间充质干细胞衍生液制备方法及其在化妆品中的应用
阅读：1032发布：2020-05-14
专利汇可以提供间充质干细胞衍生液制备方法及其在化妆品中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种间充质干细胞衍生液的制备方法及其在 化妆品 中的应用，该间充质干细胞衍生液的制备方法包括以下步骤：(1)使用间充质干细胞培养基对脐带组织来源的间充质干细胞进行培养，收集细胞培养上清液；(2)向步骤(1)所得细胞培养液中加入谷胱甘肽、辅酶Q10、壳聚糖、海藻胶原质和透明质酸钠，即得间充质干细胞衍生液。本发明所制备的间充质干细胞衍生液用于化妆品，具有深层保湿功能，可显著提高 皮肤 亮度 和光滑度，可有效改善皮肤松弛、暗淡、黄褐斑等症状，对损伤皮肤亦有极好的修复作用。，下面是间充质干细胞衍生液制备方法及其在化妆品中的应用专利的具体信息内容。
1.一种间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)使用间充质干细胞培养基对脐带组织来源的间充质干细胞进行培养，收集细胞培养上清液；
(2)向步骤(1)所得细胞培养上清液中加入谷胱甘肽、透明质酸钠、辅酶Q10、壳聚糖和海藻胶原质，即得间充质干细胞衍生液。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所得的间充质干细胞衍生液中：谷胱甘肽的浓度为3～6mg/L；辅酶Q10的浓度为2～5mg/L；壳聚糖的浓度为3～6mg/L；海藻胶原质2～5mg/L；透明质酸钠的体积占比为10～15％。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所用间充质干细胞培养基可为美国Thermo Scientific公司生产的产品名称为StemProTM MSC SFM XenoFree的培养基。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中脐带组织来源的间充质干细胞是通过以下步骤获得的:
(1)用含有青霉素-链霉素的生理盐水冲洗脐带组织5次；
(2)用手术剪刀将脐带组织剪切成1cm2小块；
(3)将1cm2小块组织真皮脂肪层面朝下平铺于培养皿中，加入0.5～1mg/mL胶原酶IV，使其浸没组织块，置4℃冰箱中消化12～16h；
(4)除去表皮，用眼科剪将组织剪成1mm3小块，接种到培养瓶中，加入适量培养基，置于胞培养箱中进行培养，即可得到存活率较高的脐带组织来源的间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中对脐带组织来源的间充质干细胞进行培养的方式包括原代培养和传代培养。
6.根据权利要求5所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述原代培养和传代培养均采用现有技术中的常规方法。
7.根据权利要求1所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述收集细胞培养上清液优选收集第3～8代的细胞培养上清液。
8.根据权利要求1所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述脐带组织优选来源于人类。
9.根据权利要求1所述的间充质干细胞衍生液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中获得的间充质干细胞衍生液，用于抗衰老化妆品。
间充质干细胞衍生液制备方法及其在化妆品中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一类护肤品及其制备方法和应用，特别涉及一种间充质干细胞衍生液的制备方法及其在化妆品领域中的应用。
背景技术
[0002] 人的生命周期通常被划分为生长期、成熟期和衰老期三个阶段。一般情况下，当年龄达到25岁时，身体的各项衰老机制开始启动，与老化相关的各项指标也都开始下降，人们逐步进入衰老状态。皮肤衰老是人体衰老最易觉察的特征之一。随着年龄的变化，皮肤会逐渐变得暗淡无光，会产生色斑和皱纹，还会松弛下垂，这些症状都严重影响到现代女性的生活质量和心理健康，“抵抗衰老”已成为她们生活中的必不可少的话题。
[0003] 现代女性对日常生活中的皮肤护理非常重视，总是期望能找到安全有效的护肤产品，然而目前市场上的护肤产品质量参差不齐，令消费者难以鉴别。更有一些护肤品中含有铅汞、乙醇、着色剂及矿物油等物质，不仅对皮肤无益，还可能会造成严重的皮炎及感染等问题。
[0004] 随着生物医学的迅猛发展，科学家们发现间充质干细胞培养上清液中含有很多活性物质能够使衰老细胞年轻化，但由于技术壁垒导致的产能问题，使含有生物活性物质的化妆品无法投放到市场。目前市场上销售的化妆品都是由植物成分直接提取或精细化工制作工艺加工而成，产品中的主要有效成分均为大分子化合物，不易渗透到皮肤内部，无法从本质上改善皮肤衰老的问题，还有可能会导致过敏等一些不良反应。
发明内容
[0005] 为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种间充质干细胞衍生液的制备方法及其在化妆品中的应用。该间充质干细胞衍生液具有深层保湿功能,可显著提高皮肤亮度和光滑度，有效改善皮肤松弛、暗淡、黄褐斑等症状，同时对损伤皮肤有极好的修复作用；其制备方法简单易行，可进行大规模推广，可实现产业化生产加工。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 一种间充质干细胞衍生液的制备方法，所述方法包括以下步骤:
[0008] (1)使用间充质干细胞培养基对脐带组织来源的间充质干细胞进行培养，收集细胞培养上清液；
[0009] (2)向步骤(1)所得的细胞培养上清液中加入谷胱甘肽、辅酶Q10、壳聚糖、海藻胶原质和透明质酸钠，即得间充质干细胞衍生液。进一步优选的：在所述间充质干细胞衍生液中:谷胱甘肽的浓度为3～6mg/L；辅酶Q10的浓度为2～5mg/L；壳聚糖的浓度为3～6mg/L；海藻胶原质2～5mg/L；透明质酸钠的体积占比为10～15％。
[0010] (3)优选的：所述间充质干细胞培养基即通过正规商业渠道购买的适合间充质干TM细胞培养的培养基即可，如:美国Thermo Scientific公司生产的产品名称为StemPro MSC SFM XenoFree的培养基。该培养基用于在完全无血清和异种(无异种)条件下生长和扩增人间充质干细胞和脂肪干细胞。该培养基支持人类间充质干细胞的扩增，同时可保持其多项分化潜能的表型。
[0011] (4)优选的：所述脐带组织来源的间充质干细胞是通过以下方式获得的:(1)用含有青霉素-链霉素的生理盐水冲洗脐带组织5次；(2)用手术剪刀将脐带组织剪切成1cm2小块；(3)将1cm2小块组织真皮脂肪层面朝下平铺于培养皿中，加入0.5～1mg/mL胶原酶IV，使其浸没组织块，置4℃冰箱中消化12～16h；(4)除去表皮，用眼科剪将组织剪成1mm3小块，接种到培养瓶中，加入适量培养基，置于胞培养箱中进行培养，即可得到存活率较高的脐带组织来源的间充质干细胞。
[0012] (5)优选的：所述对脐带组织来源的间充质干细胞进行培养包括原代培养，和传代培养，以获得更多的细胞培养上清液，所述原代培养和传代培养均可以采用现有技术中的常规方法，如:在间充质干细胞培养基中加入青霉素和链霉素，使其浓度均为1％，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，每3～4天更换一次培养液；当细胞融合度达70～80％时可进行传代。传代时用0.25％的胰酶在37℃条件下消化3～5分钟；当细胞蜷缩，即将脱离瓶壁时，吸弃胰酶消化液；用适量新鲜培养液将细胞收集起来并进行离心；弃上清洗液，用3～4倍原培养体积的新鲜培养液重悬细胞，然后接种到培养瓶中，置37℃、5％CO2培养箱中进行传代培养，传代间隔时间优选为7～10天。
[0013] (6)优选的：上述步骤⑴中所述收集细胞培养上清液优选收集第3～8代的细胞培养上清液。当细胞生长至3～8代时，其产生的对皮肤有利的活性蛋白分子将达到最大峰值，但代次超过8代时，上清液中的活性蛋白分子含量则会下降，同时还会出现一些对皮肤组织不利的的细胞代谢产物，因此优选第3～8代细胞的培养上清液来制备间充质干细胞衍生液。
[0014] (7)优选的：所述脐带组织优选来源于人类。
[0015] 优选的：可用于抗衰老化妆品。
[0016] 本发明有益的技术效果在于：
[0017] (1)本发明间充质干细胞衍生液采用“细胞工程”方法，通过培养人脐带组织来源的间充质干细胞来收集含有活性物质的培养上清液，并将其作为整个产品的基础配方。间充质干细胞培养上清液中的活性物质具有脂质体结构，与人类皮肤结构相同，有利于人体皮肤的吸收和利用，可从根本上改善肌肤衰老的症状。
[0018] (2)本发明间充质干细胞衍生液的制备方法摆脱了传统的植物成分萃取和精细化工生产工艺，无任何化工添加物，如:乙醇、铅汞、矿物油等致敏毒素，最大程度上保证了产品使用的安全性；
[0019] (3)本发明间充质干细胞衍生液能够促进皮肤上皮细胞分裂增殖，增加皮肤表皮厚度，从而增强表皮皮肤的屏障保护作用；
[0020] (4)本发明间充质干细胞衍生液能够渗入到皮肤深层结构，激活皮下脂肪干细胞使其再生，从而促进胶原蛋白、细胞黏着蛋白、EGF(表皮生长因子)等生成，能显著减少细纹，增加皮肤的弹性和光滑度。
[0021] (5)本发明在间充质干细胞衍生液中加入了谷胱甘肽、辅酶Q10、壳聚糖、海藻胶原质和透明质酸钠，可显著提高皮肤组织的抗氧化、抗辐射和去除自由基能力，同时还可抵抗由于光照诱发的肌肤老化现象，长期使用具有显著的美白和淡斑效果；
[0023] (7)本发明在间充质干细胞衍生液中加入了壳聚糖和海藻胶原质，这两种成分能够促进皮肤内在胶原及弹性纤维产生，从而达到深层保湿和防皱功能；本发明间充质干细胞衍生液中的各种配方成分互相协同，得以实现其最佳的皮肤保养效果；
[0025] 图1为本发明实施例4美白效果测试扫描照片；
[0026] 图2为本发明实施例4淡斑效果测试扫描照片；
[0027] 图3为本发明实施例4的细胞划痕修复测试照片。
具体实施方式
[0028] 下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
[0029] 一种间充质干细胞衍生液的制备方法及其在化妆品中的应用，所述方法包括如下步骤：
[0030] (1)用含有青霉素-链霉素的生理盐水冲洗脐带组织5次；
[0031] (2)用手术剪刀将脐带组织剪切成1cm2小块；
[0032] (3)将1cm2小块组织真皮脂肪层面朝下平铺于培养皿中，加入0.5mg/mL胶原酶IV，使其浸没组织块，置4℃冰箱中消化16h；
[0033] (4)除去表皮，用眼科剪将组织剪成1mm3小块，接种到培养瓶中，用适量培养基进行培养，即可得到存活率较高的脐带组织来源的间充质干细胞。培养基为美国Thermo Scientific公司生产的产品名称为StemProTMMSC SFM XenoFree的培养基；
[0034] (5)每3～4天更换一次间充质干细胞培养液；当细胞生长至80％融合状态时进行传代；
[0035] (6)传代时用0.25％的胰酶在37℃条件下消化3～5分钟，当细胞蜷缩，即将脱离瓶壁时，吸弃胰酶消化液；
[0036] (7)用适量新鲜培养液将细胞收集起来并进行离心；
[0037] (8)弃上清，用3～4倍体积的新鲜培养液重悬细胞，然后接种到培养瓶中，置37℃、5％CO2培养箱中进行传代培养，传代间隔时间优选为7～10天。
[0038] 实施例1
[0039] (1)收集第3代间充质干细胞培养上清液。
[0040] (2)在步骤(1)中收集的1L间充质干细胞培养上清液中加入3mg/L谷胱甘肽、2mg/L辅酶Q10、3mg/L壳聚糖；2mg/L海藻胶原质和体积占比为10％透明质酸钠，即得间充质干细胞衍生液。
[0041] 实施例2
[0042] (1)收集第5代间充质干细胞培养上清液。
[0043] (2)在步骤(1)中收集的1L间充质干细胞培养上清液中加入6mg/L谷胱甘肽、5mg/L辅酶Q10、6mg/L壳聚糖；5mg/L海藻胶原质和体积占比为15％透明质酸钠，即得间充质干细胞衍生液。
[0044] 实施例3
[0045] (1)收集第8代间充质干细胞培养上清液。
[0046] (2)在步骤(9)中收集的1L间充质干细胞培养上清液中加入4.5mg/L谷胱甘肽、3.5mg/L辅酶Q10、4.5mg/L壳聚糖；3.5mg/L海藻胶原质和体积占比为12.5％透明质酸钠，即得间充质干细胞衍生液。
[0047] 实施例4:结合附图1-3对比试验
[0048] 1、锁水保湿功效测试
[0049] (1)招募30位25-60岁身体健康、皮肤干燥志愿者，其中男性12人，女性18人；
[0051] (3)选取标记双手臂内侧2个区域，标记为产品测试区和对照区，每个区域面积为3cm×3cm；
[0053] (5)根据产品使用要求在产品测试区使用测试样品；测试样品为90％无菌纯水加入10％实施例1所制备的间充质干细胞衍生液混匀后分装，每份3mL,密封包装，开盖后24小时内用完，需冷藏；对照样品为含10％透明质酸钠原液的无菌纯水，需冷藏；使用方法：用清水清洁划分区域皮肤，分别涂抹相应样品，早晚各一次，按摩1分钟为佳，可帮助皮肤吸收；持续涂抹14天；
[0054] (6)参照步骤(2)和(4)，检测受试者前臂各区域角质层水分含量值：产品测试区皮肤平均含水量为48.3％，对照区皮肤平均含水量为47.2％。
[0055] (7)参照步骤(5)继续使用测试样品14天；
[0056] (8)参照步骤(2)和(4)，检测受试者前臂各区域角质层水分含量值：产品测试区皮肤平均含水量为69.8％，对照区皮肤平均含水量为50.6％。；
[0057] (9)对使用前、使用14天和使用28天的受试者前臂各区域角质层水分含量值进行比较分析，可得知实施例1中的间充质干细胞衍生液具有长效的保湿效果，且保湿效果显著优于对照组样品。
[0058] 2、皮肤弹性改善效果测试
[0059] (1)招募30位25-60岁身体健康、皮肤干燥志愿者，其中男性10人，女性20人；
[0060] (2)使用德国CK公司皮肤弹性测试仪MPA580对志愿者进行皮肤弹性测试，测试区域为左右手臂内侧两个区域，每个区域面积为3cm×3cm，测试结果作为此次试验的空白值；
[0061] (3)根据产品使用要求在产品区使用测试样品；测试样品为90％无菌纯水加入10％实施例2所制备的间充质干细胞衍生液混匀后分装，每份3mL,密封包装，开盖后24小时用完，需冷藏；对照样品为含15％透明质酸钠原液的无菌纯水，需冷藏；使用方法：用清水清洁划分区域皮肤，分别涂抹相应样品，早晚各一次，按摩1分钟为佳，可帮助皮肤吸收；持续涂抹14天；
[0062] (4)参照步骤(2)，检测受试者前臂各区域皮肤弹性值增加率：产品测试区皮肤弹性平均增加率为5.8％，对照区皮肤弹性平均增加率为2.7％；
[0063] (5)参照步骤(3)继续使用测试样品14天；
[0064] (6)参照步骤(2)，检测受试者前臂各区域皮肤弹性值增加率：产品测试区皮肤弹性平均增加率为20.2％，对照区皮肤弹性平均增加率为4.3％；
[0065] (7)对使用前、使用14天和使用28天的受试者左右臂各区域皮肤弹性增加率进行比较分析，可得知实施例2中的间充质干细胞衍生液可显著提高皮肤弹性增加率，且提高效果显著优于对照组样品。
[0066] 3、美白、淡斑效果测试
[0067] (1)招募30-50岁身体健康、面部有斑的女性志愿者15人，随机分成2组，实验组为10人，对照组为5人；
[0068] (2)志愿者自行清洁面部皮肤后，实验人员使用荷兰进口设备SyltonObserv专业皮肤图像分析系统对志愿者进行面部表层皮肤与深层皮肤扫描，扫描时间标记为D0。
[0069] (3)实验组使用测试样品，对照组使用对照样品，根据产品使用要求使用样品：测试样品为90％无菌纯水加入10％实施例3所制备的间充质干细胞衍生液混匀后分装，每份5mL,密封包装，开盖后24小时用完，需冷藏；对照样品为含10％透明质酸钠原液的无菌纯水，需冷藏；使用方法：用洗面奶清洁面部皮肤，然后涂抹相应样品，早晚各一次，按摩1分钟为佳，可帮助皮肤吸收；持续涂抹14天；
[0070] (4)参照步骤(2)，受试者接受面部表层皮肤与深层皮肤扫描，扫描时间标记为D14；
[0071] (5)参照步骤(3)继续使用测试样品和对照样品14天；
[0072] (6)参照步骤(2)，受试者接受面部表层皮肤与深层皮肤扫描，扫描时间标记为D28；
[0073] (7)对使用前D0、使用中D14和使用后D28受试者面部表层皮肤与深层皮肤照片进行比较分析，可得知实施例3中的间充质干细胞衍生液具有显著的亮肤和祛斑效果，而对照组样品使用前后无明显差异。
[0074] 4、抗皱效果测试
[0075] (1)招募30位50-60岁身体健康的男性、女性混合志愿者，其中男性14位，女性16位。随机将其分为试验组和对照组，每组各15人；
[0076] (2)志愿者自行清洁面部皮肤后，在温度21±1℃，50±5％RH的实验室中静坐30分钟，期间不能使用护肤品。实验人员使用皮肤快速光学成像系统DermaTOP对志愿者进行眼部周围皱纹深度扫描，皮肤纹理度的变化直接通过皮肤粗糙度Rt进行量化，此次量化结果记为试验空白值。
[0077] (3)根据产品使用要求，实验组使用测试样品，对照组使用对照样品；测试样品为90％无菌纯水加入10％实施例3所制备的间充质干细胞衍生液混匀后分装，每份3mL,密封包装，开盖后24小时内用完，需冷藏；对照样品为空白凝胶，需冷藏；使用方法：用洗面奶清洁面部皮肤，取适量涂抹在眼部周围，轻轻打圈至完全吸收，早晚各一次，持续涂抹14天；
[0078] (4)参照步骤(2)，受试者接受眼部周围皮肤进行扫描，扫描结果为：试验组Rt值平均降低4.1％，对照区Rt值平均降低2.3％；
[0079] (5)参照步骤(3)继续使用测试样品和对照样品28天；
[0080] (6)参照步骤(2)，受试者接受眼部周围皮肤进行扫描，扫描结果为：试验组Rt值平均降低12.3％，对照区Rt值平均降低2.7％；
[0081] (7)对使用前、使用14天和使用42天受试者眼部皮肤Rt平均数值进行分析，结果显示实施例3中的间充质干细胞衍生液具有显著的除皱效果，对照组样品则无显著除皱效果。
[0082] 5、细胞划痕修复效果检测
[0083] (1)将实施例1所得间充质干细胞衍生液按2倍梯度浓度稀释在含2％FCS的MEM培养基中，稀释浓度分别为2％、4％和8％；对照组使用完全培养液，即含10％FCS的MEM培养基。
[0084] (2)将Hacat细胞用10％FCS MEM培养基在T175的培养瓶里培养，待细胞铺满培养瓶，用0.05％胰酶消化，1000rpm/min离心10min。重悬接种6孔板，3×105个细胞/孔。
[0085] (3)1天后细胞长近100％，用200μL枪头在每孔细胞中划痕。用37℃预热1×PBS洗涤细胞3次，加2％FCS MEM配制的梯度浓度待测样品和对照组样品；
[0086] (4)36h后观察划痕愈合明显，吸掉培养基，用37℃预热1×PBS洗涤细胞3次，加冷甲醇1.5mL，4℃孵育。
[0087] (5)5h后，吸掉冷甲醇，加1×Geimsa染液1.5mL。
[0088] (6)45min后，吸掉染液，流水冲洗，晾干。
[0089] (7)对划痕拍照，图像使用Image J进行处理分析,结果显示：实施例1所得的间充质干细胞衍生液能显著促进Hacat细胞的伤口愈合能力，而完全培养液对伤口愈合能力的促进效果不明显。该结果说明干细胞衍生液能促进Hacat细胞的增殖和迁移能力，对划痕损伤细胞的修复具有显著效果。
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