特异性捕获和有效释放循环肿瘤细胞的磁性纳米复合物及其
制备方法
技术领域
[0001] 本
发明属于
生物材料技术领域，具体是指一种特异性捕获和有效释放循环肿 瘤细胞的磁性纳米复合物及其制备方法。
背景技术
[0002] 癌症的转移是癌症致死的主要原因，而循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)是癌症转移的关键因素。检测和分析CTCs对癌症的早期诊断、
预后判断、 复发检测以及个体化
治疗等都有非常重要的临床意义。但是外周血中CTCs数目 极少(1mL外周血中约有1-10个CTC)，因此采用常规手段难以实现CTCs的捕 获和分离。目前富集CTCs的方法有
密度梯度离心法、
膜过滤法、免疫
磁珠富集 法等。其中，免疫磁珠富集技术是最常用的方法之一，该方法是将磁性纳米颗粒 表面经修饰改性后，可偶联
抗体、酶、DNA或RNA等多种生物活性物质，通过 这些生物活性分子与细胞表面的特异性受体结合，实现细胞的分离与检测(Wen C Y,Wu L L,Zhang Z L,et al.Quick-response magnetic nanospheres for rapid,efficient capture and sensitive detection of circulating tumor cells[J].Acs Nano,2014, 8(1):941-949.)。例如，Pen等采用HER2-靶向多肽功能化磁性
纳米粒子捕获病人 中的HER2过表达的循环肿瘤细胞，其捕获效率达到68％～80％。(Peng,Jiaxi,et al. "Peptide-functionalized nanomaterials for the efficient isolation of HER2-positive circulating tumor cells."ACS applied materials&interfaces 9.22(2017): 18423-18428.)。为了进一步提高捕获效率，Ma等在免疫磁球表面偶联两种抗体， 与细胞共孵育30min后捕获效率可达到90％(Ma,Xu-Yan,et al.Enhanced and High-Purity Enrichment of Circulating Tumor Cells Based on Immunomagnetic Nanospheres.ACS Applied Nano Materials 1.8(2018):4019-4027.)。然而抗体与多 肽分子价格昂贵且容易失活，因此需要找寻成本低、简单有效的靶向分子极其重 要。本发明采用透明质酸作为靶标，功能化磁性
纳米材料作为基底，有效且特异 性地捕获CD44受体过表达的肿瘤细胞。
[0003] 常见的CTCs分离方法大多只用于CTCs的捕获和分离，分离出的CTCs难 以从分离基质上释放出来，从而不利于后续对CTCs的检测和分析。因此，对富 集的CTCs进行释放是CTCs分析和检测的关键步骤。目前释放CTCs的方式主 要有酶解释放、温
控释放、光控释放、化学竞争结合释放等。例如，Shen等将生 物素化的核酸适配体引入到有亲和素的芯片中，实现靶细胞的捕获，当加入核酸 内切酶时，有超过85％的细胞从基质表面解离，释放后约80％的细胞保持活
力 (Shen,Qinglin,et al.Specific Capture and Release ofCirculating Tumor Cells Using Aptamer-ModifiedNanosubstrates.Advanced Materials,2013,25.16:2368-2373.)。 Lv等采用聚N-异丙基丙烯酰胺
水凝胶作为温控释放目标细胞的基质，利用
氧化
石墨烯作为光照升温的介质，当升温到40℃时，有超过90％的细胞被释放出来 (Lv,Song-Wei,et al.Photoresponsive immunomagnetic nanocarrier for capture and release of rare circulating tumor cells.Chemical science,2015,6.11:6432-6438.)。然 而这些释放方法大部分具有侵袭性，可能损害细胞的完整性结构和干扰细胞微环 境。据报道，二硫键是一种对氧化还原极其敏感的连接剂，可以通过谷胱甘肽、 二硫苏二醇(DTT)或其他还原剂处理迅速断裂。本发明通过在功能化磁性纳米 材料中引入二硫键，采用DTT还原剂，实现CTCs的快速释放，并较好的保证细 胞的活性。
发明内容
[0004] 针对上述
现有技术存在的不足，本发明提供了一种特异性捕获和有效释放循 环肿瘤细胞的磁性纳米复合物及其制备方法，以期对
恶性肿瘤进行及时监测，并 为CTCs的诊断技术打下坚实的
基础。本发明提供反应条件温和、制备成本低的 有效捕获与释放循环肿瘤细胞的磁性(
荧光)纳米复合物Fe3O4@SiO2-SS-HA-(RhB) 的制备方法，该纳米复合物可以用于高效、快速的捕获与释放循环肿瘤细胞。
[0005] 为实现上述目的，本发明的方案如下：
[0006] 第一方面，本发明提供了一种特异性捕获和有效释放循环肿瘤细胞的磁性纳 米复合物，其特征在于：其分子结构如下所示：
[0007]
[0008] 第二方面，本发明提供了一种特异性捕获和有效释放循环肿瘤细胞的磁性纳 米复合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
[0009] (1)将四氧化三
铁、正
硅酸四乙酯、巯丙基三甲氧基硅烷混合，进行反应， 制得Fe3O4@SiO2-SH；
[0010] (2)将二硫二吡啶与Fe3O4@SiO2-SH反应，制得Fe3O4@SiO2-SSPy；
[0011] (3)将透明质酸、1-(3-甲
氨基丙基)-3-乙基
碳二亚胺
盐酸盐，N-羟基丁二酰 亚胺，半胱氨酸乙酯盐酸盐混合，进行反应。制得HA-Cys；
[0012] (4)将罗丹明接枝于HA-Cys上，制得RhB-HA-Cys；
[0013] (5)将磁性纳米粒子Fe3O4@SiO2-SSPy与HA-Cys或RhB-HA-Cys反应， 制备靶向功能磁性纳米复合物Fe3O4@SiO2-SS-HA-(RhB)。
[0014] 进一步地，步骤(1)具体过程为：向四氧化三铁溶液中加入超纯水、无水
乙醇，进行磁力搅拌，使其混合均匀，再加入浓
氨水和正
硅酸四乙酯(TEOS) 在40℃下反应4～24h，然后加入3-巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)，在60℃下 反应2～12h，将所得产物进行磁分离并用无水乙醇、超纯水洗涤，最终分散在超 纯水中，制得Fe3O4@SiO2-SH；其中，Fe3O4磁性纳米粒子可以采用本领域已经 披露的制备方法获得(Zhang,Yuting,et al.Fe3O4/PVIM-Ni2+magnetic composite microspheres for highly specific separation of histidine-rich proteins.ACS applied materials&interfaces 6.11(2014):8836-8844.)，Fe3O4、TEOS、MPTMS、浓氨水 的
质量比为1：(0.48～3.74)：(2.2～10.6)：(3.03～30.3)，超纯水与无水乙醇的体积 比为1：(1～4)。
[0015] 进一步地，步骤(2)具体过程为：向Fe3O4@SiO2-SH体系中加入酸调节其 pH为4～5，然后加入2,2’-二硫二吡啶，在室温下搅拌10～24h，磁分离并用甲醇 洗涤4次，最后分散在甲醇中；其中Fe3O4@SiO2-SH和2,2’-二硫二吡啶的质量 比为1：(0.5～10)，酸为
柠檬酸、盐酸或
醋酸。
[0016] 进一步地，步骤(3)具体过程为：将HA溶于超纯水中，加入EDC、NHS 将其羧基活化，然后加入半胱氨酸乙酯盐酸盐的水溶液，在室温下搅拌反应 12～48h，用分子量为1000D的
透析袋透析3天，得到半胱氨
酸化透明质酸复合物 (HA-Cys)；其中HA、EDC、NHS、半胱氨酸乙酯盐酸盐的摩尔比为1：1～5： 1～5：0.2～1。
[0017] 进一步地，步骤(4)具体过程为：将罗丹明B(RhB)溶于超纯水中，加入EDC活化羧基，在室温下搅拌0.5～4h后，加入HA水溶液以及4-二甲氨基吡啶 (DMAP)催化，反应10～48h，用分子量为1000D的透析袋透析直至透析出来 的溶液无色，得到罗丹明修饰的透明质酸复合物(RhB-HA)，然后同步骤(3)， 得到半胱氨酸化透明质酸荧光复合物(RhB-HA-Cys)；
其中RhB、EDC、DMAP、 HA的摩尔比为1：(1～5)：(0.1～3)：(0.5～2)。
[0018] 进一步地，步骤(5)具体过程为：将(RhB)-HA-Cys溶于超纯水中，然后加 入Fe3O4@SiO2-SSPy磁性纳米粒子，室温下磁搅拌反应20～28h，磁分离并用超 纯水洗涤3次，最后分散在超纯水中，制得磁性(荧光)纳米复合物 Fe3O4@SiO2-SS-HA-(RhB)；其中(RhB)-HA-Cys和Fe3O4@SiO2-SSPy的质量比为 1：(1～5)。
[0019] 相比较现有技术，本发明的优点及有益效果如下：
[0020] (1)该磁性(荧光)纳米复合物具有粒径分布窄，
稳定性高，磁响应性和
生物相容性好等优点，合成工艺简单，成本低廉，具有产业化实施的前景。
[0021] (2)本发明通过引入HA作为靶标用于CD44过表达的CTCs的捕获，可以 实现癌细胞的高效、快速捕获，Fe3O4@SiO2-SS-HA对MCF-7细胞的捕获效率达 到90％以上。
[0022] (3)本发明通过引入具有还原响应性的二硫键，采用DTT将捕获的肿瘤细 胞释放，其释放效率可达到52％，便于后续对CTCs的检测分析。
附图说明
[0023] 图1为Fe3O4@SiO2-SS-HA-(RhB)的合成示意图。
[0024] 图2为制备的磁性纳米粒子的结构表征示意图；
[0025] 图中：
[0026] a-d分别为Fe3O4,Fe3O4@SiO2-SH,Fe3O4@SiO2-SSPy,Fe3O4@SiO2-SS-HA的透射电镜(TEM)图(标尺为200nm)，e-h分别为Fe3O4,Fe3O4@SiO2-SH,Fe3O4@SiO2-SSPy,Fe3O4@SiO2-SS-HA的尺寸分布图(DLS)。
[0027] 图3为本发明
实施例制备的Fe3O4,Fe3O4@SiO2-SH,Fe3O4@SiO2-SSPy, Fe3O4@SiO2-SS-HA的Zeta电位图。
[0028] 图4为本发明实施例制备的HA-Cys
核磁共振氢谱图。
[0029] 图5为本发明实施例制备Fe3O4(1),Fe3O4@SiO2-SH(2),Fe3O4@SiO2-SSPy (3),Fe3O4@SiO2-SS-HA(4),HA(5),HA-Cys(6)的红外表征图。
[0030] 图6为本发明实施例制备的磁性纳米粒子Fe3O4、Fe3O4@SiO2-SS-HA的
磁滞 曲线图。
[0031] 图7为本发明实施例制备的Fe3O4@SiO2-SS-HA的光
电子能谱图(XPS)。
[0032] 图8为本发明实施制备的Fe3O4@SiO2-SS-HA-RhB荧光纳米粒子的倒置荧 光
显微镜图。
[0033] 图9为不同浓度Fe3O4@SiO2-SS-HA(10～400ug/ml)对MCF-7和U87MG的 生物相容性结果图。
[0034] 图10为不同浓度Fe3O4@SiO2-SS-HA对MCF-7捕获率结果图。
[0035] 图11为Fe3O4@SiO2-SS-HA与MCF-7孵育不同时间后的捕获率结果图。
[0036] 图12为癌细胞的捕获效率图；
[0037] 图中：1为Fe3O4@SiO2-SS-HA对MCF-7的捕获效率；2为Fe3O4@SiO2-SSPy对MCF-7的捕获效率；3为Fe3O4@SiO2-SS-HA对U87MG的捕获效率。
[0038] 图13为不同浓度Fe3O4@SiO2-SS-HA捕获MCF-7状态图(a-100ug/ml， b-200ug/ml，c-300ug/ml，d-400ug/ml)
[0039] 图14为DTT浓度对MCF-7释放效率的影响结果图。
[0040] 图15为孵育时间对MCF-7释放效率的影响结果图。
具体实施方式
[0041] 本发明特异性捕获和有效释放循环肿瘤细胞的磁性纳米复合物的制备方法， 如图1所示，首先以磁性Fe3O4纳米粒子为核，通过TEOS、3-巯丙基三甲氧基 硅烷(MPTMS)在其表面引入巯基官能团，再加入2,2’-二硫二吡啶进行配体交 换，构建出二硫二吡啶化四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4@SiO2-SSPy)(图1a)。其 次，通过采用EDC/NHS法活化透明质酸上大量的羧基，然后与半胱氨酸乙酯盐 酸盐反应，生成HA-Cys复合物，透明质酸也可以与罗丹明反应后再与半胱氨酸 乙酯盐酸盐反应，制备RhB-HA-Cys复合物(图1b)。最后，将Fe3O4@SiO2-SSPy 与HA-Cys(RhB-HA-Cys)进行配体交换，得到磁性(荧光)纳米复合物 Fe3O4@SiO2-SS-HA-(RhB)。
[0042] 为了对本发明提供的技术方案更加清楚，下面结合附图和实施例给出更加详 细的说明和解释。
[0043] 实施例1二硫二吡啶化四氧化三铁(Fe3O4@SiO2-SSPy)的制备
[0044] 取2ml Fe3O4纳米粒子(30mg/ml)溶液，进行磁分离后，加入60ml无水乙 醇和15ml超纯水，磁搅拌使其混合均匀，再加入1ml浓氨水，然后每隔半小时 加入20ul正硅酸四乙酯(TEOS)，总共加3次，在40℃下反应12h，之后加入200ul浓氨水和200ul巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)，在60℃下反应6h，将所 得产物磁分离并用无水乙醇洗涤3-4次，最后分散在无水乙醇中，制得 Fe3O4@SiO2-SH分散液(10mg/ml)。
[0045] 取1ml Fe3O4@SiO2-SH溶液进行磁分离后分散在10ml甲醇中，用醋酸调节 其pH至4-5，然后加入2ml、5mg/ml的2,2’-二硫二吡啶甲醇溶液，在室温下搅 拌10h，磁分离并用甲醇洗涤4次，最后分散在甲醇中，制得Fe3O4@SiO2-SSPy 的甲醇分散液(10mg/ml)。
[0046] 实施例2半胱氨酸(Cys)化的透明质酸(HA-Cys)的制备。
[0047] 将透明质酸HA(Mw＝31000D，310mg，0.8mmol-COOH)溶于20ml超纯水 中，然后加入1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC(766.8mg，4mmol) 搅拌0.5h，然后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS(460.36mg，4mmol)，搅拌1.5h， 然后加入半胱氨酸乙酯盐酸盐(29.70mg，
0.16mmol)，室温反应24h后将反应液 转移至透析袋(1000D)中，用超纯水透析3天，
冷冻干燥得到HA-Cys复合物。
[0048] 将RhB(95.8mg，0.2mmol)溶于10ml超纯水中，加入EDC(38.34mg， 0.2mmol)，搅拌半个小时后加入HA(155mg,0.4mmol)水溶液，然后加入DMAP (25mg，0.2mmol)，室温反应过夜将所得反应液透析以除去未反应的反应物， 用超纯水透析3天，冻干后低温避光保存，之后将HA-RhB(61.06mg， 0.0727mmol)溶于10ml超纯水中，加入EDC(69.66mg,0.36mmol)搅拌半个小时 后，加入NHS(41.82mg,0.36mmol)，搅拌1.5h，然后加入半胱氨酸乙酯盐酸盐 (13.50mg，0.0727mmol)，室温反应24h后将反应液转移至透析袋(1000D)中， 用超纯水透析3天，冷冻干燥得到RhB-HA-Cys复合物。
[0049] 实施例3磁性(荧光)纳米复合物Fe3O4@SiO2-SS-HA-(RhB)的制备。
[0050] 取上述制备的HA-Cys(RhB-HA-Cys)溶于20ml超纯水中，待完全溶解后， 磁力搅拌下加入3ml(10mg/ml)Fe3O4@SiO2-SSPy溶液，室温反应48h后，磁 分离并用超纯水洗涤产品数次，冷冻干燥得到Fe3O4@SiO2-SS-HA-(RhB)纳米粒 子。
[0051] TEM图显示，Fe3O4,Fe3O4@SiO2-SH,Fe3O4@SiO2-SSPy,Fe3O4@SiO2-SS-HA 纳米粒子均为球形，大小均一，且MPTMS(b)、SSPy(c)、HA(d)已经成功 地修饰到Fe3O4磁性纳米粒子表面(图2a-d)，所得Fe3O4@SiO2-SS-HA粒径分布 在100-300nm之间。DLS结果显示，Fe3O4、Fe3O4@SiO2-SH、Fe3O4@SiO2-SSPy、 Fe3O4@SiO2-SS-HA平均粒径分别为242.9±4.2nm，390.2±7.0nm，465.2± 12.5nm，581.5±51.5nm(图2e-h)，随着Fe3O4纳米粒子表面的修饰，平均粒径 逐渐增大。如图3所示，Fe3O4、Fe3O4@SiO2-SH、Fe3O4@SiO2-SSPy、 Fe3O4@SiO2-SS-HA的Zeta电位分别为-8.54mV、-47mV、-21.7mV和-29mV， 随着Fe3O4纳米粒子表面不同基团的修饰，Zeta电位发生了变化。如图4所示， 从HA-Cys的氢谱图可以看出，3.20ppm到3.75ppm的峰代表了透明质酸上的 H2-H11的质子峰,1.86ppm处是透明质酸H12的甲基质子峰，1.24ppm处代表了 半胱氨酸乙酯盐酸盐(H-Cys-Oet.HCl)的甲基质子峰，结果证实了HA-Cys复合 物成功合成。
[0052] 如图5红外谱图所示，从曲线1可以看出，587.80cm-1处的特征峰为Fe-O 的伸缩振动。曲线2中，1088.23cm-1和793.82cm-1的吸收峰对应为Si-O-Si的不 对称与对称伸缩振动峰，454.62cm-1处是O-Si-O的弯曲振动吸收峰。与曲线1 相比，曲线2在2972.85cm-1和2928.28cm-1处出现了新的吸收峰，这是MPTMS
试剂中-CH2的反对称伸缩振动峰，说明MPTMS成功修饰到Fe3O4@SiO2表面。 采用二硫二吡啶修饰后，曲线3在1577.39cm-1处出现了一个新的吸收峰，其对 应为吡啶环吸收峰。曲线5为纯HA的红外谱图，3271.06cm-1与1031.37cm-1代 表HA上的-OH特征峰。相比于曲线5，曲线6在1737.95cm-1处出现新峰，其对 应为半胱氨酸乙酯盐酸盐的酯基吸收峰，表明HA-Cys
聚合物成功合成。曲线4 在587.71cm-1和-1
467.81cm 出现了Fe-O、O-Si-O新峰，这表明 Fe3O4@SiO2-SS-HA-(RhB)的成功合成。图6为Fe3O4和Fe3O4@SiO2-SS-HA的磁 滞曲线图，从图中可以发现两种粒子都具有较高饱和磁化强度，而修饰后的 Fe3O4@SiO2-SS-HA磁化能力较单独的Fe3O4弱。Fe3O4@SiO2-SS-HA的XPS谱 图证实了Fe、S、N、Si、O元素的存在(图7)。倒置荧光显微镜图显示罗丹明 修饰的透明质酸成功包裹在磁性纳米粒子表面(图8)。
[0053] 综上所述，所制备的具有
核壳结构Fe3O4@SiO2-SS-HA-(RhB)纳米粒子具有 优异的磁响应能力，表面修饰的透明质酸可以特异性靶向CD44过表达的MCF-7 细胞，进而为CTCs的体外识别与检测提供可能。
[0054] 实施例4材料的生物相容性实验
[0055] 具体步骤和过程简述如下:收集对数期MCF-7以及U87MG细胞，用相应的 培养基稀释到细胞密度为12万/ml。然后取96孔板，每孔加入100ul的细胞悬液， 设置对照组和调零组在
培养箱中孵育过夜，至细胞
单层铺满孔底，去掉100ul培 养基，加入100ul溶于培养基的浓度梯度材料(10ug/ml；50ug/ml；100ug/ml； 200ug/ml；400ug/ml)，以及调零组，空白组，同时对其设置5个复孔，减少误 差。共同孵育24h，然后取出96孔板，用PBS洗涤一次后，再加培养基，每孔 加入20ul MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h，然后终止培养，用吸管小心吸出 孔内的培养液，然后分别加入150ul二甲亚砜，置于摇床上低速振荡10min (100r/min)，使结晶充分溶解，用酶标仪检测在490nm处各孔的吸光值。
[0056] 细胞存活率通过以下公式计算得到：
[0057]
[0058] 其中 为各个样品组对应调零孔的吸光度平均值； 为对 照组对应的调零孔的吸光度平均值。
[0059] 图9为不同浓度Fe3O4@SiO2-SS-HA(10～400ug/ml)对MCF-7和U87MG的 生物相容性结果图，结果表明，当Fe3O4@SiO2-SS-HA的浓度增至400ug/ml时， 两种细胞的存活率仍在80％以上，说明具有较好的生物相容性。
[0060] 实施例5细胞捕获与特异性实验
[0061] 具体步骤和过程简述如下：研究不同浓度Fe3O4@SiO2-SS-HA纳米材料对癌 细胞的捕获效率。取500ul(约2×105个/ml)MCF-7细胞悬液于2ml离心管中； 然后与含不同质量(100ug，200ug，300ug，400ug)的Fe3O4@SiO2-SS-HA纳 米材料悬浮液(500ul)进行混合；随后将离心管置于转速为150rpm的摇床中, 室温下保持30min；之后用
磁铁快速(1min)分离出上清液，并用PBS洗涤3次， 然后用血球计数板对上清中剩余细胞计数。
[0062] 研究不同孵育时间对癌细胞的捕获效率。取500ul(约2×105个/ml)MCF-7 细胞悬液于2ml离心管中；然后与300ug的Fe3O4@SiO2-SS-HA纳米材料悬浮 液(500ul)进行混合；随后将离心管置于摇床中，室温下保持不同时间(10min， 20min，30min，40min，50min)；之后用磁铁快速(1min)分离出上清液，并用 PBS洗涤3次，然后用血球计数板对上清中剩余细胞计数。
[0063] 通过CD44过表达的MCF-7细胞与低表达U87MG细胞，来探究 Fe3O4@SiO2-SS-HA纳米复合物对肿瘤细胞捕获的特异性，具体步骤如下：分别 取500ul(约2×105个/ml)MCF-7细胞悬液以及U87MG细胞悬液于2ml离心管 中，加入300ug Fe3O4@SiO2-SS-HA纳米材料悬浮液(500ul)进行混合；随后将 离心管置于摇床中，室温下保持10min；之后用磁铁快速(1min)分离出上清液， 并用PBS洗涤3次，然后用血球计数板对上清中剩余细胞计数。
[0064] 通过对比Fe3O4@SiO2-SS-HA与Fe3O4@SiO2-SSPy纳米材料探究纳米材料的 特异性，具体步骤如下：分别取500ul(约2×105个/ml)MCF-7细胞悬液于2ml离 心管中，分别加入300ug Fe3O4@SiO2-SS-HA和Fe3O4@SiO2-SSPy纳米材料悬浮 液(500ul)进行混合；随后将离心管置于摇床中,室温下保持10min；之后用磁 铁快速(1min)分离出上清液，并用PBS洗涤3次，然后用血球计数板对上清 中剩余细胞计数。
[0065] 细胞捕获率通过以下公式计算得到：
[0066] 细胞捕获率/％＝(总细胞数-上清细胞数)/(总细胞数)＊100％
[0067] 图10为Fe3O4@SiO2-SS-HA浓度对MCF-7捕获率影响，结果表明，当 Fe3O4@SiO2-SS-HA浓度超过300ug/ml时，Fe3O4@SiO2-SS-HA对MCF-7细胞的 捕获效率不再增加，因此Fe3O4@SiO2-SS-HA的浓度应以300ug/ml为宜；当材料 与癌细胞孵育时间不同时，捕获效率没有明显变化，孵育10min后其捕获效率均 能达到90％以上(图11)；如图12所示，Fe3O4@SiO2-SS-HA纳米复合物对目 的细胞MCF-7具有特异性捕获能力，其捕获能力大于Fe3O4@SiO2-SSPy。图13 为不同浓度Fe3O4@SiO2-SS-HA对MCF-7捕获效果的明场图，其中a,b,c,d分 别为
100ug/ml，200ug/ml，300ug/ml和400ug/ml浓度下与MCF-7孵育10min后 的状态图，可以看出，随着材料加入量的增加，捕获的MCF-7细胞数目逐渐增 加。
[0068] 实施例6细胞释放实验
[0069] 具体步骤和过程简述如下：研究不同浓度DTT溶液对癌细胞的释放效率。 将1ml不同浓度的DTT溶液(10，30，50，70和90mM)加入到上述捕获细胞 的纳米复合物中，然后置于摇床中，室温下保持40min，然后用磁铁快速(1min) 分离出上清，并用PBS洗涤3次，用血球计数板对上清中细胞计数。
[0070] 研究不同孵育时间对癌细胞的释放效率。将1ml、70mM的DTT溶液加入 到上述捕获细胞的纳米复合物中，然后置于摇床中，在室温下保持不同时间 (10min，20min，30min，40min和50min)，然后用磁铁快速(1min)分离出上 清，并用PBS洗涤3次，用血球计数板对上清中细胞计数。
[0071] 细胞释放率通过以下公式计算得到：
[0072] 细胞释放率/％＝(释放细胞数)/(总细胞数-未捕获细胞数)＊100％
[0073] 如图14所示，当DTT浓度达到70mM的时候，细胞释放率达到52％；如图 15所示，当孵育时间为40min的时候，细胞释放效率达到53％，说明 Fe3O4@SiO2-SS-HA纳米复合物具有捕获后释放的能力。
