技术领域
[0001] 本
发明涉及一种
微生物的快速分离方法，更具体的说是一种快速筛选抗菌活性丝状真菌的方法。
背景技术
[0002] 抗生素的长期广泛使用导致耐药性病原细菌种类增加，甚至出现“超级细菌”，新的感染性
疾病也不断涌现，致使新型抗菌物质的研究与开发迫在眉睫（李越中, 陈琦. 海洋微生物资源及其产生生物活性代谢产物的研究，
生物工程进展，2000, 20 (5): 28-31)。一直以来，放线菌被认为是活性
次级代谢产物的最主要来源，但是近期的研究表明，丝状真菌产活性次级代谢产物的潜
力也非常巨大，因此筛选丝状真菌活性次级代谢产物成为研究热点（朱伟明，王俊锋. 海洋真菌生物活性物质研究之管见，菌物学报，2011, 30(2): 218-
228）
[0003] 微生物活性次级代谢产物的筛选方法是制约新颖活性次级代谢产物筛选效率的关键步骤。分子生物学技术快速发展，通过构建宏基因组文库筛选新型天然产物可以避开微生物的分离过程，扩大了天然产物筛选范围。但是，目前环境大
片段DNA 的提取困难、基因在宿主细胞中不表达或表达量低、无法进行高通量的活性物质筛选等问题制约了宏基因组文库的实用性。通过化学修饰或全化学合成可以获得新颖抗生素，但是合成过程复杂，且造成环境污染。通过基因组发掘可以提高天然产物的发现效率，但是天然产物基因簇的功能鉴定一直是尚未解决的难题（白林泉，邓子新. 微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新，中国抗生素杂志，2006, 31(2): 80-86）。由此可见，对微生物进行调查，筛选新型次级代谢产物产生菌株，仍然是一种重要的开发新型抗生素的途径。
[0004] 近期研究表明，两种或多种微生物的共培养可以刺激微生物产生新颖的次级代谢产物，对新颖物质的开发有重要意义，提供了通过共培养提高新颖抗菌物质的筛选效率的可能性。（黄兵，刘宁，黄英，陈劲春. 放线菌与枯草芽孢杆菌的共培养及其对活性次生代谢产物的影响，生物工程学报，2009, 25(6): 932-940）。但是，目前对新颖抗菌物质的筛选方法多以单一的纯菌种进行的筛选方法。通过共培养筛选新颖抗菌物质产生丝状真菌，按传统方法，首先分离丝状真菌，对所有菌株和其它菌株共同液体培养
发酵，制备发酵上清液或发酵液
有机溶剂萃取液，进一步用
滤纸片法、管碟法、打孔法测定抑菌活性（李小俊，成丽霞，吴彦彬，边艳青. 拮抗菌抗菌谱及发酵液拮抗能力测定的新方法，生物技术，2007，17(1): 55-58）。该方法成本高，周期长，劳动强度大。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对
现有技术的不足，提供了一种成本低、操作简单、周期短、效率高的通过共培养方式筛选抗菌活性丝状真菌的方法。
[0006] 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种快速筛选抗菌活性丝状真菌的方法，其特点是：
[0007] （1）样品采集：用无菌取样瓶采集
水样及土样，迅速送至实验室，4℃保存；
[0008] （2）培养基制备：营养琼脂培养基：
牛肉膏 3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000 ml，pH7.2；PDA培养基：
马铃薯 200g，
葡萄糖 20g，蒸馏水1000 ml，自然pH；若制备固体培养基平板，添加琼脂20g/L；121℃灭菌20min，待
温度降至60℃，加入过滤除菌的
链霉素和
氨苄青霉素至终浓度分别为100 mg/ml和 50 mg/ml，混匀后倒平板；若分离是海洋样品则上述培养中配制过程中，用
海水代替蒸馏水；
[0009] （3）截取
吸头的制备：取1ml移液器吸头，以宽口端为准，截取12mm，其余部分锯掉，边缘打磨光滑，121℃灭菌20min；
[0010] （4）共培养菌株的制备：从斜面中挑取Escherichia coli 保存菌种，在厚度约为3mm营养琼脂培养基平板上三区划线，37℃倒置培养至出现单菌落；用截取吸头的窄口端在Escherichia coli单菌落上打孔，使Escherichia coli单菌落及培养基进入吸头内；
[0011] （5）丝状真菌分离及共培养：将所取样品进行梯度稀释，取50μL不同稀释度的稀释液涂布在厚度约为4mm的PDA平板。30℃倒置培养1-5d，在丝状真菌菌落形成初期，即菌落直径小于截取吸头宽口端前，用含有Escherichia coli单菌落及培养基的截取吸头宽口端在培养基上打孔，使丝状真菌菌落和培养基保留在截取吸头宽口端内，并使两侧培养基离开大约3mm的距离，30℃继续培养3d；
[0012] （6）抗菌活性菌株筛选：将共培养吸头宽口端向下置于Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Penicillium expansum等含菌指示平板，并用灭菌
镊子轻压窄口端培养基，使吸头内的丝状真菌和Escherichia coli
接触。指示细菌用培养基为营养琼脂培养基，真菌为PDA培养基。于指示菌适合的温度培养后观察，并用游标卡尺测定抑菌圈的大小，抑菌圈越大，菌株抗菌活性越强，从而快速筛选得到抗菌活性丝状真菌。
[0013] 本发明中涉及的菌株均来自于中国普通微生物菌种保藏中心，Escherichia coli 的保藏号为CGMCC 1.487，Staphylococcus aureus的保藏号为CGMCC 1.2465，Saccharomyces cerevisiae的保藏号为CGMCC 2.114，Penicillium expansum的保藏号为CGMCC 3.3703。
[0014] 本发明所述的一种快速筛选抗菌活性丝状真菌的方法的步骤（5）中，通过截取吸头将Escherichia coli和待筛选丝状真菌共培养，并放于指示菌平板，指示菌培养后测定抑菌圈直径，根据抑菌圈的有无和大小快速筛选抗菌活性菌株。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明方法通过共培养的方式快速地筛选抗菌活性丝状真菌，与纯种培养筛选抗菌活性丝状真菌相比，可以增加新颖抗菌活性菌株及抗菌活性物质的筛选几率，并且整个筛选过程快速，操作简单，能够快速、直观、高效的筛选到抗菌活性的丝状真菌，为抗菌活性丝状真菌的筛选研究提供了极大方便。
具体实施方式
[0016] 以下通过实例进一步说明本发明，以使本领域技术人员可以更好地理解本发明，而不构成对本发明权利的限制。
[0017]
实施例1，一种快速筛选抗菌活性丝状真菌的方法，
[0018] （1）样品采集：用无菌取样瓶采集海水样及土样，迅速送至实验室，4℃保存；
[0019] （2）培养基制备：营养琼脂培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000 ml，pH7.2；PDA培养基：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，蒸馏水1000 ml，自然pH；若制备固体培养基平板，添加琼脂20g/L；用于丝状真菌分离时，PDA培养基灭菌后待温度降至60℃，加入过滤除菌的链霉素和氨苄青霉素至终浓度分别为100 mg/ml和 50 mg/ml，混匀后倒平板；若为海洋样品则上述培养中配制过程中，用海水代替蒸馏水；
[0020] （3）截取吸头的制备：取1ml移液器吸头，以宽口端为准，截取12mm，其余部分锯掉，边缘打磨光滑，121℃灭菌20min；
[0021] （4）共培养菌株的制备：从斜面中挑取Escherichia coli 保存菌种，在厚度约为3mm营养琼脂培养基平板上三区划线，37℃倒置培养至出现单菌落；用截取吸头的窄口端在Escherichia coli单菌落上打孔，使Escherichia coli单菌落及培养基进入吸头内；
[0022] （5）丝状真菌分离及共培养：将所取样品进行梯度稀释，取50μL不同稀释度的稀释液涂布在厚度约为4mm的PDA平板。30℃倒置培养1-5d，在丝状真菌菌落形成初期，即菌落直径小于截取吸头宽口端前，用含有Escherichia coli单菌落及培养基的截取吸头宽口端在培养基上打孔，使丝状真菌菌落和培养基保留在截取吸头宽口端内，并使两侧培养基离开大约3mm的距离，30℃继续培养3d；
[0023] （6）抗菌活性菌株筛选：将共培养吸头宽口端向下置于Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Penicillium expansum等含菌指示平板，并用灭菌镊子轻压窄口端培养基，使吸头内的丝状真菌和Escherichia coli接触。指示细菌用培养基为营养琼脂培养基，真菌为PDA培养基。于指示菌适合的温度培养后观察，并用游标卡尺测定抑菌圈的大小；抑菌圈越大，菌株抗菌活性越强；从而快速筛选得到抗菌活性丝状真菌。
[0024] （7）菌株的培养特征及生理生化鉴定
[0025] 真菌的鉴定参照《真菌鉴定手册》（魏景超，上海: 上海科学技术出版社, 1979）和文献（许玉林，郑月霞，叶
冰莹，张积森，陈由强. 一株
纤维素降解真菌的筛选及鉴定，微生物学报，2013, 40(2): 220−227）进行。
[0026] 实施例2，实施例1所述的一种快速筛选抗菌活性丝状真菌的方法的步骤（5）中，通过截取吸头将Escherichia coli和待筛选丝状真菌共培养，并放于指示菌平板，指示菌培养后测定抑菌圈直径，根据抑菌圈的有无和大小快速筛选抗菌活性菌株。
[0027] 实施例3，对比实验：
[0028] 1．现有技术方法筛选。从连
云港海域连岛取海水、海泥，花果山上采集
土壤和
淡水样品，通过稀释涂布法利用PDA培养基分离丝状真菌，海洋样品中丝状真菌分离培养基中用海水代替蒸馏水。将纯化后的单菌落接种至PDA斜面培养后4℃保藏。共分离获得丝状真菌122株。将不同菌株接种至PDA液体培养基, 30℃，160rpm培养2-3d，发酵液双层滤纸抽滤后, 上清液过0. 22 µm微孔滤膜后为待测样品，采用管碟法测定抑菌活性。每个牛津杯中加入200 μL发酵样品，采用含Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Penicillium expansum指示菌平板，30℃培养后观察，共获得抗Staphylococcus aureus活性菌株18株，抗Escherichia coli活性菌株13株，抗Saccharomyces cerevisiae活性菌株3株，抗Penicillium expansum活性菌株8株。
[0029] 2．采用实施例1记载的本发明方法进行筛选。用上述同样的海洋及陆源样品，通过稀释涂布法利用PDA培养基分离丝状真菌。从斜面中挑取Escherichia coli 保存菌种，在厚度约为3mm营养琼脂培养基平板上三区划线，37℃倒置培养至出现单菌落；用截取吸头的窄口端在Escherichia coli单菌落上打孔，使Escherichia coli单菌落及培养基进入吸头内。在丝状真菌菌落形成初期，即菌落直径小于截取吸头宽口端前，用含有Escherichia coli单菌落及培养基的截取吸头宽口端在培养基上打孔，使丝状真菌菌落和培养基保留在截取吸头宽口端内，并使两侧培养基离开大约3mm的距离，30℃继续培养3d。将此共培养微生物的截取吸头宽口端置于含Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Penicillium expansum指示菌平板，30℃培养后观察，共获得抗Staphylococcus aureus活性菌株22株，抗Escherichia coli活性菌株15株，抗Saccharomyces cerevisiae活性菌株6株，抗Penicillium expansum活性菌株10株。
[0030] 从以上对比筛选实验可以看出，本发明方法显著地提高了抗菌活性丝状真菌的筛选效率。
