技术领域
[0001] 本
发明涉及一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其在Cd毒性效应研究中的应用，本发明属于
淡水贝类细胞毒理学研究技术领域。
背景技术
[0002] 我国渔业生态环境重金属污染形势仍较为严峻。《2015年中国渔业生态环境状况
公报》即指出我国江河天然重要渔业水域中镉(Cd)超标率为1.5％，国家级内陆水产种质资源保护区Cd超标率达到2.7％。水环境中的Cd易于沿食物链发生
生物放大作用，从而导致渔业生物中Cd残留量超标。例如，我国长三角地区池塘养殖水产品中Cd的超标率甚至高达100％(和庆,彭自然,张晨,等.长三角地区池塘养殖水产品重金属含量及其健康
风险评价. 农业环境科学学报,2017,36(6):1070-1077)。因此，亟需对水环境中的重金属(如Cd)进行污染预警和毒性评价。
[0003]
淡水贝类背角无齿蚌(Anodonta woodiana)对重金属具有高积累性、低代谢性、体内积累重金属与水环境中重金属含量呈简单相关等特点，被确定为“淡水贝类观察”研究体系的专用指示生物。利用背角无齿蚌已成功监测渔业生态环境重金属的污染状况，并有效评价了Cd等重金属的毒性效应。值得注意的是，生命系统在不同水平对环境污染物胁迫之应答顺序大不相同，个体的应答效应可能要数小时到数年才能把握，而细胞的应答时间可以是数秒到数小时。鳃作为背角无齿蚌对重金属积累的关键“靶器官”，其细胞有潜
力作为水环境重金属污染早期预警及毒性灵敏评价的重要研究模型。
[0004] 需要引起关注的是，由于淡水贝类鳃等组织的生理结构、功能分化、细胞形态等方面的特殊性，至今还没有建立起细胞系，原代细胞培养仍然是主要依托的方法。在细胞毒性效应研究中，对照组细胞的存活率≥90％是开展该研究的基本前提条件。即使是暴露时间较短的急性毒性实验，一般也要求开展连续暴露96h。然而，利用已报道的淡水贝类细胞原代培养方法，维持鳃细胞存活率≥90％的优良状态往往难以超过72h( -Dikmen B, Arslan P,Kuzukιran et al.Unio sp.primary cell culture potential in ecotoxicology research.Toxin Reviews,2018,37(1):75-81)，这严重限制了基于鳃细胞毒性效应的水环境重金属污染早期预警及毒性灵敏评价的开发和应用。
发明内容
[0005] 本发明的目的之一是克服
现有技术中存在的不足，提供一种存活率高、存活时间长的背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种背角无齿蚌鳃细胞在Cd毒性效应研究中的应用。
[0007] 按照本发明提供的技术方案，所述一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法包括以下步骤：
[0008] a1、将超纯水在110～130℃下灭菌20～30min，灭菌后冷却至常温，制成无菌水；
[0009] b1、将洗净的背角无齿蚌置于无菌水中暂养24～96h；
[0010] c1、先向4～26℃的900～1000ml的无菌水中加入青霉素50000～500000 IU、
链霉素0.05～0.5g、庆大霉素0.05～5g和卡那霉素0.03～3g配制成抗生素溶液；再将洗净的背角无齿蚌置于抗生素溶液中消毒1～6h；
[0011] d1、解剖出背角无齿蚌的鳃，将鳃置于经0.2～0.3μm滤头过滤的4～26℃的抗生素溶液中，并在抗生素溶液将鳃进一步剪成1～5mm2的鳃片，鳃片在抗生素溶液中消毒1～3h；
[0012] e1、消毒后收集鳃片，先取鳃片
质量10～50倍、4～26℃且浓度为 0.025wt％～0.25wt％的链霉蛋白酶溶液，再取链霉蛋白酶溶液体积30％～50％的步骤c配制的抗生素溶液，将所取的抗生素溶液与链霉蛋白酶溶液混合在一起形成消化溶液，将鳃片置于消化溶液中分解细胞0.5～8h，然后往链霉蛋白酶溶液中与其质量相等的胎
牛血清终止消化；
[0013] f1、先用50～100μm无菌滤网将背角无齿蚌鳃细胞液过滤至无菌离心管，然后1000～2000r/min离心5～10min，去除清液，收集细胞沉淀；
[0014] g1、在300～800ml无菌水中加入L-15
基础培养基150～300ml、青霉素 10000～50000IU、链霉素0.01～0.05g、庆大霉素0.1～1g、卡那霉素0.01～1g、 4-羟乙基哌嗪乙磺酸1～5g和左旋谷酰胺10～100ml，形成细胞培养基
混合液，再取细胞培养基混合液体积
10％～20％的胎牛血清并加入到细胞培养基混合液中经
温度控制形成15～20℃的人工合成细胞培养基；取部分人工合成细胞培养基加入到步骤f1的离心管中，调节成细胞浓度为
105～106cell/ml的细胞悬液；
[0015] h1、在培养孔板的每个培养孔洞中加入细胞悬液0.5～1.5ml，培养孔板置于15～20℃的二
氧化
碳培养箱中进行细胞原代培养，6h即可以完成贴壁；每天用浓度为0.4wt％～
1wt％的台盼蓝
染色检验细胞的成活率，然后用 15～20℃的人工合成细胞培养基更换掉培养孔洞中至少1/2的人工合成细胞培养基；成功获得了培养时间长达120h、成活率≥90％的背角无齿蚌原代培养鳃细胞。
[0016] 作为优选，步骤a1中使用的超纯水为Milli-Q级超纯水。
[0017] 作为优选，步骤c1中，抗生素溶液由50000～500000IU青霉素、0.05～0.5g 链霉素、0.05～5g庆大霉素和0.03～3g卡那霉素配制而成。
[0018] 作为优选，步骤e1中，链霉蛋白酶溶液的浓度为0.025wt％～0.25wt％。
[0019] 一种使用背角无齿蚌原代培养鳃细胞在Cd毒性效应研究中的应用包括以下步骤：
[0020] a2、应用概率单位分析计算出Cd2+对背角无齿蚌原代培养鳃细胞的LC25；
[0021] b2、根据LC25采用等比法设定至少5个Cd2+浓度梯度暴露组及1个空白对照组，每个Cd2+浓度梯度暴露组均设置4～6个平行组；
[0022] c2、将背角无齿蚌细胞浓度为105～106cell/ml的细胞悬液分别接种到第一培养孔板和第二培养孔板中，第一培养孔板中每孔接种100～200μL细胞悬液，第二培养孔板中每孔接种0.5～1.5mL细胞悬液，培养6～24h以保证细胞贴壁；
[0023] d2、用人工合成细胞培养基分别配制出目标Cd2+浓度2～10倍的Cd2+母液，在相同温度条件下，贴壁吸出孔板中1/10～1/2的人工合成细胞培养基，然后再贴壁缓缓加入等量的Cd2+母液，即得到设定的5个Cd2+浓度梯度暴露组；空白对照组更换等量的无Cd2+人工合成细胞培养基，暴露时间为6～96h；
[0024] e2、第一培养孔板用于检测细胞活力，第二培养孔板上清用于检测抗氧化因子SOD、抗氧化因子CAT及
磷酸酶AcP毒理学指标。
[0025] 本发明淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法精准，细胞成活率高且存活时间长，突破了目前原代培养淡水贝类鳃细胞的存活率低、存活时间短的“
瓶颈”难题，达到实验研究标准。基于原代培养的鳃细胞，可用于重金属等多种污染物的细胞毒理学研究，在水环境重金属污染早期预警及毒性灵敏评价等领域具有广阔的应用前景。
具体实施方式
[0026] 下面结合具体
实施例对本发明作进一步说明。
[0027] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的
修改和替换，均属于本发明的范围。
[0028] 实施例1
[0029] 一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法包括以下步骤：
[0030] a1、将电导率为18.2MΩ·CM的Milli-Q级超纯水在120℃下灭菌20min，灭菌后冷却至常温，制成无菌水；
[0031] b1、选取2龄的背角无齿蚌幼蚌，用无菌水洗净贝壳表面的附着物，置于无菌水中暂养24h；
[0032] c1、先向20℃的950ml的无菌水中加入青霉素250000IU、链霉素0.3g、庆大霉素2.5g和卡那霉素1.5g配制成抗生素溶液；再将洗净的背角无齿蚌置于抗生素溶液中消毒
2h；
[0033] d1、用无菌的不锈
钢剪刀迅速解剖出背角无齿蚌幼蚌的鳃，将其置于经 0.22μm滤头过滤的抗生素溶液中，剪成2mm2的小片，在20℃条件下，消毒1h；
[0034] e1、消毒后用50ml无菌离心管收集鳃片，先取鳃片质量10倍、4℃且浓度为0.025wt％的链霉蛋白酶溶液，再取链霉蛋白酶溶液体积30％的步骤c 配制的抗生素溶液，将所取的抗生素溶液与链霉蛋白酶溶液混合在一起形成消化溶液，将鳃片置于消化溶液中分解细胞8h，然后往链霉蛋白酶溶液中与其质量相等的胎牛血清(即FBS)终止消化；
[0035] f1、先用70μm无菌滤网将背角无齿蚌鳃细胞液过滤至无菌离心管，然后1000r/min离心5min，去除清液，收集细胞沉淀；
[0036] g1、在600ml无菌水中加入L-15基础培养基200ml、青霉素30000IU、链霉素0.03g、庆大霉素0.6g、卡那霉素0.5g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸3g和左旋谷酰胺60ml，形成细胞培养基混合液，再取细胞培养基混合液体积10％的FBS并加入到细胞培养基混合液中经
温度控制形成20℃的人工合成细胞培养基；取部分人工合成细胞培养基加入到步骤f1的离心管中，调节成细胞浓度为5×105cell/ml的细胞悬液；
[0037] h1、在24孔板的每个培养孔洞中加入细胞悬液0.5ml，培养孔板置于 20℃的二氧化碳培养箱中进行细胞原代培养，6h即可以完成贴壁；每天用浓度为0.4wt％的台盼蓝染色随机检验3个
血细胞计数板方格中的细胞成活率，然后用20℃的人工合成细胞培养基更换掉培养孔洞中1/2的人工合成细胞培养基，进行了连续一周的原代培养，鳃细胞成活率见表1。
[0038] 所有数据通过One-way ANOVA分析，并对不同组间数据进行LSD多重比较，上标不同字母表示差异水平显著(P<0.05)。
[0039] 表1
[0040]
[0041] 一种使用背角无齿蚌原代培养鳃细胞在Cd毒性效应研究中的应用包括以下步骤：
[0042] a2、向收集淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞的离心管中加入含10％FBS的人工合成细胞培养基，调节成细胞浓度约为2×106cell/ml的细胞悬液以应用于毒理学研究。应用概率单位分析(Probit Analysis)分析预实验结果，显示 Cd2+对鳃细胞的24h-LC25为1.0mg Cd2+/L；
[0043] b2、据此设定1个空白对照组(0mg Cd2+/L)和5个Cd2+浓度梯度暴露组(0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0mg Cd2+/L)，每个Cd2+浓度梯度暴露组设置4个平行实验组；
[0044] c2、将细胞浓度约为2×106cell/ml的细胞悬液分别接种到96孔板和24 孔板中，96孔板中每孔100μL，24孔板中每孔1.0mL，培养24h以保证细胞贴壁；
[0045] d2、分别用上述人工合成细胞培养基分别配制出目标Cd2+浓度2倍的 Cd2+母液更换掉1/2的培养液，开始24h的暴露；
[0046] e2、应用WST-1
试剂盒(由碧
云天生物技术研究所提供)检测细胞活力，并应用SOD、CAT和AcP试剂盒(南京建成
生物工程研究所提供)检测相关酶活力。
[0047] 结果显示0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0mg Cd2+/L降低了鳃细胞活力，并诱导抗
氧化酶(SOD、CAT)活力增强及免疫因子(AcP)活力增加(表2)。所有数据通过One-way ANOVA分析，并对不同组间数据进行LSD多重比较，上标不同字母表示差异水平显著(P<0.05)。
[0048] 表2
[0049]
[0050] 实施例2
[0051] 一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法包括以下步骤：
[0052] a1、将电导率为18.2MΩ·CM的Milli-Q级超纯水在121℃下灭菌30min，灭菌后冷却至常温，制成无菌水；
[0053] b1、选取2龄的背角无齿蚌幼蚌，用无菌水洗净贝壳表面的附着物，置于无菌水中暂养72h；
[0054] c1、先向20℃的950ml的无菌水中加入青霉素250000IU、链霉素0.3g、庆大霉素2.5g和卡那霉素1.5g配制成抗生素溶液；再将洗净的背角无齿蚌置于抗生素溶液中消毒
2h；
[0055] d1、用无菌的
不锈钢剪刀迅速解剖出背角无齿蚌幼蚌的鳃，将其置于经 0.22μm滤头过滤的抗生素溶液中，剪成1mm2的小片，在20℃条件下，消毒1h；
[0056] e1、消毒后用50ml无菌离心管收集鳃片，先取鳃片质量10倍、20℃且浓度为0.1wt％的链霉蛋白酶溶液，再取链霉蛋白酶溶液体积30％的步骤c配制的抗生素溶液，将所取的抗生素溶液与链霉蛋白酶溶液混合在一起形成消化溶液，将鳃片置于消化溶液中分解细胞4h，然后往链霉蛋白酶溶液中与其质量相等的胎牛血清(即FBS)终止消化；
[0057] f1、先用60μm无菌滤网将背角无齿蚌鳃细胞液过滤至无菌离心管，然后1500r/min离心5min，去除清液，收集细胞沉淀；
[0058] g1、在600ml无菌水中加入L-15基础培养基150ml、青霉素30000IU、链霉素0.03g、庆大霉素0.6g、卡那霉素0.5g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸3g和左旋谷酰胺60ml，形成细胞培养基混合液，再取细胞培养基混合液体积20％的FBS并加入到细胞培养基混合液中经温度控制形成20℃的人工合成细胞培养基；取部分人工合成细胞培养基加入到步骤f1的离心管中，调节成细胞浓度为106cell/ml的细胞悬液；
[0059] h1、在24孔板的每个培养孔洞中加入细胞悬液0.5ml，培养孔板置于 20℃的二氧化碳培养箱中进行细胞原代培养，6h即可以完成贴壁；每天用浓度为0.4wt％的台盼蓝染色随机检验3个血细胞计数板方格中的细胞成活率，然后用20℃的人工合成细胞培养基更换掉培养孔洞中80％的人工合成细胞培养基，进行了连续5d的原代培养，鳃细胞成活率见表3。
[0060] 所有数据通过One-way ANOVA分析，并对不同组间数据进行LSD多重比较，上标不同字母表示差异水平显著(P<0.05)。
[0061] 表3
[0062]
[0063] 一种使用背角无齿蚌原代培养鳃细胞在Cd毒性效应研究中的应用包括以下步骤：
[0064] a2、向收集淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞的离心管中加入含20％FBS的人工合成细胞培养基，调节成细胞浓度约为5×106cell/ml的细胞悬液以应用于毒理学研究。应用概率单位分析(Probit Analysis)分析预实验结果，显示 Cd2+对鳃细胞的24h-LC25为1.0mg Cd2+/L；
[0065] b2、据此设定1个空白对照组(0mg Cd2+/L)和5个Cd2+浓度梯度暴露组(0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0mg Cd2+/L)，每个Cd2+浓度梯度暴露组设置4个平行实验组；
[0066] c2、将细胞浓度约为5×106cell/ml的细胞悬液分别接种到96孔板和24 孔板中，96孔板中每孔100μL，24孔板中每孔1.0mL，培养24h以保证细胞贴壁；
[0067] d2、分别用上述人工合成细胞培养基分别配制出目标Cd2+浓度2倍的 Cd2+母液更换掉1/2的培养液，开始24h的暴露；
[0068] e2、应用WST-1试剂盒(由碧云天生物技术研究所提供)检测细胞活力，并应用SOD、CAT和AcP试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)检测相关酶活力。
[0069] 对结果进行One-way ANOVA分析，并对不同组间数据进行LSD多重比较，上标不同字母表示差异水平显著(P<0.05)。结果显示0.0625、0.125、 0.25、0.5和1.0mg Cd2+/L降低了鳃细胞活力，并诱导抗氧化酶(SOD、CAT) 活力增强及免疫因子(AcP)活力增加(表4)。
[0070] 表4
[0071]
