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一种无血清无DMSO细胞冻存液及其制备方法

阅读：82发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种无血清无DMSO细胞冻存液及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种无血清无DMSO的细胞冻存液，其组成包括：DMEM/F-12 基础培养基16.762-16.825g/L，细胞因子32-34mg/L、羟乙基淀粉 0.2-0.8mg/L、维生素1-3mg/L、抗生素0.15-0.16g/L、蛋白多肽5-6mg/L、脂类1-4mg/L、细胞内外冷冻保护剂 0.1-0.41g/L。本申请技术方案获得的不包含血清也不添加DMSO成分的细胞冻存液，且此溶液配方成分确定，具备非常高的生物安全性和临床应用前景。同时，此细胞冻存液具有85％以上的细胞复苏成活率，并能够维持良好的细胞活性和生理特性，非常适用于原代细胞及干细胞的相关研究领域。，下面是一种无血清无DMSO细胞冻存液及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种无血清无DMSO的细胞冻存液，其组成包括：DMEM/F-12基础培养基16.762-
16.825g/L、细胞因子32-34mg/L、羟乙基淀粉0.2-0.8mg/L、维生素1-3mg/L、抗生素0.15-
0.16g/L、蛋白多肽5-6mg/L、脂类1-4mg/L、细胞内外冷冻保护剂0.1-0.41g/L。
2.根据权利要求1所述的一种无血清无DMSO的细胞冻存液，其特征在于：所述的细胞因子，按质量百分含量，其组成为：胰岛素99.955％、重组人表皮细胞生长因子0.03％、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.015％。
3.根据权利要求1所述的一种无血清无DMSO的细胞冻存液，其特征在于：所述的抗生素为青霉素和链霉素，所述的青霉素含量为0.06g/L，所述的链霉素含量为0.1g/L。
4.根据权利要求1所述的一种无血清无DMSO的细胞冻存液，其特征在于：所述的维生素为维生素C。
5.根据权利要求1所述的一种无血清无DMSO的细胞冻存液，其特征在于：所述的蛋白多肽为白蛋白和转铁蛋白，所述的白蛋白的加入量为0.1-0.8μg/L，所述的转铁蛋白的加入量为5.1-5.2mg/L。
6.根据权利要求1所述的一种无血清无DMSO的细胞冻存液，其特征在于：所述的脂类为乙醇胺和亚油酸，所述的乙醇胺加入量为1-3mg/L，所述的亚油酸的加入量为2-6μg/L。
7.根据权利要求1所述的一种无血清无DMSO的细胞冻存液，其特征在于：所述的细胞内外的冷冻保护剂为海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和甲基纤维素；所述的海藻糖的加入量为
0.034-0.102g/L，所述的聚乙烯吡咯烷酮加入量为0.2-0.8mg/L，所述的甲基纤维素加入量为0.1-0.3g/L。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种无血清无DMSO的细胞冻存液，其特征在于：所述的无血清无DMSO细胞冻存液，其组分含量为：无水氯化钙110-116.6mg/L，L-亮氨酸55-
59.05mg/L，亚油酸0.03-0.042mg/L，五水硫酸铜0.0012-0.0013mg/L，L-赖氨酸盐酸盐90-
91.25mg/L，硫辛酸0.08-0.105mg/L，九水硝酸铁0.02-0.05mg/L，L-蛋氨酸15.00-17.24mg/L，酚红6.5-8.1mg/L，七水硫酸亚铁0.35-0.417mg/L，L-苯丙氨酸33-35.48mg/L，1，4-丁二胺二盐酸盐0.07-0.081mg/L，氯化钾280-311.8mg/L，L-丝氨酸24-26.25mg/L，丙酮酸钠53-
55mg/L，氯化镁26.2-28.64mg/L，苏氨酸50.3-53.45mg/L，维生素H 0.0035-0.005mg/L，无水硫酸镁47-48.84mg/L，丙氨酸4.45-4.50mg/L，泛酸钙2.24-3.2mg/L，氯化钠6500-
6999.5mg/L，L-天门冬酰胺7.5-8.3mg/L，氯化胆碱7.88-8.98mg/L，无水磷酸二氢钠51.2-
54.35mg/L，天门冬氨酸5.59-6.65mg/L，叶酸2.65-3.25mg/L，磷酸氢二钠69.5-71.02mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐16.88-17.56mg/L，I-肌醇11.3-12.6mg/L，七水硫酸锌0.432-0.551mg/L，谷氨酸7.35-8.06mg/L，烟酰胺2.02-2.45mg/L，L-精氨酸盐酸盐145-147.5mg/L，L-脯氨酸15.9-17.25mg/L，盐酸吡哆醛1-2mg/L，L-胱氨酸盐酸盐31.29-32.85mg/L，L-色氨酸
9.02-9.57mg/L，盐酸吡哆醇0.031-0.036mg/L，L-谷氨酰胺365-378mg/L，L-酪氨酸38.4-
39.1mg/L，核黄素0.219-0.233mg/L，甘氨酸18.75-19.11mg/L，L-颉氨酸52.85-53.31mg/L，盐酸硫胺2.17-2.22mg/L，L-组氨酸盐酸盐31.48-32.10mg/L，D-葡萄糖3151-3230mg/L，胸苷0.365-0.445mg/L，L-异亮氨酸54.47-55.2mg/L，次黄嘌呤1.55-2.03mg/L，维生素B12
0.63-0.68mg/L，胰岛素8-12mg/L，转铁蛋白5-6mg/L，乙醇胺1-3mg/L，亚油酸2-6μg/L，白蛋白0.1-0.8μg/L，重组人表皮细胞生长因子0.1-0.5μg/L，氢化可的松0.3-0.4mg/L，青霉素
0.06g/L，链霉素0.1g/L，维生素C 1-3mg/L，甜菜碱0.05-3mg/L，海藻糖0.1-0.3mM/L，甲基纤维素0.1-0.3g/L，碳酸氢钠10-12.75mg/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.1-0.2μg/L，羟乙基淀粉0.2-0.8mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.2-0.8mg/L。
9.根据权利要求8所述的一种无血清无DMSO的细胞冻存液，其特征在于：所述的无血清无DMSO细胞冻存液，其组分含量为：无水氯化钙116.6mg/L，L-亮氨酸59.05mg/L，亚油酸
0.042mg/L，五水硫酸铜00013mg/L，L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L，硫辛酸0.105mg/L，九水硝酸铁0.05mg/L，L-蛋氨酸17.24mg/L，酚红8.1mg/L，七水硫酸亚铁0.417mg/L，L-苯丙氨酸
35.48mg/L，1，4-丁二胺二盐酸盐0.081mg/L，氯化钾311.8mg/L，L-丝氨酸26.25mg/L，丙酮酸钠55mg/L，氯化镁28.64mg/L，苏氨酸53.45mg/L，维生素H0.0035mg/L，无水硫酸镁
48.84mg/L，丙氨酸4.45mg/L，泛酸钙2.24mg/L，氯化钠6999.5mg/L，L-天门冬酰胺7.5mg/L，氯化胆碱8.98mg/L，无水磷酸二氢钠54.35mg/L，天门冬氨酸6.65mg/L，叶酸2.65mg/L，磷酸氢二钠71.02mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L，I-肌醇12.6mg/L，七水硫酸锌0.432mg/L，谷氨酸7.35mg/L，烟酰胺2.02mg/L，L-精氨酸盐酸盐147.5mg/L，L-脯氨酸17.25mg/L，盐酸吡哆醛2mg/L，L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L，L-色氨酸9.02mg/L，盐酸吡哆醇0.031mg/L，L-谷氨酰胺365mg/L，L-酪氨酸38.4mg/L，核黄素0.219mg/L，甘氨酸18.75mg/L，L-颉氨酸
52.85mg/L，盐酸硫胺2.17mg/L，L-组氨酸盐酸盐31.48mg/L，D-葡萄糖3151mg/L，胸苷
0.365mg/L，L-异亮氨酸54.47mg/L，次黄嘌呤2mg/L，维生素B12 0.68mg/L，胰岛素8-12mg/L，转铁蛋白5-6mg/L，乙醇胺1-3mg/L，亚油酸2-6μg/L，白蛋白0.1-0.8μg/L，重组人表皮细胞生长因子0.1-0.2μg/L，氢化可的松0.3-0.4mg/L，青霉素0.06g/L，链霉素0.1g/L，维生素C 1-3mg/L，甜菜碱0.05-3mg/L，海藻糖0.1-0.3mM/L，甲基纤维素0.1-0.3g/L，碳酸氢钠10-
12.75mg/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.1-0.2μg/L，羟乙基淀粉0.2-0.8mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.4-0.8mg/L。
10.权利要求1-9所述的一种无血清无DMSO的细胞冻存液的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)在cGMP洁净级车间里，以DMEM/F-12为基础培养基，然后逐步添加青霉素和链霉素、重组人表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子、乙醇胺、甜菜碱、白蛋白、维生素C、以及羟乙基淀粉，最后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液将pH调至7.4±0.1，然后按比例分别添加细胞内外的冷冻保护剂成分，混合均匀；
2)将步骤1)中所得的溶液用孔径≤0.1μm的滤器进行过滤灭菌处理，即得到无血清无DMSO的细胞冻存液。

说明书全文

一种无血清无DMSO细胞冻存液及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种无血清无DMSO细胞冻存液及其制备方法。

背景技术

[0002] 定义培养动物细胞生存和增殖所必需的培养基成分一直是一个非常活跃的研究领域。由最初的简单盐离子形成的培养基发展到在基础培养基中加入了多种生物因子。Eagle和他的同伴发现氨基酸和维生素是体外培养哺乳动物细胞所必需的。后来，大部分合成培养基中都会加入血清来支持细胞体外生存和增殖状态。但是血清大多取自外源的胎牛血清，对于一般的哺乳动物细胞培养而言，只要能够保持细胞的生长状态就表明该合成培养基是能够用于细胞的培养。

[0003] 随着医疗技术的发展，细胞治疗手段的进步，体外细胞培养的要求也越来越高。无血清的细胞培养基和冻存液一方面可以避免动物源成分和过敏源的引入，且血清成分未知会对细胞的生长和分化产生不可预测的影响，另一方面能够在明确已知成分的培养条件下进行人类自体细胞培养，因此，医疗科研领域对于无血清细胞培养基和冻存液的研发极其重要，也为后续基因编辑和个体化细胞治疗提供必要的技术基础。早期研究发现在Hela细胞的培养过程中，培养基中添加荷尔蒙、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、重组人表皮细胞生长因子和成纤维生长因子可以代替血清。但是这只是无血清细胞培养基和细胞冻存液的研究雏形。许多哺乳动物细胞，尤其是原代细胞，只有这些因子是远远不能够支持细胞的生长需求的。

[0004] 而无血清细胞冻存液是在无血清细胞培养基的基础上，通过添加一定的冷冻保护剂，避免冷冻过程中产生冰晶对细胞造成致命的伤害，进而提高细胞的存活效率。此外，研究表明，传统细胞冻存液中经常使用的冷冻保护剂二甲亚砜(DMSO)在后续细胞复苏的过程中，残存的DMSO会对干细胞的分化潜能产生影响，在一定程度上降低了干细胞的全能性，因此，改变了干细胞的特性。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种细胞冻存后复苏活性85％以上、细胞表型基本没有变化、能保持细胞复苏后的生理功能和生物学特性的无血清无DMSO的细胞冻存液。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种无血清无DMSO 的细胞冻存液，其组成包括：DMEM/F-12基础培养基16.762-16.825g/L，细胞因子32-34mg/L、羟乙基淀粉0.2-0.8mg/L、维生素1-3mg/L、抗生素 0.15-0.16g/L、蛋白多肽5-6mg/L、脂类1-4mg/L、细胞内外冷冻保护剂 0.1-0.41g/L。

[0007] 优选的，所述的细胞因子，按质量百分含量，其组成为：胰岛素99.955％、重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.03％、重组人碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)0.015％。

[0008] 优选的，所述的抗生素为青霉素和链霉素，所述的青霉素含量为0.06g/L，所述的链霉素含量为0.1g/L。

[0009] 优选的，所述的维生素为维生素C。

[0010] 优选的，所述的蛋白多肽为白蛋白和转铁蛋白，其中，所述的白蛋白的加入量为0.1-0.8μg/L，所述的转铁蛋白的加入量为5.1-5.2mg/L。

[0011] 优选的，所述的脂类为乙醇胺和亚油酸，乙醇胺与亚油酸的总量比例按照 1:500进行添加，当所述的乙醇胺加入量为1-3mg/L，所述的亚油酸的加入量为2-6μg/L。

[0012] 优选的，所述的细胞内外的冷冻保护剂为海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和甲基纤维素，所述的海藻糖的加入量为0.034-0.102g/L，所述的聚乙烯吡咯烷酮加入量为0.2-0.8mg/L，所述的甲基纤维素加入量为0.1-0.3g/L。

[0013] 优选的，所述的无血清无DMSO细胞冻存液，其组分含量为：无水氯化钙110-116.6mg/L，L-亮氨酸55-59.05mg/L，亚油酸0.03-0.042mg/L，五水硫酸铜0.0012-
0.0013mg/L，L-赖氨酸盐酸盐90-91.25mg/L，硫辛酸 0.08-0.105mg/L，九水硝酸铁0.02-
0.05mg/L，L-蛋氨酸15.00-17.24mg/L，酚红6.5-8.1mg/L，七水硫酸亚铁0.35-0.417mg/L，L-苯丙氨酸33-35.48mg/L，1， 4-丁二胺二盐酸盐0.07-0.081mg/L，氯化钾280-311.8mg/L，L-丝氨酸 24-26.25mg/L，丙酮酸钠53-55mg/L，氯化镁26.2-28.64mg/L，苏氨酸 50.3-
53.45mg/L，维生素H 0.0035-0.005mg/L，无水硫酸镁47-48.84mg/L，丙氨酸4.45-4.50mg/L，泛酸钙2.24-3.2mg/L，氯化钠6500-6999.5mg/L，L-天门冬酰胺7.5-8.3mg/L，氯化胆碱
7.88-8.98mg/L，无水磷酸二氢钠 51.2-54.35mg/L，天门冬氨酸5.59-6.65mg/L，叶酸2.65-
3.25mg/L，磷酸氢二钠69.5-71.02mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐16.88-17.56mg/L，I-肌醇
11.3-12.6mg/L，七水硫酸锌0.432-0.551mg/L，谷氨酸7.35-8.06mg/L，烟酰胺 2.02-
2.45mg/L，L-精氨酸盐酸盐145-147.5mg/L，L-脯氨酸15.9-17.25mg/L，盐酸吡哆醛1-2mg/L，L-胱氨酸盐酸盐31.29-32.85mg/L，L-色氨酸 9.02-9.57mg/L，盐酸吡哆醇0.031-
0.036mg/L，L-谷氨酰胺365-378mg/L，L- 酪氨酸38.4-39.1mg/L，核黄素0.219-0.233mg/L，甘氨酸18.75-19.11mg/L， L-颉氨酸52.85-53.31mg/L，盐酸硫胺2.17-2.22mg/L，L-组氨酸盐酸盐 31.48-32.10mg/L，D-葡萄糖3151-3230mg/L，胸苷0.365-0.445mg/L，L-异亮氨酸
54.47-55.2mg/L，次黄嘌呤1.55-2.03mg/L，维生素B12 0.63-0.68mg/L，胰岛素8-12mg/L，转铁蛋白5-6mg/L，乙醇胺1-3mg/L，亚油酸2-6μg/L，白蛋白0.1-0.8μg/L，重组人表皮细胞生长因子0.1-0.5μg/L，氢化可的松 0.3-0.4mg/L，青霉素0.06g/L，链霉素0.1g/L，维生素C1-3mg/L，甜菜碱 0.05-3mg/L，海藻糖0.1-0.3mM/L，甲基纤维素0.1-0.3g/L，碳酸氢钠
10-12.75mg/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.1-0.2μg/L，羟乙基淀粉 0.2-0.8mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.2-0.8mg/L。

[0014] 进一步优选的，所述的无血清无DMSO细胞冻存液，其组分含量为：无水氯化钙116.6mg/L，L-亮氨酸59.05mg/L，亚油酸0.042mg/L，五水硫酸铜 00013mg/L，L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L，硫辛酸0.105mg/L，九水硝酸铁 0.05mg/L，L-蛋氨酸17.24mg/L，酚红8.1mg/L，七水硫酸亚铁0.417mg/L， L-苯丙氨酸35.48mg/L，1，4-丁二胺二盐酸盐0.081mg/L，氯化钾311.8mg/L， L-丝氨酸26.25mg/L，丙酮酸钠55mg/L，氯化镁28.64mg/L，苏氨酸 53.45mg/L，维生素H 0.0035mg/L，无水硫酸镁48.84mg/L，丙氨酸4.45mg/L，泛酸钙2.24mg/L，氯化钠
6999.5mg/L，L-天门冬酰胺7.5mg/L，氯化胆碱 8.98mg/L，无水磷酸二氢钠54.35mg/L，天门冬氨酸6.65mg/L，叶酸2.65mg/L，磷酸氢二钠71.02mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L，I-肌醇12.6mg/L，七水硫酸锌0.432mg/L，谷氨酸7.35mg/L，烟酰胺2.02mg/L，L-精氨酸盐酸盐
147.5mg/L，L-脯氨酸17.25mg/L，盐酸吡哆醛2mg/L，L-胱氨酸盐酸盐 31.29mg/L，L-色氨酸
9.02mg/L，盐酸吡哆醇0.031mg/L，L-谷氨酰胺365mg/L，L-酪氨酸38.4mg/L，核黄素
0.219mg/L，甘氨酸18.75mg/L，L-颉氨酸52.85mg/L，盐酸硫胺2.17mg/L，L-组氨酸盐酸盐
31.48mg/L，D-葡萄糖 3151mg/L，胸苷0.365mg/L，L-异亮氨酸54.47mg/L，次黄嘌呤2mg/L，维生素B12 0.68mg/L，胰岛素8-12mg/L，转铁蛋白5-6mg/L，乙醇胺1-3mg/L，亚油酸2-6μg/L，白蛋白0.1-0.8μg/L，重组人表皮细胞生长因子0.1-0.2μg/L，氢化可的松0.3-0.4mg/L，青霉素0.06g/L，链霉素0.1g/L，维生素C1-3mg/L，甜菜碱0.05-3mg/L，海藻糖0.1-0.3mM/L，甲基纤维素0.1-0.3g/L，碳酸氢钠 10-12.75mg/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.1-
0.2μg/L，羟乙基淀粉 0.2-0.8mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.4-0.8mg/L。

[0015] 本发明所要解决的第二个技术问题是：提供了一种无血清无DMSO细胞冻存液的制备方法。

[0016] 为解决第二个技术问题，提供的技术方案是：一种无血清无DMSO细胞冻存液的制备方法，该方法包括以下步骤：

[0017] 1)在cGMP洁净级车间里，以DMEM/F-12为基础培养基，然后逐步添加青霉素和链霉素、重组人表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子、乙醇胺、甜菜碱、白蛋白、维生素C、以及羟乙基淀粉，最后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液将pH调至7.4±0.1，然后按比例分别添加细胞内外的冷冻保护剂成分，混合均匀；

[0018] 2)将步骤1)中所得的溶液用孔径≤0.1μm的滤器进行过滤灭菌处理，即得到无血清无DMSO的细胞冻存液。

[0019] 有益效果：本申请技术方案获得的不包含血清也不添加DMSO成分的细胞冻存液，且此溶液配方成分确定，具备非常高的生物安全性和临床应用前景。同时，此细胞冻存液具有85％以上的细胞复苏成活率，并能够维持良好的细胞活性和生理特性，非常适用于原代细胞及干细胞的相关研究领域。

[0020] 所述的无血清无DMSO的细胞冻存液安全有效，成分明确，制备方法简便，成本可控，具备良好的临床应用前景，可用于继续培养或临床细胞体外培养后直接回输。附图说明

[0021] 图1是人脐带间充质干细胞复苏后的光镜图。

[0022] 图2是人脐带间充质干细胞复苏后经CCK-8 试剂盒检测细胞的增殖状态。

[0023] 图3是人脐带间充质干细胞诱导成脂分化情况光镜图。

[0024] 图4是人脐带间充质干细胞诱导成软骨分化情况光镜图。

具体实施方式

[0025] 实施例1

[0026] 所述的无血清无DMSO细胞冻存液，其组分含量为：无水氯化钙 116.6mg/L，L-亮氨酸59.05mg/L，亚油酸0.042mg/L，五水硫酸铜00013mg/L，L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L，硫辛酸0.105mg/L，九水硝酸铁0.05mg/L，L- 蛋氨酸17.24mg/L，酚红8.1mg/L，七水硫酸亚铁0.417mg/L，L-苯丙氨酸 35.48mg/L，1，4-丁二胺二盐酸盐0.081mg/L，氯化钾311.8mg/L，L-丝氨酸 26.25mg/L，丙酮酸钠55mg/L，氯化镁28.64mg/L，苏氨酸53.45mg/L，维生素H
0.0035mg/L，无水硫酸镁48.84mg/L，丙氨酸4.45mg/L，泛酸钙 2.24mg/L，氯化钠6999.5mg/L，L-天门冬酰胺7.5mg/L，氯化胆碱8.98mg/L，无水磷酸二氢钠54.35mg/L，天门冬氨酸
6.65mg/L，叶酸2.65mg/L，磷酸氢二钠71.02mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L，I-肌醇
12.6mg/L，七水硫酸锌0.432mg/L，谷氨酸7.35mg/L，烟酰胺2.02mg/L，L-精氨酸盐酸盐
147.5mg/L，L-脯氨酸17.25mg/L，盐酸吡哆醛2mg/L，L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L，L-色氨酸
9.02mg/L，盐酸吡哆醇0.031mg/L，L-谷氨酰胺 365mg/L，L-酪氨酸38.4mg/L，核黄素
0.219mg/L，甘氨酸18.75mg/L，L-颉氨酸52.85mg/L，盐酸硫胺2.17mg/L，L-组氨酸盐酸盐
31.48mg/L，D-葡萄糖 3151mg/L，胸苷0.365mg/L，L-异亮氨酸54.47mg/L，次黄嘌呤2mg/L，维生素B12 0.68mg/L，胰岛素10mg/L，转铁蛋白5mg/L，乙醇胺1mg/L，亚油酸2μg/L，白蛋白
0.8μg/L，重组人表皮细胞生长因子0.2μg/L，氢化可的松 0.3mg/L，青霉素0.06g/L，链霉素
0.1g/L，维生素C1mg/L，甜菜碱1mg/L，海藻糖0.3mM/L，甲基纤维素0.3g/L，碳酸氢钠10mg/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.1μg/L，羟乙基淀粉0.2mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.4mg/L。

[0027] 实施例2

[0028] 所述的无血清无DMSO细胞冻存液，其组分含量为：无水氯化钙 116.6mg/L，L-亮氨酸59.05mg/L，亚油酸0.042mg/L，五水硫酸铜00013mg/L， L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L，硫辛酸0.105mg/L，九水硝酸铁0.05mg/L，L- 蛋氨酸17.24mg/L，酚红8.1mg/L，七水硫酸亚铁0.417mg/L，L-苯丙氨酸 35.48mg/L，1，4-丁二胺二盐酸盐0.081mg/L，氯化钾311.8mg/L，L-丝氨酸 26.25mg/L，丙酮酸钠55mg/L，氯化镁28.64mg/L，苏氨酸53.45mg/L，维生素H
0.0035mg/L，无水硫酸镁48.84mg/L，丙氨酸4.45mg/L，泛酸钙 2.24mg/L，氯化钠6999.5mg/L，L-天门冬酰胺7.5mg/L，氯化胆碱8.98mg/L，无水磷酸二氢钠54.35mg/L，天门冬氨酸
6.65mg/L，叶酸2.65mg/L，磷酸氢二钠71.02mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L，I-肌醇
12.6mg/L，七水硫酸锌0.432mg/L，谷氨酸7.35mg/L，烟酰胺2.02mg/L，L-精氨酸盐酸盐
147.5mg/L，L-脯氨酸17.25mg/L，盐酸吡哆醛2mg/L，L-胱氨酸盐酸盐 31.29mg/L，L-色氨酸
9.02mg/L，盐酸吡哆醇0.031mg/L，L-谷氨酰胺365mg/L，L-酪氨酸38.4mg/L，核黄素
0.219mg/L，甘氨酸18.75mg/L，L-颉氨酸52.85mg/L，盐酸硫胺2.17mg/L，L-组氨酸盐酸盐
31.48mg/L，D-葡萄糖 3151mg/L，胸苷0.365mg/L，L-异亮氨酸54.47mg/L，次黄嘌呤2mg/L，维生素B12 0.68mg/L，胰岛素8mg/L，转铁蛋白6mg/L，乙醇胺2mg/L，亚油酸4μg/L，白蛋白
0.2μg/L，重组人表皮细胞生长因子0.2μg/L，氢化可的松 0.3mg/L，青霉素0.6g/L，链霉素
0.1g/L，维生素C 3mg/L，甜菜碱2mg/L，海藻糖0.3mM/L，甲基纤维素0.3g/L，碳酸氢钠
12.75mg/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.2μg/L，羟乙基淀粉0.2mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.6mg/L。

[0029] 实施例3

[0030] 所述的无血清无DMSO细胞冻存液，其组分含量为：无水氯化钙 116.6mg/L，L-亮氨酸59.05mg/L，亚油酸0.042mg/L，五水硫酸铜00013mg/L， L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L，硫辛酸0.105mg/L，九水硝酸铁0.05mg/L，L- 蛋氨酸17.24mg/L，酚红8.1mg/L，七水硫酸亚铁0.417mg/L，L-苯丙氨酸 35.48mg/L，1，4-丁二胺二盐酸盐0.081mg/L，氯化钾311.8mg/L，L-丝氨酸 26.25mg/L，丙酮酸钠55mg/L，氯化镁28.64mg/L，苏氨酸53.45mg/L，维生素H
0.0035mg/L，无水硫酸镁48.84mg/L，丙氨酸4.45mg/L，泛酸钙 2.24mg/L，氯化钠6999.5mg/L，L-天门冬酰胺7.5mg/L，氯化胆碱8.98mg/L，无水磷酸二氢钠54.35mg/L，天门冬氨酸
6.65mg/L，叶酸2.65mg/L，磷酸氢二钠71.02mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L，I-肌醇
12.6mg/L，七水硫酸锌0.432mg/L，谷氨酸7.35mg/L，烟酰胺2.02mg/L，L-精氨酸盐酸盐
147.5mg/L，L-脯氨酸17.25mg/L，盐酸吡哆醛2mg/L，L-胱氨酸盐酸盐 31.29mg/L，L-色氨酸
9.02mg/L，盐酸吡哆醇0.031mg/L，L-谷氨酰胺 365mg/L，L-酪氨酸38.4mg/L，核黄素
0.219mg/L，甘氨酸18.75mg/L，L-颉氨酸52.85mg/L，盐酸硫胺2.17mg/L，L-组氨酸盐酸盐
31.48mg/L，D-葡萄糖 3151mg/L，胸苷0.365mg/L，L-异亮氨酸54.47mg/L，次黄嘌呤2mg/L，维生素B12 0.68mg/L，胰岛素8mg/L，转铁蛋白5mg/L，乙醇胺2mg/L，亚油酸4-5μg/L，白蛋白
0.5μg/L，重组人表皮细胞生长因子0.2μg/L，氢化可的松 0.35mg/L，青霉素0.06g/L，链霉素0.1g/L，维生素C 2mg/L，甜菜碱2mg/L，海藻糖0.3mM/L，甲基纤维素0.2g/L，碳酸氢钠
10mg/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.2μg/L，羟乙基淀粉0.8mg/L，聚乙烯吡咯烷酮
0.8mg/L。

[0031] 所述的无血清无DMSO细胞冻存液的制备方法，按照实施例1-3原料配方投料，该方法包括以下步骤：

[0032] 1)在cGMP洁净级车间里，以DMEM/F-12为基础培养基，然后逐步添加青霉素和链霉素、重组人表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子、乙醇胺、甜菜碱、白蛋白、维生素C、以及羟乙基淀粉，最后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液将pH调至7.4，然后按比例分别添加细胞内外的冷冻保护剂成分，混合均匀；

[0033] 2)将步骤1)中所得的溶液用0.1μm孔径的滤器进行过滤灭菌处理，即得到无血清无DMSO的细胞冻存液。

[0034] 随机选取实施例2配方所得的无血清无DMSO细胞冻存液与普通细胞冻存液应用比较：

[0035] 步骤一、

[0036] 1)提前准备细胞冻存液，DMEM+10％血清+10％DMSO的普通细胞冻存液，即在DMEM基础培养基中依次添加占基础培养基体积的10％的血清和 10％的DMSO溶液，混合均匀，备用；

[0037] 本发明所述的无血清无DMSO细胞冻存液即实施例1中所列比例配置的无血清无DMSO细胞冻存液。

[0038] 2)将生长期位于对数期的人脐带间充质干细胞，采用胰酶进行消化，然后4000rpm，离心2分钟，以收集细胞。每株细胞(1～5×106Cells)加入1ml 的普通细胞冻存液或本发明所述的无血清无DMSO细胞冻存液，用移液器吸头进行反复吹打均匀，制成细胞悬液，细胞的密度为1～5×106Cells/ml为宜。

[0039] 3)分装至冻存管中，标记好细胞的名称、冻存日期以及细胞冻存液的类型等信息。

[0040] 4)按照程序降温的方式进行细胞的慢冻步骤，即4℃放置30min，-20℃放置30min，然后-80℃过夜冻存，最后再将细胞置于液氮罐中进行保存。

[0041] 步骤二、

[0042] 1)提前10分钟将水浴锅预热到37℃。并用75％酒精擦净超净工作台备用。

[0043] 2)把实施例1中分别用普通细胞冻存液和本发明所述的无血清无DMSO 细胞冻存液保存的，冻存时间为6个月的人脐带间充质干细胞细胞从液氮中取出来，立即置于37℃水浴锅中，并不时地轻轻摇动，使其快速融化。

[0044] 3)解冻后的细胞在1000rpm速度下离心2分钟，然后弃去上层细胞冻存液，最后加入适量人脐带间充质干细胞专用培养基重悬细胞沉淀后接种于细胞培养皿中并置于37℃，5％二氧化碳培养箱中进行培养。

[0045] 4)培养12小时后观察细胞的复苏状态和生长情况，并及时更换新鲜的培养基继续培养。

[0046] 如图1所示，图1A为经普通细胞冻存液冻存后复苏的人脐带间充质干细胞的生长状态；图1B为经本发明所述的无血清无DMSO细胞冻存液冻存后复苏的人脐带间充质干细胞的生长状态。

[0047] 与DMEM+10％血清+10％DMSO的普通细胞冻存液相比，本发明所述的无血清无DMSO细胞冻存液冻存6个月之后，人脐带间充质干细胞的复苏效果及细胞状态来看，本发明所述细胞冻存液冻存后的复苏效果(图1B)优于普通细胞冻存液(图1A)的冻存效果，即细胞的存活比例高达80％以上以及细胞的形态更接近标准形态，这表明本发明的细胞冻存液在对人脐带间充质干细胞的冻存方面可以替代传统的细胞冻存液。

[0048] 步骤三、

[0049] 1)将实施例2中复苏后的人脐带间充质干细胞接种于96孔板中，每孔配置100μl的细胞悬液。

[0050] 2)将培养板分别在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24小时、48小时和 72小时后(图2)，然后向培养板中加入10μl CCK8溶液(细胞增殖检测-8 溶液)。然后将培养板在培养箱中孵育2小时。

[0051] 3)在酶标仪450nm处测定吸光值，参比波长为600nm。

[0052] 4)细胞增殖活力计算方法为：

[0053] 细胞活力(％)＝[A(培养时间2)-A(空白)]/[A(培养时间1)-A(空白)]×100[0054] 其中，A(培养时间)：具有不同培养时间的细胞和CCK8溶液的培养孔的吸光度；

[0055] A(空白)：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的培养孔的吸光度；

[0056] 如图2所示，图2中经本发明所述的无血清无DMSO细胞冻存液处理后的人脐带间充质干细胞的增殖情况(虚线-圆黑点)，经普通细胞冻存液处理后的人脐带间充质干细胞的增殖情况(实线-灰方点)。

[0057] 与DMEM+10％血清+10％DMSO的普通细胞冻存液相比，经本发明所述的无血清无DMSO细胞冻存液处理过的细胞的细胞增殖情况优于普通细胞冻存液处理过后的效果。

[0058] 步骤四、

[0059] 1)将实施例2中复苏好的人脐带间充质干细胞悬液接种于10cm细胞培养皿中。

[0060] 2)利用间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒对人脐带间充质干细胞进行诱导分化。严格按照商品化的诱导说明书进行相关操作。

[0061] 3)诱导7-10天之后，采用油红O染色试剂盒对诱导的脂肪滴进行染色(如图3A和图3B，图3A为经普通细胞冻存液冻存后复苏的人脐带间充质干细胞的诱导成脂分化情况；图
3B为经本发明所述的无血清无DMSO细胞冻存液冻存后复苏的人脐带间充质干细胞的诱导成脂分化情况。从图3中可以看出3B 中的油滴明显多于图3A中的数目，这表明经本发明细胞冻存液处理过的细胞的全能性更好，成脂诱导的效果也更突出。)

[0062] 4)将实施例2中复苏好的细胞悬液接种于10cm细胞培养皿中。

[0063] 5)利用商业化的成软骨诱导试剂盒对人脐带间充质干细胞进行诱导分化。严格按照商品化的诱导说明书进行相关操作。

[0064] 6)诱导21天之后，采用阿尔新蓝染色试剂盒对诱导的软骨细胞进行染色 (如图4A和图4B，图4A为经普通细胞冻存液冻存后复苏的人脐带间充质干细胞的诱导成软骨分化情况；图4B为经本发明所述的无血清无DMSO细胞冻存液冻存后复苏的人脐带间充质干细胞的诱导成软骨分化情况(箭头所指即为诱导的软骨结节)；从图中可以看出，图4B中形成的软骨的数目和程度都显著优于图4A中的软骨效果，表明本发明的无血清无DMSO的细胞冻存液具有更加优秀的维持干细胞特性的效果)。

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一种无血清无DMSO细胞冻存液及其制备方法

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