乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤
性的研究方法
技术领域
背景技术
[0002] 自从Otto Warburg在1956年提出著名的“无
氧糖酵解理论”，认为无氧糖酵解在
肿瘤的发生中起了至关重要的作用，无氧代谢也被认为是肿瘤的标志物之一。即使在氧存在的情况下，肿瘤细胞也主要依赖分解糖原产生
能量，导致高浓度的乳酸的产生和堆积。乳酸有很多作用。一方面，无氧糖酵解能够产生能量，维持肿瘤细胞的生长和其他活动；另一方面，糖酵解产生的乳酸能使肿瘤微环境的pH值降低，创造一个能够促进肿瘤发生发展和转移的酸性环境。越来越多的证据显示，曾经被认为是代谢废物的乳酸，能够作为一个调控因子，在肿瘤的发生发展和转移中起到重要的调节作用。确实，实验证明，在多种肿瘤类型比如淋巴瘤、
乳腺癌、胰腺癌和
前列腺癌中，组织和细胞中乳酸的浓度和肿瘤的发生、转移和肿瘤病人的
预后差密切相关。因此，乳酸含量和酸性微环境已经被公认为是肿瘤诊断和抗肿瘤
治疗的标志物。
[0003] 全世界的科学家都试图阐明无氧代谢与肿瘤发生发展之间的关系。乳酸通过促进细胞“干性”相关基因或者转录因子如SP1,MAZ, MEIS1等高表达或过表达使细胞重编程。Ubaldo等曾报道，乳酸能够增加细胞的干性。但是，乳酸促进淋巴瘤的发生的机制还不明确。
[0004] 二代测序技术和基因表达谱分析表明，淋巴瘤的起始和发展与原癌基因的多位点突变导致与肿瘤发生相关的
信号通路的激活密切相关。除此之外，高浓度的乳酸和酸性肿瘤微环境也常见于淋巴瘤病人中，对淋巴瘤病人的病情恶化起了一定的推动作用。但是，乳酸引起淋巴瘤恶化的机制迄今还不明确。我们猜想，乳酸可能是通过促进淋巴瘤发生过程中关键的原癌基因的表达来实现的，而这些原癌基因有哪些迄今还没有报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种方便、准确的乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤性的研究方法。
[0006] 本发明的技术解决方案是：
[0007] 一种乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤性的研究方法，其特征是：包括下列步骤：
[0008] (1)细胞培养
[0009] HMY2-CIR细胞株的培液是在DMEM高糖培养基中加入了10％胎
牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml
链霉素，并且调节成不同的pH 值；培养条件为5％CO2，37℃；
[0010] (2)低pH培养基制备
[0011] 20mM乳酸溶解于上述DMEM中，用pH计测试溶液的pH值，并且在培养基中加入
盐酸将溶液的pH值调至5.6和6.0；
[0012] (3)细胞形态学检测
[0013] HMY2-CIR细胞分别用pH7.4,6.0和5.6的培养基培养八周，每三天换一次培养基，然后利用甩片机将细胞黏附到玻片上，用瑞姬氏染液进行
染色；
[0015] 细胞增殖是用Alamar Blue assay进行检测：将相同数量的 HMY2-CIR细胞200μl加入96孔培养板中，并在每个孔中加上不同pH 的培养基，用DMSO作为对照，培养三天后，在每个孔中加入10μl的 Alamar Blue染液。并在37℃，5％CO2的条件下继续培养2小时，用SpectraMax M5 multi-detection reader读取560nm至590nm 的吸光度值；
[0016] (5)集落生成实验
[0017] HMY2-CIR细胞在不同pH值的培养液中培养了8周后，用新鲜的培养基洗两遍，并且重悬计数；取1×103个活细胞与Methocult H4230 methylcellulose混合后置于30mm培养皿中，并于37℃和5％ CO2条件下培养14天；14天后，对克隆的数量进行计数，大于50个细胞算作克隆，并用体视
显微镜进行拍照；
[0018] (6)RT-PCR
[0019] 从用乳酸处理过的HMY2-CIR细胞中提取总RNA；然后用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis
试剂盒和oligo(dT)引物进行逆转录，每20μL反应体系中含有5μg总RNA，还需要加入 RNase-free DNase I；每一个25μL的RT-PCR反应体系中含有1μL cDNA和1μL TaKaRa Taq DNA聚合酶；反应条件为94℃4分钟,94 ℃30秒，25-35个循环,58–68℃30秒,72℃1分钟.RT-PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶
电泳进行分离；所用的引物序列在表I中列出：
[0020]
[0021] (7)数据分析
[0022] 数据都是均值±方差；组别之间的差异都是用SPSS 16.0
软件进行分析；*P<0.05代表有差异，**P<0.01代表差异显著。
[0023] 人B淋巴母细胞HMY2-CIR在含有20mM乳酸的培养液中培养72 小时，并用Alamar Blue assay检测细胞的增殖情况，*P<0.05；
[0024] 人B淋巴母细胞HMY2-CIR在20mM乳酸中培养8周后收取细胞，细胞计数后取1000个活细胞，加入甲基
纤维素中，混匀后置于
培养箱中；14天后，计数集落的数量，并用体式显微镜进行拍照，对计得的集落数量进行统计学分析，**P<0.01；
[0025] 人B淋巴母细胞HMY2-CIR在20mM乳酸中培养8周后收取细胞，提取总RNA后用RT-PCR检测多个原癌基因的表达情况，条带的灰度用Quantity One软件进行扫描，并进行统计；这些实验数据至少重复三次；*P<0.05；**P<0.01。
[0026] 本发明方便、准确。用没有致瘤性的B淋巴母细胞HMY2-CIR作为细胞模型，研究发现，乳酸能够促进五个关键的与细胞干性相关的原癌基因的表达，包括ALDH1A1,EpCAM,Oct4,KLF4,和Nestin,并且能够促进HMY2-CIR细胞去分化而获得致瘤性。这些数据说明，乳酸能够诱导原癌基因的表达，使没有致瘤性的淋巴母细胞去分化获得了致瘤的能
力。
附图说明
[0027] 下面结合附图和
实施例对本发明作进一步说明。
[0028] 图1是乳酸和酸性环境诱导HMY2-CIR细胞形态变化，促进细胞增殖示意图。
[0029] 图2是乳酸和酸性环境增强人B淋巴母细胞HMY2-CIR的干性示意图。
[0030] 图3是乳酸和酸性环境促进HMY2-CIR细胞中多个与细胞致瘤性相关的基因过表达示意图。
[0031] 图1中：
[0032] 人B淋巴母细胞HMY2-CIR在20mM乳酸中培养8周后收取细胞，用瑞姬氏染色，并用正置显微镜进行拍照(图1A)。人B淋巴母细胞 HMY2-CIR在含有20mM乳酸的培养液中培养72小时，并用Alamar Blue assay检测细胞的增殖情况(mean±SD；n＝6)。*P<0.05。
[0033] 图2中：
[0034] 人B淋巴母细胞HMY2-CIR在20mM乳酸中培养8周后收取细胞，细胞计数后取1000个活细胞，加入甲基
纤维素中，混匀后置于培养箱中。14天后，计数集落的数量，并用体式显微镜进行拍照(SZX16, OLYMPUS)(图2A)。对计得的集落数量进行统计学分析(图2B；mean ±SD,n＝3)。**P<0.01。
[0035] 图3中：
[0036] 人B淋巴母细胞HMY2-CIR在20mM乳酸中培养8周后收取细胞，提取总RNA后用RT-PCR检测多个原癌基因的表达情况：ALDH1A1， CD34，EpCAM，C-KIT，Nestin，Oct4，MYC，Nanog，KLF4(图3A)。条带的灰度用Quantity One软件进行扫描，并进行统计，ALDH1A1(图 3B)，EpCAM(图3C)，Nestin(图3D)，Oct4(图3E)。这些实验数据至少重复了三次。*P<0.05。**P<0.01。
具体实施方式
[0037] 材料和方法
[0038] 2.1.材料
[0039] 乳酸购买于Sigma(上海)公司。HMY2-CIR细胞株购买于ATCC (Manassas,VA)。RNase-free DNase I购买于Qiagen(上海)。TaqTM DNA聚合酶购买于TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd。RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis试剂盒购买于南京诺维赞公司。 Methocult H4230 methylcellulose甲基纤维素购买于Stem Cell Technologies。PCR引物是从上海生工
生物技术有限公司订购的。
[0040] 2.2.细胞培养
[0041] HMY2-CIR细胞株的培液是在DMEM高糖培养基中加入了10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，并且调节成不同的pH 值。培养条件为5％CO2，37℃,每三天换一次培养基，持续八周。
[0042] 2.3.低pH培养基制备
[0043] 20mM乳酸溶解于上述DMEM中，用pH计测试溶液的pH值，并且在培养基中加入盐酸将溶液的pH值调至5.6和6.0。
[0044] 2.4.细胞形态学检测
[0045] HMY2-CIR细胞分别用pH7.4,6.0和5.6的培养基培养八周，每三天换一次培养基，然后利用甩片机将细胞黏附到玻片上，用瑞姬氏染液进行染色[18]。
[0046] 2.5.细胞增殖的测定
[0047] 细胞增殖是用Alamar Blue assay进行检测的。我们在之前的文章中有过报道。简单地说，将相同数量的HMY2-CIR细胞200μl加入96孔培养板中，并在每个孔中加上不同pH的培养基，用DMSO作为对照，培养三天后，在每个孔中加入10μl的Alamar Blue染液。并在37℃，5％CO2的条件下继续培养2小时，用SpectraMax M5 multi-detection reader读取560nm至590nm的吸光度值。
[0048] 2.6.集落生成实验
[0049] HMY2-CIR细胞在不同pH值的培养液中培养了8周后，用新鲜的培养基洗两遍，并且重悬计数。取1×103个活细胞与Methocult H4230 methylcellulose(甲基纤维素)混合后置于30mm培养皿中，并于37℃和5％CO2条件下培养14天。14天后，对克隆的数量进行计数(大于50个细胞算作克隆)，并用体视显微镜(SZX16, OLYMPUS)进行拍照。
[0050] 2.7.RT-PCR
[0051] 从用乳酸处理过的HMY2-CIR细胞中提取总RNA。然后用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒和oligo(dT)引物进行逆转录，每20μL反应体系中含有5μg总RNA，还需要加入 RNase-free DNase I。每一个25μL的RT-PCR反应体系中含有1μL cDNA和1μL TaKaRa Taq DNA聚合酶。反应条件为94℃ 4分钟,94 ℃ 30秒，25-35个循环,58–68℃ 30秒,72℃ 1分钟.RT-PCR 产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分离。所用的引物序列已经在表I 中列出。
[0052] 2.8.数据分析
[0053] 文中所用的数据都是均值±方差。组别之间的差异都是用SPSS 16.0软件进行分析的。*P<0.05代表有差异，**P<0.01代表差异显著。
[0054] 3.结果
[0055] 3.1乳酸能导致B淋巴母细胞形态发生变化，并且略有促进细胞增殖的作用[0056] 为了研究乳酸和酸性环境对细胞致瘤性的影响，我们用没有致瘤性的B淋巴母细胞HMY2-CIR细胞株作为模型，首次发现了细胞在20 mM乳酸、培养基pH为6.0或者5.6的条件下进行培养三天或者更长时间，细胞的形态发生了明显的变化，然后收取细胞做了瑞姬氏染色来观察细胞形态。结果表明，在20mM乳酸、培养基pH为6.0或者 5.6的条件下，细胞的形态都发生了明显的变化。最明显的特征是，细胞的细胞核变大，
细胞质变少，显示出细胞去分化的形态特征。(图 1A)。此外，我们对于人胃上皮细胞(HGC-27)和低分化的直肠癌 (Hce8693)细胞做了相同的处理(在相同的培养液中培养相同的时间)，也得出了类似的结果(结果未出示)。
[0057] 另外，我们检测了乳酸是否能够促进细胞增殖。Alamar Blue assay的结果证实，仅仅只含有20mM乳酸的培养基(pH在6.8左右) 能够显著地促进HMY2-CIR细胞增殖。总的来说，这些结果证实，乳酸和酸性环境能够诱导B淋巴母细胞HMY2-CIR细胞去分化，并能促进其增殖。
[0058] 3.2乳酸和酸性环境使没有致瘤性的HMY2-CIR获得致瘤性
[0059] 细胞去分化能够使细胞获得很强的干性，从而拥有形成肿瘤细胞的能力。集落生成能力是检测细胞干性和致瘤性的金标准，因此我们做了一个集落生成实验来检测乳酸和酸性环境是否能诱导细胞获得肿瘤生成的能力。14天后，我们对集落数量进行了统计，并对集落进行了拍照。结果显示，在正常的培养基(pH7.4)中培养的淋巴母细胞HMY2-CIR没有集落生成的能力，不能形成集落；相反，在经过乳酸和酸性培养基(pH6.0)培养后，B淋巴母细胞的集落生成能力提力提高了150倍(图2A)，证实乳酸能够促进细胞的肿瘤形成能力。
[0060] 另一方面，没有致瘤性的HMY2-CIR细胞在含有20mM乳酸并且将 pH调至5.6的培养基中培养后，其集落生成的能力也大大增加了，集落生成的数量达到了200+/-37个(图2B)，这个结果提示仅仅是酸性环境(不存在乳酸的作用)也可以增强细胞的致瘤性。
[0061] 3.3乳酸和酸性环境诱导细胞干性和致瘤性的机制研究
[0062] 接着，我们对乳酸和酸性环境诱导细胞干性和致瘤性的机制进行了探究。由于很多促癌基因的过表达能够明显增加细胞的致瘤性，我们用RT-PCR的方法检测了在处理前与处理后与肿瘤干性和致瘤性相关的一些癌基因的表达包括ALDH1A1，Oct4，MYC，Nanog，KLF4，EpCAM， CD34，C-KIT，Nestin，Oct4，MYC，Nanog和KLF4等重要的癌基因。我们发现，许多癌基因的表达被上调。著名的干细胞标志基因ALDH1A1 被上调了9倍之多(3A,3B)。另外，EpCAM的表达量上调了3.7倍(图 3A，3C)。除此之外，Nestin(图3A，3D)，OCT4(图3A，3E)和KLF4 (图3A)分别上调了3.2,2.8和3.1倍。然而，CD34,C-KIT，MYC和 Nanog等其他一些基因却没有发现明显的表达上调(图3A)。这些证据表明，乳酸和酸性环境选择性地使B淋巴母细胞中的部分原癌基因的表达上调，从而增加细胞的干性和致瘤性。
[0063] 4.讨论
[0064] 乳酸在细胞的许多活动中起着重要作用，包括能量调节，免疫耐受，细胞记忆，损伤修复等。另外，也有报道称，乳酸可以促进肿瘤细胞生长和转移，高浓的乳酸和酸性环境和淋巴瘤的恶化和预后差密切相关；然而，乳酸是如何诱导淋巴瘤发生的机制至今还不明确。我们的实验数据表明，乳酸能够促进许多与肿瘤干性和发生相关的原癌基因过表达，从而使没有致瘤性的B淋巴母细胞去分化，增强其致瘤的能力。我们的发现也支持乳酸能够引起基因重编程，从而促进细胞的干性，给乳酸诱导的肿瘤发生提供新的提示。
[0065] ALDH1A1被广泛认为是一个干细胞的标志物，在肿瘤的发生发展中起了重要作用。这个基因属于乙
醛脱氢酶家族，报道称，ALDH1A1 的过表达和胃癌,卵巢癌,多发性骨髓瘤,
结直肠癌,乳腺癌,非小细胞
肺癌,和淋巴瘤的发生发展和预后相关。在我们的研究中，我们发现，乳酸可以诱导ALDH1A1的表达量提高9倍以上，从而提高B 淋巴母细胞的致瘤性。
[0066] 另外，其他几个上调较多的基因包括Oct4，EpCAM，KLF4和Nestin 都是和细胞干性相关的促瘤基因。这些基因高表达，细胞就会有干细胞的特性。比如说，EpCAM一直被用作淋巴瘤诊断的标志物之一； Nestin是一个著名的干细胞标志基因，在乳腺癌，非小细胞肺癌，胶质瘤,子宫内膜癌和淋巴瘤中，它与细胞的增殖，肿瘤的生长和转移都相关。Nestin在B淋巴母细胞中的上调能够使其获得干细胞的特性。Oct4和KLF4都是转录因子，能够诱导“诱导多能干细胞”(iPS) 的形成。我们发现，这两个基因在乳酸的作用下，都被上调，增加了细胞的干性和致瘤性。根据这些资料，我们认为，将培养液的pH调到6.0左右，可能可以用作诱导iPS的一个新的方法，当然还需要进一步研究。
[0067] 总的来说，乳酸诱导没有致瘤性的B淋巴母细胞去分化，通过上调 ALDH1A1，Nestin，Oct4，KLF4和EpCAM等促癌基因的表达，增强其致瘤性。我们的发现阐明了乳酸可能对基因进行重编程，为乳酸诱导细胞的致瘤性提供新的思路。
