体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法
专利汇可以提供体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种体外诱导人胚胎干细胞分化为 视网膜 色素上皮细胞的方法，属于 生物 技术领域。本发明诱导分化经过一次传代可获得纯的视网膜色素上皮细胞。与 现有技术 相比，本发明缩短了人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的时间。本发明为人胚胎干细胞定向诱导分化为色素上皮细胞提供指导和新的途径。，下面是体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法专利的具体信息内容。
1.一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将人胚胎干细胞接种到饲养层细胞中，加入干细胞完全培养基，放置培养4-5天并定期换液；
b、去除分化细胞后用酶处理人胚胎细胞成小团块并接种于培养皿，加入分化培养基并添加特定的细胞因子，悬浮培养3天形成类胚体；
c、按照一定的密度将类胚体接种到贴壁培养皿，加入分化培养基并添加特定的细胞因子，贴壁培养并定期换液11天；
d、更换为视网膜色素上皮细胞培养基，放置培养2周，然后用酶处理细胞并1：2传代，接种到贴壁培养皿，继续培养4周，即可得到100％纯化的视网膜色素上皮细胞；
步骤a中所述干细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇及成纤维细胞生长因子，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/mL ，链霉素的浓度为100μg/mL ，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，成纤维细胞生长因子浓度为4ng/mL ；
步骤b中所述去除分化细胞是用玻璃针挑除分化的干细胞；所述酶处理为5mg/mL 胶原酶IV处理12分钟并用移液器机械吹打；所述小团块为20～50个细胞的细胞团块；所述培养皿为不贴壁的细菌培养皿；
步骤b中所述分化培养基成分为：Neurobasal medium和DMEM/F12等体积混合的基础培养基、N2、B27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，N2体积含量为1％，B27体积含量为1％，青霉素的浓度为100U/mL ，链霉素的浓度为100μg/mL ，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；
步骤b中所述特定的细胞因子为CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1与PJ34，各细胞因子在分化培养基中含量分别为：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：1μg/mL ；IGF1：5ng/mL ，PJ34：3μM；
步骤c中所述特定的细胞因子为CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1与PJ34，各细胞因子在分化培养基中含量分别为：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：10μg/mL ；IGF1：10ng/mL ，PJ34：3μM；
步骤d中所述视网膜色素上皮细胞培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，血清替代物的体积含量为
20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/mL ，链霉素的浓度为100μg/mL ，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；所述酶处理为0.25％胰酶处理10分钟；所述贴壁培养基为300μg/mL matrigel包被的细胞培养皿；100％纯化视网膜色素上皮细胞为整皿的单层视网膜色素上皮样细胞，该细胞呈鹅卵石样形态，有色素积累。
2.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，步骤a中所述饲养层细胞为X射线处理小鼠胚胎成纤维细胞。
3.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，步骤c中所述一定的密度为10个类胚体/cm2；所述贴壁培养皿为300μg/mL matrigel包被的细胞培养皿。
4.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，各步骤中所述培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行。
体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为
100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，成纤维细胞生长因子浓度为4ng/ml，培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行，所述hESCs培养4-5天后并每天换液的状态如图1A。
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