技术领域
[0001] 本
发明涉及新型药物载体领域，特别涉及一种叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体及其制备方法。
背景技术
[0002] 癌症正日益变为危害人类健康最严重的重大
疾病。据世界卫生组织(WHO)报道，2012年全世界新发癌症病例和死亡病例分别达到1400万和820万，其中中国新诊断癌症病例为307万，占全球总数的21.8％，癌症死亡人数约220万，占到全球癌症死亡人数的
26.9％。
基础研究和有效
治疗被认为是治愈癌症的关键环节和有效手段。与传统的放疗、化疗和手术治疗相比，靶向药物载体对
肿瘤细胞有高度选择性，在治疗过程中对正常细胞的毒
副作用小，被认为是抗争癌症最有效的方法之一。
[0003] 自2010年Andre Geim和Konstantin Novoselov因
石墨烯的研究获得诺贝尔物理学奖以来，类
石墨烯过渡金属硫化物MS2(M＝Mo、W、Nb和Ta等)因其独特的物理化学性质受到了人们的广泛关注。其中，
单层二硫化钨具有独特的
片层结构、大的
比表面积和显著的
电子特性，在催化剂、
场效应晶体管和
锂离子电池方面表现出广阔的应用空间，但在
生物医学领域的研究报道还比较少见。二硫化钨具有和石墨烯类似的密排六方结构，层与层间通过弱的范德华
力连接，并且可以通过简单的液相剥离法、超声辅助剥离法或锂离子插层剥离法制备出稳定的单层或少层的二硫化钨分散液，这为二硫化钨纳米片应用于生物医学领域奠定了重要基础。此外，Teo等人采用WST-8法和MTT法研究了二硫化钨纳米片对人
肺泡上皮细胞(A549)的毒性效果。结果表明，A549细胞在样品最大浓度400μg/mL时培育24h后仍保持80％以上的细胞存活率，证实单层二硫化钨在高样品浓度下对A549细胞仍表现出低的细胞毒性。重要的是，二硫化钨具有大的比表面积，结合良好的
水溶液分散性和低的细胞毒性使其在高效药物载体方面呈现出良好的应用前景，这一观点已被2014年Advanced Materials期刊上刘庄课题组首次报道的聚乙二醇功能化二硫化钨纳米片应用于肿瘤的光疗和化疗的研究工作所证实。
[0004] 尽管目前的药物载体在提高药物
溶解度和延长血液循环时间等方面取得了重要的进展，但是靶向效率低下、载药量不足、
生物相容性不够和缺乏可
控释放极大地限制了靶向药物载体在
癌症治疗领域的进一步应用。本发明旨在通过化学共沉淀法将MFe2O4(M＝Fe、Co和Ni)
磁性纳米粒子修饰在二硫化钨纳米片表面，继而对磁性二硫化钨纳米片进行
氨基功能化改性，然后以叶酸为靶向生物分子利用羧基和氨基形成酰胺键的反应对其进行靶向修饰，制备的功能化二硫化钨纳米片不仅具有高的靶向效率和高的抗肿瘤药物负载量，而且可以实时追踪药物在体内的运输和分布以及评估药物对疾病的诊疗效果，这对于癌症和其它重大疾病的有效治疗具有重要的理论意义和临床价值。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体及其制备方法，旨在通过在单层二硫化钨纳米片表面均匀修饰粒径为4-15nm的MFe2O4(M＝Fe、Co和Ni)磁性纳米粒子，继而对磁性二硫化钨纳米片进行氨基功能化改性，然后利用羧基和氨基形成酰胺键的反应将叶酸连接在磁功能化二硫化钨纳米片，最后负载抗肿瘤模型药物制备而成，制备工艺可控、反应条件温和且利于规模化生产，制得的叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体系统具有良好的水溶液分散性、优良的结构
稳定性和高的抗肿瘤药物负载量，该靶向药物载体系统利用叶酸与癌细胞表面受体之间强烈的
抗体-
抗原相互作用，将装载抗肿瘤药物的功能化二硫化钨通过细胞内吞作用特异性运至癌细胞当中，从而实现
磁共振成像指导下的药物靶向释放和疗效实时评估。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体，其特征在于：包括二硫化钨纳米片，均匀修饰在二硫化钨纳米片表面的MFe2O4磁性纳米粒子，通过酰胺成键作用与被MFe2O4磁性纳米粒子修饰后的磁功能化二硫化钨纳米片的表面连接的叶酸靶向分子，以及通过物理
吸附和氢键作用负载在连接有叶酸靶向分子的叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片上的抗肿瘤模型药物，其中MFe2O4磁性纳米粒子的M为Fe、Co、Ni元素中的一种。
[0007] 进一步的技术方案在于，所述二硫化钨纳米片厚度为0.3-1.5nm，其尺寸为0.5-5μm，所述MFe2O4纳米粒子的直径为4-15nm，其形状为球形或六面体状。
[0008] 进一步的技术方案在于，所述的抗肿瘤模型药物为
顺铂、卡铂、泰素、紫杉醇、喜树
碱、5-氟尿嘧啶、表柔比星、吉西他滨、丙卡巴肼、环磷酰胺、柔红霉素、丝裂霉素、普卡霉素、道诺霉素、
盐酸阿霉素中的一种或多种。
[0009] 进一步的技术方案在于，所述的一种叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0010] (1)磁功能化二硫化钨纳米片的制备
[0011] 将二硫化钨粉末加入去离子水中，超声振荡0.5-12h，将成比例计量的三价
铁盐和二价M盐完全溶解于去离子水中，用氮气鼓泡法将其搅拌均匀后升温至60℃，逐渐滴加碱性调节剂使反应体系pH值为10-14，反应0.5-2h后加热至90℃，继续反应1-4h，加入与二硫化钨纳米片成比例计量的氨基改性剂，机械搅拌或超声振荡1-4h，其反应产物用无水
乙醇醇洗三次，离心分离，置于
真空干燥箱中干燥24h，得到磁功能化二硫化钨纳米片；
[0012] (2)叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片的制备
[0013] 将磁功能化二硫化钨纳米片分散于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入与磁功能化二硫化钨纳米片成比例计量的催化剂后机械搅拌或超声振荡0.5-1h，接着加入与磁功能化二硫化钨纳米片成比例计量的叶酸，在30℃下氮气氛围中机械搅拌或超声振荡6-24h,其反应产物用无水乙醇醇洗三次，离心分离，真空干燥24h即得叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片；
[0014] (3)叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体的制备
[0015] 将成比例计量的叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片和抗肿瘤药物分散于
磷酸盐缓冲溶液中，在30℃下氮气氛围中机械搅拌或超声振荡4-24h，其反应产物用磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，离心分离，真空干燥24h即得叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体。
[0016] 进一步的技术方案在于，所述叶酸靶向分子与磁功能化二硫化钨纳米片的
质量比为1:2-1:6，所述抗肿瘤药物与叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片的质量比为1:1-1:5。
[0017] 进一步的技术方案在于，所述步骤(1)中所使用的氨基改性剂为γ-氨基丙基三乙
氧基
硅烷、γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、L-半胱氨酸、聚甲烯酰胺、聚乙亚胺或聚天冬酰胺中的一种，其中二硫化钨纳米片和氨基改性剂的质量比为1:1-20:1。
[0018] 进一步的技术方案在于，所述步骤(1)中所使用的三价铁盐为铁的
硝酸盐、氯化物、
硫酸盐、
草酸盐、
醋酸盐、硝酸盐水合物、氯化物水合物、
硫酸盐水合物、草酸盐水合物、醋酸盐水合物中的一种，所使用的二价M盐为M的硝酸盐、氯化物、硫酸盐、草酸盐、醋酸盐、硝酸盐水合物、氯化物水合物、硫酸盐水合物、草酸盐水合物、醋酸盐水合物中的一种或多种，其中三价铁盐和二价M盐的摩尔比为1:0.5-1:1.9。
[0019] 进一步的技术方案还在于，所述步骤(2)中所使用的催化剂为N,N'-二环己基
碳酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/4-二甲氨基吡啶中的一种，其中二硫化钨纳米片和催化剂的质量比为1:1-10:1。
[0020] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明具有操作过程可控、反应条件温和易于规模化生产的优点；本发明首先通过化学共沉淀法将MFe2O4(M＝Fe、Co和Ni)磁性纳米粒子修饰在二硫化钨纳米片表面，继而对磁性二硫化钨纳米片进行氨基功能化改性，然后以叶酸为靶向生物分子利用羧基和氨基形成酰胺键的反应对其进行靶向修饰，最后负载抗肿瘤模型药物制备而成；本发明显著提高了纳米片的载药量、血液
半衰期和平均滞留时间，同时基于该纳米
复合材料的药物传输体系可以靶向到达并富集在病灶部位，药物缓慢释放且智能可控，从而达到降低抗肿瘤药物毒副作用、提高病变部位的药物浓度和改善诊疗效果的目的。
附图说明
[0021] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0022] 图1是本发明制备的叶酸靶向磁功能化二硫化钨的透射电镜图；
[0023] 图2是本发明制备的叶酸靶向磁功能化二硫化钨的X-射线衍射图；
[0024] 图3是本发明制备的叶酸靶向磁功能化二硫化钨的
磁滞回线；
[0025] 图4-a是本发明制备的叶酸靶向磁功能化二硫化钨的载药量；
[0026] 图4-b是本发明制备的叶酸靶向磁功能化二硫化钨的药物释放曲线图；
[0027] 图5是本发明制备的叶酸靶向磁功能化二硫化钨的细胞毒性数据图。
具体实施方式
[0028] 下面结合本发明
实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0030] 本发明包括二硫化钨纳米片，均匀修饰在二硫化钨纳米片表面的MFe2O4磁性纳米粒子，通过酰胺成键作用与被MFe2O4磁性纳米粒子修饰后的磁功能化二硫化钨纳米片的表面连接的叶酸靶向分子，以及通过
物理吸附和氢键作用负载在连接有叶酸靶向分子的叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片上的抗肿瘤模型药物，其中MFe2O4磁性纳米粒子的M为Fe、Co、Ni元素中的一种。
[0031] 其中，二硫化钨纳米片厚度为0.3-1.5nm，其尺寸为0.5-5μm，MFe2O4磁性纳米粒子的直径为4-15nm，其形状为球形或六面体状。
[0032] 其制备方法包括如下步骤：
[0033] (1)磁功能化二硫化钨纳米片的制备
[0034] 将二硫化钨粉末加入去离子水中，超声振荡0.5-12h，将成比例计量的三价铁盐和二价M盐完全溶解于去离子水中，用氮气鼓泡法将其搅拌均匀后升温至60℃，逐渐滴加碱性调节剂使反应体系pH值为10-14，反应0.5-2h后加热至90℃，继续反应1-4h制成二硫化钨纳米片，加入与二硫化钨纳米片成比例计量的氨基改性剂，机械搅拌或超声振荡1-4h，其反应产物用无水乙醇醇洗三次，离心分离，置于真空干燥箱中干燥24h，得到磁功能化二硫化钨纳米片；
[0035] 其中，三价铁盐为铁的硝酸盐、氯化物、硫酸盐、草酸盐、醋酸盐、硝酸盐水合物、氯化物水合物、硫酸盐水合物、草酸盐水合物、醋酸盐水合物中的一种，所使用的二价M盐为M的硝酸盐、氯化物、硫酸盐、草酸盐、醋酸盐、硝酸盐水合物、氯化物水合物、硫酸盐水合物、草酸盐水合物、醋酸盐水合物中的一种或多种，其中三价铁盐和二价M盐的摩尔比为1:0.5-1:1.9。
[0036] 氨基改性剂为γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、L-半胱氨酸、聚甲烯酰胺、聚乙亚胺或聚天冬酰胺中的一种，其中二硫化钨纳米片和氨基改性剂的质量比为1:1-20:1。
[0037] (2)叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片的制备
[0038] 将成比例计量的磁功能化二硫化钨纳米片和叶酸分散于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入与二硫化钨纳米片成比例计量的催化剂后机械搅拌或超声振荡0.5-1h，接着加入与二硫化钨纳米片成比例计量的叶酸(请确定此次所加入的物质以及数量，是否和第一次加入的量一样，两者有何种关系)，在30℃下氮气氛围中机械搅拌或超声振荡6-24h,其反应产物用无水乙醇醇洗三次，离心分离，真空干燥24h即得叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片；
[0039] 其中，叶酸与磁功能化二硫化钨纳米片的质量比为1:2-1:6，
[0040] (3)叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体的制备
[0041] 将成比例计量的叶酸磁功能化二硫化钨纳米片和抗肿瘤药物分散于磷酸盐缓冲溶液中，在30℃下氮气氛围中机械搅拌或超声振荡4-24h，其反应产物用磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，离心分离，真空干燥24h即得叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体。
[0042] 其中，抗肿瘤药物与叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片的质量比为1:1-1:5。
[0043] 抗肿瘤模型药物为顺铂、卡铂、泰素、紫杉醇、喜树碱、5-氟尿嘧啶、表柔比星、吉西他滨、丙卡巴肼、环磷酰胺、柔红霉素、丝裂霉素、普卡霉素、道诺霉素、盐酸阿霉素中的一种或多种。
[0044] 实施例1
[0045] (1)磁功能化二硫化钨纳米片的制备
[0046] 将5.0g商用二硫化钨粉末加入500mL去离子水中，置于低功率超声槽中,超声振荡0.5-12h；加入8.0g FeCl3·6H2O和2.94g FeCl2·4H2O，用氮气鼓泡法将其搅拌均匀后升温至60℃，逐渐滴加2.5M氢氧化钠溶液使反应体系pH值为10-14，反应0.5-2h后加热至90℃，继续反应1-4h；加入0.25gγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌或超声振荡4-12h，反应液用磷酸盐缓冲液超声分散后在4000r/min转速下离心分离，其反应产物用无水乙醇醇洗三次，置于真空干燥箱中干燥24h，得到磁功能化二硫化钨纳米片；
[0047] (2)叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片的制备
[0048] 将0.5g磁功能化二硫化钨纳米片分散于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入0.5g N,N'-二环己基碳酰亚胺后机械搅拌或超声振荡0.5-1h，接着加入0.1g叶酸，在30℃下氮气氛围中机械搅拌或超声振荡6-24h,反应液用磷酸盐缓冲溶液超声分散后在4000r/min转速下离心分离，其反应产物用无水乙醇醇洗三次，真空干燥24h即得叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片。
[0049] (3)叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体的制备
[0050] 将250mg叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片和2.5mg抗肿瘤药物盐酸阿霉素分散于磷酸盐缓冲溶液中，在30℃下氮气氛围中机械搅拌或超声振荡4-24h，反应液用磷酸盐缓冲液超声分散后在4000r/min转速下离心分离，其反应产物用磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，真空干燥24h即得叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体。
[0051] 实施例2
[0052] (1)磁功能化二硫化钨纳米片的制备
[0053] 将5.0g商用二硫化钨粉末加入500mL去离子水中，置于低功率超声槽中,超声振荡0.5-12h；加入8.0g FeCl3·6H2O和4.85g C℃l2·6H2O，用氮气鼓泡法将其搅拌均匀后升温至60℃，逐渐滴加2.5M氢氧化钠溶液使反应体系pH值为10-14，反应0.5-2h后加热至90℃，继续反应1-4h；加入0.25gγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌或超声振荡4-12h，反应液用磷酸盐缓冲液超声分散后在4000r/min转速下离心分离，其反应产物用无水乙醇醇洗三次，置于真空干燥箱中干燥24h，得到磁功能化二硫化钨纳米片。
[0054] (2)叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片的制备
[0055] 将0.5g磁功能化二硫化钨纳米片分散于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入0.5g N,N'-二环己基碳酰亚胺后机械搅拌或超声振荡0.5-1h，接着加入0.1g叶酸，在30℃下氮气氛围中机械搅拌或超声振荡6-24h,反应液用磷酸盐缓冲液超声分散后在4000r/min转速下离心分离，其反应产物用无水乙醇醇洗三次，真空干燥24h即得叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片。
[0056] (3)叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体的制备
[0057] 将250mg叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片和2.5mg抗肿瘤药物盐酸阿霉素分散于磷酸盐缓冲溶液中，在30℃下氮气氛围中机械搅拌或超声振荡4-24h，然后反应液用磷酸盐缓冲液超声分散后在4000r/min转速下离心分离，其反应产物用磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，真空干燥24h即得叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体。
[0058] 实施例3
[0059] (1)磁功能化二硫化钨纳米片的制备
[0060] 将5.0g商用二硫化钨粉末加入500mL去离子水中，置于低功率超声槽中,超声振荡0.5-12h；加入8.0g FeCl3·6H2O和3.52g NiCl2·6H2O，用氮气鼓泡法将其搅拌均匀后升温至60℃，逐渐滴加2.5M氢氧化钠溶液使反应体系pH值为10-14，反应0.5-2h后加热至90℃，继续反应1-4h；加入0.25gγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌或超声振荡4-12h，反应液用磷酸盐缓冲液超声分散后在4000r/min转速下离心分离，其反应产物用无水乙醇醇洗三次，置于真空干燥箱中干燥24h，得到磁功能化二硫化钨纳米片；
[0061] (2)叶酸靶向磁功能化二硫化钨的制备
[0062] 将0.5g磁功能化二硫化钨纳米片分散于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入0.5g N,N'-二环己基碳酰亚胺后机械搅拌或超声振荡0.5-1h，接着加入0.1g叶酸，在30℃下氮气氛围中机械搅拌或超声振荡6-24h,反应液用磷酸盐缓冲液超声分散后在4000r/min转速下离心分离，其反应产物用无水乙醇醇洗三次，真空干燥24h即得叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片。
[0063] (3)叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体的制备
[0064] 将250mg叶酸靶向磁功能化二硫化钨纳米片和2.5mg抗肿瘤药物盐酸阿霉素分散于磷酸盐缓冲溶液中，在30℃下氮气氛围中机械搅拌或超声振荡4-24h，反应液用磷酸盐缓冲液超声分散后在4000r/min转速下离心分离，其反应产物用磷酸盐缓冲溶液冲洗三次,真空干燥24h即得叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体。
[0065] 叶酸靶向磁功能化二硫化钨药物载体的性能表征：
[0066] 图1为实施例1中叶酸靶向磁功能化二硫化钨的透射电镜图。从图中可见，几近透明的二硫化钨纳米片完全剥离，没有自由堆砌和层叠现象的发生。四氧化三铁纳米粒子的平均尺寸在4-15nm之间，纳米粒子均匀地修饰在二硫化钨纳米片的表面，未见到严重团聚和自由散落粒子。
[0067] 图2为实施例1中叶酸靶向磁功能化二硫化钨的X-射线衍射图谱。从图中可观察到，在2θ＝29.7°、35.4°、42.8°、53.4°、56.8°和62.3°处出现强烈而尖锐的特征衍射峰，分别对应四氧化三铁标准卡片中的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面(JCPDS No.22-1086)。此外，叶酸靶向磁功能化二硫化钨基本显现出四氧化三铁的特征衍射峰而未观察到二硫化钨的衍射峰，这主要是因为在化学反应的过程中，四氧化三铁纳米粒子在二硫化钨纳米片表面的附着和生长破坏了二硫化钨纳米片层的有序堆叠，导致二硫化钨纳米片在
复合体系中呈无序剥离状态。
[0068] 图3为实施例1中叶酸靶向磁功能化二硫化钨的磁滞回线图。从图中可见，制备的叶酸靶向磁性二硫化钨的磁化曲线上未出现明显的磁滞回线，剩磁和
矫顽力基本为零，表明得到的叶酸靶向磁功能化二硫化钨在室温下具有超
顺磁性，饱和磁化强度为62.7emu/g。
[0069] 图4-a及4-b为实施例1中以盐酸阿霉素DOX为模型药物叶酸靶向磁功能化二硫化钨的载药量和药物释放曲线图。从图中可知，制备的叶酸靶向磁功能化二硫化钨的载药量具有浓度依赖性，饱和载药量达到0.71mg/mg。此外，制备的纳米复合材料的药物释放行为呈现突释和缓释两个阶段，在不同的pH值环境下具有不同的累积释放量，呈现出典型的pH敏感释放特性，表明制备的叶酸靶向磁功能化二硫化钨是一种良好的智能药物载体。
[0070] 图5为实施案例1中叶酸靶向磁功能化二硫化钨的MTT细胞毒性数据图。从图中可知，MG-63细胞在最大浓度为150μg/mL的样品分散液中孵育24h后，它的细胞存活率下降到15％，证实制备的叶酸靶向磁功能化二硫化钨具有明显的癌细胞杀死效果，这为进一步的临床肿瘤早期诊断和治疗提供理论参考。
