技术领域
[0001] 本
发明属于医学技术领域，尤其涉及一种MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法。
背景技术
[0003] 骨质疏松症是老年常见的骨病，其特点是骨
密度降低以及骨折
风险明显增加，严重影响着老年人的
生活质量。随着平均寿命的增加，骨质疏松症的患病率及其相关的并发症如骨折的发生率在不久的未来都将进一步的增加。老龄性骨质疏松症的诊断主要是通过骨骼的影像学检查、
骨密度检测以及血液骨转换生化标志物的检测。尽管现在针对骨质疏松症的诊断和
治疗策略很多，但仍无法降低骨折的发生率。因此，发展新的诊断和治疗策略是至关重要的。骨是一个基于持续的骨形成和骨吸收的稳定的动态结构。这两个过程必须是平衡的，一旦失调就会产生病理性的结构。以往，雌
激素缺乏被认为不仅是女性，而且还是男性骨质疏松症发生的主要原因。更年期卵巢功能的降低导致了骨量的丢失，同时雌激素的替代可以阻止这种情况的发生，所以，成年人骨量的丢失始于性激素
水平的下降。然而，大型流行病学研究已经清楚的证明，男性和女性的骨量丢失是发生在性激素改变之前，即在三十岁左右。因此，性激素缺乏并不能用来全面解释骨质疏松症的发生和发展。已有大量的证据表明随着
机体的老化，体内增加的
活性氧(Reactive oxygen species,ROS)引起的氧化应激可以影响骨的体内平衡。发展新的治疗手段的，需要了解ROS如何参与调节骨的
生物学、生理学和病理学。大量研究证据表明，ROS特别是H2O2和一些超氧化物，参与了细胞内不同的
信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinas,MAPKs)，细胞内
钙离子水平和转录因子的调控。ROS在促进氧化应激和
疾病方面的有害影响近年来已引起高度关注。其中，氧化应激和骨质疏松症之间的关系是近年来研究的重点。
[0004] 综上所述，现有技术存在的问题是：
[0005] 现有技术，不能有效测试出氧化应激刺激能引起细胞的死亡，不能有助于解释氧化应激在骨质疏松症发病机制中的作用，不能为抗骨质疏松症新药的研制提供有效的理论依据。
发明内容
[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法。
[0007] 本发明是这样实现的，一种MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，所述MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法包括：
[0008] 将经病理学检查确认为病变骨组织的标本置于含10％～12％胎
牛血清的1640培养液的已消毒培养皿中，培养皿四周事先铺好
冰块，于无菌操作台内迅速移入内含青霉素100U/ml、
链霉素100μg/ml的双抗的PBS液中洗涤3次～5次；用组织剪剔除脂肪组织、
坏死组织；用PBS液冲洗3次～5次后放入10％～12％胎牛血清的1640培养液浸泡；
[0009] 使用眼科剪剪碎为0.5mm3大小的块状，使用0.15％胰酶消化分解切碎的样本；通过无菌240目筛网
过滤器过滤后将滤网表面的组织收集到一新100ml离心管内，用离心机1500rpm×5分钟分离细胞；清洗五次后1640培养液重悬而后加入10％～12％的胎牛血清6×105细胞/毫升；最后MC3T3-E1细胞在5％～8％的CO2 37℃的环境下孵育培养；制成MC3T3-E1细胞悬液；
[0010] 选择MC3T3-E1细胞，按2×106mL-1浓度接种于细胞培养瓶内，待细胞贴壁生长至细胞密度达80％时，加入不同浓度油酸作为诱导剂；以
基础培养基DMEM添加体积比例为10％～12％的胎牛血清，分别添加25mM、50mM、100mM和200mM油酸四种浓度为成MC3T3-E1细胞的诱导培养基；每二天换液一次，以未加诱导培养液的细胞培养瓶作为对照，4周后油红O
染色检测；
[0011] MC3T3-E1细胞分化到实验所需的时间点后，将孔板从
培养箱取出，小心吸去培养液，PBS清洗两次，不要损坏底层细胞；清洗后，每孔加入对应体积的hoechst33258工作液，室温20℃～25℃，避光孵育15min；弃染液，用PBS轻缓清洗两次，将孔板置于
荧光酶标仪中，设置激发
波长/发射波长＝360nm/480nm检测荧光强度；弃去染液并用PBS清洗三次，每孔加入对应量的PBS和尼罗红工作液，室温20℃～25℃，避光孵育10min；
[0012] 将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝500nm/600nm,检测荧光强度；将孔板置于荧光
显微镜，在同一
视野下，用蓝色和红色光道对胞核进行观察并拍照。
[0013] 进一步，制成MC3T3-E1细胞悬液后，还需进行：取制成MC3T3-E1细胞悬液步骤中的浓度为0.1-1.0mmol/L的成骨细胞液，培养20-28小时后加入浓度为0.1-1.0mmol/L的过氧化氢溶液；
[0014] 去除原有α-MEM培养液，用正常α-MEM培养液清洗2-4次后再用PBS清洗1-3次，每孔加入10ul的CCK-8毒性/增殖检测
试剂，37℃避光孵育3小时；
[0015] 在450nm波长处，测定各孔光吸收值即可。
[0016] 进一步，MC3T3-E1细胞在5％～8％的CO2 37℃的环境下孵育培养过程中，还需进行：
[0017] 于冰上提取细胞总蛋白：
[0018] 吸干含双抗的PBS液中PBS后，再加入2ml PBS，使用细胞刮轻缓刮取细胞，重复一次将刮取下的细胞转移至15ml玻璃离心管内，离心1500rpm，5分钟，弃上清后加2mlPBS，吹匀后转移至2.5mlEP管内，5000rpm 5分钟再弃上清，加入含PMSF蛋白酶
抑制剂、RIPA
磷酸酶抑制剂的细胞裂解液150μl，冰上反复吹打5分钟冰上静置40分钟，振荡一次/53min，15000rpm，4℃低温离心25分钟，吸取上清置入另一2.5mlEP管，并放冰上，取部分做pro浓度测定、煮沸变性：上样缓冲液为4：1，-20℃
冰箱冷冻保存备用；
[0019] 蛋白浓度测定：应用BCA蛋白浓度测定
试剂盒，并按照浓度测定试剂
说明书中所注明步骤操作：按A:B＝60:1配制BCA工作液配制50mg/ml的蛋白标准溶液，取适量50mg/ml的蛋白标准溶液，稀释至终浓度为0.6mg/ml稀释标准品，每一种蛋白梯度和样品做4个复孔；将标准品按0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，25μl加到96孔板视为标准品孔中，加标准品稀释液补足到25μl，加适当体积样品到96孔板的视为样品孔中，加标准品稀释液到25μl，各孔加入200μlBCA工作液，37℃孵箱内放置40分钟；取出于室温中冷却到室温，使用之前预热好的酶标仪测定60Onm时的吸光度OD值。
[0020] 进一步，MC3T3-E1细胞在5％～8％的CO2 37℃的环境下孵育培养过程中，还需进行：免疫印迹反应：
[0021] 1)首先安装好
电泳仪的玻璃板；根据不同目的蛋白分子量大小来配制1％～12％不同浓度的SDS-PAGE分离胶；灌注并加水液封；将其放置在室温中30min-60min以上；
[0022] 2)浓缩胶灌制：等待分离胶
凝固后，倒去胶面上层水，用
滤纸吸干分离胶表面的水份；沿胶槽边缘迅速注入浓缩胶；然后沿水平方向轻轻插入梳子后放25分钟，以
预防气泡进入胶层影响后续
进程；
[0023] 3)当浓缩胶完全聚合后就可以将梳子取出，再用蒸馏水对准样品孔进行冲洗，再把玻璃板固定在电泳仪的电泳槽中，注入电泳缓冲液；
[0024] 4)将事先以BCA法制备的变性的蛋白样品取出，按预定顺序加样，从两边分别向加样孔注入50μl缓冲液，避免边缘效应；
[0025] 5)电泳：以恒压模式电泳，首先以100V的
电压预电泳40分钟，当上样缓冲液至两种胶的交界线处时，将电压调到150V继续电泳；电泳直至胶条中蛋白Marker的各条带都被彻底的分离时即终止电泳；
[0026] 6)切胶；
[0027] 7)转膜：在电泳结束前将转膜缓冲液准备好，标记PVDF膜后将
纤维垫片、滤纸、
硝酸纤维素滤膜等一起浸入电转缓冲液中做平衡准备；待电泳结束取出凝胶，浸入转膜缓冲液中10分钟；
[0028] 8)按照顺序安装转移装置：底上垫一张海绵垫-三层滤纸-凝胶条-PVDF膜-三层滤纸-海绵垫片，将各层不留气泡的完全对齐，由下而上顺序固定在夹层盒。再将夹子放进电转槽中，并将夹的黑面与槽子黑面相对，白面与槽红面相对；槽放入加入冰块的盒中，根据目标蛋白分子量定转膜时间；转膜完毕后胶条用考
马斯亮蓝染色，用于判断目标蛋白的转膜效率；
[0029] 9)TBST配制及封闭：250μl Tween20加入500ml PBS中；将膜用10％的
脱脂奶粉在摇床上封闭2h，再用TBST漂洗2次；
[0030] 10)一抗孵育：加入适当稀释的一抗(cyclin D1，P21and P27(1:500，Abcam，UK)，Fas，caspase-3and caspase-9，Bcl-2and Bax(1:1000，Cell Signaling，USA)，andβ-actin antibody(1:8000，Beyotime，China))，室温下振荡2h，4℃冰箱过夜孵育；TBST洗4次以上，每次15min；加入以5％脱脂奶粉的TBST溶液按1:1000稀释HRP标记的羊抗兔二抗，室温条件下摇床振荡孵育2h；取出二抗，37℃孵化2小时；再在脱色摇床上摇动，用TBST漂洗6以上，每次10min；
[0031] 11)
化学发光、
图像采集：配制ECL Plus试剂发光反应液，振荡使之混合均匀；将膜缓冲液中取出，贴
角用滤纸貼角吸干残余缓冲液，固定在片盒中，滴加发光反应液。
[0032] 本发明另一目的在于提供一种实现所述MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法的信息
数据处理终端。
[0033] 本发明另一目的在于提供一种计算机可读存储介质，包括指令，当其在计算机上运行时，使得计算机执行所述的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法。
[0034] 本发明另一目的在于提供一种MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试系统包括：
[0035] 培养单元，用于将经病理学检查确认为病变骨组织的标本置于含10％～12％胎牛血清的1640培养液的已消毒培养皿中，培养皿四周事先铺好冰块，于无菌操作台内迅速移入内含青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的双抗的PBS液中洗涤3次～5次；用组织剪剔除脂肪组织、坏死组织；用PBS液冲洗3次～5次后放入10％～12％胎牛血清的1640培养液浸泡；
[0036] MC3T3-E1细胞悬液制成单元，使用眼科剪剪碎为0.5mm3大小的块状，使用0.15％胰酶消化分解切碎的样本；通过无菌240目筛网过滤器过滤后将滤网表面的组织收集到一新100ml离心管内，用离心机1500rpm×5分钟分离细胞；清洗五次后1640培养液重悬而后加入10％～12％的胎牛血清6×105细胞/毫升；最后MC3T3-E1细胞在5％～8％的CO2 37℃的环境下孵育培养；制成MC3T3-E1细胞悬液；
[0037] 检测单元，选择MC3T3-E1细胞，按2×106mL-1浓度接种于细胞培养瓶内，待细胞贴壁生长至细胞密度达80％时，加入不同浓度油酸作为诱导剂；以基础培养基DMEM添加体积比例为10％～12％的胎牛血清，分别添加25mM、50mM、100mM和200mM油酸四种浓度为成MC3T3-E1细胞的诱导培养基；每二天换液一次，以未加诱导培养液的细胞培养瓶作为对照，4周后油红O染色检测；
[0038] 孵育单元，MC3T3-E1细胞分化到实验所需的时间点后，将孔板从培养箱取出，小心吸去培养液，PBS清洗两次，不要损坏底层细胞；清洗后，每孔加入对应体积的hoechst33258工作液，室温20℃～25℃，避光孵育15min；弃染液，用PBS轻缓清洗两次，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝360nm/480nm,检测荧光强度；弃去染液并用PBS清洗三次，每孔加入对应量的PBS和尼罗红工作液，室温20℃～25℃，避光孵育10min；
[0039] 拍照单元，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝500nm/600nm,检测荧光强度；将孔板置于荧光显微镜，在同一视野下，用蓝色和红色光道对胞核进行观察并拍照。
[0040] 本发明另一目的在于提供一种搭载有所述MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试系统的信息数据处理终端。
[0041] 本发明的优点及积极效果为：
[0042] 本发明采用成骨细胞MC3T3-E1细胞为对象，有效测试出氧化应激刺激能引起细胞的死亡，并损害成骨细胞的正常功能，抑制成骨细胞的分化，有助于阐明氧化应激在骨质疏松症发病机制中的作用，为抗骨质疏松症新药的研制提供一定的理论依据。本测试方法简单、有效，便于实施。
[0043] 本发明提供的大鼠脊柱转移性细胞的检测方法，本发明正确评估了长期影响脊柱转移性细胞的原理。
[0044] 本发明另采用新的诱导剂油酸来诱导脂细胞，以基础培养基(DMEM)添加10％胎牛血清，分别添加25mM、50mM、100mM和200mM油酸四种浓度为细胞的诱导培养基。这四种浓度的油酸均可诱导细胞分化为不同大小的细胞，随着油酸浓度的增加，细胞的数量和体积也在增加。
[0045] 本发明的诱导方法，配置更加简单，诱导速度快，诱导率高。研究不同大小细胞功能的差异。
[0046] 本发明使用hoechst33258染液。hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色
荧光染料，对细胞的毒性较低，可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。比经典的苏木精染色更加方便快捷，容易操作，且杂质少，便于观察。同时用hoechst33258染色后可以测定吸光度值，直接反应细胞数目。
[0047] 本发明定义一个新的用于评估细胞平均分化程度的数值：校正尼罗红OD值＝尼罗红OD值/hoechst33258的OD值。尼罗红OD值反应总的成骨细胞多少，Hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，hoechst 33258的OD值反应细胞的数量。校正尼罗红OD值排除分
化成熟后试验组间细胞数目的差异，用于反应单位细胞分化程度。与传统的油红O萃取法和测定总尼罗红OD值法相比，使用hoechst33258的OD值校正可以排除分化后细胞数目的差异，避免假阴性和
假阳性的干扰，更能够客观反应细胞真实的分化程度。
[0048] 本发明提供的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试系统集成有多单元，将检测数据在信息处理终端中进行数据处理，可获得准确的测试数据，为MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试提供依据。
附图说明
[0049] 图1是本发明
实施例提供的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法
流程图。
具体实施方式
[0050] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0051] 衰老是生物随着时间的推移，发生的一个不可逆的过程。它是复杂的自然现象，表现为结构和机能衰退，适应性和抵抗
力减退，更易感染疾病。随着年龄的增加，自由基的产生增加。在衰老及其并发症中，体内增加的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)扮演着重要的角色。骨质疏松症是老年性疾病，患病率与年龄成正比。以往，雌激素缺乏被认为是骨质疏松症发生的主要机制。然而骨质的流失开始于三十岁，而且补充雌激素并不能有效治疗老龄性骨质疏松。衰老引起的骨质丢失是不依赖性激素的，氧化应激起了非常大的作用。
[0052] 氧化应激可直接或间接地影响骨吸收与骨形成的过程。为了模仿衰老中ROS对骨代谢的影响，本发明对前成骨细胞MC3T3-E1进行刺激诱导氧化应激反应。
[0053] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0054] 图1，本发明实施例提供的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，包括：
[0055] S101：将经病理学检查确认为病变骨组织的标本置于含10％～12％胎牛血清的1640培养液的已消毒培养皿中，培养皿四周事先铺好冰块，于无菌操作台内迅速移入内含青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的双抗的PBS液中洗涤3次～5次；用组织剪剔除脂肪组织、坏死组织；用PBS液冲洗3次～5次后放入10％～12％胎牛血清的1640培养液浸泡；
[0056] S102：使用眼科剪剪碎为0.5mm3大小的块状，使用0.15％胰酶消化分解切碎的样本；通过无菌240目筛网过滤器过滤后将滤网表面的组织收集到一新100ml离心管内，用离心机1500rpm×5分钟分离细胞；清洗五次后1640培养液重悬而后加入10％～12％的胎牛血5
清6×10 细胞/毫升；最后MC3T3-E1细胞在5％～8％的CO2 37℃的环境下孵育培养；制成MC3T3-E1细胞悬液；
[0057] S103：选择MC3T3-E1细胞，按2×106mL-1浓度接种于细胞培养瓶内，待细胞贴壁生长至细胞密度达80％时，加入不同浓度油酸作为诱导剂；以基础培养基DMEM添加体积比例为10％～12％的胎牛血清，分别添加25mM、50mM、100mM和200mM油酸四种浓度为成MC3T3-E1细胞的诱导培养基；每二天换液一次，以未加诱导培养液的细胞培养瓶作为对照，4周后油红O染色检测；
[0058] S104：MC3T3-E1细胞分化到实验所需的时间点后，将孔板从培养箱取出，小心吸去培养液，PBS清洗两次，不要损坏底层细胞；清洗后，每孔加入对应体积的hoechst33258工作液，室温20℃～25℃，避光孵育15min；弃染液，用PBS轻缓清洗两次，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝360nm/480nm,检测荧光强度；弃去染液并用PBS清洗三次，每孔加入对应量的P B S和尼罗红工作液，室温20℃～25℃，避光孵育10m i n；
[0059] S105：将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝500nm/600nm,检测荧光强度；将孔板置于荧光显微镜，在同一视野下，用蓝色和红色光道对胞核进行观察并拍照。
[0060] 制成MC3T3-E1细胞悬液后，还需进行：取制成MC3T3-E1细胞悬液步骤中的浓度为0.1-1.0mmol/L的成骨细胞液，培养20-28小时后加入浓度为0.1-1.0mmol/L的过氧化氢溶液；
[0061] 去除原有α-MEM培养液，用正常α-MEM培养液清洗2-4次后再用PBS清洗1-3次，每孔加入10ul的CCK-8毒性/增殖检测试剂，37℃避光孵育3小时；
[0062] 在450nm波长处，测定各孔光吸收值即可。
[0063] MC3T3-E1细胞在5％～8％的CO2 37℃的环境下孵育培养过程中，还需进行：
[0064] 于冰上提取细胞总蛋白：
[0065] 吸干含双抗的PBS液中PBS后，再加入2ml PBS，使用细胞刮轻缓刮取细胞，重复一次将刮取下的细胞转移至15ml玻璃离心管内，离心1500rpm，5分钟，弃上清后加2mlPBS，吹匀后转移至2.5mlEP管内，5000rpm 5分钟再弃上清，加入含PMSF蛋白酶抑制剂、RIPA磷酸酶抑制剂的细胞裂解液150μl，冰上反复吹打5分钟冰上静置40分钟，振荡一次/53min，15000rpm，4℃低温离心25分钟，吸取上清置入另一2.5mlEP管，并放冰上，取部分做pro浓度测定、煮沸变性：上样缓冲液为4：1，-20℃冰箱冷冻保存备用；
[0066] 蛋白浓度测定：应用BCA蛋白浓度测定试剂盒，并按照浓度测定试剂说明书中所注明步骤操作：按A:B＝60:1配制BCA工作液配制50mg/ml的蛋白标准溶液，取适量50mg/ml的蛋白标准溶液，稀释至终浓度为0.6mg/ml稀释标准品，每一种蛋白梯度和样品做4个复孔；将标准品按0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，25μl加到96孔板视为标准品孔中，加标准品稀释液补足到25μl，加适当体积样品到96孔板的视为样品孔中，加标准品稀释液到25μl，各孔加入200μlBCA工作液，37℃孵箱内放置40分钟；取出于室温中冷却到室温，使用之前预热好的酶标仪测定60Onm时的吸光度OD值。
[0067] MC3T3-E1细胞在5％～8％的CO2 37℃的环境下孵育培养过程中，还需进行：免疫印迹反应：
[0068] 1)首先安装好电泳仪的玻璃板；根据不同目的蛋白分子量大小来配制1％～12％不同浓度的SDS-PAGE分离胶；灌注并加水液封；将其放置在室温中30min-60min以上；
[0069] 2)浓缩胶灌制：等待分离胶凝固后，倒去胶面上层水，用滤纸吸干分离胶表面的水份；沿胶槽边缘迅速注入浓缩胶；然后沿水平方向轻轻插入梳子后放25分钟，以预防气泡进入胶层影响后续进程；
[0070] 3)当浓缩胶完全聚合后就可以将梳子取出，再用蒸馏水对准样品孔进行冲洗，再把玻璃板固定在电泳仪的电泳槽中，注入电泳缓冲液；
[0071] 4)将事先以BCA法制备的变性的蛋白样品取出，按预定顺序加样，从两边分别向加样孔注入50μl缓冲液，避免边缘效应；
[0072] 5)电泳：以恒压模式电泳，首先以100V的电压预电泳40分钟，当上样缓冲液至两种胶的交界线处时，将电压调到150V继续电泳；电泳直至胶条中蛋白Marker的各条带都被彻底的分离时即终止电泳；
[0073] 6)切胶；
[0074] 7)转膜：在电泳结束前将转膜缓冲液准备好，标记PVDF膜后将纤维垫片、滤纸、硝酸纤维素滤膜等一起浸入电转缓冲液中做平衡准备；待电泳结束取出凝胶，浸入转膜缓冲液中10分钟；
[0075] 8)按照顺序安装转移装置：底上垫一张海绵垫-三层滤纸-凝胶条-PVDF膜-三层滤纸-海绵垫片，将各层不留气泡的完全对齐，由下而上顺序固定在夹层盒。再将夹子放进电转槽中，并将夹的黑面与槽子黑面相对，白面与槽红面相对；槽放入加入冰块的盒中，根据目标蛋白分子量定转膜时间；转膜完毕后胶条用考马斯亮蓝染色，用于判断目标蛋白的转膜效率；
[0076] 9)TBST配制及封闭：250μl Tween20加入500ml PBS中；将膜用10％的脱脂奶粉在摇床上封闭2h，再用TBST漂洗2次；
[0077] 10)一抗孵育：加入适当稀释的一抗(cyclin D1，P21and P27(1:500，Abcam，UK)，Fas，caspase-3and caspase-9，Bcl-2and Bax(1:1000，Cell Signaling，USA)，andβ-actin antibody(1:8000，Beyotime，China))，室温下振荡2h，4℃冰箱过夜孵育；TBST洗4次以上，每次15min；加入以5％脱脂奶粉的TBST溶液按1:1000稀释HRP标记的羊抗兔二抗，室温条件下摇床振荡孵育2h；取出二抗，37℃孵化2小时；再在脱色摇床上摇动，用TBST漂洗6以上，每次10min；
[0078] 11)化学发光、图像采集：配制ECL Plus试剂发光反应液，振荡使之混合均匀；将膜缓冲液中取出，贴角用滤纸貼角吸干残余缓冲液，固定在片盒中，滴加发光反应液。
[0079] 发明采用成骨细胞MC3T3-E1细胞为对象，有效测试出氧化应激刺激能引起细胞的死亡，并损害成骨细胞的正常功能，抑制成骨细胞的分化，有助于阐明氧化应激在骨质疏松症发病机制中的作用，为抗骨质疏松症新药的研制提供一定的理论依据。本测试方法简单、有效，便于实施。
[0080] 本发明实施例提供的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试系统包括：
[0081] 培养单元，用于将经病理学检查确认为病变骨组织的标本置于含10％～12％胎牛血清的1640培养液的已消毒培养皿中，培养皿四周事先铺好冰块，于无菌操作台内迅速移入内含青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的双抗的PBS液中洗涤3次～5次；用组织剪剔除脂肪组织、坏死组织；用PBS液冲洗3次～5次后放入10％～12％胎牛血清的1640培养液浸泡；
[0082] MC3T3-E1细胞悬液制成单元，使用眼科剪剪碎为0.5mm3大小的块状，使用0.15％胰酶消化分解切碎的样本；通过无菌240目筛网过滤器过滤后将滤网表面的组织收集到一新100ml离心管内，用离心机1500rpm×5分钟分离细胞；清洗五次后1640培养液重悬而后加入10％～12％的胎牛血清6×105细胞/毫升；最后MC3T3-E1细胞在5％～8％的CO 2 37℃的环境下孵育培养；制成MC3T3-E1细胞悬液；
[0083] 检测单元，选择MC3T3-E1细胞，按2×106mL-1浓度接种于细胞培养瓶内，待细胞贴壁生长至细胞密度达80％时，加入不同浓度油酸作为诱导剂；以基础培养基DMEM添加体积比例为10％～12％的胎牛血清，分别添加25mM、50mM、100mM和200mM油酸四种浓度为成MC3T3-E1细胞的诱导培养基；每二天换液一次，以未加诱导培养液的细胞培养瓶作为对照，4周后油红O染色检测；
[0084] 孵育单元，MC3T3-E1细胞分化到实验所需的时间点后，将孔板从培养箱取出，小心吸去培养液，PBS清洗两次，不要损坏底层细胞；清洗后，每孔加入对应体积的hoechst33258工作液，室温20℃～25℃，避光孵育15min；弃染液，用PBS轻缓清洗两次，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝360nm/480nm,检测荧光强度；弃去染液并用PBS清洗三次，每孔加入对应量的PBS和尼罗红工作液，室温20℃～25℃，避光孵育10min；
[0085] 拍照单元，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝500nm/600nm,检测荧光强度；将孔板置于荧光显微镜，在同一视野下，用蓝色和红色光道对胞核进行观察并拍照。
[0086] 本发明提供的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试系统集成有多单元，将检测数据在信息处理终端中进行数据处理，可获得准确的测试数据，为MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试提供依据。
[0087] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
