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一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法

阅读:369发布:2020-05-08

专利汇可以提供一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法,包括如下步骤:(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗,用 剪刀 剪碎至1mm2组织 块 ,取适量组织块至分离液中,用吸管吹打、过滤,滤液离心,得黄色沉淀;(2)取黄色沉淀,加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml 链霉素 的培养基中,吹打均匀后接种至培养板,于CO2细胞 培养箱 中培养。本发明的方法可以稳定培养中华绒螯蟹肝胰腺细胞至72h存活率高于50%,为后续细胞系的建立提供理论依据,为细胞毒理、基因工程等相关领域研究提供细胞工具。,下面是一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法专利的具体信息内容。

1.一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法,其特征在于,具体方法如下:
(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗4-5次,用剪刀剪碎至1mm2组织,再用吸管吸取适量的组织块至装有5ml分离液的离心管中,用吸管吹打50次,200目细胞筛过滤至培养皿中,滤液移至干净离心管中1200r/min离心4min,得黄色沉淀,所述细胞分离液为D-Hanks液;
(2)取黄色沉淀,加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的2×L-15培养基中,吹打均匀后接种至96孔板中,将培养板放置于CO2细胞培养箱中,培养箱保持恒温28℃,5%CO2;
所述培养基为GIBCO公司的L-15培养基;所述2×L-15培养基制备方法如下:取1L规格L-15干粉溶解于500ml蒸馏中,在无菌环境下0.22μm滤膜过滤除菌。

说明书全文

一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域,具体地说,是一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法。

背景技术

[0002] 中华绒螯蟹(Eriocheir)属甲壳纲十足目,是我国产养殖产业的主要养殖品种之一。随着养殖规模扩大,养殖年份增加,各类疾病,尤其是一些病毒病的爆发对中华绒螯蟹养殖产业造成了巨大影响。肝胰腺是蟹类重要的组织器官,肩负着许多生理功能,其中包括合成并分泌消化酶、吸收营养物质、存储无机物,代谢糖类物质,除此之外肝胰腺还参与排泄与蜕皮等生理活动。肝胰腺由多种细胞构成,根据细胞形态和功能可以分为四种,即胚细胞(E细胞)、分泌细胞(B细胞)、吸收细胞(F细胞)、储存细胞(R细胞)。其中R细胞主要形式储存功能,R细胞的胞质中具有圆形的小液泡,近圆形的细胞核靠近细胞基部,部分细胞具有大小不一的双核,两核或紧贴或分开。R细胞中具有大量的粗面内质网和噬性强的脂滴,胞质中游离核糖体的数量同样非常之多,除此之外还分布有少量的线粒体和一些小液泡。R细胞发达的脂肪体使其具有储藏功能,储存着河蟹生活必需的能量来源。
[0003] 中国期刊《动物学杂志》2012年2月公开的论文《中华绒螯蟹血细胞原代培养条件的优化》,比较了几种常见血细胞培养基(L-15、2×L-15、3×L-15、M199和RMPI-1640)对中华绒螯蟹血细胞原代培养中细胞形态以及存活率的影响,在筛选获得的最佳培养基中添加不同比例胎血清,进一步观察血清对中华绒螯蟹血细胞培养效果的比较。河北大学2009年公开的硕士论文《中华绒螯蟹雄性生殖细胞体外培养的研究》,以中华绒鳌蟹雄性生殖细胞为研究对象,以细胞的贴壁率、存活率和RNA/DNA比值为生理和生化指标,分别测定了几种不同渗透压(600,700,800,900,1000,1100nunol/L)和pH值(6.5,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8)条件下体外培养雄性生殖细胞的生长状况,指出1000mmol/L为培养细胞的最适渗透压,在此渗透压条件下,培养细胞的贴壁率、存活率、RNA/DNA最大,培养细胞的适宜pH范围是7.2-7.4,在此pH条件下,细胞的贴壁率、存活率、RNA/DNA均较大。然而现有技术中,关于本发明的中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法,目前还未见报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法。
[0005] 为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
[0006] 一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法,包括如下步骤:
[0007] (1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗,用剪刀剪碎至1mm2组织,取适量组织块至分离液中,用吸管吹打、过滤,滤液离心,得黄色沉淀;
[0008] (2)取黄色沉淀,加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中,吹打均匀后接种至培养板,于CO2细胞培养箱中培养。
[0009] 进一步,所述培养基为GIBCO公司的L-15培养基。
[0010] 进一步,所述L-15培养基制备方法如下:取1L规格L-15干粉溶解于500ml蒸馏水中,在无菌环境下0.22μm滤膜过滤除菌。
[0011] 进一步,所述细胞分离液为D-Hanks液。
[0012] 进一步,所述中华绒螯蟹肝胰腺细胞至72h存活率高于50%。
[0013] 进一步,所述具体方法如下:
[0014] (1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗4-5次,用剪刀剪碎至1mm2组织块,再用吸管吸取适量的组织块至装有5ml分离液的离心管中,用吸管吹打50次,200目细胞筛过滤至培养皿中,滤液移至干净离心管中1200r/min离心4min,得黄色沉淀,所述细胞分离液为D-Hanks液;
[0015] (2)取黄色沉淀,加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的2×L-15培养基中,吹打均匀后接种至96孔板中,将培养板放置于CO2细胞培养箱中,培养箱保持恒温28℃,5%CO2。
[0016] 本发明优点在于:
[0017] 本发明通过比较6种甲壳动物细胞培养中常见培养基或缓冲液(2×L-15,3×L-15,M199,DMEM,Crab saline,D-Hanks)作为细胞分离液对中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离的效果,以及4种培养基(2×L-15,3×L-15,M199,DMEM)对中华绒螯蟹肝胰腺细胞贴壁率和存活率的影响,建立了一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法,可以稳定培养中华绒螯蟹肝胰腺细胞至72h存活率高于50%,为后续细胞系的建立提供理论依据,为细胞毒理、基因工程等相关领域研究提供细胞工具。本发明的方法结合细胞培养技术、活体细胞染色技术、细胞形态学观察技术,对中华绒螯蟹肝胰腺细胞最佳的分离及原代培养条件进行探索。
附图说明
[0018] 附图1为四种肝胰腺细胞形态。其中箭头所指分别是B细胞,R细胞,F细胞,E细胞。标尺=20μm。
[0019] 附图2为6种不同试剂条件下分离中华绒螯蟹肝胰腺细胞存活率。
[0020] 附图3为接种2h后4中培养基下中华绒螯蟹肝胰腺细胞贴壁率。
[0021] 附图4为培养24h不同培养基条件下肝胰腺细胞。a.2×L-15,b.2×L-15,c.DMEM,d.M199;黑色箭头表示肝胰腺细胞,白色箭头表示破裂的细胞。
[0022] 附图5为4种不同培养基条件下肝胰腺细胞培养的存活率情况。不同字母标记表示组间差异性显著(P<0.05)。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0024] 实施例1
[0025] 1材料与方法
[0026] 1.1试验材料
[0027] 中华绒螯蟹采自江苏省金坛市水产技术推广站,规格125g~135g/只,雌雄不限,暂养于75cm×50cm×45cm养殖箱内,光照周期12h:12h,每天换水1/3,早晚固定时间投喂配合饲料,每天吸出缸内残饵和粪便保证水质清晰。
[0028] Crab saline(蟹生理盐水):NaCl(14.5g),KCl(0.355g),无水CaCl2(0.899g),MgSO4·7H2O(1.58g),NaHCO3(0.25g),MgCl2·6H2O(0.85g),HEPES(2.38g),蒸馏水(500ml)。
[0029] 2×L-15和3×L-15培养基:1L规格L-15干粉(Gibico)分别溶解于500ml,333ml蒸馏水中,在无菌环境下0.22μm滤膜过滤除菌然后分装于无菌蓝盖瓶内。
[0030] M199及DMEM培养基选用Gibico商用液体培养基。
[0031] 1.2试验方法
[0032] 将6种试剂(2×L-15,3×L-15,M199,DMEM,Crab saline,D-Hanks)作为细胞分离液,取足量的肝胰腺组织分别用以上分离液清洗4-5次,用剪刀剪碎至1mm2组织块,再用吸管吸取适量的组织至装有5ml分离液的6支离心管中,分别用吸管吹打50次,200目细胞筛过滤至培养皿中,滤液移至干净离心管中1200r/min离心4min。离心后,黄色沉淀部分取出分别分装于预先加入1ml分离液的离心管中,均匀重悬浮。细胞悬液台盼蓝染色,血球计数板计数计算其存活率。
[0033] 根据分离液筛选结果,选取最佳分离液分离中华绒螯蟹肝胰腺细胞,分离过程同上述步骤。离心后得到黄色沉淀,分别取等量加入含双抗(100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素,购自Gibico公司)的2×L-15,3×L-15,DMEM以及M199四种培养基中,调整细胞密度一致,缓慢吹打均匀后接种至96孔板中。将培养板放置于CO2细胞培养箱(购自本德公司)中,培养箱保持恒温28℃,5%CO2。培养2h后,将培养板取出,轻微摇晃后在显微镜下观察拍照,发现细胞有不同程度贴壁脱落情况。在倒置显微镜下每孔随机选取5个视野计数脱落的细胞,并计算贴壁率。
[0034] 接种后以后每2天换液一次,在24h、48h、72h、96h分别用台盼蓝排斥法测定肝胰腺细胞存活率。在Motic AE31倒置显微镜下从0h起至96h每隔24h观察细胞形态变化。
[0035] 1.3统计分析
[0036] 数据采用SPSS20.0单因素方差分析,组间差异采用Turkey’s比较。
[0037] 2结果
[0038] 2.1中华绒螯蟹肝胰腺细胞的形态观察
[0039] 中华绒螯蟹的肝胰腺细胞由四种细胞组成,如图1所示:B细胞(泡状细胞),R细胞(储存细胞),E细胞(胚胎细胞)和F细胞(纤维细胞)。B细胞体积最大,细胞内充满大量的液泡,且液泡占据细胞80%-90%的空间,可见少量的脂滴。R细胞体积次之,内有小液泡,但数量最多,细胞内充满大量的脂滴。F细胞同R细胞大小相近,其胞内液泡较少,呈多边形,含少量脂滴。E细胞体积最小,几乎不含脂滴。
[0040] 2.2不同分离液对中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离效果比较
[0041] 分别用6种不同分离液进行细胞分离,结果表明:分离后各组细胞之间存活率差异不显著(P>0.05)(图2),均高于80%。其中,D-Hanks组所获得细胞数量更多,细胞成团情况更少,因此后续试验采用D-Hanks作为细胞分离液。
[0042] 2.3不同培养基条件下肝胰腺细胞贴壁情况
[0043] 肝胰腺细胞在2×L-l5培养基条件下2h贴壁率最高,达到97.69±3.72%,显著高于3×L-15组,但与DMEM和M199组差异不显著(图3)。
[0044] 2.4不同培养基对肝胰腺细胞培养效果的比较
[0045] 不同培养基培养条件下,分别在24h、48h、72h和96h对培养细胞按台盼蓝:培养液=1:9进行染色,静置3min,计算细胞存活率。
[0046] 培养24h后2×L-15组及3×L-15组细胞形态完整,仅见少数细胞出现破裂,有少量细胞碎片(图4a,b);而DMEM,M199组肝胰腺细胞出现贴壁脱落,视野内细胞数量减少,且部分细胞出现破裂,大量颗粒物质从细胞溢出(图4c,d)。接种24h、48h、72h及96h后,2×L-15组存活率均高于其余三组,差异显著(p<0.05);而DMEM和M199组肝胰腺细胞存活率显著低于2×L-15和3×L-15组,24h存活率分别只有34.81±2.52%和26.70±3.44%,低于50%。随着培养时间的增加,各组存活率均有下降,96h时2×L-15组存活率为34.14%。(图5)[0047] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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