牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白及其应用
阅读：1019发布：2020-07-26
专利汇可以提供牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种 牛 轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白，其是将破伤 风 毒素中T细胞表位多肽P2引入牛轮状病毒VP8*亚单位多拷贝嵌合基因重组蛋白表位 疫苗 中，可以大大提高表位疫苗的免疫效 力 ，并可以诱导交叉中和免疫保护，并诱导更高的中和 抗体 滴度，而且可以诱导高滴度的抗P[5]和P[11]基因型特异的轮状病毒中和抗体。利用本发明的牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白可以同时防治世界范围内主要流行的G6和G10型轮状病毒，适用于制备安全、成本低廉的牛轮状病毒疫苗，与其他目前研发的轮状病毒疫苗配合，可以有效地降低轮状病毒胃肠炎给养牛业的经济损失，具有广阔的市场前景。，下面是牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白及其应用专利的具体信息内容。
1.牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白，其特征在于，其是由破伤风毒素T细胞表位多肽P2以及基因型为G6P[5]的牛轮状病毒VP8*亚单位的截短形式a和截短形式b嵌合而成的重组蛋白；其中，截短形式a和截短形式b之间无多余氨基酸，且为多拷贝，在破伤风毒素T细胞表位多肽P2、多拷贝的基因型为G6P[5]的牛轮状病毒VP8*亚单位的截短形式a和截短形式b之间通过柔性Linker连接；
其中，所述破伤风毒素T细胞表位多肽P2、基因型为G6P[5]的牛轮状病毒VP8*亚单位的截短形式a和截短形式b的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-3所示。
2.根据权利要求1所述的重组嵌合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.编码权利要求2所述重组嵌合蛋白的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体。
6.含有权利要求3或4所述基因的宿主细胞。
7.制备权利要求1或2所述重组嵌合蛋白的方法，其特征在于，将权利要求5所述的表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并接种于LB液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达获得重组嵌合蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LB液体培养基中还添加0.02g/mL葡萄糖、1～5v/v％乙醇和2％甘油。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将阳性克隆接种于LB液体培养基中培养至OD600＝0.5，加入IPTG至终浓度为0.5mM，在18℃下诱导表达重组嵌合蛋白。
10.权利要求1或2所述的重组嵌合蛋白在制备牛轮状病毒疫苗中的应用。
牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 轮状病毒为呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，是导致多种新生动物和婴幼儿胃肠炎的主要病原体。牛轮状病毒腹泻以精神沉郁、厌食、腹泻、脱水为主要特征，7日龄以内犊牛最易感染，发病率可高达90％～100％，死亡率可达10％～50％。如果继发大肠杆菌性败血症则可导致死亡率进一步上升，严重危害养牛业的经济效益。
[0003] 轮状病毒粒子由3层衣壳组成，最外层衣壳由VP7和纤突蛋白VP4组成，两者均可以独立地诱导中和抗体。研究表明，VP4蛋白具有诸多功能，如病毒血凝素、吸附和细胞侵入、毒力相关。VP4蛋白经胰酶裂解为VP8*(28kDa、aa 1～240)和VP5*(60kDa、aa247-775)两种亚单位，其中VP8*具有VP4蛋白的主要抗原表位，且决定VP4蛋白血清特异性中和反应。
[0004] 目前尚无特效药物治疗轮状病毒性胃肠炎，疫苗接种是预防该病的主要措施。轮状病毒的免疫防制主要通过免疫怀孕母牛，新生犊牛通过初乳获得天然被动免疫。一直以来广泛应用灭活疫苗来进行轮状病毒的免疫防制，但灭活疫苗不总是安全的，经常出现严重的副反应。而且牛源轮状病毒在猴源MA104细胞系上扩增效率较低，病毒滴度较低，一般4 5
只能达到10～10 cfu/ml，远远达不到灭活疫苗的所要求的病毒滴度，必须要经过培养后的浓缩和纯化，导致生产成本的增加。所以世界范围内不同研究小组尝试DNA疫苗、病毒样颗粒疫苗、植物可食用疫苗。但是这些疫苗存在制备工艺复杂、生产成本高等缺点，不适合商品化疫苗生产，目前只停留在实验室研究阶段。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于力课题组将绵羊轮状病毒LLR-85毒株(G10P[15])VP7基因替换为牛源G6型VP7基因进而开发出牛轮状病毒重配弱毒候选疫苗，但是任何轮状病毒活疫苗都存在排毒的问题。更重要的是，活疫苗不能用于怀孕母牛免疫。因此亟待研发安全、高效的新型牛轮状病毒疫苗用来防制牛轮状病毒性腹泻。
只能达到10～10 cfu/ml，远远达不到灭活疫苗的所要求的病毒滴度，必须要经过培养后的浓缩和纯化，导致生产成本的增加。所以世界范围内不同研究小组尝试DNA疫苗、病毒样颗粒疫苗、植物可食用疫苗。但是这些疫苗存在制备工艺复杂、生产成本高等缺点，不适合商品化疫苗生产，目前只停留在实验室研究阶段。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于力课题组将绵羊轮状病毒LLR-85毒株(G10P[15])VP7基因替换为牛源G6型VP7基因进而开发出牛轮状病毒重配弱毒候选疫苗，但是任何轮状病毒活疫苗都存在排毒的问题。更重要的是，活疫苗不能用于怀孕母牛免疫。因此亟待研发安全、高效的新型牛轮状病毒疫苗用来防制牛轮状病毒性腹泻。
[0005] 近年来，表位疫苗的使用越来越广泛，它是利用基因工程的手段，体外表达或人工合成病原微生物的表位，将其作为一种疫苗使用。表位疫苗相对于传统疫苗来说最大的优势就是可以克服传统疫苗散毒风险以及活疫苗不能用于怀孕动物等缺陷。已在人Wa株轮状病毒VP8*上鉴定出5个抗原表位，其中3个为线性中和表位(aa 1-10、aa55-66和aa223-234)，且aa 1-10表位在多种毒株间高度保守，对研制抗多种毒株或血清型的轮状病毒疫苗有重要意义。
[0006] 轮状病毒基因型别组合众多，不同基因型间的交叉免疫甚少，这给疫苗研制带来了困难。但是，研究发现一个P基因型可能覆盖数个G基因型，即某个P型可以与不同的G型组合，理论上同一P型可以诱导抗不同G型的异型免疫。而决定P型的VP4蛋白含有多个线性化抗原表位，且该蛋白无需翻译后修饰，其经胰酶裂解后形成的VP8*片段，包含了VP4型特异性主要抗原表位，皆为线性且较为保守，提示可以利用VP8*蛋白来开发新型PRV亚单位疫苗。
[0007] 世界范围内流行的牛轮状病毒G基因型主要为G6和G10两种，其P基因型主要为P[5]和P[11]，除此之外还存在P[1]、P[21]和P[29]。常规的疫苗开发主要是开发二价疫苗同时防治G6P[5]和G10P[11]轮状病毒毒株，这给疫苗开发和生产带来一定的困难，注定导致疫苗生产成本提高。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种新型的牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白及其应用。
[0009] 为了实现本发明目的，本发明的牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白，其是由破伤风毒素T细胞表位多肽P2以及基因型为G6P[5]的牛轮状病毒VP8*亚单位的截短形式a和截短形式b嵌合而成的重组蛋白；其中，截短形式a和截短形式b之间无多余氨基酸，且为多拷贝，在破伤风毒素T细胞表位多肽P2、多拷贝的基因型为G6P[5]的牛轮状病毒VP8*亚单位的截短形式a和截短形式b之间通过柔性Linker连接。
[0010] 其中，所述破伤风毒素T细胞表位多肽P2、基因型为G6P[5]的牛轮状病毒VP8*亚单位的截短形式a和截短形式b的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-3所示。
[0011] 本发明还提供编码上述重组嵌合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0012] 本发明还提供含有编码上述重组嵌合蛋白基因的表达载体、宿主细胞和工程菌。
[0013] 本发明还提供制备上述重组嵌合蛋白的方法，将含有编码上述重组嵌合蛋白基因的表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并接种于LB液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达获得重组嵌合蛋白。
[0015] 具体地，将阳性克隆接种于上述LB液体培养基中培养至OD600约0.5，加入IPTG至终浓度为0.5mM，在18℃下诱导表达重组嵌合蛋白。
[0016] 本发明进一步提供所述牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白在制备牛轮状病毒疫苗中的应用。
[0017] 本发明将破伤风毒素中T细胞表位多肽P2(破伤风毒素TT的第830-844位氨基酸)引入牛轮状病毒VP8*亚单位多拷贝嵌合基因重组蛋白表位疫苗中，可以大大提高表位疫苗的免疫效力，并可以诱导交叉中和免疫保护，并诱导更高的中和抗体滴度，而且可以诱导高滴度的抗P[5]和P[11]基因型特异的轮状病毒中和抗体。利用本发明的牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白可以同时防治世界范围内主要流行的G6和G10型轮状病毒，适用于制备安全、成本低廉的牛轮状病毒疫苗，与其他目前研发的轮状病毒疫苗配合，可以有效地降低轮状病毒胃肠炎给养牛业的经济损失，具有广阔的市场前景。附图说明
[0019] 图2为本发明实施例1 中退火扩增VP8*-ab模板和VP8*-a；其中，M:DL2000Marker；1:VP8*-ab基因的PCR产物；2:VP8*-a基因的PCR产物；3:阴性对照。
[0020] 图3为本发明实施例1中全长VP8*基因PCR扩增结果；其中，M:DL2000Marker；1:VP8*PCR扩增产物；2:阴性对照。
[0021] 图4为本发明实施例1中P2-VP8*-(ab)3和P2-VP8*-ab PCR扩增产物电泳结果；其中，M：DL2000Marker；1:P2-VP8*-(ab)3PCR扩增产物；2:P2-VP8*-ab PCR扩增产物；3:阴性对照。
[0022] 图5 为 本 发 明 实 施 例 1中 菌 液 PCR鉴 定 pET28a-P2-VP8*-(ab)3 和pET32a-P2-VP8*-ab 结 果； 其 中，M:DL2000Marker；1:pET28a-VP8*-(ab)3T7PCR产 物；2:pET28a-P2-VP8*-(ab)3T7PCR 产 物；3:pET32a-VP8*-ab T7PCR 产 物；4:pET32a-P2-VP8*-ab T7PCR产物；5:阴性对照。
[0023] 图6为本发明实施例2中重组蛋白在大肠杆菌中的表达结果；其中，图A中，M：蛋白质分子质量标准；1、2、3分别为pET-28a-VP8*-(ab)3诱导前全菌体、诱导后菌体裂解上清和诱导后菌体裂解沉淀；4、5、6分别为pET-32a-VP8*-ab诱导前全菌体、诱导后菌体裂解上清和诱导后菌体裂解沉淀；7、8、9分别为pET-32a-VP8*-a诱导前全菌体、诱导后菌体裂解上清和诱导后菌体裂解沉淀；10、11分别为pET-28a-BL21(DE3)、pET-32a(+)-BL21(DE3)空载体重组菌诱导后全菌体全菌体；图B中，M：蛋白质分子质量标准；1、2、3分别为pET-28a-P2-VP8*-(ab)3诱导前全菌体、诱导后菌体裂解上清和诱导后菌体裂解沉淀；4、5、6分别为pET-32a-P2-VP8*-ab诱导前全菌体、诱导后菌体裂解上清和诱导后菌体裂解沉淀；7、8分别为pET-28a(+)诱导后全菌体和pET-32a(+)诱导后全菌体；9、10、11分别为pET-28a-VP8*诱导前全菌体、诱导后菌体裂解上清和诱导后菌体裂解沉淀。
[0024] 图7为本发明实施例3中重组蛋白的Western blot分析结果；其中，M：蛋白质分子质量标准；1：重组VP8*-(ab)3蛋白；2：重组VP8*-ab蛋白；3：重组VP8*-a蛋白；4：重组VP8*蛋白；5：重组P2-VP8*-(ab)3蛋白；6：重组P2-VP8*-ab蛋白；7：pET-28a(+)对照；8：pET-32a(+)对照。
[0025] 图8为本发明实施例4中重组蛋白的纯化结果；其中，M：蛋白质分子质量标准；1：重组VP8*-(ab)3蛋白；2：重组VP8*-ab蛋白；3：重组VP8*-a蛋白；4：重组VP8*蛋白；5：
P2-VP8*-(ab)3蛋白；6：P2-VP8*-ab蛋白。
P2-VP8*-(ab)3蛋白；6：P2-VP8*-ab蛋白。
[0026] 图9为本发明实施例5中P2-VP8*-(ab)3、P2-VP8*-ab、VP8*-(ab)3、VP8*-ab、VP8*重组蛋白的免疫原性分析结果。
具体实施方式
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0028] 以下实施例中涉及的生物材料的来源：原核表达载体pET28a购自Novagen公司；E.coli BL21(DE3)购自Novagen公司；所用引物为自行设计并委托北京六合华大基因科技有限公司合成。
[0029] 实施例1含有目的片段的表达载体的构建
[0030] 所用材料为基因型G5P[6]的牛轮状病毒，用原代非洲绿猴肾(AGMK)细胞进行培养。所用培养基为EMEM，其中添加胰酶至终浓度为0.5μg/ml，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，两性霉素B2.5μg/ml。EMEM培养基(高糖型)配方见表1。
[0031] 表1 EMEM培养基配方
[0032]
[0033] (1)引物设计
[0034] 根据GenBank中公开的牛轮状病毒VP4基因序列(基因登录号：JF693062.1)，利用Oligo7.0和DNAStar软件设计引物，引物序列见表2。其中第一对引物VP8*-ab-0-F、VP8*-ab-0-R退火作为后续扩增的模板，a、b分别代表aa 1-11和aa 218-235)，斜体划线部分为酶切位点序列。
[0035] 表2 引物序列
[0036]
[0037] (2)轮状病毒RNA提取
[0038] 经AGMK细胞培养获得的牛轮状病毒上清液用于提取RNA，具体步骤如下：每200μL病毒液(细胞液)中加入500μL TRizol，充分振荡1min(以最快速度手动振荡)后室温静置5～10min；加入400μL氯仿，如上振荡后静止5～10min，4℃12000r/min离心15min；取上层水相置于新EP管中，加入1/2TRizol体积的异丙醇，室温静置5～
10min(或-20℃放置2～3h、或-70℃放置30min以上)进行沉淀，4℃12000r/min离心
15min；弃上清，RNA沉淀在超净台内室温自然干燥15min左右；用10μL不含RNase的水溶解RNA沉淀。
10min(或-20℃放置2～3h、或-70℃放置30min以上)进行沉淀，4℃12000r/min离心
15min；弃上清，RNA沉淀在超净台内室温自然干燥15min左右；用10μL不含RNase的水溶解RNA沉淀。
[0039] (3)轮状病毒VP4全长基因的RT-PCR扩增
[0040] 反转录体系(20μL体系)如下：下游通用引物(20μM)0.5μL；RNA模板5.5μL；不含RNase的水4μL；2.5mM的dNTP 4μL；RNase抑制剂0.5μL(20u)；M-MuLV反转录酶
1μL(40u)；5×反应缓冲液4μL。具体步骤如下：首先加入RNA及引物，并按它们总体积的10％加入DMSO(约0.6μL)，95℃3min使双链RNA变性，冰上放置2min冷却；冷却后加入dNTP、RNase抑制剂及不含RNase的水，37℃孵育3～5min，冰上放置2min冷却；冷却后加入M-MuLV反转录酶，37℃孵育2h；最后70℃孵育10min终止反应，冰上放置2min，置于-20℃或-70℃保存备用。PCR反应体系如下(25μL体系)：引物各1μL(20μM)；cDNA模板1μL；2.5mM的dNTP 8μL；pfu DNA聚合酶0.25μL(1.25u)；10×pfu buffer 2.5μL；
ddH2O 6.25μL。反应条件如下：95℃3min预变性；95℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸
2.5min，30个循环；72℃延伸10min。将所扩增的全长目的基因用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)，并用胶回收试剂盒(Promega，A9303)进行回收纯化。产物回收纯化步骤如下：
琼脂糖凝胶电泳结束后，将目的DNA条带切下，置于1.5mL离心管中；每10mg的的胶中加入
10μL膜结合液，于50～60℃孵育直至琼脂糖完全溶解(如果是PCR产物，则直接加入等体积的膜结合液于PCR产物中；将吸附柱插入收集管中；溶液转移到吸附柱中，室温放置约
1min；16000×g离心1min，弃掉所收集的废液，并将吸附柱重新插到收集管中；加入700μL膜洗液(已加乙醇)，16000×g离心1min，弃掉所收集的废液，并将吸附柱重新插到收集管中；用500μL的膜洗液重复一次，16000×g离心5min；弃掉收集管中的废液，重新离心
1min；将吸附柱转移到一个新的1.5mL离心管中；向吸附柱中加入50μL不含核酸酶的水，室温放置1min，16000×g离心1min；弃掉吸附柱，将DNA贮存于-20℃。
1μL(40u)；5×反应缓冲液4μL。具体步骤如下：首先加入RNA及引物，并按它们总体积的10％加入DMSO(约0.6μL)，95℃3min使双链RNA变性，冰上放置2min冷却；冷却后加入dNTP、RNase抑制剂及不含RNase的水，37℃孵育3～5min，冰上放置2min冷却；冷却后加入M-MuLV反转录酶，37℃孵育2h；最后70℃孵育10min终止反应，冰上放置2min，置于-20℃或-70℃保存备用。PCR反应体系如下(25μL体系)：引物各1μL(20μM)；cDNA模板1μL；2.5mM的dNTP 8μL；pfu DNA聚合酶0.25μL(1.25u)；10×pfu buffer 2.5μL；
ddH2O 6.25μL。反应条件如下：95℃3min预变性；95℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸
2.5min，30个循环；72℃延伸10min。将所扩增的全长目的基因用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)，并用胶回收试剂盒(Promega，A9303)进行回收纯化。产物回收纯化步骤如下：
琼脂糖凝胶电泳结束后，将目的DNA条带切下，置于1.5mL离心管中；每10mg的的胶中加入
10μL膜结合液，于50～60℃孵育直至琼脂糖完全溶解(如果是PCR产物，则直接加入等体积的膜结合液于PCR产物中；将吸附柱插入收集管中；溶液转移到吸附柱中，室温放置约
1min；16000×g离心1min，弃掉所收集的废液，并将吸附柱重新插到收集管中；加入700μL膜洗液(已加乙醇)，16000×g离心1min，弃掉所收集的废液，并将吸附柱重新插到收集管中；用500μL的膜洗液重复一次，16000×g离心5min；弃掉收集管中的废液，重新离心
1min；将吸附柱转移到一个新的1.5mL离心管中；向吸附柱中加入50μL不含核酸酶的水，室温放置1min，16000×g离心1min；弃掉吸附柱，将DNA贮存于-20℃。
[0041] (4)pMD18-T-Bo-VP4载体的构建
[0042] 取上述胶回收试剂盒回收的VP4全长基因PCR产物与pMD18-T载体进行连接，连接体系(10μL体系)如下：VP4全长基因PCR产物4.5μL；pMD18-T载体0.5μL；Solution I连接缓冲液5μL，混匀、瞬时离心后16℃过夜连接。取出-80℃冰箱中存放的感受态细胞一管(100μL/管)置于冰水混合物中，待感受态细胞近乎完全融化时加入10μL连接产物，轻轻吹吸混匀后放置于冰水混合物中30min；42℃热激90s后置于冰水混合物中2～3min；向管中加入约1mL培养基，200rpm、37℃振荡培养45min～1h；5000rpm离心3min后吸出约1mL上清后将剩余菌体和上清混匀涂板(卡那霉素抗性平板)，风干后37℃培养12h左右。质粒提取步骤如下：在超净台内挑取平板上的单菌落接于试管中，37℃、200r/min过夜摇菌；取所接菌液2mL，12000rpm离心1min收集菌体，弃掉上清，残余液用枪头吸净；加入Solution I 100μL，将菌液重悬、漩涡混匀；加入Solution II 200μL，立即温和颠倒
4～5次，冰浴5min；加入Solution III 150μL，温和地上下颠倒6～8次，冰浴5min；
12000rpm离心15min；将上清吸出转入一个新的1.5mL离心管中，向离心管中加两倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀；12000rpm离心5min，弃上清，沉淀用1mL 75％乙醇洗涤，12000rpm离心3min，弃上清；重复洗涤步骤两次，沉淀于室温干燥10min；用20μL的TER溶解沉淀，-20℃保存所提质粒。利用pMT18-T上的酶切位点BamHI切割所提取的质粒以鉴定所提取质粒是否成功连接于pMT18-T上，单酶切体系如下：重组质粒6.6μL；buffer Bam H I
1.0μL；Bam H I 0.5μL；ddH2O 1.9μL，混匀、瞬时离心后37℃水浴2h，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将单酶切鉴定正确重组质粒的菌液转接至新鲜LB培养基中过夜摇菌，次日加入
25％甘油后送至北京华大基因测序。
4～5次，冰浴5min；加入Solution III 150μL，温和地上下颠倒6～8次，冰浴5min；
12000rpm离心15min；将上清吸出转入一个新的1.5mL离心管中，向离心管中加两倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀；12000rpm离心5min，弃上清，沉淀用1mL 75％乙醇洗涤，12000rpm离心3min，弃上清；重复洗涤步骤两次，沉淀于室温干燥10min；用20μL的TER溶解沉淀，-20℃保存所提质粒。利用pMT18-T上的酶切位点BamHI切割所提取的质粒以鉴定所提取质粒是否成功连接于pMT18-T上，单酶切体系如下：重组质粒6.6μL；buffer Bam H I
1.0μL；Bam H I 0.5μL；ddH2O 1.9μL，混匀、瞬时离心后37℃水浴2h，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将单酶切鉴定正确重组质粒的菌液转接至新鲜LB培养基中过夜摇菌，次日加入
25％甘油后送至北京华大基因测序。
[0043] (5)单拷贝基因及多拷贝嵌合基因的克隆
[0044] VP8*-ab的扩增：反应体系如下：引物VP8*-ab-0F、VP8*-ab-0R各3μL，dNTP2μL(2.5mM)，pfu DNA聚合酶0.2μL，10×pfu Buffer(含MgSO4)2.5μL，ddH2O补充体系至25μL。反应条件为：95℃预变性3min；95℃40s，70℃40s，72℃30s，7个循环；72℃延伸10min。
[0045] 引 入 酶 切 位 点 的VP8*-ab扩 增：以 引 物VP8*-ab-1-F和 VP8*-ab-1-R、VP8*-ab-2-F和VP8*-ab-2-R、VP8*-ab-3-F和VP8*-ab-3-R分别进 行PCR来扩增 三段VP8*-ab-1、VP8*-ab-2和VP8*-ab-3基因片段，反应体系如下：10×pfu Buffer(含MgSO4)2.5μL；dNTP(2.5mM)2μL；引物(20μM)各0.5μL；模板DNA 1μL；pfu DNA聚合酶0.2μL；ddH2O 18.3μL。反应条件为：95℃预变性3min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。
[0046] VP8*-a的扩增：直接用两条引物VP8*-a-F，VP8*-a-R退火扩增此目的片段，退火温度为50.5℃，其余同上。
[0047] VP8*全长片段的扩增：以保存的重组质粒pMD18-T-Bo-VP4为模板，VP8*-F、VP8*-R为引物进行扩增，退火温度为55℃，72℃延伸100s，其余同上(PCR扩增结果如图2所示)。
[0048] (6)轮状病毒VP8全长基因的克隆
[0049] 取上述构建的pMD18-T-Bo-VP4质粒为模板，以引物VP8*-F和VP8*-R为扩增VP8*基因片段，反应体系如下(25μL)：10×pfu buffer2.5μL；dNTP(2.5mM)2μL；引物(20μM)各1.0μL；pfu DNA聚合酶0.2μL；ddH2O 18.3μL。PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸100s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图3)。胶回收试剂盒回收、纯化PCR产物，-20℃保存。
[0050] (7)PCR产物与载体的连接及鉴定
[0051] PCR产物与载体利用相应限制性内切酶双酶切，胶回收试剂盒回收目的片段，T4DNA连接酶4℃过夜连接后转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含相应抗性的LB平板，37℃培养过夜。次日挑取单菌落接种于含相应抗性的LB液体培养基中，37℃摇菌12h后提取质粒。PCR(用通用引物T7进行PCR)鉴定阳性质粒，逐步克隆第2段和第3段基因。最后重组阳性质粒命名为pET28a-VP8*-(ab)3，送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序鉴定。其他3种重组质粒同法构建，其中VP8*-ab、VP8*-a所用载体为pET32a(+)，全长VP8*片段所用载体为pET28a(+)。阳性重组质粒命名为pET32a-VP8*-ab、pET32a-VP8*-a和pET28a-VP8*。
[0052] (8)P2-VP8*-(ab)3和P2-VP8*-ab基因克隆
[0053] 以所构建的重组质粒pET28a-VP8*-(ab)3为模板，以P2-VP8*-(ab)3-F和VP8*-ab-3-R为引物扩增P2-VP8*-(ab)3；以所构建的重组质粒pET32a-VP8*-ab为模板，以P2-VP8*-(ab)3-F和VP8*-ab-2-R为引物扩增P2-VP8*-ab。反应体系均如下(25μL)：10×pfu buffer 2.5μL，dNTP(2.5mM)2μL，引物(20μM)各1.0μL，pfu DNA聚合酶
0.2μL，ddH2O 18.3μL。PCR扩增目的片段反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，
55℃(P2-VP8*(ab)3)或60℃(P2-VP8*-ab)退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸
10min。扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图4)。胶回收试剂盒回收、纯化PCR产物，-20℃保存。
0.2μL，ddH2O 18.3μL。PCR扩增目的片段反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，
55℃(P2-VP8*(ab)3)或60℃(P2-VP8*-ab)退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸
10min。扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图4)。胶回收试剂盒回收、纯化PCR产物，-20℃保存。
[0054] (9)P2-VP8*-(ab)3和P2-VP8*-ab重组质粒的构建
[0055] PCR产物P2-VP8*-(ab)3、P2-VP8*-ab与载体pET28a/pET32a利用Nco I和Xho I内切酶双酶切，胶回收试剂盒回收目的片段，T4DNA连接酶4℃过夜连接后转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含相应抗性的LB平板，37℃培养过夜。次日挑取单菌落接种于含相应抗性的LB液体培养基中，37℃摇菌12h后提取质粒。PCR(用通用引物T7进行PCR)鉴定阳性质粒，逐步克隆第2段和第3段基因(菌落PCR鉴定结果如图5所示)。最后重组阳性质粒命名为pET28a-P2-VP8*-(ab)3和pET32a-P2-VP8*-(ab)，重组质粒委托北京六合华大基因科技有限公司进行测序鉴定。
[0056] 实施例2牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白的表达
[0057] 采用热休克法，将表达质粒pET28a-P2-VP8*-(ab)3、pET28a-P2-VP8*-ab、pET28a-VP8*-(ab)3、pET32a-VP8*-ab、pET32a-VP8*-a 和 pET28a-VP8* 转 化 到 E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。从琼脂板上挑取单克隆接种于含50μg/ml卡那霉素(pET28a载体)或50μg/ml氨苄霉素(pET32a载体)的LB液体培养基中(加入2％葡萄糖，1％乙醇和2％甘油)。当600nm下吸光度值达0.5时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃过夜诱导表达蛋白。然后4℃10000g离心15min收集重组E.coli细胞，-80℃贮存备用(重组蛋白SDS-PAGE电泳结果如图6A和图6B所示，P2-VP8*-(ab)3的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示)。
[0058] 实施例3重组蛋白的Western blot检测
[0059] 表达的重组蛋白经15％SDS-PAGE电泳后，电转至PVDF膜上，以含5％脱脂乳的PBST 37℃封闭1h，PBST洗涤3次，以1:2000倍稀释的抗His-tag单抗4℃孵育过夜，PBST洗涤3次，以1:5000倍稀释HRP标记的羊抗鼠IgG 37℃孵育1h；PBST洗涤3次，DAB显色(图7)。
[0060] 实施例4重组蛋白的纯化
[0061] 用含蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的BugBuster Master Mix(Novagen)破坏E.Coli细胞的细胞壁，或用超声波破碎法，收集可溶性产物，-80℃贮存备用。用ProBond nickel-NTA琼脂亲和层析(Invitrogen)，按照厂商所给步骤对每种蛋白进行纯化。用含不同浓度咪唑(20-100mM)的洗脱缓冲液洗去细胞蛋白后，250mM咪唑洗脱重组蛋白。SDS-PAGE分析重组蛋白的纯度，然后用超滤管(Millipore)去除咪唑。按照BCA定量试剂盒(Thermo)厂商说明，用BCA定量试剂盒确定纯化后的重组蛋白浓度。纯化后的重组蛋白于-80℃保存备用(每种重组蛋白的产量可以达到20mg/L)。按照厂商所给步骤，用TM
Toxinsensor chromogenic LAL内毒素检测试剂盒(GenScript)检测纯化后的蛋白中内毒素水平。结果显示，内毒素水平均在1.8-2.0EU/ml左右，其远远低于重组亚单位疫苗最大允许内毒素水平(＜20EU/ml)(图8)。
Toxinsensor chromogenic LAL内毒素检测试剂盒(GenScript)检测纯化后的蛋白中内毒素水平。结果显示，内毒素水平均在1.8-2.0EU/ml左右，其远远低于重组亚单位疫苗最大允许内毒素水平(＜20EU/ml)(图8)。
[0062] 实施例5不同免疫原之间的免疫原性
[0063] 1、小鼠免疫实验
[0064] 将6～8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分组，每组10只进行肌肉注射免疫。对照组为PBS+氢氧化铝佐剂，其他9组为实验组，以P2-VP8*-(ab)3、P2-VP8*-ab、VP8*-(ab)3、VP8*-ab、VP8*-a、VP8*共6种重组蛋白分别与氢氧化铝佐剂乳化混合免疫动物，每只小鼠注射20μg蛋白+600μg氢氧化铝佐剂，不足体积的以PBS补齐；每次免疫前及末次免疫后14d对小鼠进行尾静脉采血，分离血清于-20℃保存备检。
[0065] 2、抗体水平的检测
[0066] 首先对抗原包被浓度及二抗稀释度进行优化，以确定最佳抗原包被浓度和二抗工作浓度。然后以优化好的抗原包被浓度及二抗稀释度对所采集的小鼠血清样品进行检测，检测每次免疫后小鼠产生的血清抗体水平。间接ELISA的具体操作程序如下：用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将VP8*蛋白进行稀释，以每孔100μL包被96孔ELISA反应板，4℃过夜包被，包被后以PBST洗涤3次，拍干后加封闭液(含5％脱脂乳的PBST)，每孔200μL，
37℃封闭2h。封闭后以PBST洗涤3次拍干后，将待检血清进行倍比稀释后加入孔中，同时设阴性对照孔，每孔100μL，37℃孵育1h。以PBST洗涤3次拍干后加用含5％的脱脂乳的PBST稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤3次拍干后加TMB底物显色液，室温避光作用15min。加2mol/L硫酸终止反应，酶标仪检测OD450值。以P/N值大于或等于2.1为阳性阈值。P2-VP8*-(ab)33次免疫后诱导了极佳的免疫应答，其抗体滴度高于全长VP8*的(P＜0.05)。VP8*-(ab)3、VP8*-ab两组血清效价相比表明，嵌合表位的多拷贝重复显著地提高了抗原的免疫原性(P＜0.05)。P2-VP8*-ab、VP8*-ab两组比较表明，T细胞抗原表位的引入显著地提高了抗原的免疫应答水平(P＜0.01)(ELISA测定血清抗体滴度比较结果如图9所示)。
37℃封闭2h。封闭后以PBST洗涤3次拍干后，将待检血清进行倍比稀释后加入孔中，同时设阴性对照孔，每孔100μL，37℃孵育1h。以PBST洗涤3次拍干后加用含5％的脱脂乳的PBST稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤3次拍干后加TMB底物显色液，室温避光作用15min。加2mol/L硫酸终止反应，酶标仪检测OD450值。以P/N值大于或等于2.1为阳性阈值。P2-VP8*-(ab)33次免疫后诱导了极佳的免疫应答，其抗体滴度高于全长VP8*的(P＜0.05)。VP8*-(ab)3、VP8*-ab两组血清效价相比表明，嵌合表位的多拷贝重复显著地提高了抗原的免疫原性(P＜0.05)。P2-VP8*-ab、VP8*-ab两组比较表明，T细胞抗原表位的引入显著地提高了抗原的免疫应答水平(P＜0.01)(ELISA测定血清抗体滴度比较结果如图9所示)。
[0067] 实施例6重组蛋白的中和试验
[0068] 采用500-550g/只的远交系雌性豚鼠，每组4只，随机分配。每两周给豚鼠肌内注射(IM)免疫一次，P2-VP8*-(ab)3、P2-VP8*-ab、VP8*-(ab)3、VP8*-ab、VP8*每次免疫20μg(加磷酸铝(AP)佐剂)(每剂含100μg铝)，共免疫3次，末次免疫7天后采血。
[0069] 通过60％噬斑减少中和(PRN)试验确定每份血清样本的中和抗体滴度。0.25ml G6P[5]型或者G10P[11]型轮状病毒与等体积倍比稀释的血清混合1h后，加入6孔板中，37℃吸附1h，加入3ml琼脂糖(含MEM，0.5μg/ml胰酶)，待琼脂糖凝固后，37℃倒置培养。
4d后，铺第2层琼脂糖(含2％中性红)，计算病毒噬斑被血清抑制达60％的稀释度，计算血清中和效价。
4d后，铺第2层琼脂糖(含2％中性红)，计算病毒噬斑被血清抑制达60％的稀释度，计算血清中和效价。
[0070] 表3 P2-VP8*-(ab)3、P2-VP8*-ab、VP8*-(ab)3、VP8*-ab、VP8*的中和抗体水平[0071]
[0072] 注：a60％噬斑减少中和试验血清抗体滴度(倒数)
[0073] 从表3可以看出，VP8*-(ab)3重组嵌合表位疫苗所诱导的中和抗体滴度显著高于VP8*-ab所诱导的中和抗体滴度，但低于VP8*全蛋白，与预期一致。破伤风毒素T细胞表位多肽P2的引入可以显著地提高VP8*-(ab)3重组嵌合表位疫苗的免疫效力，高于VP8*全蛋白的所诱导的中和抗体水平。可以诱导高滴度的抗P[5]和P[11]基因型特异的轮状病毒中和抗体，适合于制备牛轮状病毒疫苗。
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