一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专
用培养基及培养方法
技术领域
背景技术
[0002] 食管癌是常见的消化道
恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％。全世界每年约有20～30万人死于食管癌。食管癌在我国消化系统肿瘤中应该是排第一位的，在整个肿瘤排序中位次也很高，约四五位
水平。与其他国家相比较，我国的食管癌发病率是比较高的，全球近一半的食管癌发生在中国。我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家，每年食管癌发病和死亡人数都占全球人数一半以上。可见，食管癌可以算做最具中国特色的恶性肿瘤之一。食管癌的发病与环境和遗传因素有关，但确切原因和发病机制还不清楚。与胃癌，肝癌类似，由于西方国家的发病率相对较低，致使世界范围内食管癌的研究较其他西方高发的肿瘤落后。而作为我国发生率最高，致死率最高的几种肿瘤之一，加强食管癌的发病机理研究和药物研发有非常重大的现实意义。
[0003] 现有的食管癌细胞系主要通过长期培养，自发永生化或者
转染促使正常细胞永生化的癌基因获得。例如Het-1A是一株由人正常食管上皮细胞，通过转染Sv40病毒的大T
抗原，使细胞得到永生化而获得。这些方法改变了细胞的遗传背景，长期培养的细胞系，也容易造成基因组不稳定，可能导致肿瘤细胞系的表型和体内肿瘤细胞发生人为的改变，影响食管癌科学研究和药法研发的准确性。
[0004] 之前的食管癌原代培养模式，把肿瘤细胞与其它细胞分离后，种植于细胞培养皿中，细胞失去了原有的微环境。因此细胞很难长期稳定培养。因此，在体外模拟肿瘤生长的微环境，提供肿瘤赖以生存的三维
支撑和多种生存通路，有可能实现在体外长期稳定的培养肿瘤组织。
[0005] 体外原代肿瘤细胞类器官的培养，需要提供模拟肿瘤在体内的微环境。这些微环境包括维持三维立体培养状态的细胞外基质、维持生存重要通路的生长因子、抑制细胞分化的因子、各种维生素、微量元素、
激素、
能量代谢、抗
氧化因子、精细的化学同步
信号和抗调亡物质。每一种肿瘤类型，甚至不同的肿瘤细胞亚型，这些微环境因素都可能大不相同，因此，不同肿瘤类型的细胞原代类器官培养，需要针对这种肿瘤的类型，逐一优化。
[0006] 原有类器官培养技术应用到人食管癌类器官培养有如下问题：第一代培养时间较长，需要2至6周才能完成第一代培养；传代后类器官的活
力迅速下降，生长速度明显减慢；冻存后复苏效率低，容易死亡，活力降低，生长速度减慢；培养的成功率不高，手术获取的新鲜标本不足60％；对于活检标本，原有类器官培养技术几乎无法有效培养。
[0007] 食管癌细胞的肿瘤类器官培养，使在小鼠和人干细胞类器官培养的条件
基础上，结合食管癌细胞的特点，进一步优化条件，以利用更小的组织，在更短的时间内，获得更好的细胞活力和更高的成功率。
发明内容
[0008] 本发明的目的是解决上述
现有技术的不足，提供一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法。
[0009] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0010] 一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，所述专用培养基包括以下组分：
[0012] (2)Rho相关的卷曲蛋白激酶(ROCK1、ROCK2)
抑制剂，
[0013] (3)维生素和激素，
[0015] (5)抑制细胞分化的通路的激动剂。
[0016] 优选地，所述受体酪氨酸激酶配体包括人或动物的表皮细胞生长因子(EGF)、人或动物
肝细胞生长因子(HGF)和人或动物
碱性成
纤维生长因子(bFGF)中的一种或多种。
[0017] 优选地，所述
[0018] 人或动物的表皮细胞生长因子的浓度范围为2ng/mL～100ng/mL；
[0019] 人或动物肝细胞生长因子的浓度范围为10ng/mL～200ng/mL；
[0020] 人或动物碱性成纤维生长因子的浓度范围为5ng/mL～100ng/mL。
[0021] 优选地，所述Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂包括Fasudil、Y-27632、RKI-1447和GSK429286A中的一种或多种。
[0022] 优选地，所述维生素和激素包括腐胺、肾上腺
酮、烟酰胺和维生素A
醋酸酯中的一种或多种。
[0023] 优选地，所述
[0024] 腐胺的浓度范围为0.1μg/mL～100μg/mL；
[0025] 肾上腺酮的浓度范围为10ng/mL～10μg/mL；
[0026] 烟酰胺的浓度范围为1μg/mL～2mg/mL；
[0027] 维生素A醋酸酯的浓度范围在10ng/mL～500ng/mL。
[0028] 优选地，所述抗氧化剂包括还
原型谷胱甘肽(GSH)、维生素C、维生素E和β-巯基
乙醇中的一种或多种。
[0029] 优选地，所述β-巯基乙醇的浓度范围为0.01mM～1.5mM。
[0030] 优选地，所述抑制细胞分化的通路的激动剂包括人激活素A蛋白、Wnt通路激动剂、Hedgehog通路激动剂中的一种或多种。
[0031] 优选地，所述
[0032] 人激活素A(activin A)蛋白的浓度范围为5ng/mL～200ng/mL；
[0033] Wnt通路激动剂包括重组人或动物的Wnt3a蛋白、重组人或动物RSPO-1蛋白、GSK-3β抑制剂中的一种或多种；
[0034] Hedgehog通路激动剂包括重组人或动物SHH蛋白，SMO蛋白的激动剂SAG中的一种或多种。
[0035] 优选地，所述专用培养基包括以下组分：
[0036] ECRM-I：DMEM/F12培养基，添加2.5％胎
牛血清(FBS)、1x B27添加剂、
抗坏血酸、维生素A醋酸酯、肾上腺酮、腐胺、烟酰胺、胰岛素、氢化可的松、人激活素A、FGF2、Wnt3a、EGF、视黄酸和Y27632；或者
[0037] ECRM-II：DMEM/F12培养基，添加2.5％胎牛血清、1x B27添加剂、烟酰胺、肾上腺酮、BMP4、EGF、Wnt3a、IGF、丁酸钠、腐胺、维生素A醋酸酯、胰岛素、地塞米松、β-巯基乙醇、FGF2、人激活素A、视黄酸和Y27632；或者
[0038] ECRM-III：DMEM/F12培养基，添加1％牛血清
白蛋白(BSA)、1x B27添加剂、过氧化氢霉、维生素A醋酸酯、烟酰胺、肾上腺酮、丁酸钠、胰岛素、地塞米松、腐胺、还原型谷胱甘肽、人激活素A、EGF、BMP4、FGF1、NOG、SAG、RSPO1、Wnt3a和Y27632；或者
[0039] EDM-1：DMEM/F12培养基，添加2.5％胎牛血清、1x B27添加剂、HGF、IGF、Wnt3a、EGF、人激活素A、肾上腺酮、维生素A醋酸酯、烟酰胺、胰岛素、还原型谷胱甘肽。
[0040] 一种利用基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基的培养方法，包括以下步骤：
[0041] (1)将新鲜获取的食管癌标本组织，用组织清洗液清洗；
[0042] (2)经清洗后的食管癌标本组织转移入组织转移液中，置于0到4摄氏度转移或短期保存；
[0043] (3)从组织转移液中取出组织
块，在组织清洗液中漂洗后，转移到无菌细胞培养皿中，吸掉多余液体；
[0044] (4)根据组织块的大小，加入组织消化液，用灭菌剪反复剪碎组织；
[0045] (5)把剪碎的组织转移到无菌离心管中，继续加入2～10mL组织消化液，清洗转移培养皿中的肿瘤组织，并入无菌离心管中；
[0046] (6)将无菌离心管置于37摄氏度摇床中消化，不时取出观察，消化到多以寡细胞团或单细胞为止；
[0047] (7)将无菌离心管中的悬浮液经过70μm细胞筛网，滤过液转移到50mL离心管中；
[0048] (8)向50mL离心管中加入10～30mL PBS，100～300g离心2～5分钟，弃上清，用10～30mL PBS重悬，再次100～300g离心2～5分钟；
[0049] (9)小心地吸去离心管中的上清液，加入3～8mL食管癌肿瘤类器官的专用培养基，重悬细胞；
[0050] (10)取50～200μL细胞悬液加入台盼蓝，用血小板计数器计算活细胞的数量；
[0051] (11)计数后的细胞悬液用食管癌肿瘤类器官的专用培养基进行重悬调整细胞
密度，加入细胞悬液0.1至1倍的4℃解冻的Matrigel；
[0052] (12)细胞悬液与Matrigel重悬后，接种于24孔板，置于37℃细胞
培养箱中，15～30分钟后，待Matrigel
凝固，加入食管癌肿瘤类器官的专用培养基，隔天换液；
[0053] (13)4～10天后，食管癌类器官长成多球体形状，有上皮样细胞层。
[0054] 优选地，步骤(1)和(3)所述组织清洗液的配制方法为：在生理盐水或
磷酸盐缓冲液中加入500U/mL的青霉素、2.5μg/mL的两性霉素B和500μg/mL的
链霉素，过滤除菌。
[0055] 优选地，步骤(2)所述组织转移液的配制方法为：在DMEM培养基中加入5％胎牛血清，再加入500U/mL的青霉素、2.5μg/mL的两性霉素B和500μg/mL的链霉素。
[0056] 优选地，步骤(4)和(5)所述组织消化液的配制方法为：
[0057] EM-BS-1：在DMEM培养基中加入2.5％胎牛血清、1μg/mL～10μg/mL的IX型胶原、50μg/mL-500μg/mL的中性蛋白
水解酶；或者
[0058] EM-BS-2：在DMEM培养基中加入2.5％胎牛血清、1x青霉素和链霉素、0.01mg/mL-1mg/mL的IV型胶原酶、0.001mg/mL～0.2mg/mL的透明质酸酶和0.001mg/mL～0.2mg/mL的DNA酶I；或者
[0059] EM-3：在DMEM培养基中加入2.5％胎牛血清、1x青霉素和链霉素、20U/mL～200U/mL的XI型胶原酶、1μg/mL～100μg/mL的分散酶中性蛋白水解酶I和0.01mg/mL～1mg/mL的DNA酶I。
[0060] 本发明的有益效果在于：
[0061] 本发明通过条件去分化的分步培养技术，实现肿瘤细胞短时间内快速扩增成类器官。这一分步培养的技术使得原代细胞可以快速形成类器官，并在有效地时间内获得足够多的细胞开展后续实验操作。把食管癌原代细胞实现快速扩增的ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III培养基和在放大培养和药物敏感型检测时使用的EDM-1培养基结合使用。
[0062] 在肿瘤类器官培养过程中，肿瘤代谢旺盛，会产生氧自由基并对细胞造成伤害，降低细胞活力，引起分化、凋亡。本发明食管癌原代类器官培养液中添加了抗氧化剂，谷胱甘肽或维生素C或维生素E都是细胞在体内可获取的物质或者是细胞的自然代谢产物，可以维持环境和细胞内的氧化压力平衡，清除氧自由基，具有保护细胞膜完整性的作用。β-巯基乙醇也是细胞培养、特别是干细胞培养过程中常见的添加剂。研究表明，抗氧化剂的缺乏将使细胞对氧化压力的
反应性增强，使类器官活力下降，容易老化，功能恢复延迟。长期培养的食管癌类器官会有一定比例的出现更多碎片，细胞中出现囊泡，生长速度明显降低等问题。抗氧化剂能提高细胞的活力，降低产生老化的比例。
[0063] 本发明可以提高类器官的生长速度，由原来的2至6周缩短为1至2周。
[0064] 本发明提高类器官培养的成功率，手术
切除的肿瘤标本提高至80％以上。
[0065] 本发明通过优化组织消化液的配方和使用方法，从微小的标本中获取足够培养的活肿瘤细胞，使得原来无法培养的活检标本成为可能。
[0066] 本发明通过优化传代和冻存的配方和技术，使得类器官传代和复苏后保持良好的活力。
[0067] 本发明中，某些特定条件下优化了
葡萄糖的浓度，相配合的，通过添加抗氧化自由基
试剂，减少长期培养中引起的细胞衰老。
附图说明
[0068] 图1为多种添加物配方体外培养形成类器官率数目的统计结果。
[0069] 其中，B为基础培养基培养，BW为在基础培养基的基础上添加Wnt3a培养，B27为在基础培养基的基础上添加B27添加剂培养，BM为在基础培养基的基础上添加BMP4培养，BE为在基础培养基的基础上添加EGF培养，BF为在基础培养基的基础上添加FGF2培养，BH为在基础培养基的基础上添加HGF培养，BEW为在基础培养基的基础上添加Wnt3a和EGF培养，EDM-I、ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III分别为对应培养基培养。
具体实施方式
[0070] 为更好理解本发明，下面结合
实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。
[0071] 实施例一 专用培养基的配制
[0072] 本发明所述培养基中包含有
[0073] 一种或几种受体酪氨酸激酶配体：包括人或动物的表皮细胞生长因子，浓度范围在2ng/mL至100ng/mL；人或动物肝细胞生长因子，浓度范围在10ng/mL至200ng/mL；人或动物碱性成纤维生长因子，浓度范围为5ng/mL至100ng/mL；
[0074] Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂：选自Fasudil、Y-27632、RKI-1447和GSK429286A；
[0075] 多种维生素和激素：腐胺，浓度范围在0.1μg/mL至100μg/mL；肾上腺酮，浓度范围在10ng/mL至10μg/mL；烟酰胺，浓度范围在1μg/mL至2mg/mL；维生素A醋酸酯，浓度范围在10ng/mL至500ng/mL；
[0076] 抗氧化剂：选自还原型谷胱甘肽；维生素C；维生素E；β-巯基乙醇(0.01mM至1.5mM)；
[0077] 抑制细胞分化的通路的激动剂：人激活素A蛋白，浓度范围为5n/mL至200ng/mL；Wnt通路激动剂，包括重组人或动物的Wnt3a蛋白，重组人或动物RSPO-1蛋白；GSK-3β抑制剂，选自CHIR-99021(CAS号：252917-06-9)、SB216763(CAS号：280744-09-4)等；Hedgehog通路激动剂，包括重组人或动物SHH(Sonic hedgehog)蛋白，SMO蛋白的激动剂SAG(CAS号：
912545-86-9)。
[0078] 实施例二 食管癌原代细胞实现快速扩增的ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III培养基和在放大培养和药物敏感型检测时使用的EDM-1培养基的配制
[0079] ECRM-I的配方包括DMEM/F12培养基，添加2.5％FBS、1x B27添加剂、抗坏血酸、维生素A醋酸酯、肾上腺酮、腐胺、烟酰胺、胰岛素、氢化可的松、人激活素A、FGF2、Wnt3a、EGF、视黄酸和Y27632。
[0080] ECRM-II培养基的配方包括DMEM/F12培养基，添加2.5％FBS、1x B27添加剂、烟酰胺、肾上腺酮、BMP4、EGF、Wnt3a、IGF、丁酸钠、腐胺、维生素A醋酸酯、胰岛素、地塞米松、β-巯基乙醇、FGF2、人激活素A、视黄酸和Y27632。
[0081] ECRM-III培养基的配方包括DMEM/F12培养基，添加1％BSA、1x B27添加剂、过氧化氢霉、维生素A醋酸酯、烟酰胺、肾上腺酮、丁酸钠、胰岛素、地塞米松、腐胺、还原型谷胱甘肽、人激活素A、EGF、BMP4、FGF1、NOG、SAG、RSPO1、Wnt3a和Y27632。
[0082] EDM-I培养基配方包括DMEM/F12培养基中添加2.5％FBS、B27添加剂、HGF、IGF、Wnt3a、EGF、人激活素A、肾上腺酮、维生素A醋酸酯、烟酰胺、胰岛素、还原型谷胱甘肽。
[0083] 实施例三 组织消化液的配制
[0084] 优化手术和活检组织消化液，可实现保持肿瘤活力情况下的最大获取率。
[0085] EM-BS-1组织酶解液的配方如下：在DMEM培养基中加入2.5％FBS、IX型胶原(1μg/mL-10μg/mL)、中性蛋白水解酶(50μg/mL-500μg/mL)。
[0086] EM-BS-2组织酶解液的配方如下：DMEM培养基中加入2.5％FBS、1x青霉素和链霉素、IV型胶原酶(0.01mg/mL-1mg/mL)、透明质酸酶(0.001mg/mL-0.2mg/mL)和DNA酶I(0.001mg/mL-0.2mg/mL)。
[0087] EM-3酶解液的配方如下：DMEM培养基中加入2.5％FBS、1x青霉素和链霉素、XI型胶原酶(20U/mL-200U/mL)、分散酶中性蛋白水解酶I(1μg/mL-100μg/mL)和DNA酶I(0.01mg/mL-1mg/mL)。
[0088] 实施例四 食管癌肿瘤类器官的培养方法
[0089] 本发明获取处理食管癌组织的具体步骤如下：将新鲜获取的食管癌标本组织(包括手术切除组织，活检组织或PDX模型中获取的食管癌组织)，用组织清洗液清洗，清洗三遍后转移入组织转移液中，置于0到4摄氏度转移或短期保存。组织在有空气
净化装置的细胞培养室内，二级以上
生物安全柜内操作。对比较大的手术组织，在含有70％～75％乙醇的医用消毒液中浸泡组织10秒，取出后置于PBS中，清洗3次，去除残余乙醇，转移到无菌细胞培养皿中，吸掉多余液体，用消毒眼科剪去处结缔组织，选择较硬、色白的肿瘤
位置，取10mm见方左右肿瘤组织。加入0.5mL组织消化液，用灭菌眼科剪反复剪碎组织50次以上，剪切成1mm见方的小块，至1mL移液器枪头能顺利吸入。把剪碎的组织转移到无菌离心管中，继续加入2～10mL酶解液，清洗转移培养皿中的肿瘤组织，并入离心管中。置于37摄氏度摇床中消化，不时取出观察，消化到多以寡细胞团或单细胞为止。经过70μm细胞筛网，滤过液转移到50mL离心管中，加入20mL PBS，200g离心3分钟，弃上清，用20mL PBS重悬，再次200g离心3分钟。小心地吸去上清，加入5mL本发明所述食管癌类器官培养专用培养液，重悬细胞。取100μL细胞悬液加入台盼蓝，用血小板计数器计算活细胞的数量。
[0090] 本发明所述食管癌细胞类器官的培养阶段具体操作步骤：食管癌组织经过机械剪切和酶消化后，获得单细胞和寡细胞团悬液，计数后用培养基重悬调整细胞密度，加入等体积4℃解冻的Matrigel混合，在某些实施方案中，Marigel加入体积调整为细胞悬液的0.1倍至1倍。细胞悬液与Matrigel重悬后，接种于24孔板，置于37℃细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，隔天换液。4-10天后，食管癌类器官长成多球体形状，有上皮样细胞层。
[0091] 食管癌原代细胞标本采集是原代细胞培养成功的关键步骤，标本采集和运输不当，将会直接影响肿瘤类器官的成功与否，肿瘤标本采集的基本要求和注意事项叙述如下：(1)防控细菌和
真菌污染。手术操作环境并非无菌操作，环境和体内都有很多
微生物，正确的采集和处理方式可以最大限度的降低污染。配制组织清洗液：生理盐水(0.9％
氯化钠)或者磷酸盐缓冲液(PBS)中加入青霉素(500U/mL)、两性霉素B(2.5μg/mL)和链霉素(500μg/mL)，过滤除菌。配制组织转移液：DMEM培养基中加入5％胎牛血清，加入青霉素(500U/mL)、两性霉素B(2.5μg/mL)和链霉素(500μg/mL)。取材用的
剪刀、
镊子、刀片等器械高压灭菌后烘干。(2)标本采集要尽量选取包膜完整，生长旺盛的区域，避免腐烂组织、
坏死组织、脂肪和结缔组织。预处理时要仔细去除组织上的血液、脂肪、坏死组织及结缔组织。(3)操作运输过程要尽量快，组织离体后的时间越久，体外构建肿瘤类器官的成功率越低，一般在离体后
4小时内完成培养操作。必要时，标本可在标本转移液中4摄氏度过夜储存，但是会大大降低成功率，增加污染几率。
[0092] 通过条件去分化的分步培养技术，实现肿瘤细胞短时间内快速扩增成类器官。这一分步培养的技术使得原代细胞可以快速形成类器官，并在有效地时间内获得足够多的细胞开展后续实验操作。在一些实施方案中，从获取手术或活检标本制备的单细胞或寡细胞使用ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III培养基培养细胞，实现肿瘤细胞的部分去分化和快速扩增，这一过程在3-10天不等。例如第0-7日，第0-6日，第0-5日，第0-4日，第0-3日，第0-2日，第0-1日，其中第0日是细胞从其来源组织分离的那一日，第1日是随后的那一日，或者使用EDM-I培养基培养细胞1周或更久，例如2、3、4周或更久，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久。在一些实施方案中，EDM-I培养基在培养的第一日即可使用，在使用EDM-I培养基的条件下，进行对肿瘤类器官生物学或者药效的实验。
[0093] 实施例五 测试多种添加物配方对类器官体外培养形成率的影响
[0094] 在DMEM/F12培养基中加入2.5％FBS、肾上腺酮、烟酰胺、抗坏血酸和抗生素作为基础培养基(B)，在此基础上分别添加Wnt3a(BW)、添加B27添加剂(B27)、添加BMP4(BM)、添加EGF(BE)、添加FGF2(BF)、添加HGF(BH)、添加Wnt3a和EGF(BEW)。此外还有如上文所述的ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III和EDM-I培养条件。在这些培养条件下，测试P1代类器官的形成率，P0带类器官的单细胞5x104与基质胶混合后铺在预先湿润的24孔板中，在37摄氏度静止10分钟后，待基质胶
固化后，分别在不同孔中加入1mL上述培养基。分别在培养的第五天和第七天记录扩增的类器官数目。
[0095] 如图1所示，ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III和EDM-I培养条件下，明显优于B、BW、B27、BM、BF、BH、BEW培养条件，其中ECRM-II的培养条件效果最佳。
[0096] 以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种
变形和改进，均应落入本发明的
权利要求书确定的保护范围内。
