技术领域
[0001] 本
发明涉及免疫细胞治疗技术领域，具体为一种治疗慢性病的自体
全细胞疫苗配方及其制备方法。
背景技术
[0002] 全细胞疫苗能安全有效的激活免疫系统和刺激
机体产生自然杀伤细胞。产生免疫反应大约需一周时间才能到达变异细胞，从而产生特异性单克隆
抗体的初级反应，大约需要两周才能到达变异细胞特异性单克隆抗体的次级反应，介入先天性免疫反应的多种细胞因子在各种免疫反应中起调节作用，使疫苗能充分利用免疫系统来彻底地灭杀异质多变的变异细胞群体。
[0003] 目前在治疗慢性病的自体全细胞疫苗制备上没有明显突破，为此我们提出一种治疗慢性病的自体全细胞疫苗配方及其制备方法用于解决上述问题。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种治疗慢性病的自体全细胞疫苗配方及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种治疗慢性病的自体全细胞疫苗配方，包括以下重量组份：自
体细胞5份、单克隆抗体2份、细胞因子2份、细胞裂解剂1份以及生理盐
水；
[0006] 其中单克隆抗体包括1份单克隆抗体CD3和1份单克隆抗体CD56，细胞因子包括1份IL-2和1份IL-15。
[0007] 一种治疗慢性病的自体全细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤一：采集，从患有慢性病的人体中采集外周血；
[0009] 步骤二：分离，分离外周血并提取自体免疫细胞；
[0010] 步骤三：提取，离心后提取细胞，并洗涤细胞；
[0011] 步骤四：培养，加入单克隆抗体、血清、细胞因子培养细胞；
[0012] 步骤五：扩增，补加血清、单克隆抗体、细胞因子培养细胞；
[0013] 步骤六：收集，培养半个月后即可收集细胞；
[0014] 步骤七：裂解，用细胞裂解剂进行裂解；
[0015] 步骤八：纯化，制成半成品全细胞疫苗；
[0016] 步骤九：制剂，制成全细胞疫苗成品；
[0017] 作为本发明的一种改进，步骤一中的外周血采集的体积为100ml。
[0018] 作为本发明的一种改进，步骤二中采用离心机进行离心处理，其转速为2000rpm，离心时间为20分钟。
[0019] 作为本发明的一种改进，步骤四中添加的单克隆抗体为单克隆抗体CD3，细胞因子为IL-2，将其溶于500ml的培养基中，并在培养
温度37℃、5.0％CO
培养箱中培养。
[0020] 作为本发明的一种改进，步骤五中补加的单克隆抗体为单克隆抗体CD56，细胞因子为IL-15。
[0021] 作为本发明的一种改进，步骤六中采用离心的方式进行收集，离心机转速为1500rpm，离心时间为10分钟。
[0022] 作为本发明的一种改进，步骤七中采用的细胞裂解剂为蛋白酶K，裂解方式是放摇床震荡2个小时使细胞裂解。
[0023] 作为本发明的一种改进，步骤八中采用离心机进行纯化，离心机转速为15000rpm，离心时间为1小时。
[0024] 与
现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明是利用人体自身的血液中的变异细胞制备成的疫苗，它能够刺激机体产生针对变异
抗原的特异性免疫反应，产生具有特异杀伤作用的免疫细胞和单克隆抗体，这些细胞和抗体在体内循环识别和杀死携带变异抗原的变异细胞，清除变异细胞产生的代谢废物，达到防止
疾病复发，提高
生活质量的目的，目前实验证实该疫苗对糖尿病和
皮肤病患者有很好的疗效。
具体实施方式
[0025] 下面将结合本发明
实施例中的附表，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026] 本发明提供一种技术方案：一种治疗慢性病的自体全细胞疫苗配方，包括以下重量组份：自体细胞5份、单克隆抗体2份、细胞因子2份、细胞裂解剂1份以及生理盐水；
[0027] 其中单克隆抗体包括1份单克隆抗体CD3和1份单克隆抗体CD56，细胞因子包括1份IL-2和1份IL-15。
[0028] 本发明还提供一种治疗慢性病的自体全细胞疫苗的制备方法，下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0029] 实施例一
[0030] 一种治疗慢性病的自体全细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0031] 步骤一：采集，从患有慢性病的人体中采集外周血大约采集50ml；将采好血液在离心机内离心，离心机转速为1500rpm，离心时间为8分钟，上层血清吸出转入另一离心管中，此
血浆放置在56℃水浴锅中进行30分钟的灭活，然后再离心，离心机转速为1000rpm，离心时间为8分钟，将处理好的上清转入另一离心管中放置，放置的
环境温度为4℃；
[0032] 步骤二：分离，分离外周血提取自体细胞；将所得血浆
全血加入生理盐水稀释2倍，将以上沉淀好或稀释好的血液稀释缓慢加入装有淋巴细胞分离液，淋巴细胞分离液按照1:1的比例加入，然后进行离心，离心机转速为1800rpm，离心时间为20分钟；
[0033] 步骤三：提取，离心后能明显看到白环，用吸管轻轻插入
接触白环吸出细胞，放入另一试管中加入适量PBS或生理盐水，然后进行离心，离心机转速为1000rpm，离心时间为10分钟，弃上清再用适量PBS或生理盐水洗一次，再次离心，离心机转速为1000rpm，离心时间为10分钟，第三次用无血清培养基将细胞吹起，吹打均匀后放入培养瓶中；
[0034] 步骤四：培养，首先将1支细胞因子、1支单克隆抗体溶于500ml培养基中，然后每个培养瓶加入30ml培养基，培养瓶中添加1％病人血清，置于饱和湿度、温度为37℃以及充有5.0％CO2培养箱中培养；
[0035] 步骤五：扩增，连续培养3天之后，先将已经培养3天的免疫细胞倒入一个细胞培养袋中，再将剩余培养基及血清倒入其中，然后将1支细胞因子、1支单克隆抗体，溶于另一瓶500毫升培养基中，倒入细胞培养袋中，继续在温度为37℃、充有5.0％CO2培养箱中培养；
[0036] 步骤六：收集，培养8天后即可收集细胞，将培养袋或培养瓶中的细胞缓慢倒出至离心杯中，进行离心，离心机转速为1000rpm，离心时间为10分钟，弃上清收集细胞，用生理盐水洗3次后再次离心，离心机转速为1000rpm，离心时间为10分钟，将离心后洗涤好的细胞，用10ml生理盐水稀释备用；
[0037] 步骤七：裂解，取100mg的蛋白酶K配成20mg/ml的工作溶液，取30ul加入到10ml细胞悬液中，放摇床震荡半个小时使细胞裂解；
[0038] 步骤八：纯化，将失活后的细胞再高速离心下进行纯化，使其充分裂解后进行离心，离心机转速为9000rpm，离心时间为1小时，得到的细胞沉淀为半成品全细胞；
[0039] 步骤九：制剂，用生理盐水将沉淀吹起制成混悬液，即为全细胞疫苗，分装成0.5ml一支的注射剂。
[0040] 实施例二
[0041] 一种治疗慢性病的自体全细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0042] 步骤一：采集，从患有慢性病的人体中采集外周血大约采集120ml；将采好血液在离心机内离心，离心机转速为3000rpm，离心时间为8分钟，上层血清吸出转入另一离心管中，此血浆放置在56℃水浴锅中进行30分钟的灭活，然后再离心，离心机转速为2800rpm，离心时间为8分钟，将处理好的上清转入另一离心管中放置，放置的环境温度为4℃；
[0043] 步骤二：分离，分离外周血提取自体细胞；将所得血浆全血加入生理盐水稀释2倍，将以上沉淀好或稀释好的血液稀释缓慢加入装有淋巴细胞分离液，淋巴细胞分离液按照1:1的比例加入，然后进行离心，离心机转速为3000rpm，离心时间为20分钟；
[0044] 步骤三：提取，离心后能明显看到白环，用吸管轻轻插入接触白环吸出细胞，放入另一试管中加入适量PBS或生理盐水，然后进行离心，离心机转速为2000rpm，离心时间为10分钟，弃上清再用适量PBS或生理盐水洗一次，再次离心，离心机转速为2000rpm，离心时间为10分钟，第三次用无血清培养基将细胞吹起，吹打均匀后放入培养瓶中；
[0045] 步骤四：培养，首先将3支细胞因子、300ul单克隆抗体溶于500ml培养基中，然后每个培养瓶加入30ml培养基，培养瓶中添加5％病人血清，置于饱和湿度、温度为37℃以及充有5.0％CO2培养箱中培养；
[0046] 步骤五：扩增，连续培养9天之后，先将已经培养9天的免疫细胞倒入一个细胞培养袋中，再将剩余培养基及血清倒入其中，然后将3支细胞因子、300ul单克隆抗体，溶于另一瓶500毫升培养基中，倒入细胞培养袋中，继续在温度为37℃、充有5.0％CO2培养箱中培养；
[0047] 步骤六：收集，培养20天后即可收集细胞，将培养袋或培养瓶中的细胞缓慢倒出至离心杯中，进行离心，离心机转速为3000rpm，离心时间为5分钟，弃上清收集细胞，用生理盐水洗3次后再次离心，离心机转速为3000rpm，离心时间为5分钟，将离心后洗涤好的细胞，用10ml生理盐水稀释备用；
[0048] 步骤七：裂解，取100mg的蛋白酶K配成20mg/ml的工作溶液，取100ul加入到10ml细胞悬液中，放摇床震荡4个小时使细胞裂解；
[0049] 步骤八：纯化，将失活后的细胞再高速离心下进行纯化，使其充分裂解后进行离心，离心机转速为25000rpm，离心时间为1小时，得到的细胞沉淀为半成品全细胞；
[0050] 步骤九：制剂，用生理盐水将沉淀吹起制成混悬液，即为全细胞疫苗，分装成1.5ml一支的注射剂。
[0051] 实施例三
[0052] 一种治疗慢性病的自体全细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0053] 步骤一：采集，从患有慢性病的人体中采集外周血大约采集100ml；将采好血液在离心机内离心，离心机转速为2300rpm，离心时间为8分钟，上层血清吸出转入另一离心管中，此血浆放置在56℃水浴锅中进行30分钟的灭活，然后再离心，离心机转速为1800rpm，离心时间为8分钟，将处理好的上清转入另一离心管中放置，放置的环境温度为4℃；
[0054] 步骤二：分离，分离外周血提取自体细胞；将所得血浆全血加入生理盐水稀释2倍，将以上沉淀好或稀释好的血液稀释缓慢加入装有淋巴细胞分离液，淋巴细胞分离液按照1:1的比例加入，然后进行离心，离心机转速为2000rpm，离心时间为20分钟；
[0055] 步骤三：提取，离心后能明显看到白环，用吸管轻轻插入接触白环吸出细胞，放入另一试管中加入适量PBS或生理盐水，然后进行离心，离心机转速为1500rpm，离心时间为10分钟，弃上清再用适量PBS或生理盐水洗一次，再次离心，离心机转速为1500rpm，离心时间为10分钟，第三次用无血清培养基将细胞吹起，吹打均匀后放入培养瓶中；
[0056] 步骤四：培养，首先将2支免疫细胞诱导增值剂和1支免疫细胞细胞调节剂溶于500ml培养基中，然后每个培养瓶加入30ml培养基，培养瓶中添加5％病人血清，置于饱和湿度、温度为37℃以及充有5.0％CO培养箱中培养；
[0057] 步骤五：扩增，连续培养5天之后，先将已经培养5天的免疫细胞倒入一个细胞培养袋中，再将剩余培养基及血清倒入其中，然后将1支免疫细胞增值剂和1支免疫细胞调节刺激剂溶于另一瓶500毫升培养基中，倒入细胞培养袋中，继续在温度为37℃、充有5.0％CO2培养箱中培养；
[0058] 步骤六：收集，培养14天后即可收集细胞，将培养袋或培养瓶中的细胞缓慢倒出至离心杯中，进行离心，离心机转速为1500rpm，离心时间为10分钟，弃上清收集细胞，用生理盐水洗3次后再次离心，离心机转速为1500rpm，离心时间为10分钟，将离心后洗涤好的细胞，用10ml生理盐水稀释备用；
[0059] 步骤七：裂解，取100mg的蛋白酶K配成20mg/ml的工作溶液，取50ul加入到10ml细胞悬液中，放摇床震荡2个小时使细胞裂解；
[0060] 步骤八：纯化，将失活后的细胞再高速离心下进行纯化，使其充分裂解后进行离心，离心机转速为15000rpm，离心时间为1小时，得到的细胞沉淀为半成品全细胞；
[0061] 步骤九：制剂，用生理盐水将沉淀吹起制成混悬液，即为全细胞疫苗，分装成1.5ml一支的注射剂。
[0062] 表一注射全细胞疫苗两周之后糖尿病II型患者血糖变化情况
[0064]
[0065] 表二注射全细胞疫苗四周之后糖尿病II型患者血糖变化情况
[0066] (血糖浓度：mmol/L)
[0067]
[0068] 根据以上三个实施例我们可以发现三个实施方式均能有效的降低糖尿病患者血糖含量，其中以实施例三最优，本发明是利用人体自身的血液中的变异细胞制备成的疫苗，它能够刺激机体产生针对变异抗原的特异性免疫反应，产生具有特异杀伤作用的免疫细胞和单克隆抗体，这些细胞和抗体能够在体内循环识别和杀死携带变异抗原的变异细胞，清除变异细胞产生的代谢废物。
[0069] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由所附
权利要求及其等同物限定。
