一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法
阅读：1022发布：2020-06-27
专利汇可以提供一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种利用 生物 反应器 制备猪 圆环病毒 2型灭活 疫苗 的方法，所述的生物反应器为激流式生物反应器，通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述的方法包括以下步骤：培养PK-15细胞；接种 猪圆环病毒 2型；培养猪圆环病毒2型，取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时 收获 病毒液；制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。本发明通过激流式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗，生产用地小，劳动强度低，生产成本相对较低；操作简单，能达到全自动微电脑控制；批间差异小，产品 质量 高且稳定；生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性好、免疫效 力 高， 副作用 小，对猪圆环2型病毒强毒攻击具有较好的免疫保护作用。，下面是一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，所述的生物反应器为激流式生物反应器，通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，其特征在于:所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤: 1)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为2-5 X IO9个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.2-7.4、温度36.8-37.5°C及溶氧D060%_90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min、振荡器转速50_60rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液； 2)加入病毒维持液，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为生物反应器工作体积的5%，在培养条件为PH值7.4-7.6、温度36.5_37°C及溶氧D060_90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min和振荡器转速50_60rpm培养猪圆环病毒2型； 3)培养猪圆环病毒2型72-1 20h后，每隔6-12h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15°C以下冷冻保存； 4)制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于:所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
3.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于:所述的纸片载体密度为15-20g/L。
4.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于:所述的细胞生长液为含体积浓度为8-10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基，病毒维持液为含体积浓度为1-2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
—种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种疫苗的制备方法，尤其涉及一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。
背景技术
[0002] 猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14-17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强，即便在PH3的酸性环境及72°C的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。现已知PCV有两个血清型，即PCVl和PCV2。PCVl为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒。
[0003] PCV-2 是断乳仔猪多系统综合征(Post-weaning mult1-systemic wastingsyndrome, PMWS)的主要病原，具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。自1991年PMWS在北美最先发现以来，已在世界范围内流行。由于PCV-2经常与多种病原混合感染，典型性临床症状有消瘦、皮肤苍白、腹泻、呼吸障碍及轻度的黄疸，还包括神经症状、繁殖障碍、皮炎等。PCV-2及其相关的猪病死亡率109Γ30%不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。目前还没有治疗这种疾病的方法，现有预防和控制猪圆环病毒病最为有效的方法就是接种疫苗。
[0004]目前，猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式，进而增殖猪圆环病毒。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢。而且生产过程中对细胞和病毒的培养条件，如ΡΗ、溶氧、糖耗等难以监控和适时补给，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致生产的产品质量稳定性不够，批间差较大。另外由于该病毒是一种DNA病毒,病毒变异率低，同时在世界范围内的致病只有PCV2 —型。而PCV2的生物学特殊性比较特殊，它在细胞上的增殖滴度很低，而且不引起细胞病变，因此产毒滴度较低也是一个更为重要的问题，并且与当前大规模动物疫苗生产不相适应。此外如要扩大生产规模只能通过增加转瓶数量的方法，结果导致车间规模、设备通入、人员等需求更大，劳动量更大。
[0005] 综上所述，本领域还需继续研发一种适用的制备猪圆环病毒疫苗的新方法。另外提高病毒毒价，保证良好的临床效果是解决猪圆环病毒2型灭活疫苗产业化的当务之急。
发明内容
[0006] 本发明的目的为提供生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低，操作工艺程序不繁琐，批间差异小，产品质量高且稳定的 一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。
[0007] 为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案:[0008] 该利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，所述的生物反应器为激流式生物反应器，通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤:
[0009] I)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为2-5X IO9个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.2-7.4、温度36.8-37.5°C及溶氧D060%_90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min、振荡器转速50_60rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
[0010] 2)加入病毒维持液，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为生物反应器工作体积的5%，在培养条件为pH值7.4-7.6、温度36.5_37°C及溶氧D060_90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min和振荡器转速50_60rpm培养猪圆环病毒2型；
[0011] 3)培养猪圆环病毒2型72_120h后，每隔6_12h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，_15°C以下冷冻保存；
[0012] 4)制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
[0013] 进一步，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
[0014] 进一步，所述的纸片载体密度为15_20g/L。
[0016] 本发明采用以上技术方案，通过激流式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗，生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低；操作工艺程序简单，能达到全自动微电脑控制；批间差异小，产品质量高且稳定；生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性好、免疫效力高，副作用小，对猪圆环2型病毒强毒攻击具有较好的免疫保护作用。附图说明
[0017] 图1为本发明的激流式生物反应器示意图；
[0018] 图2为本发明的工艺流程图；
[0019] 图1中I为灌注袋，2为激流袋。
具体实施方式
[0020] 本发明的技术方案为:本发明所述的生物反应器为激流式生物反应器，通过灌注袋I和激流袋2形成循环系统，灌注袋I内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤:
[0021] I)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为2-5X109个PK-15细胞，在培养条件为pH 值7.2-7.4、温度36.8-37.5°C及溶氧D060%_90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min、振荡器转速50_60rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
[0022] 2)加入病毒维持液，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为生物反应器工作体积的5%，在培养条件为pH值7.4-7.6、温度36.5_37°C及溶氧D060_90%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min和振荡器转速50_60rpm培养猪圆环病毒2型；[0023] 3)培养猪圆环病毒2型72_120h后，每隔6_12h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，_15°C以下冷冻保存；
[0024] 4)制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
[0025] 进一步，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
[0026] 进一步，所述的纸片载体密度为15_20g/L。
[0027] 进一步，所述的细胞生长液为含体积浓度为8-10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基，病毒维持液为含体积浓度为1-2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
[0028] 本发明采用以上技术方案，通过激流式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗，生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低；操作工艺程序简单，能达到全自动微电脑控制；批间差异小，产品质量高且稳定；生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性好、免疫效力高，副作用小，对猪圆环2型病毒强毒攻击具有较好的免疫保护作用。
[0029] 所用的激流式生物反应器工作体积可为5L，10L，20L，50L等。
[0030] 下面将结合附图1-2之一所示和以激流式生物反应器的工作体积IOL为具体实施例对本发明进一步说明:
[0031] 实施例1
[0032] 激流式生物反应器，生产厂家:杭州安普生物工程有限公司；型号:AP20SC II ;工作体积:10L。
[0033] 通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
[0034] 所用纸片载体密度为20g/L，即纸片载体的质量为20g/LX IOL为200g。
[0035] 配制细胞生长液:含体积浓度为10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基；
[0036] 配制病毒维持液:含体积浓度为2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
[0037] 所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤:
[0038] I)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为5X109个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.4、温度37.5°C及溶氧D090%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度500mL/min、振荡器转速60rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
[0039] 2)加入病毒维持液9.5L，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为0.5L，在培养条件为pH值7.4、温度37°C及溶氧D090%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度500mL/min和振荡器转速60rpm培养猪圆环病毒2型；
[0040] 3)培养猪圆环病毒2型1 20h后，每隔6h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15°C以下冷冻保存；
[0041] 4)采用常用方法制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
[0042] 表I为本发明生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与普通转瓶方法生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗的比较。
[0043] 表I本发明与传统转瓶比较
[0044]
[0045] 从表I中，可以看出本发明生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低；种毒需要量小，所需培养基和血清量少，所需时间短，人员少。
[0046] 实施例2
[0047] 激流式生物反应器，生产厂家:杭州安普生物工程有限公司；型号:AP20SC II ;工作体积:10L。
[0048] 通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
[0049] 所用纸片载体密度为15g/L，即纸片载体的质量为15g/LX IOL为150g。
[0050] 配制细胞生长液:含体积浓度为8%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基；
[0051] 配制病毒维持液:含体积浓度为1%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
[0052] 所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤:
[0053] I)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为2X109个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.2、温度36.8°C及溶氧D060%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450mL/min、振荡器转速50rpm，培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
[0054] 2)加入病毒维持液9.5L，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为0.5L，在培养条件为pH值7.4、温度36.5°C及溶氧D060%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度450mL/min和振荡器转速50rpm培养猪圆环病毒2型；
[0055] 3)培养猪圆环病毒2型72h后，每隔12h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15°C以下冷冻保存；
[0056] 4)制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
[0057] 表2为本发明生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与普通转瓶方法生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗的比较。
[0058] 表2本发明与传统转瓶比较
[0059]
[0060] 从表2中，可以看出本发明生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低；种毒需要量小，所需培养基和血清量少，所需时间短，人员少。
[0061] 实施例3
[0062] 激流式生物反应器，生产厂家:杭州安普生物工程有限公司；型号:AP20SC II ;工作体积:10L。
[0063] 通过灌注袋和激流袋形成循环系统，灌注袋内置有细胞培养袋，细胞培养袋内有纸片载体，所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式，维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
[0064] 所用纸片载体密度为18g/L，即纸片载体的质量为18g/LX IOL为180g。
[0065] 配制细胞生长液:含体积浓度为9%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基；
[0066] 配制病毒维持液:含体积浓度为1.5%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
[0067] 所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤:
[0068] I)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞，细胞接种量为3X109个PK-15细胞，在培养条件为pH值7.3、温度37°C及溶氧D075%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度470mL/min、振荡器转速55rpm,培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层，弃去细胞生长液；
[0069] 2)加入病毒维持液9.5L，接种猪圆环病毒2型，病毒接种量为0.5L，在培养条件为pH值7.5、温度36.8°C及溶氧D075%的条件下，以激流式生物反应器的循环速度470mL/min和振荡器转速55rpm培养猪圆环病毒2型；
[0070] 3)培养猪圆环病毒2型90h后，每隔9h取病毒维持液测糖耗，糖耗下降时收获病毒液，-15°C以下冷冻保存；
[0071] 4)制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
[0072] 表3为本发明生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与普通转瓶方法生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗的比较。
[0073] 表3本发明与传统转瓶比较
[0074]
[0075] 从表3中，可以看出本发明生产用地小，劳动强度大大降低，生产成本相对较低；种毒需要量小，所需培养基和血清量少，所需时间短，人员少。
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