一种鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗
阅读：969发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种鼠李糖修饰的 肿瘤 全细胞 疫苗 ，由通过化学方法使表面带有鼠李糖 抗原 并经过灭活处理至失去分化、增生能 力 的完整肿瘤细胞构成。本发明的肿瘤疫苗制备简单、 稳定性 好、成本低，并且能克服现有肿瘤 治疗 方法效果差、易复发、 副作用 大的 缺陷 ，治疗肿瘤更加安全有效，理论上适用于人类各种 恶性肿瘤 和癌症的治疗，具有非常广阔的应用前景。，下面是一种鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗专利的具体信息内容。
1.一种鼠李糖（Rhamnose，Rha）修饰的肿瘤全细胞疫苗，由通过化学方法使表面带有鼠李糖（Rha）抗原并经过灭活处理至失去分化、增生能力的完整肿瘤细胞构成，其特征在于：所述肿瘤细胞是人同种异体的肿瘤细胞，它们是市售的Hela，HepG2，SMMC-7721，HCC-9724，Hep-3B，EH-H1，BEL-7404，A375，SK-MEL-1，A375.S2，MKN-45，MGC-803，NCI-N87，SNU-5，KATO III，HGC-27，BGC-823，SGC-7901，AGS，MDA-MB-231，MDA-MB-435，T47D，MCF-7，BT-20，SK-BR-3，MDA-MB-468，A549，NCI-H460，NCI H520，HPAF-II，PANC-1，ASPC-1，BxPC3，IGROV，ES-2，NIH:OVCAR3，PA-1，M21，A375，A875，SK-MEL-1，A375.S2，COLO829，G-361，HCT-116，COLO205，LoVo，WiDr，DLD-1，HCT-15，SW620，SW480，SW1116，HT-29，PC-3，LNCaPFGC，MDAPca2b或DU145细胞，所述鼠李糖（Rha）抗原包括Rha单糖、含有Rha的寡糖及含有Rha的复合物。
2.如权利要求1所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：所述肿瘤细胞是M21，所述鼠李糖（Rha）抗原是Rha单糖。
3.如权利要求1所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：所述灭活处理的方法是采用总剂量为30～100Grays的X射线辐照肿瘤细胞。
4.如权利要求3所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：所述的X射线辐照总剂量为40Grays。
5.权利要求2所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗的制备方法，其特征在于：利用化学方法合成活化鼠李糖（Rha），以使鼠李糖（Rha）携带NHS活化的羧基，并使其与肿瘤细胞表面的氨基结合成稳定的化学键，得到鼠李糖（Rha）修饰的肿瘤全细胞疫苗。
6.如权利要求5所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗的制备方法，其特征在于：所述活化鼠李糖（Rha）与肿瘤细胞反应条件为pH7.0～9.0，4～37℃，反应0.5～4h，其中所述
4 7
活化Rha的浓度为0.25～16mg/ml，所述肿瘤细胞浓度为1×10 ～8×10/ml。
7.如权利要求6所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗的制备方法，其特征在于：所述活化鼠李糖（Rha）与肿瘤细胞反应条件为pH8.5，20～25℃，反应1～2h，其中所述活化Rha
6
的浓度为1mg/ml，所述肿瘤细胞浓度为4×10/ml。
8.权利要求1或2所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的用途。
一种鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗
技术领域
背景技术
[0003] 目前肿瘤疫苗主要为治疗性疫苗。治疗性肿瘤疫苗可通过主动免疫方式诱导全身性的特异性抗瘤效应，与手术治疗、放射治疗相比，作用范围更广泛，特别适用于多发病灶性肿瘤、广泛转移性瘤或非实体性肿瘤(如白血病)；可调动机体自身的力量达到抗肿瘤作用，与放射治疗、化学药物治疗相比不良反应小、特异性高。尽管各种治疗性肿瘤疫苗的设计思想各不相同，诱导免疫应答的方式不同，抗瘤效应各有特点，但不论采用何种方法制备，都是围绕如何提高肿瘤抗原的免疫原性以及如何打破肿瘤免疫耐受这一最关键的核心问题展开的。一种理想的肿瘤疫苗不但能够诱导主动性免疫，刺激荷瘤宿主产生有效的免疫应答，同时还应当是安全的和无不良反应的；不仅能特异性地消除扩散的肿瘤细胞，而且更为重要的是，还能提供保护性的预防肿瘤复发的长期免疫记忆功能。
[0004] 肿瘤细胞疫苗是肿瘤疫苗中的一种，其是指将自身或异体肿瘤细胞，经过物理因素（照射、高温）、化学因素（酶解）以及生物因素（病毒感染、基因转移等）的处理，改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性，常与佐剂等联合应用，对肿瘤治疗有一定疗效。它是来自于自体或同种异体的肿瘤细胞，带有肿瘤特异性或肿瘤相关性抗原，易获得，无免疫排斥。自体肿瘤细胞最早应用于临床，但由于自体肿瘤细胞获取困难，特别是肿瘤患者一旦失去手术机会，就无法获取自体肿瘤细胞。同种异体肿瘤细胞系因具有制备简单，并可在体外传代培养等特点，逐渐替代自体肿瘤细胞制备疫苗，目前已有多个肿瘤细胞系应用于临床。但是由于肿瘤细胞表达抗原的免疫原性较弱，不能诱导很强的特异性免疫反应。
[0005] 近年来，随着分子修饰技术及人们对机体抗肿瘤免疫的认识的提高，对肿瘤细胞疫苗的免疫原性进行了一系列增强，如通过基因工程技术，用细胞因子、免疫辅助因子等对肿瘤细胞进行改造，提高肿瘤细胞疫苗效率。目前采用基因工程修饰的分子主要是和免疫应答密切相关的分子，包括细胞因子如IL-2，TNF-α，GM-CSF等，以及MHC分子，分子伴侣，热休克蛋白家族等。但是，也有研究表明，单一转入一种免疫分子的基因可能增强肿瘤细胞的抗原性，单独诱发免疫应答作用却不理想。
[0006] 基因工程技术虽然实现了目的分子的修饰，但是也人为的加入了像病毒载体等的潜在危险，且有些疫苗副作用大，可能会诱发机体的自身免疫反应。因此，找到一种简单的分子修饰的方法是非常有必要的，同时修饰的抗原分子也需要进一步筛选，以减小副作用的产生。
[0007] 鼠李糖（Rhamnose，Rha）是一种单糖，又称为6-脱氧-L-甘露糖，广泛存在于植物的多糖、糖苷、植物胶和细菌多糖中。在细菌和植物中分布最广，在细菌中，Rha是分支杆菌属细菌细胞膜的组成成分，以Rha为组成糖的多糖或脂多糖存在于细胞表面。此糖链结构多成为抗原特异性因子。在植物中鼠李科及漆树科植物中也含有大量Rha。但是目前对Rha的研究较少，主要原因是鼠李糖苷的合成较复杂，在细菌体内由葡萄糖（Glucose）合成鼠李糖核苷酸（dTDP-L-Rha）共需要RmlA、RmlB、RmlC、RmlD四个酶参与。这个复杂的过程严重限制了对Rha在疫苗应用方面的研究。
[0008] Oyelaran O等利用糖抗原芯片发现，人的血清中有大量的天然糖抗体，其中anti-Rha抗体的含量最高。因此这种糖抗原在疫苗的研究中具有巨大的潜在价值。鼠李糖抗体的发现为人们进一步利用鼠李糖抗体与鼠李糖抗原提供新思路。
[0009] 目前，有研究报道鼠李糖抗原被用来提高疫苗的免疫原性。Rha修饰的蛋白疫苗通过与anti-Rha结合，形成抗原抗体复合物，抗体Fc段与抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）表面的Fc受体(FcγR)结合，大大提高了APC对疫苗的递呈效率。另外，此抗原抗体复合物可诱导NK细胞产生抗体依赖的细胞毒效应（antibody-dependent cell-mediated cytotoxity，ADCC）。
[0010] 研究发现，异种移植过程中的超急排斥反应（hyperacute xenograft rejection，HAR）主要由人体内的天然抗体所介导。在超急排斥反应之后，移植物还将面临迟发型异种排斥反应（delayed xenograft rejection，DXR）。这种排斥反应主要由宿主NK细胞和巨噬细胞以及异种抗原特异性抗体介导，激起宿主体内的细胞免疫及体液免疫。
[0011] 综上，目前肿瘤全细胞疫苗制备还存在许多问题，且制备过程较复杂，成本高，效果不够显著。而检索发现，关于用鼠李糖抗原进行修饰的肿瘤全细胞疫苗还未见报导，完全利用化学方法进行全细胞疫苗修饰的方法更未见报导。
发明内容
[0012] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗。
[0013] 本发明鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗，由通过化学方法使表面带有鼠李糖抗原并经过灭活处理至失去分化、增生能力的完整肿瘤细胞构成，其特征在于：所述肿瘤细胞是人同种异体的肿瘤细胞，它们是市售的Hela，HepG2，SMMC-7721，HCC-9724，Hep-3B，EH-H1，BEL-7404，A375，SK-MEL-1，A375.S2，MKN-45，MGC-803，NCI-N87，SNU-5，KATO III，HGC-27，BGC-823，SGC-7901，AGS，MDA-MB-231，MDA-MB-435，T47D，MCF-7，BT-20，SK-BR-3，MDA-MB-468，A549，NCI-H460，NCI H520，HPAF-II，PANC-1，ASPC-1，BxPC3，IGROV，ES-2，NIH:OVCAR3，PA-1，M21，A375，A875，SK-MEL-1，A375.S2，COLO829，G-361，HCT-116，COLO205，LoVo，WiDr，DLD-1，HCT-15，SW620，SW480，SW1116，HT-29，PC-3，LNCaPFGC，MDAPca2b或DU145细胞，所述鼠李糖（Rha）抗原包括Rha单糖、含有Rha的寡糖及含有Rha的复合物。
[0014] 上述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗中：所述肿瘤细胞优选是M21，所述鼠李糖（Rha）抗原是Rha单糖。
[0015] 上述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗中：所述灭活处理的方法是采用总剂量为30～100Grays的X射线辐照肿瘤细胞。
[0016] 其中：所述的X射线辐照总剂量优选40Grays。
[0017] 本发明所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗的制备方法，其特征在于：利用化学方法合成活化鼠李糖（Rha），以使鼠李糖（Rha）携带NHS活化的羧基，并使其与肿瘤细胞表面的氨基结合成稳定的化学键，得到鼠李糖（Rha）修饰的肿瘤全细胞疫苗。
[0018] 其中：上述活化鼠李糖（Rha）与肿瘤细胞反应条件为pH7.0～9.0，4～37℃，反4
应0.5～4h，其中所述活化Rha的浓度为0.25～16mg/ml，所述肿瘤细胞浓度为1×10 ～
7
8×10/ml。
应0.5～4h，其中所述活化Rha的浓度为0.25～16mg/ml，所述肿瘤细胞浓度为1×10 ～
7
8×10/ml。
[0019] 进一步优选的实施方式是：所述活化鼠李糖（Rha）与肿瘤细胞反应条件为pH8.5，6
20～25℃，反应1～2h，其中所述活化Rha的浓度为1mg/ml，所述肿瘤细胞浓度为4×10/ml。
20～25℃，反应1～2h，其中所述活化Rha的浓度为1mg/ml，所述肿瘤细胞浓度为4×10/ml。
[0020] 本发明所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的用途。
[0021] 本发明中经鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗能靶向杀伤肿瘤细胞，表现出良好的抗癌效应。以小鼠体内实验，所用小鼠为建立的含高滴度的anti-Rha抗体的小鼠模型，此小鼠模型完全模拟人体内的环境，结果显示所用疫苗具有有效抑制肿瘤生长和转移的效果，因此理论上用于人类肿瘤治疗也会有较好的效果。预示本发明的疫苗可用于人类各种恶性肿瘤和癌症的免疫治疗，进一步为癌症的免疫治疗提供新的选择，具有良好的应用前景。
[0022] 目前，关于用鼠李糖抗原进行修饰的肿瘤全细胞疫苗还未见报导，完全利用化学方法进行全细胞疫苗修饰的方法更是新颖。本发明所述的鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗制备方法简单，易操作，稳定性好；所需原料易获得，成本低。最重要的是本发明的疫苗能巧妙地利用异种移植的超急排斥反应（hyperacute xenograft rejection，HAR）和迟发型异种排斥反应（delayed xenograft rejection，DXR）机制抑制肿瘤生长及杀伤肿瘤细胞。该疫苗进入患者体内后，在体内天然anti-Rha抗体的介导下，产生对该疫苗细胞的HAR和DXR反应，使肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA）暴露与释放，打破肿瘤的免疫逃逸，使机体产生针对TAA的特异抗体和免疫细胞，进而杀伤患者体内的肿瘤细胞，达到一种更有效的治疗效果。
[0024] 图1为活化Rha质谱检测图。
[0025] 图2为制备Rha修饰的全细胞疫苗过程中，流式细胞仪检测人黑色素瘤M21细胞表面偶联Rha的效率。由左向右依次为阴性组，pH7.4反应组，pH8.5反应组。
[0026] 图3为制备Rha修饰的全细胞疫苗过程中，流式细胞仪检测小鼠黑色素瘤B16细胞表面偶联Rha的效率。由左向右依次为阴性组，0.5mg/ml活化Rha组，1mg/ml活化Rha组，2mg/ml活化Rha组，4mg/ml活化Rha组。
[0027] 图4为建立anti-Rha小鼠模型时，ELISA检测anti-Rha IgG的滴度。OVA-Rha代表免疫OVA-Rha与佐剂的小鼠，OVA代表免疫OVA与佐剂的小鼠，PBS+Adjuvant代表免疫PBS与佐剂的小鼠，PBS代表免疫PBS的小鼠。
[0028] 图5为Rha修饰的B16全细胞疫苗抗癌实验，肺部黑色素瘤生长情况的比较。第一组为不荷瘤组（n=6）；第二组为荷瘤，注射Rha修饰的全细胞疫苗组（n=6）；第三组为荷瘤，注射无Rha修饰的全细胞疫苗组（n=6）；第四组为荷瘤，注射PBS组（n=10）。
[0029] 图6为Rha修饰的B16全细胞疫苗抗癌实验，小鼠肺重量的比较。第一组为不荷瘤组（n=6）；第二组为荷瘤，注射Rha修饰的全细胞疫苗组（n=6）；第三组为荷瘤，注射无Rha修饰的全细胞疫苗组（n=6）；第四组为荷瘤，注射PBS组（n=10）。
具体实施方式
[0030] 下面结合实施例对本发明做进一步描述，实施例为动物实验。为了模拟人体内含大量anti-Rha抗体的环境，我们首先制备了含anti-Rha抗体的小鼠模型，然后进行了本疫苗的抗肿瘤实验。实施例中的实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
[0031] 实验动物与细胞
[0032] 4-6周龄Balb/C雌性小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0033] B16细胞和M21细胞购于ATCC。
[0034] 实施例1：化学合成活化Rha
[0035] 1.取10g Rha溶于100ml二氯甲烷中，边搅拌边加入Ac2O31.1mL，Et3N61.2mL，DMAP0.67g，0℃搅拌过夜。然后加入20ml甲醇终止反应，经过洗涤、干燥，得到Rha的四乙酸盐粗品。
[0036] 2.取出Rha四乙酸盐24g溶于150ml无水甲醇中，加入苯硫酚8.12ml，SnCl25.92ml，置于0℃搅拌3h。经过洗涤、干燥、浓缩后用柱层析法进行提纯，得到Rha的硫苷化合物。
[0037] 3.取1g上述硫苷化合物，加入3-叠氮丙醇0.39g，NIS0.88g，TMSOTf2-3μl，-30℃反应1.5h。加入2-3ml NaHCO3终止反应。经过洗涤、干燥、浓缩后用柱层析法进行提纯，得到带有叠氮末端的中间体。
[0038] 4.取0.52g上述叠氮中间体溶于20ml无水甲醇中，加入新鲜配制的NaOMe-甲醇溶液0.5ml，室温搅拌3h，用amberlyst-15离子交换树脂进行纯化。加入Pd/C催化剂及NaBH40.25g，室温搅拌1h。然后加入酸酐和20ml乙腈，反应30min后，用HCl调为中性，过滤除去Pd/C，然后用P2柱层析法分离纯化得到带有羧基末端的Rha。
[0039] 5.取13mg带有羧基末端的Rha溶于0.54ml无水DMF中，加入7μl Et3N和14.2mg TSTU，室温反应1h，干燥，即获得带有活化羧基的Rha。
[0040] 活化Rha质谱检测图见图1。
[0041] 上述制备反应流程如下：
[0042]
[0043] 实施例2：制备Rha修饰的人黑色素瘤M21全细胞疫苗
[0044] 配制不同浓度的活化Rha，与M21细胞混合，制备了Rha修饰的人黑色素瘤M21肿6
瘤全细胞疫苗。其中优选细胞浓度为4×10/ml，活化Rha终浓度为1mg/ml。
瘤全细胞疫苗。其中优选细胞浓度为4×10/ml，活化Rha终浓度为1mg/ml。
[0045] 设置反应pH值分别为7.4和8.5，室温反应1h后，用PBS洗涤，随后加入FITC标记的anti-rhamnose抗体，然后经洗涤后用流式细胞仪检测M21细胞偶联Rha的效率。
[0046] 流式结果显示，M21细胞表面成功偶联Rha，（图2）且当反应pH值为8.5时，偶联Rha的M21细胞所占比例达到了92%以上，而pH为7.4时，偶联Rha的M21细胞所占比例只有75.92%。
[0048] 最终成功获得了Rha修饰的人黑色素瘤M21肿瘤全细胞疫苗。
[0049] 实施例3：制备Rha修饰的小鼠黑色素瘤B16全细胞疫苗
[0050] 配制不同浓度的活化Rha，与B16细胞混合，制备了Rha修饰的小鼠黑色素瘤B166
肿瘤全细胞疫苗。其中优选细胞浓度为4×10/ml，活化Rha终浓度分别为0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，4mg/ml，反应pH值为8.5，室温反应1h后，用PBS洗涤，随后加入FITC标记的anti-rhamnose抗体，然后经洗涤后用流式细胞仪检测B16细胞偶联Rha的效率。
肿瘤全细胞疫苗。其中优选细胞浓度为4×10/ml，活化Rha终浓度分别为0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，4mg/ml，反应pH值为8.5，室温反应1h后，用PBS洗涤，随后加入FITC标记的anti-rhamnose抗体，然后经洗涤后用流式细胞仪检测B16细胞偶联Rha的效率。
[0051] 流式结果显示，B16细胞表面成功偶联Rha，（图3）且当活化Rha浓度为1mg/ml以上时，偶联Rha的B16细胞所占比例达到了98%以上。
[0052] 将以上制备的Rha修饰的B16肿瘤细胞用总剂量为40Gy的X射线照射，使其灭活。所用仪器为高能量生物学X射线辐照仪X-RAD225。
[0053] 最终成功获得了Rha修饰的小鼠黑色素瘤B16肿瘤全细胞疫苗。
[0054] 实施例4：建立anti-Rha抗体的小鼠模型
[0055] 1.OVA-Rha和BSA-Rha的合成
[0056] OVA-Rha用于免疫小鼠使其产生anti-Rha抗体。
[0057] 取10mg活化Rha溶于1ml3×PBS，浓度为10mg/ml；另取10mg卵清蛋白（OVA）溶于1ml3×PBS，浓度为10mg/ml。将两者混合，于室温缓慢搅拌1h。将以上反应体系转移到10KD超滤管中，3500g，4℃离心30min，换缓冲液1×PBS，3次。用BCA试剂盒法测蛋白浓度，用PBS将浓度调整为5mg/ml，分装到EP管，保存于-20℃。用SDS-PAGE，westernblot及MOLDI-TOF等方法进行检测。结果为成功制备OVA-Rha，平均每个OVA分子表面连有11个Rha分子。
[0058] BSA-Rha作为包被抗原用于ELISA检测anti-Rha抗体的滴度。
[0059] 取10mg活化Rha溶于1ml3×PBS，浓度为10mg/ml；另取10mg牛血清白蛋白（BSA）溶于1ml3×PBS，浓度为10mg/ml。将两者混合，于室温缓慢搅拌1h。将以上反应体系转移到10KD超滤管中，3500g，4℃离心30min，换缓冲液1×PBS，3次。用BCA试剂盒法测蛋白浓度，用PBS将浓度调整为5mg/ml，分装到EP管，保存于-20℃。用SDS-PAGE，westernblot等方法进行检测。结果为成功制备BSA-Rha。
[0060] 2.制备体内含有anti-Rha抗体的小鼠模型
[0061] 取6周龄Balb/C雌鼠，分为四组，分别为背部皮下多点注射OVA-Rha（每只30g，150l，n=36），OVA（每只30g，150l，n=5），以及PBS加佐剂（每只150l，n=5）和PBS（每只
150l，n=4），隔两周免疫一次，共免疫四次。首次免疫使用完全弗氏佐剂，第二、三、四次免疫使用不完全弗氏佐剂。免疫前及每次免疫后一周，从小鼠腿部隐静脉取血200μl，室温静置
1h后，4000rpm离心20min，取出血清，分装保存于-20℃。
150l，n=4），隔两周免疫一次，共免疫四次。首次免疫使用完全弗氏佐剂，第二、三、四次免疫使用不完全弗氏佐剂。免疫前及每次免疫后一周，从小鼠腿部隐静脉取血200μl，室温静置
1h后，4000rpm离心20min，取出血清，分装保存于-20℃。
[0062] BSA-Rha包板，ELISA检测小鼠血清中anti-Rha滴度（图4）。成功获得含anti-Rha抗体的小鼠模型。
[0063] 实施例5：建立荷瘤小鼠
[0064] 将建立的体内含有anti-Rha抗体的小鼠模型分为4组，第一组为不荷瘤组（n=6）；第二组为荷瘤，注射Rha修饰的全细胞疫苗组（n=6）；第三组为荷瘤，注射无Rha修饰的全细胞疫苗组（n=6）；第四组为荷瘤，注射PBS组（n=10）。其中荷瘤的方法是每只小鼠尾静脉注
5
射3×10B16黑色素瘤细胞，产生肺转移的黑色素瘤。
5
射3×10B16黑色素瘤细胞，产生肺转移的黑色素瘤。
[0065] 实施例6：Rha修饰的B16全细胞疫苗小鼠体内抗肿瘤实验
[0066] 小鼠荷瘤3天后第二组背部皮下注射实施例3的Rha修饰的全细胞疫苗（5×105/5
只），第三组背部皮下注射无Rha修饰的全细胞疫苗（5×10/只），第四组注射PBS。每周注射一次，共三次。
只），第三组背部皮下注射无Rha修饰的全细胞疫苗（5×10/只），第四组注射PBS。每周注射一次，共三次。
[0067] 28天后断颈处死小鼠，取出肺，观察肺部黑色素瘤的大小和数量，并对肺进行称重。
[0068] 图6中，Rha修饰的全细胞疫苗组小鼠肺的重量明显低于无Rha修饰的全细胞疫苗组和PBS组，而与正常小鼠肺的重量无显著差异。通过T检验，Rha修饰的全细胞疫苗组与无Rha修饰的全细胞疫苗组P=0.0361（显著差异），Rha修饰的全细胞疫苗组与PBS组P=0.0037（显著差异），Rha修饰的全细胞疫苗组与未荷瘤P=0.1687（无显著差异），而无Rha修饰的全细胞疫苗组与PBS组P=0.8721（无显著差异）。
[0069] 图5中观察肺部黑色素瘤个数发现，Rha修饰的B16疫苗组小鼠肺部黑色素瘤数量明显少于无Rha修饰的疫苗组和PBS组。其中Rha修饰的全细胞疫苗组（一只死）5只中有2只小鼠肺部有少量黑色素瘤，另外3只完全正常，且肺的重量和颜色正常。无Rha修饰的疫苗组中（一只死）有2只小鼠肺部长满黑色素瘤，1只小鼠肺部有一个黑色素瘤，其余2只未见黑色素瘤，但是在这一组中，未长黑色素瘤的肺部表面肿胀，重量增加，颜色异常。PBS组小鼠（一只死）肺部均有黑色素瘤生长，且肺部表面肿胀，重量增加，颜色异常。
[0070] 根据以上动物体内抑瘤实验可得出结论，本发明的Rha修饰的全细胞疫苗具有明显抑制体内肿瘤生长的作用。
[0071] 由此说明，本发明中经鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗能靶向杀伤肿瘤细胞，表现出良好的抗癌效应。以上实施例为小鼠体内实验，所用小鼠为建立的含高滴度的anti-Rha抗体的小鼠模型，此小鼠模型完全模拟人体内的环境，结果显示所用疫苗具有有效抑制肿瘤生长和转移的效果，因此理论上用于人类肿瘤治疗也会有较好的效果。预示本发明的疫苗可用于人类各种恶性肿瘤和癌症的免疫治疗。
[0072] 本发明为癌症的免疫治疗提供了新的选择，具有良好的应用前景。
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