悬；
[0125] 4)裂解：加入125ml Buffer P2，轻柔而彻底地颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物，室温放置5分钟；
[0126] 5)中和：加入125ml冰预冷的Buffer P3，立即彻底而温和地颠倒离心瓶数次，充分混匀内容物，直至白色絮状物形成，而裂解物不再粘稠。然后在冰上放置30分钟，冰浴期间应间或混匀样品数次；
[0127] 6)沉淀杂蛋白：4℃下≥20000rpm/min离心样品30min，小心收集上清液到另一干净离心管中；
[0128] 7)收集质粒溶液：将收集的上清液再离心15分钟，4℃，20000rpm/min，收集上清，同时取样电泳检查。
[0129] 8)去内毒素：加入30ml Buffer ER，混匀后冰浴30min；
[0130] 9)平衡柱子：在Qiagen-tip 10000中加入75ml Buffer QBT，以自然流速过柱；
[0131] 10)样品上柱：将样品倒入柱子，以自然流速过柱；
[0132] 11)反复洗柱：用600ml Buffer QC洗柱；
[0133] 12)样品洗脱：用75ml Buffer QN将吸附于膜上的质粒DNA样品洗脱下来，收集于无内毒素的离心管里；
[0134] 13)沉淀质粒：在洗脱下来的DNA样品中加入0.70体积置于室温的异丙醇，混匀后即在4℃，≥15000rpm离心30分钟，小心弃上清；
[0135] 14)洗涤沉淀：用10ml 70％乙醇洗涤DNA沉淀，≥15000rpm/min离心样品10分钟，小心顷弃上清；
[0136] 15)凉干溶解：敞开离心管口，放置10～20分钟，直到乙醇蒸发殆尽，用适量无内毒素的灭菌双蒸水溶解质粒DNA，并检测质粒的纯度；
[0137] 16)紫外分光光度仪测定其纯度及浓度，并将其浓度调整为1mg/ml，-20℃冻存备用。
[0138] 2、阳离子脂质体制备
[0139] 1)将阳离子脂质体DOTAP(D6182)按1∶1的摩尔比加入DOPE(Dioleylphosphatidyl-ethanolamine，Sigma P1223)中，然后溶解于氯仿和甲醇的混合物(氯仿和甲醇的体积比为3∶1)。
[0140] 2)再将上述脂质体混合物放入充满氮气的圆底烧瓶内的薄片上进行旋转蒸发，然后进行真空干燥。
[0141] 3)经上述过程制备的脂质体放入5％的葡萄糖溶液中进行水合，再次旋蒸。
[0142] 4)将旋蒸后液体进行水浴超声破碎直至完全增溶。
[0143] 5)再将制备的脂质体通过聚碳酸酯膜进行滤过，形成单层小囊泡形态。
[0144] 6)制备好的阳离子脂质体(浓度3mg/ml)保存在4℃的条件下备用。
[0145] 3、肿瘤全细胞疫苗的制备
[0146] 3.1细胞复苏培养
[0147] 1)从液氮中取出装有C6细胞的冻存管、迅速置于37℃恒温水浴箱，使冻存管中的冻存物迅速融化；
[0148] 2)打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中；
[0149] 3)1000rpm/min离心10min，弃去上清液；
[0150] 4)沉淀加10ml DMEM培养液，吹打均匀，离心1000rpm/min，10min，弃上清液；
[0151] 5)加入DMEM培养基，吹打均匀，接种与细胞培养瓶中，37℃培养，次日观察细胞生长情况。
[0152] 3.2细胞传代
[0153] 从培养箱中取出培养瓶，吸去培养基后，用无血清培养基洗涤2次，加入0.25％的胰酶或0.02％EDTA消化，显微镜下观察细胞收缩变圆后，加入完全培养基终止消化，并吹打使细胞脱落分散，收集液体，1500rpm/min，离心3min，细胞沉淀用完全培养基重悬，吹打均匀后分瓶培养。一般3-4天传代1次。
[0154] 3.3细胞保种
[0155] 1)胰酶消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。
[0156] 2)1000rpm/min离心10min，弃上清液。
[0157] 3)沉淀加细胞保种液，计数，调整至5×106/ml左右。
[0158] 4)将悬液分至冻存管中，每管1ml。
[0159] 5)将冻存管口封严。
[0160] 6)贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。
[0161] 7)按下列顺序缓慢降温：①室温，②4℃(20min)，③冰箱冷冻室(30min)④低温冰箱(1h)，⑤气态氮(30min)，⑥液氮。
[0162] 3.4肿瘤细胞疫苗制备及方法
[0163] 1)取出对数生长期细胞，吸去培养基上清；
[0164] 2)用无血清培养基洗涤2次，加入0.25％的胰酶或0.02％EDTA消化，显微镜下观察细胞收缩变圆后，加入完全培养基终止消化，并吹打使细胞分散脱落收集液体，1500rpm，离心3min，细胞沉淀用PBS重悬，细胞悬液计数；
[0165] 3)再次离心后弃上清；
[0166] 4)细胞加入1％戊二醛10ml固定过夜；
[0167] 5)用PBS洗涤后离心，重复3次；
[0168] 6)用10mlPBS重悬后置37℃，5％CO2孵箱2h；
[0169] 7)用PBS洗涤后离心，重复3次；
[0170] 8)重悬后细胞4℃保存。
[0171] 试验例1本发明药物用于治疗Wistar/C6皮下脑胶质瘤肿瘤模型
[0172] 1、模型建立及评估
[0173] ①Wistar雄性大鼠，每组12只，体重250g±20g；
[0174] ②大鼠右后肢去毛，局部予以碘酒和75％酒精消毒；
[0175] ③用微量进样器将20μl细胞悬液(含2×106个C6胶质瘤细胞)接种于大鼠右后肢皮下，制成C6胶质瘤皮下模型；
[0176] ④术后前3天，每只大鼠每天给予青霉素10-20万U/只腹腔注射预防感染。
[0177] ⑤观察大鼠生长情况，体重变化、饮食、毛色、活动情况及注射局部有无红肿及包块等。
[0178] 2、皮下胶质瘤动物模型分组及治疗
[0179] 肿瘤成瘤后(直径大于5mm)，随后将其随机分成5组，即溶剂对照组(Control)、脂质体组(Liposome)，白介素15重组质粒+脂质体组(pORF-hIL-15+lipo)，全细胞瘤苗+脂质体+空载质粒组(TV+pORF+lipo)(简称TV-ORF组)，联合治疗组即全细胞瘤苗+脂质体+白介素15重组质粒组(TV+pORF-hIL-15+lipo)(简称TV+IL-15组)，每组12只。
[0180] 3、治疗
[0181] 各组动物成瘤后，分别予上述分组进行干预，每3天治疗1次，连续8次。
[0182] 4、皮下胶质瘤动物模型观察指标
[0184] ②皮下胶质瘤动物模型体积检测
[0185] 用游标卡尺每3天检测皮下肿瘤大小，测量出肿瘤的短径(a)和最大径(b)，根据2 2
公式计算各组的肿瘤体积：皮下肿瘤体积＝1/2×肿瘤短径 ×肿瘤长径(ab/2)。将肿瘤体积均值与生长时间的变化绘出生长曲线。按公式[1-(治疗组平均体积变化/对照组平均体积变化)]×100％，计算抑瘤率。
公式计算各组的肿瘤体积：皮下肿瘤体积＝1/2×肿瘤短径 ×肿瘤长径(ab/2)。将肿瘤体积均值与生长时间的变化绘出生长曲线。按公式[1-(治疗组平均体积变化/对照组平均体积变化)]×100％，计算抑瘤率。
[0186] ③生存期观察及标本采集：记录各组大鼠的生存天数，用公式(治疗组平均存活天数-对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数×100％，计算延长生存期。
[0187] 5、治疗效果
[0188] 皮下接种大鼠55只，接种5-7天后，右后肢接种肿瘤处包块隆起，为实体性包块，当直径大于0.5cm时认为建模成功，3只未见确切肿瘤，成瘤率为94.5％，将其中50只建模成功者随机分为5组予以相应措施干预。肿瘤逐渐长大，以后期为甚，大鼠右后肢皮下可见团块性肿瘤形成，大多瘤体随瘤龄延长其体积明显增大。自15天开始，个别肿瘤开始变小，大部分体积逐步增加，每次治疗同时测一次肿瘤体积，治疗结束后仍每3d检测1次，直到肿瘤完全消失或者大鼠死亡。
[0189] 根据体积的检查变化，可见各组体积均表现出增大的趋势，以对照组和脂质体组最为明显。pORF-hIL-15组、TV+pORF组及联合治疗组体积增加趋势变缓，以联合组最为明显，大部分肿瘤生长受到抑制，部分肿瘤完全消失，至40d时，联合组肿瘤均消失。其他各组肿瘤体积在同期逐渐变大，而部分肿瘤在干预结束后体积逐渐变小，而对照组也出现体积变小的趋势。至60天时，各组肿瘤均完全消失(如图1所示)。计算各组肿瘤平均体积大小并称重，根据前述公式计算与Control组对比，联合治疗组(TV+IL-15)肿瘤的抑瘤率约为86％，明显高于其余各组。
[0190] 试验例2本发明药物用于治疗Wistar/C6颅内肿瘤
[0191] 1、模型建立及评估
[0192] ①接种前3d灌胃给予地塞米松10μg/g，降低免疫力，减少排斥反应。
[0193] ②参照Paxinos和Watson的《大鼠脑立体定位图谱》确定右尾状核区靶点接种。在大鼠脑立体定位仪上选取大鼠脑右侧尾状核区为靶点，其坐标为前囟中点前1.0mm，矢状缝右旁开3～3.5mm，硬膜下4～5.0mm。
[0195] ④以双侧内玼连线与头正中矢状线交点向后1cm为切口，剪去头顶部毛，碘酒、75％酒精消毒，于选定切口向后纵向切开皮肤，暴露颅骨标志，按上述坐标点定位，用牙科钻在露骨上钻孔，孔径1.2mm，用25ul的微量注射器(Hamilton syringe)针头锐性刺破硬膜在立体定向引导下接种针垂直缓慢延伸至硬膜下6.0mm，上提(后延)1.0mm硬膜下5mm
6
靶点处，将细胞悬液1×10 个细胞以1uL/min缓慢注入靶区(注射量为10μl/只，速度不
6
超过1μl/min)，留针5-10min，使细胞充分沉积，避免返流(如为9L细胞，同样为1×10 个肿瘤细胞重悬于10μlPBS中，1μl/min)，注射完后留针3min，退出3min。
6
靶点处，将细胞悬液1×10 个细胞以1uL/min缓慢注入靶区(注射量为10μl/只，速度不
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超过1μl/min)，留针5-10min，使细胞充分沉积，避免返流(如为9L细胞，同样为1×10 个肿瘤细胞重悬于10μlPBS中，1μl/min)，注射完后留针3min，退出3min。
[0196] 在注射过程中，密切观察实验动物的呼吸状况，如果出现呼吸急促，叹气样呼吸，呼吸微弱等情况，需暂停注射。
[0197] ⑤缓慢拔针后，颅骨钻孔处以骨蜡封闭，缝合头皮，侧卧，保温，置于干燥环境。常规分笼饲养。
[0198] ⑥术后前3天，每只大白鼠每天给予青霉素10～20万U/只腹腔注射预防感染。观察大鼠生长情况，体重变化、饮食及活动情况等。
[0199] 手术后动物保温，观察有无手术后死亡等。待麻醉清醒后，分笼饲养，自由进食水。手术后第10日进行磁共振检查，观察颅内肿瘤的成瘤情况、形态特征等。
[0200] 2、分组及治疗
[0201] 经过MRI检测观察成瘤后，去除成瘤不确切、体积过大及颅外有肿瘤生长者，选择60只随机分为5组，分组及干预方案同皮下胶质瘤。即：对照组，Liposome组，pORF-IL-15+lipo组，TV+pORF+lipo组，TV+pORF-IL-15+lipo。每组各12只。
[0202] 3、实验结果
[0203] 从手术后第8日开始，各组按照预定实验方案在皮下予以治疗，以多点局部注射方式进行，在进行联合治疗时，先予以皮下注射全细胞胶质瘤疫苗，后在疫苗周围注射由脂质体包裹的pORF-hIL-15，每3d注射一次，共注射8次。
[0204] 经过治疗干预后，第二次(治疗后2w)MRI检测时肿瘤体积仍呈总体增大的趋势，以对照组、脂质体和IL-15组为甚，肿瘤体积明显变大，平均体积为；而TV组和联合组肿瘤体积增大较缓慢，部分肿瘤几乎没有变大，少部分肿瘤开始变小(图2)。经统计学分析后发现后两组平均体积为较前三组有统计学意义，后两者间间尚没有统计学差异。
[0205] 经过干预后，第二次(治疗后2w)MRI检测时肿瘤体积仍呈总体增大的趋势，以对照组、脂质体和IL-15组为甚，肿瘤体积明显变大；而TV组和联合组肿瘤体积增大较缓慢，特别是联合组，部分肿瘤几乎没有变大，少部分肿瘤开始变小(图3)。经统计学分析后发现后两组平均体积为较前三组有统计学意义，后两者间联合组TV+IL-15组效果明显较TV+pORF效果更佳。
[0206] 自接种后5w(治疗后4w，8次免疫已经完成)，对照组仅存活2只，1只肿瘤已经消失，1只肿瘤体积巨大。pORF-hIL-15+lipo、脂质体组也大部分大鼠死亡，至35d时分别存活4只和2只；联合组肿瘤体积明显变小，大部分已消失，而TV组大鼠虽然体积增加缓慢，但是大鼠死亡率较联合组高，至60d时，联合组有7只存活，肿瘤消失，而TV+pORF+lipo组仅剩3只，其余各组均剩下1只为死亡。计算各组生存率后得到生存曲线如下(图4)。
[0207] 计算肿瘤的长、宽、高，根据前述公式计算肿瘤抑瘤率，相对于溶剂对照组，TV+IL-15组的抑瘤率在第3w和第5w分别为72％和83％，最终TV+IL-15组治疗的有效率为58.3％。
[0208] 试验例3本发明药物用于治疗F344/9L颅内肿瘤
[0209] 1、建模及分组、干预同试验例2
[0210] 2、实验结果
[0211] 1)MRI影像学检查结果
[0212] 因为肿瘤破坏正常的血脑屏障，经尾静脉注射的Gd-BOPTA大量通过破坏的血脑屏障进入组织间隙，形成影像上的造影剂浓聚区域，因此高信号区域可以认为是肿瘤生长的范围。磁共振影像上肿瘤呈不规则圆形或类圆形，与周围脑组织之间分界不清。在21及35d的磁共振影像上，肿瘤体积继续增大，以对照组和脂质体组明显。TV-ORF组和TV+IL-15组肿瘤早期(术后21d前)生长较缓慢，随治疗时间延长，联合治疗组肿瘤部分开始出现变小，或者消失；而TV-ORF组组等对照组肿瘤体积均呈增大的趋势(图5)。
[0213] 与C6胶质瘤不同，9L所致肿瘤出现瘤内坏死的几率低，常常为实体瘤，即便体积巨大时，瘤内可见部分小是囊性坏死区，仍以实体性为主。
[0214] 2)颅内F344/9L胶质瘤干预后体积变化
[0215] 手术后第7d，通过磁共振证实大鼠颅内肿瘤种植成功后，精确测量肿瘤的前后径、左右径及上下径的最大值，数据精确到立方毫米，计算肿瘤体积(肿瘤容积＝3
L×W×D×π/6，即长×宽×深×π/6)。发现第一次检测时平均体积在0.5cm 左右，各组间没有统计学差异。
L×W×D×π/6，即长×宽×深×π/6)。发现第一次检测时平均体积在0.5cm 左右，各组间没有统计学差异。
[0216] 经过干预后，肿瘤的体积变化类似Wistar/C6，第二次(治疗后2周)MRI检测时肿瘤体积仍呈总体增大的趋势，以对照组、脂质体和IL-15组为甚，肿瘤体积明显变大；而TV-ORF组和TV+IL-15组肿瘤体积增大较缓慢，部分肿瘤几乎没有变大，少部分肿瘤开始变小。较前三组差异有统计学意义，后两者间尚没有统计学差异(图6)。经过不同干预后，对照组肿瘤体积逐步快速增大，而联合组肿瘤体积增加缓慢，至后期肿瘤完全消失。
[0217] 3)颅内F344/9L胶质瘤干预后生存时间
[0218] 荷瘤大鼠大多数在接种后4～5w死亡(治疗后4w，8次免疫已经完成)，对照组仅存活2只，MRI显示肿瘤巨大，中线移位明显，而联合治疗组肿瘤体积增加不明显，大部分肿瘤体积开始变小，甚至完全消失，肿瘤的体积变化曲线见图7。至40d时，对照组和脂质体组大鼠全部死亡，而TV-ORF组和IL-15组也大部分死亡，TV+IL-15组肿瘤体积明显变小，大部分已消失，至60d时，联合组有7只存活，肿瘤消失，其余各组均死亡，由此描绘的大鼠生存曲线如下(图7)。从图9可知，各组荷瘤大鼠经过治疗后生存情况可见荷瘤大鼠大多在3-5周内死亡，联合组经治疗后存活率可达近60％。
[0219] 根据前述公式计算肿瘤的抑瘤率，相对于对照组，TV+IL-15联合组的抑瘤率在第3w和第5w分别为66.3％和63％，联合组长期存活为58.3％。
[0220] 试验例4本发明药物用于LL2小鼠肺癌
[0221] 1.LL2小鼠肺癌皮下荷瘤模型建立
[0222] 75％酒精消毒，用1ml皮试针将制备好的LL2肿瘤细胞悬液均匀接种于小鼠右后肢皮下，建立LL2肺癌皮下模型。
[0223] 2.动物分组及免疫
[0224] 将健康C57小鼠随机分成6组，每组5只：
[0225] A生理盐水组：皮下注射生理盐水，100μl/只；
[0226] B脂质体组：皮下注射脂质体，25μg/只，注射体积100μl/只；
[0227] C空载体组：皮下注射按前述方法制备的未连接IL-15基因片段的pORF-lipo(空载)质粒，10μg/只(单纯pORF质粒质量)，注射体积100μl/只；
[0228] D IL-15组：皮下注射前述方法制备的IL-15-pORF-lipo质粒，10μg/只(单纯IL-15-pORF质粒质量)，注射体积100μl/只；
[0229] E全细胞瘤苗组：皮下注射前述方法制备的LL2全细胞瘤苗，106/只，注射体积100μl/只；
[0230] F联合免疫组：皮下注射全细胞瘤苗，剂量方法同TV组，围绕TV组皮下注射点周围多点皮下注射IL-15-pORF-lipo质粒，总剂量同IL-15组。
[0231] 免疫方案：分别于第1周、第3周、第4周、第5周按上述方法及剂量免疫C57小鼠，并与设定时间采集小鼠血清。
[0232] 3.实验结果
[0233] 1)荷瘤小鼠一般情况
[0234] 免疫结束后第7天(D0)建立LL2肺癌皮下模型，接种后12天(D12)开始，联合免疫组小鼠进食饮水明显多于其它组小鼠，全细胞瘤苗组次之，IL-15组再次，精神状况及活动情况各组均无明显异常。接种后第15天(D15)开始，除联合免疫组小鼠外各组小鼠均开始出现进行性的进食及活动减少，伴体重减轻、精神不振、皮毛粗糙。
[0235] 2)LL2皮下肿瘤生长
[0236] 接种后8天(D8)开始触及右后肢皮下米粒大小团块形成，大多数瘤体随瘤龄延长而体积明显增大，质韧、可推动。根据前述公式计算肿瘤抑瘤率，联合免疫组相对生理盐水对照组的抑瘤率在接种后15天最大，达93.02％(图8)。
[0237] 3)荷瘤小鼠生存情况
[0238] 联合免疫组小鼠生存情况明显优于其它5组。接种后21天开始出现对照组小鼠死亡，到接种后45天，联合免疫组和全细胞瘤苗组各存活2只，其余组小鼠全部死亡，其中联合免疫组存活的两只小鼠肿瘤体积不超过2500mm3，至接种后60天观察结束时仍带瘤存活(图9)。
[0239] 4)联合免疫对小鼠细胞免疫的影响
[0240] 实验结果显示，生理盐水组、脂质体组和空载体组杀伤效应均小于15％，IL-15组、全细胞瘤苗组及联合免疫组抑制率升高，其中联合免疫组升高最为明显，且在效靶比为1∶100时达到最大的58.17％。
[0241] 5)联合免疫对小鼠体液免疫的影响
[0242] 以LL2细胞为包被抗原，检测小鼠血清中LL2全细胞瘤苗抗体的含量，通过此实验结果可了解联合免疫对小鼠体液免疫的影响。图示不同时间点各组小鼠血清LL2全细胞瘤苗抗体表达量的差异，免疫后联合免疫组和全细胞瘤苗组血清中的LL2瘤苗抗体表达量明显增高，且联合免疫组抗体表达量增高更为显著。而IL-15基因疫苗组和其余对照组免疫前后抗体表达量改变无统计学差异。
[0243] 6)免疫组化结果
[0244] 选择了CD4、CD8、CD24、CD57抗体分别作为CD4+的T细胞、CD8+的T细胞、B细胞、NK细胞的标志物，对各组小鼠肿瘤组织进行了免疫组化检测。结果显示，IL-15组肿瘤中CD57、CD8有较多表达，CD4和CD24相对表达较少，而全细胞瘤苗组的CD4、CD8和CD24都有较多表达，CD57相对表达较少。全细胞瘤苗联合IL-15组的小鼠肿瘤中各标记物均明显表达增多，且均多于单独全细胞瘤苗组或IL-15组。余组偶见少量非特异性染色，上述各标记物均未见明显阳性征。
[0245] 综上，经过相应干预后，TV-ORF组、pORF-hIL-15和TV+IL-15联合组通过激活淋巴细胞CTL作用和NK细胞及体液免疫参与抗瘤治疗，而联合组显示了更强的抗瘤效应。35d时皮下肿瘤抑制率达到86％，颅内为81％(C6/Wistar)和79％(9L/F344)；联合治疗组生存期延长，部分治疗后肿瘤消失；血清学分析显示肿瘤TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15等明显升高，抗胶质瘤抗原的抗体滴度增加。CTL显示联合组明显高于其他组，4h时细胞死+ + + +亡约40％；淋巴细胞流式表型分析发现CD4、CD8 细胞在联合组相应增多，CD4/CD8 比值约+ +
为3，明显超过正常值；免疫组化显示CD4、CD8 和CD56抗体在瘤周及瘤内明显增多，说明细胞免疫在脑胶质瘤免疫治疗中占有主导性地位，VEGF等表达和MVD在联合组明显降低，可能同时抑制了肿瘤血管生长和肿瘤细胞增殖。总之，通过实验证实采用灭活肿瘤全细胞+
瘤苗、脂质体包裹IL-15质粒局部多点注射后，机体的细胞免疫和体液免疫均被激活，CD4、+
CD8T细胞和NK细胞被激活，荷瘤大鼠针对胶质瘤抗原的抗体IgG滴度增高，可直接通过细胞毒效应和/体液免疫方式参与免疫过程，能显著抑制肿瘤生长，甚至部分被治愈，有效提高了抗瘤效果，延长了生存期。
为3，明显超过正常值；免疫组化显示CD4、CD8 和CD56抗体在瘤周及瘤内明显增多，说明细胞免疫在脑胶质瘤免疫治疗中占有主导性地位，VEGF等表达和MVD在联合组明显降低，可能同时抑制了肿瘤血管生长和肿瘤细胞增殖。总之，通过实验证实采用灭活肿瘤全细胞+
瘤苗、脂质体包裹IL-15质粒局部多点注射后，机体的细胞免疫和体液免疫均被激活，CD4、+
CD8T细胞和NK细胞被激活，荷瘤大鼠针对胶质瘤抗原的抗体IgG滴度增高，可直接通过细胞毒效应和/体液免疫方式参与免疫过程，能显著抑制肿瘤生长，甚至部分被治愈，有效提高了抗瘤效果，延长了生存期。
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