流感病毒的拯救方法及其组合物
阅读：1016发布：2020-08-02
专利汇可以提供流感病毒的拯救方法及其组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种新型流感病毒拯救方法以及其组合物。所述方法包括提供稳定整合并表达流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的宿主细胞，将PA、PB1、PB2和NP基因中分别引入了终止密码子的流感病毒拯救系统导入所述宿主细胞，实现病毒拯救。产生的病毒颗粒可以被用作流感减毒活 疫苗 ，其特点是，由于编码相关蛋白的基因被突变，在人及正常动物细胞中不具有复制增殖能 力 ，仅在上述构建的宿主细胞中可以实现复制增殖，在保证安全性的同时，实现全面激发 机体 免疫，有效防护机体安全。，下面是流感病毒的拯救方法及其组合物专利的具体信息内容。
1.一种流感病毒拯救方法，其特征在于，提供稳定表达流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的哺乳动物宿主细胞，将具有突变型PA、PB1、PB2和NP基因的流感病毒拯救系统导入前述宿主细胞以实现拯救，其中所述突变使得流感病毒拯救系统不能在天然哺乳动物细胞中拯救获得完整病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建编码PA、PB1、PB2和NP基因的单质粒或多质粒系统；
(2)将步骤(1)的单质粒或多质粒系统导入哺乳动物细胞，筛选获得稳定表达四种基因的宿主细胞，优选地，通过电转化导入；
(3)分别构建突变型PA、PB1、PB2和NP基因的重组质粒以及编码HA、NA、M、NS四种基因的重组质粒，形成流感病毒拯救系统，所述突变通过分别在四个基因序列中引入TAG密码子实现；
(4)将步骤(3)构建的流感病毒拯救系统共转染导入步骤(2)的宿主细胞；
(5)培养步骤(4)获得的细胞并收获流感病毒的颗粒；
优选的，其中导入宿主细胞中的PA、PB1、PB2和NP基因以及流感病毒拯救系统中的HA、NA、M、NS基因均来源于流感病毒H1N1的A/WSN/1933株。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述PA、PB1、PB2和NP基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；和/或所述流感病毒拯救系统包括如下八个质粒：pPolI-M-PB2、pPolI-M-PB1、pPolI-M-PA、pPolI-M-NP、pPolI-WSN-HA；pPolI-WSN-NA；pPolI-WSN-M；pPolI-WSN-NS，其中，所含有的PA基因存在R266密码子突变为TAG、PB1基因存在R52密码子突变为TAG、PB2基因存在K33密码子突变为TAG和NP基因存在D101密码子突变为TAG；和/或
所述哺乳动物细胞选自Vero细胞、MDCK细胞，293细胞或MRC5细胞。
4.如权利要求1-3任一项的方法所制备的宿主细胞。
5.如权利要求1-3任一项的方法所制备的流感病毒。
6.包含权利要求5所述流感病毒的免疫原性组合物。
7.一种病毒拯救组合物，包括宿主细胞和病毒拯救系统，其中，所述宿主细胞表达PA、PB1、PB2和NP基因，所述病毒拯救系统包含突变型PA、PB1、PB2和NP基因，所述突变使得流感病毒拯救系统不能在天然哺乳动物细胞中拯救获得完整病毒。
8.如权利要求7的病毒拯救组合物，其特征在于所述PA、PB1、PB2和NP基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
9.如权利要求7或8的病毒拯救组合物，其特征在于，所述流感病毒拯救系统包括如下八个质粒：pPolI-M-PB2、pPolI-M-PB1、pPolI-MPA、pPolI-M-NP、pPolI-WSN-HA；pPolI-WSN-NA；pPolI-WSN-M；pPolI-WSN-NS，其中，所含有的PA基因存在R266密码子突变为TAG、PB1基因存在R52密码子突变为TAG、PB2基因存在K33密码子突变为TAG和NP基因存在D101密码子突变为TAG。
10.权利要求4的宿主细胞、权利要求5的流感病毒、权利要求6的免疫原性组合物或权利要求7-9的病毒拯救组合物在制备预防或治疗流行性感冒药物中的用途。
流感病毒的拯救方法及其组合物
技术领域
背景技术
[0002] 流行性感冒(流感)是由流感病毒(Influenza virus)导致的呼吸道和其他脏器的疾病，在健康儿童和成人中，每年均会在春冬季，甚至其它季节有不同程度的流行，通常是一种急性、传染性的疾病。
[0003] 流感病毒是导致流感的病原体，属于负链单股RNA病毒，其基因组共有8个独立的RNA片段(分别以片段1-8命名)组成，核酸总长度约为13.6kb。这8个片段共编码10种蛋白质，其中8种为结构蛋白，包括PB1、PB2、PA、HA、NA、NP、M1、M2,而NS1、NS2为非结构蛋白。流感病毒分为人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。
[0004] 病毒复制主要依靠病毒核糖核蛋白(vRNPs)。甲型流感病毒的核糖核蛋白由病毒RNA、RNA聚合酶(RdRp)复合体以及核蛋白(NP)组成，是病毒的最小复制单位，病毒蛋白在该结构基础上才能表达。vRNPs结构中的RdRp由3个亚基(PA、PB2、PB1)组成，PB1位于三聚体的核心，其N末端和C末端分别与PA亚基的C末端以及PB2亚基的N末端通过非共价键(如疏水作用、氢键、范德华力等)形成稳定的蛋白质复合物。
[0006] 目前，流感疫苗按照其种类可分为：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。流感全病毒灭活疫苗具有较高的免疫原性和相对较低的生产成本，但是在接种过程中副反应发生率也较高，同时不得应用于6岁以下儿童，这些都限制了流感全病毒疫苗的应用；裂解疫苗是建立在流感全病毒灭活疫苗的基础上，通过选择适当的裂解剂和裂解条件裂解流感病毒，纯化去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白制备而成，裂解型流感疫苗可降低全病毒灭活疫苗的接种副反应，并保持相对较高的免疫原性，可扩大疫苗的使用范围，但在制备过程中须添加和去除裂解剂，而且在裂解过程中导致大量抗原丢失，导致流感疫苗保护效率降低；在裂解疫苗的基础上，又研制出了毒粒亚单位和表面抗原(HA和NA)疫苗；亚单位型流感疫苗具有很纯的抗原组分，但流感疫苗变异很快，因此预防效果上受到了一定的影响。
[0007] 此外，全病毒灭活疫苗、裂解疫苗，因流感快速变异，需要每年在爆发季节前，对当年可能爆发的毒株进行预测，准确预测有一定难度，预测错误，将导致疫苗保护率大幅度下降，而且，即便准确预测，也因为目前主要采用的鸡胚生产工艺，病毒产生的鸡胚适应性变异，导致疫苗保护效率不高；对于亚单位疫苗，由于目前并没有发现流感病毒可以用于疫苗的保守序列，导致进展缓慢。
[0008] 在生产方法方面，传统的制备流感病毒疫苗的方法是使用鸡胚制备。然而，利用鸡胚制备的流感疫苗尚存在生产技术以及安全上的问题。例如，培养周期过长，病毒在培养过程中产生的变异性，劳动强度大，效率低，生产成本高，不易于控制产量，并且鸡胚不同批次间的差异大，不利于扩大生产，以用于应对大规模的流感爆发；另一方面，鸡胚自身被细菌或其他病毒污染而致生产的疫苗存在质量及安全隐患，并且生产疫苗后的废胚数量多，无害化处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。
[0009] 因此，迫切需要更具有安全性并更好的保留全病毒免疫活性的流感疫苗及其生产方法的问世。
发明内容
[0011] 为达到上述目的，本发明向哺乳动物细胞中转入特定的基因，获得稳定表达相应的流感病毒蛋白的宿主细胞，再转染相关基因突变后的流感病毒拯救系统，拯救获得复制可控的新型流感活病毒。上述活病毒的制备，可为生产在人及动物正常体细胞中不复制增殖的安全活病毒疫苗提供基础。
[0012] 具体而言，本发明提供如下技术方案：
[0013] 一种流感病毒拯救方法，包括提供稳定表达流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的哺乳动物宿主细胞，将包含突变型PA、PB1、PB2和NP基因的流感病毒拯救系统导入前述宿主细胞以实现拯救，其中所述突变型使得流感病毒拯救系统不能在天然哺乳动物细胞中拯救获得完整病毒。
[0014] 进一步的，本发明的方法可包括如下步骤：
[0015] (1)构建编码PA、PB1、PB2和NP基因的单质粒或多质粒系统；
[0016] (2)将步骤(1)的单质粒或多质粒系统导入哺乳动物细胞，筛选稳定表达四种基因的宿主细胞，优选地，通过电转化导入；
[0017] (3)分别构建包含突变型PA、PB1、PB2和NP基因的重组质粒以及编码HA、NA、M、NS四种基因的重组质粒，形成流感病毒拯救系统，所述突变通过分别在四个基因序列中引入TAG密码子实现；
[0018] (4)将步骤(3)构建的病毒拯救系统共转染导入步骤(2)的宿主细胞；
[0019] (5)培养步骤(4)获得的细胞并收获流感病毒的颗粒。
[0020] 优选的，本发明稳定整合到宿主细胞的外源基因以及流感病毒拯救系统中的病毒编码基因均来源于流感病毒H1N1的A/WSN/1933株。
[0021] 优选的，步骤(1)中所述PA、PB1、PB2和NP基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
[0022] 优选的，所述流感病毒拯救系统包括如下八个质粒：pPolI-M-PB2、pPolI-M-PB1、pPolI-M-PA、pPolI-M-NP、pPolI-WSN-HA；pPolI-WSN-NA；pPolI-WSN-M；pPolI-WSN-NS，其中，所含有的PA基因存在R266密码子突变为TAG、PB1基因存在R52密码子突变为TAG、PB2基因存在K33密码子突变为TAG和NP基因存在D101密码子突变为TAG。
[0023] 本发明使用的哺乳动物细胞优选为Vero细胞、MDCK细胞，293细胞或MRC5细胞，更优选为Vero细胞或MDCK细胞。
[0024] 进一步的，本发明还提供根据上述方法所制备的步骤(2)的宿主细胞。
[0025] 本发明同时提供根据上述方法所制备的流感病毒。
[0026] 本发明进一步提供包含上述流感病毒的免疫原性组合物。
[0027] 本发明还提供一种病毒拯救组合物，包括宿主细胞和病毒拯救系统，其中，所述宿主细胞表达PA、PB1、PB2和NP基因，所述病毒拯救系统包含突变型PA、PB1、PB2和NP基因，所述突变型使得流感病毒拯救系统不能在天然哺乳动物细胞中拯救获得完整病毒。
[0028] 作为本发明技术方案的用途，还提供上述宿主细胞、流感病毒或免疫原性组合物、病毒拯救组合物在制备预防或治疗流行性感冒药物中的用途。优选地，所述药物为疫苗。
[0029] 以下对相关术语进行进一步解释。
[0030] 流感病毒株
[0031] 在本发明中，涉及的基因片段来源于A型流感病毒或B型流感病毒，优选来源于A型H1N1(如A/WSN/1933，A/PR/8)，H3N2(如A/Aichi/2/68)毒株。
[0032] 作为一个优选的具体实施方案，本发明使用来自H1N1的A/WSN/1933的流感病毒株作为所有基因片段的克隆来源。优选的，所述基因片段是经过密码子优化的。在一个具体技术方案中，本发明根据Vero细胞的偏好进行了密码子优化。
[0033] 许多生物体对具体密码子的使用显示出偏好，因此可基于密码子优化就给定生物体中最佳的基因表达来调节基因。本发明发现编码病毒蛋白的基因序列存在不同宿主细胞之间的密码子偏好性，并且所述偏好性直接影响了蛋白表达量，并决定了病毒拯救的效率。在一个优选方案中，发明人通过反复试验获得了具有较高外源蛋白表达量，且病毒拯救效率较高的优化密码子，基于密码子优化结果：所述PA基因序列如SEQ ID:1所示；所述PB1基因序列如SEQ ID:2所示；所述PB2基因序列如SEQ ID:3所示；所述NP基因序列如SEQ ID:4所示。
[0034] SEQ ID NO:1如下：
[0035] atggaggacttcgtgaggcagtgcttcaaccccatgatcgtggagctggccgagaaggccatgaaggagtacggcgaggacctgaagatcgagaccaacaagttcgccgccatctgcacacacctggaggtgtgcttcatgtactctgacttccacttcatcgacgagcagggcgagtccatcgtggtggagctgggggaccccaacgctctgctgaagcaccggttcgagatcatcgagggacgggacaggaccatcgcctggacagtgatcaacagcatctgcaacaccacaggggccgagaagcccaagttcctgcccgacctgtacgactacaagaagaacaggttcatcgagatcggcgtgaccaggagagaggtgcacatctactacctggagaaggccaacaagatcaagtccgagaagacccacatccacatcttcagcttcacaggggaggagatggccaccaaggccgactacacactggacgaggagagcagggcccggatcaagaccaggctgttcacaatcagacaggagatggcctccaggggcctgtgggactccttccggcagagcgagaggggagaggagacaatcgaggagagattcgagatcaccggcacaatgagaaagctggccgaccagtccctgccacccaacttcagctctctggagaagttcagagcctacgtggacgggttcgagcccaacggctacatcgaggggaagctgagccagatgtctaaggaggtgaacgccagaatcgagcccttcctgaagagcacccccaggcccctgagactgccagacggaccaccatgctcccagcggagcaagttcctgctgatggacgccctgaagctgtccatcgaggaccccagccacgagggagagggcatccccctgtacgacgccatcaagtgcatgagaacattcttcggctggaaggagcccaacgtggtgaagccccacgagaaggggatcaaccccaactacctgctgagctggaagcaggtgctggccgagctgcaggacatcgagaacgaggagaagatcccccggaccaagaacatgaagaagacatctcagctgaagtgggctctgggagagaacatggctccagagaaggtggacttcgacgactgcaaggacgtgggggacctgaagcagtacgacagcgacgagcccgagctgaggtctctggcctcctggattcagaacgagttcaacaaggcctgcgagctgaccgactccagctggatcgagctggacgagatcggagaggacgctgctcccatcgagcacatcgccagcatgcggaggaactacttcaccgccgaggtgtctcactgcagggccacagagtacatcatgaagggcgtgtacatcaacacagccctgctgaacgcctcctgcgctgctatggacgacttccagctgatccccatgatcagcaagtgcagaaccaaggaggggagacggaagacaaacctgtacggcttcatcatcaagggcaggagccacctgcggaacgacaccgacgtggtgaacttcgtgtctatggagttctccctgacagacccccggctggagccacacaagtgggagaagtactgcgtgctggaggtcggcgacatgctgctgaggtctgccatcgggcacgtgtcccggcccatgttcctgtacgtgaggaccaacggcacaagcaagatcaagatgaagtgggggatggagatgaggagatgcctgctgcagagcctgcagcagatcgagtctatgatcgaggccgagtcttccgtgaaggagaaggacatgaccaaggagttcttcgagaacaagtccgagacatggccagtgggagagagcccaaagggagtggaggagggctctatcgggaaggtgtgccggaccctgctggccaagagcgtgttcaactctctgtacgcctccccacagctggagggcttcagcgccgagtctaggaagctgctgctgatcgtgcaggccctgagagacaacctggagccagggaccttcgacctgggagggctgtacgaggccatcgaggagtgcctgatcaacgacccctgggtgctgctgaacgccagctggttcaactctttcctgacacacgccctgagatga
[0036] SEQ ID NO:2如下：
[0037] atggacgtgaaccccacactgctgttcctgaaggtgcccgcccagaacgccatctccaccacattcccctacaccggcgaccccccatacagccacggaaccgggacaggctacaccatggacacagtgaacaggacacaccagtactctgagagagggcggtggaccacaaacaccgagacaggagctccacagctgaaccccatcgacggaccactgccagaggacaacgagccatccggatacgctcagaccgactgcgtgctggaggccatggccttcctggaggagagccaccccgggatcttcgagacctcttgcctggagacaatggaggtggtgcagcagacccgggtggacaagctgacacagggcaggcagacctacgactggacactgaacagaaaccagccagctgctaccgccctggccaacacaatcgaggtgttcagatccaacggactgaccgctaacgagagcggccggctgatcgacttcctgaaggacgtgatggagtctatgaacaaggaggagatggagatcaccacacacttccagagaaagaggagagtgcgggacaacatgacaaagaagatggtgacccagagaacaatcggcaagagaaagcagcggctgaacaagaggagctacctgatcagagccctgaccctgaacaccatgacaaaggacgctgagagagggaagctgaagagaagggccatcgccaccccagggatgcagatcaggggcttcgtgtacttcgtggagacactggccaggagcatctgcgagaagctggagcagtccggactgccagtgggagggaacgagaagaaggccaagctggccaacgtggtgcggaagatgatgaccaactctcaggacacagagatcagcttcaccatcacaggggacaacacaaagtggaacgagaaccagaaccccaggatgttcctggccatgatcacctacatcacacggaaccagcccgagtggttcaggaacgtgctgtccatcgcccccatcatgttcagcaacaagatggccagactggggaagggctacatgttcgagtctaagtccatgaagatcagaacccagatcccagctgagatgctggccagcatcgacctgaagtacttcaacgactctaccagaaagaagatcgagaagatcagaccactgctgatcgacggaacagccagcctgtctcccgggatgatgatgggcatgttcaacatgctgagcaccgtgctgggggtgtctatcctgaacctgggccagaagaggcacacaaagaccacatactggtgggacggcctgcagagctctgacgacttcgccctgatcgtgaacgctccaaaccacgagggcatccaggctggcgtgaacaggttctacagaacatgcaagctgctggggatcaacatgagcaagaagaagagctacatcaaccggaccggcacattcgagttcacctctttcttctaccgatacgggttcgtggccaacttctccatggagctgccctctttcggggtgtccggcatcaacgagagcgccgacatgtctatcggcgtgaccgtgatcaagaacaacatgatcaacaacgacctgggaccagctacagctcagatggccctgcagctgttcatcaaggactacaggtacacctaccggtgccacaggggcgacacccagatccagacaagacggagcttcgagatcaagaagctgtgggagcagacccactctaaggctggactgctggtgtccgacggaggacccaacctgtacaacatcaggaacctgcacatccccgaggtgtgcctgaagtgggagctgatggacgaggactaccagggcagactgtgcaaccccctgaaccccttcgtgaaccacaaggacatcgagtccgtgaacaacgccgtgatcatgccagctcacggaccagctaagaacatggagtacgacgccgtggccaccacacacagctggattcccaagaggaacagatccatcctgaacaccagccagaggggcatcctggaggacgagcagatgtaccagaagtgctgcaacctgttcgagaagttcttcccctccagctcttacaggagacccgtgggcatctccagcatggtggaggctatggtgagccgggccaggatcgacgccaggatcgacttcgagtctgggagaatcaagaaggaggagttcaccgagatcatgaaaatctgcagcacaatcgaggagctgcggaggcagaagtga
[0038] SEQ ID NO:3如下：
[0039] atggagaggatcaaggagctgagaaacctgatgtctcagtcccggacaagggagatcctgaccaagaccacagtggaccacatggccatcatcaagaagtacaccagcggcaggcaggagaagaaccccgccctgagaatgaagtggatgatggccatgaagtaccccatcacagccgacaagcggatcaccgagatgatccccgagaggaatgagcagggccagaccctgtggagcaagatgaacgacgccggcagcgacagagtgatggtgagccccctggccgtgacatggtggaacagaaacggccccgtgacatctaccgtgcactaccccaaaatctacaagacatacttcgagaaggtggagagactgaagcacggcaccttcgggccagtgcacttccggaaccaggtgaagatcaggagacgggtggacatcaacccaggacacgccgacctgtctgccaaggaggcccaggacgtgatcatggaggtggtgttccccaacgaagtgggcgccagaatcctgaccagcgagtctcagctgaccacaaccaaggagaagaaggaggagctgcaggggtgcaagatcagccccctgatggtggcctacatgctggagcgggagctggtgagaaagacccggttcctgccagtggctggaggcaccagcagcgtgtacatcgaggtgctgcacctgacacagggcacctgctgggagcagatgtacacaccaggaggagaggctagaaacgacgacgtggaccagtccctgatcatcgccgccaggaacatcgtgaggagagctacagtgtctgccgaccccctggcctccctgctggagatgtgccacagcacccagatcggcggcatcaggatggtgaacatcctgaggcagaaccccacagaggagcaggccgtggacatctgcaaggccgccatgggcctgaggatctccagctctttctccttcggcgggttcacattcaagagaaccagcggctccagcgtgaagagagaggaggaggtgctgacagggaacctgcagaccctgaagatcagggtgcacgagggctacgaggagttcacaatggtggggcggagggctaccgctatcctgagaaaggccacaagacggctgatccagctgatcgtgagcggccgggacgagcagtctatcgccgaggccatcatcgtggccatggtgttcagccaggaggactgcatgatcaaggccgtgaggggggacctgaacttcgtgaaccgggccaaccagaggctgaaccccatgcaccagctgctgagacacttccagaaggacgccaaggtgctgttccagaactggggcatcgagtctatcgacaacgtgatgggcatgatcggcatcctgcccgacatgacaccctccaccgagatgagcatgaggggcgtgagaatctccaagatgggggtggacgagtactcttccgccgagaagatcgtggtgagcatcgacaggttcctgagagtgcgggaccagagaggcaacgtgctgctgtctcccgaggagatcagcgagacacaggggaccgagaagctgacaatcacctacagctcttccatgatgtgggagatcaacggccccgagtctgtgctggtgaacacctaccagtggatcatcagaaactgggagacagtgaagatccagtggtcccagaaccccaccatgctgtacaacaagatggagttcgagcccttccagagcctggtgccaaaggccgtgaggggccagtactctgggttcgtgagaaccctgttccagcagatgcgggacgtgctgggcacattcgacaccgcccagatcatcaagctgctgcccttcgccgccgccccaccaaagcagagccggacacagttcagctctctgaccatcaacgtgaggggctctgggatgagaatcctggtgcgggggaactcccccgtgttcaactacaacaagacaaccaagcggctgaccgtgctgggcaaggacgctggaccactgaccgaggaccccgacgagggcacagccggggtggagagcgccgtgctgaggggcttcctgatcctggggaaggaggacaggagatacggccccgccctgagcatcaacgagctgtctaacctggccaagggggagaaggccaacgtgctgatcggccagggcgacgtggtgctcgtgatgaagaggaagagaaactccagcatcctgaccgacagccagacagccaccaagcggatcaggatggccatcaactga
[0040] SEQ ID NO:4如下：
[0041] atggccaccaagggcacaaagaggagctacgagcagatggagaccgacggggagaggcagaacgccacagagatcagagcctctgtgggcaagatgatcgacggcatcgggagattctacatccagatgtgcaccgagctgaagctgtccgactacgaggggagactgatccagaactctctgacaatcgagcggatggtgctgtccgccttcgacgagaggagaaacaagtacctggaggagcacccaagcgccggcaaggaccccaagaagaccggaggaccaatctacagaagggtggacgggaagtggagacgggagctgatcctgtacgacaaggaggagatcaggagaatctggaggcaggctaacaacggcgacgacgctaccgctgggctgacacacatgatgatctggcactctaacctgaacgacgccacctaccagaggacaagagccctggtgcggaccggaatggaccccaggatgtgctctctgatgcaggggtccacactgccacggaggagcggagctgctggagctgccgtgaagggcgtggggaccatggtcatggagctgatccggatgatcaagaggggcatcaacgacagaaacttctggcggggcgagaacgggagacggacaaggatcgcctacgagagaatgtgcaacatcctgaagggcaagttccagaccgccgcccagaggacaatggtggaccaggtgagggagagcaggaaccccggcaacgccgagttcgaggacctgatcttcctggctagatccgccctgatcctgagagggagcgtggctcacaagtcttgcctgccagcttgcgtgtacggcagcgccgtggcctctgggtacgacttcgagagggagggctacagcctggtggggatcgaccccttcagactgctgcagaactcccaggtgtacagcctgatcagaccaaacgagaacccagctcacaagagccagctggtgtggatggcctgccactctgccgccttcgaggacctgagggtgagctctttcatcagaggaaccaaggtggtgccccggggcaagctgtccacaaggggggtgcagatcgccagcaacgagaacatggagaccatggagtccagcacactggagctgcggtccaggtactgggccatcagaacccggagcggcgggaacacaaaccagcagagggcctcttccggccagatcagcatccagcccaccttcagcgtgcagagaaacctgcccttcgaccggcccacaatcatggctgccttcaccggaaacacagagggacggaccagcgacatgaggacagagatcatcagactgatggagagcgccagaccagaggacgtgtctttccagggcaggggggtgttcgagctgtctgacgagaaggccacctcccccatcgtgccctctttcgacatgtccaacgagggcagctacttcttcggggacaacgccgaggagtacgacaactga
[0042] 需要强调的是，本发明在提到PA、PB1、PB2和NP基因时，如无特别限定，指的是可以编码PA、PB1、PB2和NP蛋白的任何核苷酸序列，包括进行了密码子偏好人工改造的核苷酸序列。Q_PA、Q_PB1、Q_PB2、Q_NP基因特指根据Vero细胞偏好进行改造后的核苷酸序列。突变型PA、PB1、PB2和NP基因是指对病毒拯救系统中的四个基因进行了引入终止密码子的定点突变所获得的核苷酸序列。
[0043] 宿主细胞
[0044] 本发明用于表达病毒蛋白的原始宿主细胞可以选自Vero细胞、MDCK细胞，293细胞，MRC5等细胞。不同宿主细胞在拯救流感病毒的效力方面存在差别，优选为Vero细胞、MDCK细胞，因为使用这两种细胞的拯救效率高于其余细胞2倍以上(以拯救后的病毒滴度计算)。
[0045] 载体
[0046] 本发明用于向哺乳动物细胞导入PA、PB1、PB2和NP基因的载体可以选自各种常规的蛋白表达质粒，优选pBudCE4.1。为表达上述基因，本发明构建了同时表达上述四个基因的一个重组质粒。作为备选的技术方案，本发明构建了表达上述四个基因的双质粒系统，三质粒系统，和四质粒系统，其中每个质粒可以表达上述四个基因中的一个或多个。根据实验验证，上述四种系统均能实现目标蛋白的稳定表达。作为优选的方案，本发明使用pBudCE4.1，因为在该质粒上实现了同时表达所述四种外源基因，具有相对较高的转染效率，并获得了相对其他载体更高的稳定整合效率。作为另一种实现较高转染和整合效率的可选的方案，本发明也使用双质粒系统。所谓双质粒系统优选是以pcDNA3.1/Hygro(+)为骨架，构建同时表达PA和PB1蛋白的pcDNA3.1_PA_PB1载体；以pBudCE4.1为骨架，构建同时表达NP和PB2蛋白的pBudCE4.1_Puro_NP_PB2载体。在构建稳定细胞株时，同时将该双质粒转入宿主细胞中。
[0047] pBudCE4.1的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)如下：
[0048] gcgcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttgcattcctgcaggtcgacatcgatcttaagcagtacttctagaggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatatgcataccggtcatcatcaccatcaccattgagtttgatccccgggaattcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtagcacgtgtcagtcctgctcctcggccacgaagtgcacgcagttgccggccgggtcgcgcagggcgaactcccgcccccacggctgctcgccgatctcggtcatggccggcccggaggcgtcccggaagttcgtggacacgacctccgaccactcggcgtacagctcgtccaggccgcgcacccacacccaggccagggtgttgtccggcaccacctggtcctggaccgcgctgatgaacagggtcacgtcgtcccggaccacaccggcgaagtcgtcctccacgaagtcccgggagaacccgagccggtcggtccagaactcgaccgctccggcgacgtcgcgcgcggtgagcaccggaacggcactggtcaacttggccatggtttagttcctcaccttgtcgtattatactatgccgatatactatgccgatgattaattgtcaacacgtgctgatcagatccgaaaatggatatacaagctcccgggagctttttgcaaaagcctaggcctccaaaaaagcctcctcactacttctggaatagctcagaggcagaggcggcctcggcctctgcataaataaaaaaaattagtcagccatggggcggagaatgggcggaactgggcggagttaggggcgggatgggcggagttaggggcgggactatggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacaccctcgtcgagctagcttcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctccagtacgtgattcttgatcccgagctggagccaggggcgggccttgcgctttaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaggatctgcacactggtatttcggtttttgggcccgcggccggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctccagggggctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctggagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctcgttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaacacgtggtcgcggccgcttcgaaggtaccagcacagtggactcgagagatctggccggctgggcccgtttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagtggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgcca
[0049] 流感病毒拯救系统
[0050] 病毒拯救或称病毒的感染性分子克隆属于反向遗传操作技术，即通过人工操作基因，用病毒核酸的适当形式在一定条件下转染细胞，产生有感染性的病毒粒子。本发明可选的使用Hoffmann等建立的8质粒拯救系统，完全以质粒为基础的系统其优点是不需要辅助病毒，避免了大量的筛选工作。8质粒系统以数量最少的质粒为基础，利用同一载体实现在细胞内的病毒RNA和蛋白合成，进而包装成病毒。本发明的8质粒系统可以是，例如pPolI-M-PB2、pPolI-M-PB1、pPolI-M-PA、pPolI-M-NP、pPolI-WSN-HA；pPolI-WSN-NA；pPolI-WSN-M；pPolI-WSN-NS。其中，携带的PA、PB1、PB2和NP基因经本发明选择的突变位点突变改造。所述重组质粒使用PHH21载体构建。完成构建后，所述重组质粒完全可以由人工合成获得。
[0051] 定点突变
[0052] 本发明对病毒拯救系统中的四个基因(PA、PB1、PB2和NP)进行了引入终止密码子的定点突变，其目的是使拯救系统在上述构建的细胞系中，能够实现病毒拯救和感染增殖，而在正常的动物细胞中，因终止密码子的引入导致PA、PB1、PB2和NP无法正常表达，从而无法病毒拯救和无法感染增殖。所述四个基因中，PA、PB1、PB2分别编码RNA聚合酶复合体的3个亚基，NP编码核蛋白，四个基因共同失活确保了病毒不能在正常细胞中进行复制增殖，即产生复制可控型性状。定点突变的方式包括但不限于分别在四个基因序列中引入TAG密码子，从而导致表达终止。所述突变位置可以通过对所述蛋白的氨基酸序列以及晶体结构进行分析，筛选一系列最有效的突变位点。有效的突变可以是，例如：PA(R266突变为TAG)、PB1(R52突变为TAG)、PB2(K33突变为TAG)和NP(D101突变为TAG)，此外，也可以额外包含HA，NA，M，NS基因上的突变。
[0053] 电转化细胞
[0054] 本发明使用电转的方法将PA、PB1、PB2和NP基因转染Vero、MDCK或其他细胞，实验表明，电转的方法明显优于其它方法，且Vero细胞、MDCK细胞最适合。
[0055] 安全性及有效性
[0056] 鉴定安全性-复制缺陷性的方法为细胞病变检测实验。经体内外实验证明，复制可控型流感病毒在野生型动物细胞中不能进行复制，但可以在已表达了PA、PB1、PB2和NP蛋白的宿主细胞中拯救形成完整活病毒，导致细胞病变、裂解。通过细胞病变，可以获知流感病毒在不同的细胞中是否具有复制能力。病毒免疫有效性可以通过常规的动物免疫实验进行评价。实验表明，本发明的活病毒具有非常高的安全性和遗传稳定性，与灭活病毒相比具有更好的免疫效果。
[0057] 免疫原性组合物
[0058] 本发明也提供包含活病毒的免疫原性组合物(例如，疫苗)，所述活病毒通过本发明的拯救方法获得。在有些实施方案中，所述活病毒是减毒的。在有些实施方案中，免疫原性组合物包含二、三、四种或更多种活病毒。疫苗的规格可以是例如包含每剂量106.5-107.5FFU的活流感病毒。在某些实施方案中，所述免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为含有例如0.2ml单剂量的预填充的喷雾剂。本发明的疫苗的可药用媒介物优选含水的溶液或乳液。更优选采用油包水乳液媒介。疫苗的具体配制取决于所用的病毒载体、以及所插入的外源核苷酸序列。
[0059] 在某些实施方案中，本文描述的组合物包含佐剂或与佐剂组合进行给药。与本文描述的组合物一起给药的佐剂可以在给予所述组合物之前、同时或之后给予。在有些实施方案中，术语“佐剂”指这样的化合物，当其与本发明描述的组合物联合或作为本文描述的组合物的一部分给药时，能增强、提高和/或加强对流感病毒疫苗的免疫应答，但是当该化合物单独给药时不产生对所述多肽的免疫应答。
[0060] 预防与治疗用途
[0061] 本发明的流感病毒可以用于制备疫苗，并用于预防或治疗性用途。药物组合物有效剂量取决于疾病或病症的性质，可由标准临床技术确定。另外，可选用体外试验来有助于确定优化剂量范围。配制剂中使用的精确剂量也会取决于给药的途径，以及疾病或病症的严重程度，应根据医师的判断以及每名患者的状态来确定。然而，给药的合适剂量范围通常约为104-5×107pfu，可给药一次，或根据需要间隔多次给药。本发明药物组合物含104-5×7
10 pfu的突变型复制可控型病毒，可以鼻内、气管内、肌内或皮下给药。可以自剂量反应曲线推出有效剂量，此曲线可衍生自体外或动物模型测试系统。
10 pfu的突变型复制可控型病毒，可以鼻内、气管内、肌内或皮下给药。可以自剂量反应曲线推出有效剂量，此曲线可衍生自体外或动物模型测试系统。
[0062] 本发明的创新之处在于：
[0063] 提供了一种生产突变型流感病毒的全新方法，使用该方法生产的流感病毒只在特定的细胞系中可以拯救和感染增殖，但在正常的动物和人体细胞中不会复制增殖，大大提高了病毒安全性，同时保留了作为活病毒的极高的免疫原性，为人类流感病毒的预防以及治疗提供了新的选择。使用本发明的病毒拯救系统，发明人出人意料的发现整合外源病毒蛋白的Vero或MDCK细胞中，可以实现病毒拯救和感染增殖，并首次验证了组装病毒的活性。
[0064] 本发明使用经过密码子优化的外源病毒基因，配合Vero细胞或MDCK细胞，实现了外源蛋白最优化的表达。同时，优选的载体保证四个基因同时转入宿主细胞并在细胞中稳定传代表达，不但可以作为病毒拯救的必需宿主细胞，而且可以作复制可控型病毒的配套细胞基质，用于病毒或疫苗的大量生产。附图说明
[0065] 图1为质粒pBudCE4.1_NP_IRES_PA_PB2_IRES_PB1构建图谱；
[0066] 图2为双质粒系统的质粒pcDNA3.1_PA_PB1构建图谱；
[0067] 图3为双质粒系统的质粒pBudCE4.1_Puro_NP_PB2构建图谱；
[0068] 图4为拯救形成的病毒的电镜照片，透射电镜(Spirit 120KV)，100kv，放大15万倍；
[0069] 图5为拯救产生的病毒的突变点验证测序结果，其中基因位点1-4分别对应于NP、PA、PB1和PB2的相应位点，其中在同一基因位点的对比图中，上面的序列为测定的序列，下面的序列为参考序列。
[0070] 图6拯救病毒转染细胞安全性对照实验，其中A1为转染正常细胞铺板过夜后，A2为转染正常细胞培养3天后的电镜图；B1为转染按照实施例1单质粒构建的细胞并铺板过夜后，B2为其培养3天后的细胞电镜图。所用病毒液利用实施例3-1的细胞参与拯救获得。
具体实施方式
[0071] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0072] 需要说明的是，本发明实施例的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
[0073] 实验材料
[0074] 本发明经密码子优化的NP，PA，PB1，PB2基因序列均来自人工合成，所有序列克隆引物、筛选标记也按照本发明所公开的序列由人工合成。载体pBudCE4.1(SEQ ID NO:5)由人工合成。
[0075] 本实施例部分的宿主细胞使用Vero细胞，来自 CCL-81TM，属于可商购的Vero细胞系。
[0076] 实施例1质粒pBudCE4.1_NP_IRES_PA_PB2_IRES_PB1的构建
[0077] 根据Pubmed公布的流感病毒A/WSN/1933(Taxonomy ID:382835)的基因序列，通过密码子优化，分别获得对Vero细胞具有偏好性的PA、PB1、PB2和NP表达基因序列，经全基因合成，将获得的基因片段分别命名为Q_PA(SEQ ID NO:1)、Q_PB1(SEQ ID NO:2)、Q_PB2(SEQ ID NO:3)、Q_NP(SEQ ID NO:4)基因。
[0078] 对pBudCE4.1和Q PURO(嘌呤霉素抗性基因，SEQ ID NO:6)进行双酶切(EcoRI,AvrII),T4DNA连接酶连接，热激法转化至大肠杆菌DH5α中，筛选，培养扩增，纯化获得pBudCE4.1+puro。
[0079] 对pBudCE4.1+puro和Q_NP进行双酶切(HindIII，SalI),T4DNA连接酶连接，热激法转化至大肠杆菌DH5α中，筛选，培养扩增，纯化获得pBudCE4.1+puro_NP。
[0080] pBudCE4.1+puro_NP和Q_PA进行双酶切(SalI，BamHI),T4DNA连接酶连接，构建pBudCE4.1+puro_NP，热激法转化至大肠杆菌DH5α中，筛选，培养扩增，纯化获得pBudCE4.1+puro_NP_PA。
[0081] pBudCE4.1+puro_NP_PA和Q_PB2进行双酶切(NotI，XhoI),T4DNA连接酶连接，热激法转化至大肠杆菌DH5α中，筛选，培养扩增，纯化获得pBudCE4.1+puro_NP_PA_PB2。
[0082] pBudCE4.1+puro_NP_PA_PB2和Q_PB1进行双酶切(XhoI,BglII),T4DNA连接酶连接，热激法转化至大肠杆菌DH5α中，筛选，培养扩增，纯化获得pBudCE4.1+puro_NP_PA_PB2_PB1。
[0083] 上述构建过程中，筛选步骤使用的固体培养基为：低钠LB固体培养基(1％蛋白胨，0.5％氯化钠，0.5％酵母提取物，1.8％琼脂糖)，25μg/ml的博莱霉素；扩增步骤使用的液体培养基为：低钠LB液体培养基(1％蛋白胨，0.5％氯化钠，0.5％酵母提取物)，25μg/ml的博莱霉素。
[0084] 该质粒的构建图谱如图1所示。Q PURO基因的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:6)：
[0085] atgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtcccccgggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgacccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctag[0086] 实施例2双质粒系统的构建
[0087] pcDNA3.1_PA_PB1载体构建过程见图2，具体如下：pcDNA3.1/Hygro(+)质粒(从生物风购买，来源invitrogene)与含有PA蛋白基因(Q_PA，金斯瑞合成)的载体(pUC57，生物风购买)(该载体通过PA基因与pUC57通过HindIII,BamHI双酶切并连接而获得，用于扩增)同时进行HindIII,BamHI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收pcDNA3.1/Hygro(+)质粒与PA蛋白基因片段(Q_PA)，使用T4DNA连接酶将上述回收片段进行连接(载体与插入片段摩尔比1：3)并使用热激法转化至大肠杆菌DH5α中，构建成pcDNA3.1_PA质粒。
[0088] 将pcDNA3.1_PA质粒与含有PB1蛋白基因(Q_PB1,金斯瑞合成)的载体(pUC57，生物风购买)(该载体通过PB1基因与pUC57通过HindIII,BamHI双酶切并连接而获得，用于扩增)同时进行BamHI和NotI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收pcDNA3.1_PA质粒与PB1蛋白基因片段(Q_PB1)，使用T4DNA连接酶将上述回收片段进行连接(载体与插入片段摩尔比1：3)并使用热激法转化至大肠杆菌DH5α中，构建成pcDNA3.1_PA_PB1质粒。
[0089] 以pBudCE4.1为骨架，构建同时表达NP和PB2蛋白的pBudCE4.1_Puro_NP_PB2载体构建过程可参考实施例1，区别仅在于引入NP基因后直接引入PB2基因。该质粒的构建图谱如图3所示。
[0090] 实施例3Vero细胞培养及电转化
[0091] 实施例3-1单质粒Vero细胞电转化：
[0092] 复苏后的Vero细胞，转至T25细胞培养瓶，细胞浓度为9×106个/瓶，所用的细胞培养基为含有L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、10％FBS的MEM。培养的第二天，胰酶消化后，收集细胞重悬于50ml PBS，4000rpm，10min离心去上清，再重悬于0.5mLoptiMEM(购于美国Sigma公6
司) 。FCM 1∶40计数细胞 ，每5×10 个细胞中加入0 .4cm电 穿孔杯
(electroporationcuvette)和400μL optiMEMI(购于美国Sigma公司)。
司) 。FCM 1∶40计数细胞 ，每5×10 个细胞中加入0 .4cm电 穿孔杯
(electroporationcuvette)和400μL optiMEMI(购于美国Sigma公司)。
[0093] 将1μg质粒pBudCE4.1+puro_NP_PA_PB2_PB1通过电转化的方式转入Vero细胞(1.67E+04个细胞/ug质粒)中，电转条件为：电压120V,脉冲500μs，电击次数6次，时间间隔100ms。
[0094] 实施例3-2单质粒MDCK细胞电转化
[0095] 作为另一种可选方案，将MDCK细胞接种于T75细胞培养瓶中，所种植的细胞浓度为1.0×106个/瓶，所用的细胞培养基为含有4mmol/L L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、10％FBS的MEM中。培养的第二天，收集细胞重悬于5ml MEM，细胞计数，离心，加入3mL EK buffer清洗细胞，再次离心，加入EK buffer重悬至2.5E+06细胞/mL细胞密度，取60μL至96孔板孔中将9μg质粒(1.2μg/μL，4.1μL)pBudCE4.1+puro_NP_PA_PB2_PB1通过电转化的方式转入MDCK细胞中，电转条件为：电压175V，脉冲100μs，电击次数6次，时间间隔1000ms
[0096] 实施例3-3双质粒电转化：
[0097] 将Vero细胞接种于T75细胞培养瓶中，所接种的细胞浓度为1.0×106个/瓶，所用的细胞培养基为含有4mmol/L L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、20％FBS的DMEM中。培养的第二天，收集细胞重悬于5ml DMEM，细胞计数，离心，加入3mL EK buffer清洗细胞，再次离心，加入EK buffer重悬至2.5E+06细胞/mL细胞密度，取60μL至96孔板孔中分别将5ug质粒(1.2μg/μL，4.1μL)pcDNA3.1_PA_PB1和质粒pBudCE4.1_Puro_NP_PB2通过电转化的方式转入Vero细胞中，电转条件为：电压175V，脉冲100μs，电击次数6次，时间间隔1000ms。
[0098] 实施例3-4转化后的培养
[0099] 电转后的细胞，取3-5个生长情况较好的细胞池,扩大培养。
[0100] Vero细胞培养条件：250μg/ml潮霉素，2μg/ml嘌呤霉素，细胞培养基为含有4mmol/L L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、20％FBS的DMEM中。37℃，5％二氧化碳恒温静置培养；每2天进行换液。
[0101] MDCK细胞培养条件：100μg/ml潮霉素，0.5μg/ml嘌呤霉素，细胞培养基为含有4mmol/L L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、20％FBS的DMEM中。37℃，5％二氧化碳恒温静置培养；
每2天进行换液。
每2天进行换液。
[0102] 实施例3-5RT-PCR
[0103] TRIzol提取上述培养细胞中的总RNA，使用随机引物通过M-MLV反转录酶反转录为cDNA，以反转录的cDNA为模板PCR扩增检测目标基因的表达情况。RT-PCR结果证明了在单质粒、双质粒转化的Vero细胞和单质粒转化的MDCK细胞中，有PA、PB2、PB1和NP基因mRNA水平的稳定表达。
[0104] 实施例4突变病毒RNA拯救系统的构建
[0105] 根据Pubmed公布的流感病毒A/WSN/1933(Taxonomy ID:382835)的基因序列，经全基因合成，获得该流感病毒八个基因片段的基因。流感病毒各基因序列的GeneBank登录号分别为，PB2：LC333182.1，PB1：LC333183.1，PA：LC333184.1，NP：LC333186.1，HA：LC333185.1，NA：LC333187.1，M：LC333188.1，NS：LC333189.1。然后将其分别连接在PHH21(购自中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心)载体上，获得拯救野生型流感病毒WSN的质粒。
获得的质粒的命名分别为：pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-HA；pPolI-WSN-NA；pPolI-WSN-M；pPolI-WSN-NS。构建8质粒系统的方法是已有技术，也可参考相关专利文献构建并使用，例如可参中国专利申请201511029463.1中的构建方法。
获得的质粒的命名分别为：pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-HA；pPolI-WSN-NA；pPolI-WSN-M；pPolI-WSN-NS。构建8质粒系统的方法是已有技术，也可参考相关专利文献构建并使用，例如可参中国专利申请201511029463.1中的构建方法。
[0106] 通过生物信息学工具Consurf对流感病毒A/WSN/1933各蛋白的氨基酸的保守性进行分析，并根据已被解析的流感病毒蛋白的晶体结构，选择保守、相对保守、相对不保守、不保守的氨基酸位点进行突变，最终筛选并获得分别针对PA、PB1、PB2、NP的可选择突变，PA(R266密码子突变为TAG)、PB1(R52密码子突变为TAG)、PB2(K33密码子突变为TAG)和NP(D101密码子突变为TAG)突变。
[0108] 表1四种蛋白上被选择位点的点突变引物
[0109]
[0110] 以pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-NP作为模板质粒，利用定点突变试剂盒(Lightning Site-DirectedMutagenesis Kits，Catalog#210518)，按说明书操作将各个蛋白上被选择的位点的氨基酸密码子通过上述引物位点突变为琥珀终止密码子TAG，经测序验证突变成功。所得包含突变型基因的载体分别命名为pPolI-M-PB、pPolI-M-PB1、pPolI-M-PA、pPolI-M-NP。
[0111] 实施例5复制可控型病毒的拯救
[0112] 将实施例3-1制备的稳定表达细胞铺板：以10cm皿为例，将稳定系按照每皿1×106个/ml铺板于10cm皿平板中，混匀后，放置于37℃，5％CO2，培养20-24hrs至细胞汇合度20％-40％。
[0113] 按照常规方法进行病毒质粒的转染以及病毒拯救，将拯救流感病毒所用的8个质粒共转染实施例3获得的转化单质粒及双质粒的Vero稳定细胞系。其中：携带NP、PA、PB2、PB1基因的质粒采用实施例4获得的四个定点突变质粒，携带HA，NA，M，NS基因的质粒采用pPolI-WSN-HA；pPolI-WSN-NA；pPolI-WSN-M；pPolI-WSN-NS四个质粒。
[0114] 1ml Opti-MEM于EP管中，加入8种质粒(每种质粒1μg)，加入转染试剂，混匀，37℃，5％CO2下孵育，5.5小时换液，转染后第4天进行半量换液，转染后第6天起，每两天补液初始体积的10％，每天观察记录细胞的生长情况以及细胞病变的情况，在单质粒和双质粒转化产生稳定细胞系参与的病毒拯救中，均出现70％以上病变，收获病毒液。
[0115] 采用磷钨酸负染色，5min，透射电镜(Spirit 120KV)，100kv，放大15万倍，观察，拍得单质粒转化Vero细胞参与拯救获得的完整的病毒图像，如图4所示。
[0116] 双质粒整合的Vero细胞以及稳定整合的MDCK细胞也获得了同样结果。
[0117] 实施例6复制可控型病毒的突变点确认
[0118] 使用RNAiso plus(TaKaRa Code No.:9108)提取实施例5所获得的病毒(单质粒整合的Vero细胞系参与拯救)全部的RNA，提取后溶于13μl无RNA酶dH2O中，经TaKaRaPrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2(Code No.:RR055A)进行RT-PCR，TSINGKE DNA凝胶回收试剂盒(Code No.：GE0101-200)切胶回收上述PCR产物，溶于25μl Eluent Buffer， Terminator v3.1测序反应及纯化，3730测序仪测序，3730xl对数据进行收集分析。结果参见图5。四个突变点引物如下：
[0119] 表2
[0120]
[0121]
[0122] 实验结果：如图5所示，四个突变点测序结果与参考序列完全一致，没有发生回复突变。针对双质粒系统构建的宿主细胞所参与的病毒拯救，同样进行所述突变检测，结果相同。
[0123] 实施例7病毒细胞病变实验确定安全性
[0124] 取正常Vero细胞和实施例3-1构建的细胞，按照4*105每孔铺6孔板，每孔2mL培养基分别加入不同孔中，37℃，5％CO2过夜培养，再加入0.5mL病毒液(实施例5制备)，混匀，37℃，5％CO2，培养3天，显微镜下观察，构建的细胞因病毒复制裂解，而正常Vero细胞并未裂解。参见图6。
[0125] 实施例8病毒血凝检测实验测定HA
[0126] 取实施例5获得的复制可控病毒液，同时也采用本申请实施例教导的方法制备MDCK参与病毒拯救所获得的病毒液，可分为3组6个样品进行检测。其中，样品1和2分别实施例3-1的细胞参与拯救形成的病毒液(分别培养6天和7天)，样品3和4分别为实施例3-2的细胞参与拯救形成的病毒液(分别培养6天和7天)，样品5和6分别为实施例3-3的细胞参与拯救形成的病毒液(分别培养6天和7天)。按照“1％鸡红细胞悬液配制”SOP配制红细胞悬液。将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行方向称行，如A1～A12称为A行。标记好待检病毒的实验室编号及加样顺序。加PBS，取8道加样器装好200μL带滤芯滴头，于加样槽中吸取50μL PBS加入微量板的第二列，依次加入50μL PBS直至最后一列。加入待检病毒，单道加样器装好200μL带滤芯滴头，吸取100μL待检病毒液，加入已标记好的微量板的第一列相对应的孔内。最后的H1孔内加100μLPBS作为红细胞对照。8道加样器装好200μL带滤芯滴头，从第一列的各孔分别取50μL病毒液，加入到第二列的相应的各孔，混匀数次。
依次从微量板的第二列至第十二列做二倍系列稀释。最后一列每孔弃去50μL液体。8道加样器装好200μL带滤芯滴头，于加样槽中吸取50μL红细胞悬液。每孔加入50μL1％的红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。室温孵育60min，观察红细胞凝集现象并记录结果。结果判定：红细胞凝集滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点其稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。红细胞完全凝集以“+”记录；无凝集或部分凝集“-”记录。空白对照用50μL PBS替代50μL病毒液。阳性对照为野生型流感病毒A/WSN/1933用PBS稀释100倍的样品。阴性对照1为未转入pBudCE4.1+puro_NP_PA_PB2_PB1等质粒或质粒系统，但是瞬时转化了包含突变的8质粒系统的Vero细胞；阴性对照2为未转入包含突变的8质粒系统，但是转入了pBudCE4.1+puro_NP_PA_PB2_PB1载体的Vero细胞。
依次从微量板的第二列至第十二列做二倍系列稀释。最后一列每孔弃去50μL液体。8道加样器装好200μL带滤芯滴头，于加样槽中吸取50μL红细胞悬液。每孔加入50μL1％的红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。室温孵育60min，观察红细胞凝集现象并记录结果。结果判定：红细胞凝集滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点其稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。红细胞完全凝集以“+”记录；无凝集或部分凝集“-”记录。空白对照用50μL PBS替代50μL病毒液。阳性对照为野生型流感病毒A/WSN/1933用PBS稀释100倍的样品。阴性对照1为未转入pBudCE4.1+puro_NP_PA_PB2_PB1等质粒或质粒系统，但是瞬时转化了包含突变的8质粒系统的Vero细胞；阴性对照2为未转入包含突变的8质粒系统，但是转入了pBudCE4.1+puro_NP_PA_PB2_PB1载体的Vero细胞。
[0127] 表3：红细胞凝集
[0128]
[0129] 实验结果表明，在未经稀释或进行2倍稀释的条件下，利用单质粒或双质粒构建的稳定表达四种基因的Vero和MDCK细胞系可以用于病毒拯救，并能产生完整病毒血凝活性。该结果进一步证明病毒拯救成功。其中，使用Vero作为宿主细胞整合单质粒的细胞，作为病毒拯救的宿主细胞具有更好的效率。
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