技术领域
[0001] 本
发明涉及一种湖羊精液常温保存的稀释液配方及其稀释方法，属于湖羊繁殖技术领域。
背景技术
[0002] 湖羊是世界著名的多胎
绵羊品种，具有四季发情、一年两胎和生长发育快等优点，因此湖羊的养殖规模正在快速扩大。人工受精技术是
家畜繁殖中的一项基本技术，能够充分地利用优良种
公畜的的精液，是一种提高家畜生殖效率和生产
力的重要手段。
[0003] 人工授精技术配合
同期发情技术应用，可以降低养殖成本，防止
疾病的传播，实现规模化的饲养和管理。精液保存则是人工授精技术中的关键环节。精液保存通常分为常温保存、低温保存和冷冻保存。绵羊精子膜上含有大量的高
密度不饱和
脂肪酸并且缺乏抗
氧化剂，由于其特殊的结构，其对冷冻刺激的影响非常敏感，导致了较低的受精率，进而限制了精液冷冻保存在绵羊上的应用。在实际生产中，精液保存大多采用常温保存，其具有处理操作过程简单、适合推广应用、无需特殊的控温及
制冷设备等优点，具有实际的应用价值。现有的精液常温保存稀释液配方其保存的总存活时间只有45小时，活力在0.3以上的时间只有25小时。
[0004] 为此，有必要发明一种可以提高湖羊精液常温保存品质的稀释液配方，来提高人工受精技术的效率，降低精液保存的成本，满足实际生产的需要。
发明内容
[0005] 本发明的目的就是针对上述现有问题，提供一种湖羊精液常温保存的稀释液配方及其稀释方法，用于解决
现有技术中，湖羊精液常温保存时间太短，远远不能满足实际生产所需这一问题。
[0006] 本发明的目的是这样实现的，一种湖羊精液常温保存的稀释液配方，其特征在于，所述配方由30.2～31.2gTris、15.9～16.9g
柠檬酸、19.5～20.5g果糖、0.3～0.4g青霉素钠、0.6～ 0.7g
链霉素硫酸盐溶解于1000mL灭菌的超纯
水中构成；
[0007] 首先将30.2～31.2gTris、15.9～16.9g柠檬酸、19.5～20.5g果糖溶解于1000mL灭菌的超纯水中，使其充分溶解，然后使用0.22μm滤膜进行过滤除菌，过滤除菌后在4℃
冰箱保存，最后添加0.3～0.4g青霉素钠、0.6～0.7g链霉素
硫酸盐，得到湖羊精液常温保存的稀释液。
[0008] 所述Tris、柠檬酸、果糖、青霉素钠、链霉素硫酸盐分别为30.7g、16.4g、20g、0.3118g、 0.6944g。
[0009] 一种湖羊精液常温保存的稀释液配方对湖羊精液进行稀释的方法，其特征在于，将采集的湖羊精液倒入离心管进行混合处理，以消除个体差异，沿着离心管壁缓慢加入已经37℃预热的稀释液，把湖羊的精液稀释10倍；最后用
棉花包裹3层放置在16℃进行常温保存，每隔24小时轻轻摇晃保存精液的离心管，使沉淀的物质尽量溶于稀释液中，防止代谢废物聚集而对精子产生毒害作用，完成对湖羊精液的稀释。
[0010] 使用假
阴道对湖羊精液采集时，假阴道的水温控制在40℃-45℃，采集的湖羊精液吸取至2mL离心管，放置盛有37℃水的保温杯中，1小时之内对采集到的精液进行处理。
[0011] 湖羊精液稀释后，采用计算机精子辅助分析仪(CASA)或考
马斯亮蓝
染色和低渗试验方法对湖羊精液保存期间的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率、存活时间以及一些设定的运动参数进行检测。
[0012] 本发明方法科学合理，通过本发明提供的一种湖羊精液常温保存的稀释液配方及其稀释方法，本发明使用五种稀释液对湖羊精液进行常温保存，采用计算机精子辅助分析仪(CASA)、考马斯亮蓝染色和低渗试验等方法对精液保存期间的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率、存活时间以及一些运动参数进行检测，本发明筛选得到的Ⅰ液配方，在精液保存期间其活率、活力缓慢平稳下降，活力在0.6以上的时间可以达到3天以上，其总存活时间可以达到17天以上。本发明旨在客观的评价并筛选出一种湖羊精液常温保存效果最好的稀释液配方，以期为湖羊精液保存技术在生产中的推广应用提供参考，进一步提高湖羊的养殖规模。
[0013] 本发明当中的稀释液配方，增添了适量的营养物质：果糖和维持PH稳定的物质：Tris 和柠檬酸，Ⅰ液保存的精子活力在0.6以上的时间可以保持72小时以上，其总存活时间可以保持17天以上。且本发明得到稀释液配方成本低廉，配置工序简便，不需要昂贵的设备进行保存，一定程度上降低了养殖成本，同时的到了很好的保存效果，对湖羊养殖规模的发展有着深远的影响，对实际应用有着深远的影响。
[0014] 本稀释液配方使用后，可以减少精液低温保存和超低温保存时繁琐的准备工作，可以去掉解冻的操作过程，大大减少了操作时间，同时可以减少精液保存设备如冰箱、液氮罐、程控降温仪等昂贵设备的购买，同时也不需要专业的技术人员进行操作，大大降低了养殖成本。
[0015] 若使用该配方对精液进行常温保存，可以达到很好的保存效果，能够避免超低温冷冻保存对精子结构的损伤，可以提高人工授精技术的效率，提高受胎率，产生一定的经济效益，在实际生产和试验中都具有深远的应用前景。
附图说明
[0016] 图1为不同稀释液对保存精子活率的影响图(I号稀释液为本发明提供的稀释液配方)；
[0017] 图2为不同稀释液对保存精子活力的影响图(I号稀释液为本发明提供的稀释液配方)。
具体实施方式
[0018] 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
[0019] 材料与方法；
[0021] Tris(A100826-0500)、果糖(A100226-0500)、柠檬酸(A100529-0250)和0.22μm滤膜 (F513142-0001)均购自生工
生物工程(上海)股份有限公司；青霉素钠(S17030-100g)和链霉素硫酸盐(S17058-100g)均购自源叶生物(上海)科技有限公司；
电子分析天平(AB204-N) 购自梅特勒托利多测量设备(上海)有限公司。
[0022] 2.具体操作过程；
[0023] 湖羊精液常温保存稀释液的配制：使用天平准确称取30.7g Tris，16.4g柠檬酸，20g 果糖，溶解于1000mL灭菌的超纯水中，使其充分溶解，使用0.22μm滤膜进行过滤除菌，在 4℃冰箱保存，待使用时添加0.3118g青霉素钠，0.6944g链霉素。
[0024] 采集精液以及精液稀释保存的过程：采集精液时注意假阴道的水温控制在40℃到45℃之间，采集的精液吸取至2mL离心管，放置盛有37℃水的保温杯中，1小时之内对采集到的精液进行处理。首先对采集的精液进行一个混合处理，以消除个体差异，然后把湖羊的精液稀释10倍，例如将5mL的精液加入到50mL的离心管中，沿着离心管壁缓慢加入45mL已经37℃预热的稀释液。最后用棉花包裹3层放置在16℃进行常温保存，每隔24小时轻轻摇晃保存精液的离心管，使沉淀的物质尽量溶于稀释液种，防止代谢废物聚集而对精子产生毒害作用。
[0025] 精液品质的检测：本发明使用五种稀释液对湖羊精液进行常温保存，采用计算机精子辅助分析仪(CASA)、考马斯亮蓝染色和低渗试验等方法对精液保存期间的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率、存活时间以及一些运动参数进行检测。
[0026] 表1 5种不同稀释液配方
[0027]
[0028] 表2不同稀释液对保存精子活率的影响％
[0029]
[0030] 注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，相同表示差异不显著(P＞0.05)，─表示失去统计学意义。
[0031] 表3不同稀释液对保存精子活力的影响％
[0032]
[0033] 注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，相同表示差异不显著(P＞0.05)，─表示失去统计学意义。
[0034] 表4不同稀释液对保存精子运动性能的影响
[0035]
[0036]
[0037] 注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，相同表示差异不显著(P＞0.05)，─表示失去统计学意义。
[0038] 表5不同稀释液对保存精子存活时间的影响h
[0039]
[0040] 注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，相同表示差异不显著(P＞0.05)。
[0041] 表6不同稀释液对保存精子质膜完整率的影响％
[0042]
[0043]
[0044] 注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，相同表示差异不显著(P＞0.05)，─表示失去统计学意义。
[0045] 表7不同稀释液对保存精子顶体完整率的影响％
[0046]
[0047] 注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，相同表示差异不显著(P＞0.05)，─表示失去统计学意义。
[0048] 本发明所述的一种湖羊精液常温保存的稀释液配方，首先使用天平准确称取30.7gTris， 16.4g柠檬酸，20g果糖，溶解于1000mL灭菌的超纯水中，使其充分溶解，然后使用0.22μm 滤膜进行过滤除菌，在4℃冰箱保存，最后待使用时添加0.3118g青霉素钠，
0.6944g链霉素硫酸盐。
[0049] 采集精液结束后，对采集的精液进行一个混合处理，以消除个体差异，把湖羊的精液稀释10倍，用棉花包裹3层放置在16℃常温保存，每隔24小时轻轻摇晃保存精液的离心管，使沉淀的物质尽量溶于稀释液种，防止代谢废物聚集而对精子产生毒害作用。
