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一种纳米凝胶、其制备方法和抗肿瘤纳米凝胶载药体系及其制备方法

阅读：1017发布：2020-11-23

专利汇可以提供一种纳米凝胶、其制备方法和抗肿瘤纳米凝胶载药体系及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本申请提供了一种纳米凝胶及其制备方法，该方法在苯硼酸类引发剂和吗啉类引发剂存在下，将L‑谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯‑N‑环内酸酐在有机溶剂中进行反应，得到反应液；将所述反应液与L‑胱氨酸‑N‑环内酸酐及L‑苯丙氨酸‑N‑环内酸酐混合后反应，得到纳米凝胶；其包括苯硼酸基团、吗啉基团、谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节、苯丙氨酸链节和胱氨酸链节；所述纳米凝胶通过二硫键形成交联网络结构。本发明提供了一种抗肿瘤纳米凝胶载药体系及其制备方法。该载药颗粒表面带有苯硼酸与吗啉基团，促进肿瘤靶向和内吞。本发明通过二硫键交联形成纳米凝胶结构，在肿瘤部位靶向富集以及内吞后，该载药颗粒可以快速释放药物，达到抑制肿瘤的效果。，下面是一种纳米凝胶、其制备方法和抗肿瘤纳米凝胶载药体系及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种纳米凝胶，其特征在于，所述纳米凝胶为聚氨基酸类材料，包括聚谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节和聚苯丙氨酸聚胱氨酸共聚链节，所述聚谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节与聚苯丙氨酸聚胱氨酸共聚链节通过二硫键交联而形成交联网络结构；
所述纳米凝胶还包括苯硼酸基团和吗啉基团，所述苯硼酸基团和吗啉基团均存在于纳米凝胶表面。
2.根据权利要求1所述的纳米凝胶，其特征在于，所述谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节的数量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比为(5～50)：1；
所述聚苯丙氨酸聚胱氨酸共聚链节中苯丙氨酸链节的数量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比为(2～50)：1；
所述聚苯丙氨酸聚胱氨酸共聚链节中胱氨酸链节的数量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比为(2～50)：1。
3.根据权利要求1所述的纳米凝胶，其特征在于，所述纳米凝胶的分子量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比为(3000～10000)：1。
4.一种纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：
在苯硼酸类引发剂和吗啉类引发剂存在下，将L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐在有机溶剂中进行反应，得到反应液；
将所述反应液与L-胱氨酸-N-环内酸酐及L-苯丙氨酸-N-环内酸酐混合，进行反应，得到纳米凝胶；
所述纳米凝胶为聚氨基酸类材料，包括聚谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节和聚苯丙氨酸聚胱氨酸共聚链节，所述聚谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节与聚苯丙氨酸聚胱氨酸共聚链节通过二硫键交联而形成交联网络结构；
所述纳米凝胶还包括苯硼酸基团和吗啉基团，所述苯硼酸基团和吗啉基团均存在于纳米凝胶表面。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述苯硼酸类引发剂具有式1结构：
所述吗啉类引发剂具有式2结构：
式1中，x选自0～3的整数；式2中，y选自1～5的整数。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将所述反应液与L-胱氨酸-N-环内酸酐及L-苯丙氨酸-N-环内酸酐混合，进行反应后，将得到的溶液与乙醚混合，依次经过滤和真空干燥，得到纳米凝胶。
7.一种抗肿瘤纳米凝胶载药体系，包括：
纳米凝胶和负载在所述纳米凝胶上的抗肿瘤药物；
所述纳米凝胶为权利要求1～3任一项所述的纳米凝胶或权利要求4～6任一项所述的制备方法制得的纳米凝胶。
8.根据权利要求7所述的载药体系，其特征在于，所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱和紫草素中的任意一种。
9.一种抗肿瘤纳米凝胶载药体系的制备方法，包括以下步骤：
将纳米凝胶和抗肿瘤药物溶解于溶剂中，加水后，依次经搅拌、透析和冻干，得到抗肿瘤纳米凝胶载药体系；
所述纳米凝胶为权利要求1～3任一项所述的纳米凝胶或权利要求4～6任一项所述的制备方法制得的纳米凝胶。

说明书全文

一种纳米凝胶、其制备方法和抗肿瘤纳米凝胶载药体系及其

制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及高分子药物载体技术领域，尤其涉及一种纳米凝胶、其制备方法、抗肿瘤纳米凝胶载药体系及其制备方法。

背景技术

[0002] 当前，肿瘤已经成为威胁人类健康的最严重的疾病之一。临床上常用的恶性肿瘤治疗手段有化学治疗、放射治疗和手术治疗等，其中，化学治疗是利用化学药物治疗癌症，是最常用和重要的治疗途径。但临床上所用的抗肿瘤药物在应用中有诸多的缺陷，如水溶性及稳定性差，药物毒副作用大。

[0003] 为了解决这些问题，可将抗肿瘤药物与药物载体结合，以改善药物的水溶性和稳定性；并且可以设计出智能化的药物载体，对抗肿瘤药物进行控制释放，从而减小药物对正常组织的毒副作用，充分发挥药物的功效。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本申请提供一种纳米凝胶、其制备方法和抗肿瘤纳米凝胶载药体系及其制备方法，本发明提供的抗肿瘤纳米凝胶载药体系能促进肿瘤靶向和内吞，可以快速释放药物，达到抑制肿瘤的效果。

[0005] 本发明提供一种纳米凝胶，包括苯硼酸基团、吗啉基团、谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节、苯丙氨酸链节和胱氨酸链节；

[0006] 所述纳米凝胶通过二硫键形成交联网络结构；所述纳米凝胶为聚氨基酸类材料。

[0007] 优选地，所述纳米凝胶包括：

[0008] 聚谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节和与所述聚谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节交联的聚苯丙氨酸聚胱氨酸共聚链节；

[0009] 所述苯硼酸基团和吗啉基团均存在于纳米凝胶的表面。

[0010] 优选地，所述谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节的数量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比为(5～50)：1；

[0011] 所述苯丙氨酸链节的数量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比为(2～50)：1；

[0012] 所述胱氨酸链节的数量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比为(2～50)：1。

[0013] 优选地，所述纳米凝胶的分子量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比为(3000～10000)：1。

[0014] 本发明提供一种纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：

[0015] 在苯硼酸类引发剂和吗啉类引发剂存在下，将L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐在有机溶剂中进行反应，得到反应液；

[0016] 将所述反应液与L-胱氨酸-N-环内酸酐及L-苯丙氨酸-N-环内酸酐混合，进行反应，得到纳米凝胶；

[0017] 所述纳米凝胶包括苯硼酸基团、吗啉基团、谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节、苯丙氨酸链节和胱氨酸链节；

[0018] 所述纳米凝胶通过二硫键形成交联网络结构；所述纳米凝胶为聚氨基酸类材料。

[0019] 优选地，所述苯硼酸类引发剂具有式1结构：

[0020]

[0021] 所述吗啉类引发剂具有式2结构：

[0022]

[0023] 式1中，x选自0～3的整数；式2中，y选自1～5的整数。

[0024] 优选地，将所述反应液与L-胱氨酸-N-环内酸酐及L-苯丙氨酸-N-环内酸酐混合，进行反应后，将得到的溶液与乙醚混合，依次经过滤和真空干燥，得到纳米凝胶。

[0025] 与现有技术相比，本发明提供的纳米凝胶包括苯硼酸基团、吗啉基团、谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节、苯丙氨酸链节和胱氨酸链节；并通过二硫键形成交联网络结构；所述纳米凝胶为聚氨基酸类材料。本发明提供的纳米凝胶可作为抗肿瘤药物的载体，形成智能靶向于肿瘤细胞的智能纳米凝胶载药颗粒。在本发明实施例中，该载药颗粒表面带有苯硼酸与吗啉基团，可以靶向于唾液酸基团过度表达的肿瘤细胞，且在肿瘤组织pH值条件下转变为正电荷，从而促进肿瘤靶向和内吞。并且，本发明通过二硫键交联形成纳米凝胶结构，在肿瘤部位靶向富集以及内吞后，该载药颗粒可以快速释放药物，达到抑制肿瘤的效果。其次，该载药颗粒具有寡聚乙二醇的外壳，可以抗血液蛋白吸附，从而延长血液循环时间。

[0026] 此外，本发明提供的纳米凝胶主要以生物可降解的氨基酸基团和寡聚乙二醇为结构单元，生物相容性好，在体内可降解，且降解产物对人体无害，具有相当好的应用前景。

[0027] 本发明提供一种抗肿瘤纳米凝胶载药体系，包括：

[0028] 纳米凝胶和负载在所述纳米凝胶上的抗肿瘤药物；

[0029] 所述纳米凝胶为上文所述的纳米凝胶。

[0030] 优选地，所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱和紫草素中的任意一种。

[0031] 本发明还提供一种抗肿瘤纳米凝胶载药体系的制备方法，包括以下步骤：

[0032] 将纳米凝胶和抗肿瘤药物溶解于溶剂中，加水后，依次经搅拌、透析和冻干，得到抗肿瘤纳米凝胶载药体系；

[0033] 所述纳米凝胶为上文所述的纳米凝胶。

[0034] 与现有技术相比，本申请提供的抗肿瘤纳米凝胶载药体系主要由上文所述的纳米凝胶与抗肿瘤药物组成。在本发明中，所述纳米凝胶带有苯硼酸靶向性和吗啉基团以及具有还原响应性，使得抗肿瘤纳米凝胶载药体系能促进肿瘤靶向和内吞，可以快速释放药物，达到抑制肿瘤的效果。附图说明

[0035] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

[0036] 图1为实施例15所制备的纳米凝胶的核磁共振氢谱图；

[0037] 图2为实施例15所制备的纳米凝胶的红外光谱谱图；

[0038] 图3为实施例15所制备的纳米凝胶的透射电镜图；

[0039] 图4为实施例29所制备的纳米凝胶载药体系的药物释放曲线；

[0040] 图5为实施例29所制备的纳米凝胶载药体系的细胞毒性试验结果；

[0041] 图6为实施例29所制备的纳米凝胶载药体系的肿瘤抑制曲线。

具体实施方式

[0042] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0043] 本发明提供了一种纳米凝胶，包括苯硼酸基团、吗啉基团、谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节、苯丙氨酸链节和胱氨酸链节；

[0044] 所述纳米凝胶通过二硫键形成交联网络结构；所述纳米凝胶为聚氨基酸类材料。

[0045] 肿瘤细胞由于其快速地增值，会表现出与正常细胞不同的性质，如较低的肿瘤部位pH值，细胞表面过度表达的糖蛋白，细胞内过度表达的酶和细胞内的高谷胱甘肽浓度。这些特异性为本申请设计得到智能的抗肿瘤药物载体提供了基础，本申请提供的纳米凝胶可作为抗肿瘤药物的载体，形成智能靶向于肿瘤细胞的智能纳米凝胶载药颗粒。

[0046] 本发明提供的纳米凝胶包括苯硼酸基团，所述苯硼酸基团即主体结构为苯硼酸的基团，可由苯硼酸类引发剂形成。在本发明实施例提供的纳米凝胶中，所述苯硼酸基团在纳米凝胶表面，可以与肿瘤细胞表面的过度表达的糖蛋白中的唾液酸基团进行特异性的结合，从而达到靶向识别肿瘤细胞的效果。

[0047] 在本发明的实施例中，所述苯硼酸类引发剂优选具有式1结构：

[0048]

[0049] 式1中，x可选自0～3的整数。本发明对苯硼酸上取代基的位置没有特殊限制；具体的，所述苯硼酸类引发剂可具有式101、式102、式103或式104结构：

[0050]

[0051] 本发明提供的纳米凝胶包括吗啉基团，所述吗啉基团即主体结构为吗啉的基团，可由吗啉类引发剂形成。在本发明提供的纳米凝胶中，所述吗啉基团在纳米凝胶的表面，可使纳米凝胶在肿瘤组织pH值条件下显正电性而转变为正电荷，表面带有正电荷的纳米粒子容易被细胞内吞。

[0052] 在本发明的实施例中，所述吗啉类引发剂优选具有式2结构：

[0053]

[0054] 式2中，y可选自1～5的整数。具体的，所述吗啉类引发剂可具有式201、式202、式203或式204结构：

[0055]

[0056] 本发明提供的纳米凝胶包括谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节，所述谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节即主体结构为谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯的链节，可由L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐提供。在本发明纳米凝胶中，所述谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯基团能够赋予载药颗粒寡聚乙二醇的外壳，可以抗血液蛋白吸附，从而延长血液循环时间。

[0057] 在本发明的实施例中，所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐具有式I结构：

[0058]

[0059] 式I中，n为聚合度，优选1≤n≤5。

[0060] 本发明对所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐的来源没有特殊限制，可以按照如下方法制备得到：将L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐。

[0061] 其中，所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯优选按照以下方法制备得到：将L-谷氨酸与寡聚乙二醇单甲醚进行缩合反应，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯。具体的，本发明实施例将L-谷氨酸与寡聚乙二醇单甲醚在浓硫酸存在下进行缩合反应，得到反应液；将所述反应液的pH值调节至中性，进行离心，然后将离心得到的固体用甲醇溶解，得到混合液；将所述混合液与异丙醇混合后进行离心，将离心得到的固体真空干燥，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯。

[0062] 在制备L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯时，本发明实施例可滴加浓硫酸，使L-谷氨酸与寡聚乙二醇单甲醚在搅拌的条件下进行缩合反应；其他条件和操作采用本领域常用的即可。

[0063] 在L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐的制备方法中，可在无水条件下，用有机溶剂溶解L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯，再加入双(三氯甲基)碳酸酯混合，使两者在所述有机溶剂中进行缩合反应，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐。在本发明实施例中，所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1：(0.1～1.2)，更优选为1：(0.3～1)，最优选为1：(0.5～0.8)。所述有机溶剂优选为四氢呋喃；所述混合的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃。所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应的温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃；所述缩合反应的时间优选为0.1小时～5小时，更优选为0.15小时～3小时，最优选为0.2小时～2小时。

[0064] 所述缩合反应结束后，本发明实施例将得到的反应液在过量石油醚中沉降，依次经分离、洗涤、重结晶和干燥，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐。所述沉降、分离、洗涤、重结晶和干燥均为本领域技术人员熟知的技术手段，本申请没有特殊限制。

[0065] 本发明提供的纳米凝胶包括苯丙氨酸链节，所述苯丙氨酸链节即主体结构为苯丙氨酸的链节，可由L-苯丙氨酸-N-环内酸酐提供。在本发明的实施例中，所述L-苯丙氨酸-N-环内酸酐具有式II结构：

[0066]

[0067] 本发明对所述L-苯丙氨酸-N-环内酸酐的来源没有特殊限制，可以按照以下方法制备得到：将L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到L-苯丙氨酸-N-环内酸酐。

[0068] 本发明实施例可在无水条件下，用有机溶剂溶解L-苯丙氨酸，加入双(三氯甲基)碳酸酯混合，使两者在所述有机溶剂中进行缩合反应，得到L-苯丙氨酸-N-环内酸酐。在本发明实施例中，所述L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1：(0.1～1.2)，更优选为1：(0.3～1)，最优选为1：(0.5～0.8)。所述有机溶剂优选为四氢呋喃；所述混合的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃。所述L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应的温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃；所述缩合反应的时间优选为0.1小时～5小时，更优选为0.15小时～3小时，最优选为0.2小时～2小时。

[0069] 所述缩合反应结束后，本发明实施例将得到的反应液在过量石油醚中沉降，依次经分离、洗涤、重结晶和干燥，得到L-苯丙氨酸-N-环内酸酐。所述沉降、分离、洗涤、重结晶和干燥均为本领域技术人员熟知的技术手段，本申请没有特殊限制。

[0070] 本发明提供的纳米凝胶包括胱氨酸链节，所述胱氨酸链节即主体结构为胱氨酸的链节，可由L-胱氨酸-N-环内酸酐提供。在本发明的实施例中，所述L-胱氨酸-N-环内酸酐具有式III结构：

[0071]

[0072] 本发明对所述L-胱氨酸-N-环内酸酐的来源没有特殊限制，可以按照以下方法制备得到：将L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到L-胱氨酸-N-环内酸酐。

[0073] 本发明实施例可在无水条件下，用有机溶剂溶解L-胱氨酸，加入双(三氯甲基)碳酸酯混合，使两者在所述有机溶剂中进行缩合反应，得到L-胱氨酸-N-环内酸酐。在本发明实施例中，所述L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1：(0.1～1.2)，更优选为1：(0.3～1)，最优选为1：(0.5～0.8)。所述有机溶剂优选为四氢呋喃；所述混合的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃。所述L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应的温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃；所述缩合反应的时间优选为0.1小时～5小时，更优选为0.15小时～3小时，最优选为0.2小时～2小时。

[0074] 所述缩合反应结束后，本发明实施例将得到的反应液在过量石油醚中沉降，依次经分离、洗涤、重结晶和干燥，得到L-胱氨酸-N-环内酸酐。所述沉降、分离、洗涤、重结晶和干燥均为本领域技术人员熟知的技术手段，本申请没有特殊限制。

[0075] 本发明提供的纳米凝胶包括上文所述的谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节、苯丙氨酸链节和胱氨酸链节，其为聚氨基酸类材料，可称为聚氨基酸纳米凝胶。在本发明的一个实施例中，所述纳米凝胶包括聚谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节，可简写为PGlu-OEG。所述谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节的数量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比优选为(5～50)：1，更优选为(6～25)：1，最优选为10:1。

[0076] 在本发明的一个实施例中，所述纳米凝胶包括聚苯丙氨酸聚胱氨酸共聚链节，可简写为PPhe-co-PCys，其与聚谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节交联。所述苯丙氨酸链节的数量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比优选为(2～50)：1，更优选为(2.5～25)：1；所述胱氨酸链节的数量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比优选为(2～
50)：1，更优选为(5～25)：1，最优选为10:1。所述苯硼酸基团与吗啉基团的摩尔比优选为(0.1～10)：1，更优选为(0.5～1.5)：1，最优选为1：1。

[0077] 在本发明的一个实施例中，所述纳米凝胶包括：亲水的聚谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节和与其交联的聚苯丙氨酸聚胱氨酸共聚链节。本发明实施例无规排列的链节之间，由于二硫键的作用而形成交联网络结构。本发明提供的纳米凝胶通过二硫键形成交联网络结构，当载药的纳米凝胶进入细胞后，在细胞内高谷胱甘肽的浓度下，作为交联点的二硫键断裂，纳米凝胶解体，从而快速释放药物，达到逐级响应的智能释放药物的效果，实现抑制肿瘤的目的。

[0078] 并且，本发明实施例提供的纳米凝胶以生物可降解的聚氨基酸和寡聚乙二醇为结构单元，生物相容性好，在体内可降解，降解产物为氨基酸和聚乙二醇，降解产物可通过肾脏直接排除体外，对人体无害。

[0079] 在本发明的实施例中，所述纳米凝胶的表面带有具有靶向性的苯硼酸基团(即苯硼酸靶向基团)和可电性转变的吗啉基团；所述纳米凝胶还具有还原响应性。所述纳米凝胶的分子量与苯硼酸基团和吗啉基团的分子个数总和之比优选为(3000～10000)：1，更优选为(3500～7000)：1。本发明可以通过调节纳米凝胶的聚合度和交联度等，得到不同粒径大小的纳米凝胶；所述纳米凝胶的粒径优选为30nm～500nm，更优选为50nm～200nm，最优选为80nm～120nm。

[0080] 本发明提供了一种纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：

[0081] 在苯硼酸类引发剂和吗啉类引发剂存在下，将L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐在有机溶剂中进行反应，得到反应液；

[0082] 将所述反应液与L-胱氨酸-N-环内酸酐及L-苯丙氨酸-N-环内酸酐混合，进行反应，得到纳米凝胶；

[0083] 所述纳米凝胶包括苯硼酸基团、吗啉基团、谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节、苯丙氨酸链节和胱氨酸链节；

[0084] 所述纳米凝胶通过二硫键形成交联网络结构；所述纳米凝胶为聚氨基酸类材料。

[0085] 本发明旨在解决抗肿瘤药物的智能传输问题，为了克服抗肿瘤药物的利用率低和副作用大的缺点，本发明设计制备了一种可以促进肿瘤细胞靶向与内吞的智能纳米凝胶载药体系。

[0086] 本发明实施例分别称取苯硼酸类引发剂和吗啉类引发剂，再称取L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐，均加入到反应瓶中，然后加入有机溶剂，反应一定时间，得到反应液。

[0087] 本发明以L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐为原料，其具有式I结构：

[0088]

[0089] 式I中，n为聚合度，优选1≤n≤5。在本发明的一个实施例中，本发明以L-谷氨酸三乙二醇单甲醚-N-环内酸酐为原料。本发明对所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐的来源没有特殊限制，可以按照上文所述的相应制备方法进行制备，也可以采用市售产品。

[0090] 在本发明实施例中，将苯硼酸类引发剂和吗啉类引发剂和L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐溶解于有机溶剂中，优选氮气气氛保护，搅拌，反应。其中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环或氯仿，更优选为N,N-二甲基甲酰胺或二氧六环，最优选为N,N-二甲基甲酰胺。所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐的质量与有机溶剂的体积之比优选为1g:(1～20)mL，更优选为1g:(3～15)mL，最优选为1g:(5～10)mL。所述苯硼酸类引发剂优选具有式1结构：

[0091]

[0092] 式1中，x可选自0～3的整数。本发明对苯硼酸上取代基的位置没有特殊限制；具体的，所述苯硼酸类引发剂可具有式101、式102、式103或式104结构：

[0093]

[0094] 所述吗啉类引发剂优选具有式2结构：

[0095]

[0096] 式2中，y可选自1～5的整数。具体的，所述吗啉类引发剂可具有式201、式202、式203或式204结构：

[0097]

[0098] 在本发明中，所述苯硼酸类引发剂和吗啉类引发剂的摩尔数之和与L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐的摩尔数之比优选为1：(5～50)，更优选为1：(6～25)，最优选为1：10。所述苯硼酸类引发剂与吗啉类引发剂的摩尔比优选为(0.1～10)：1，更优选为(0.5～1.5)：1，最优选为1：1。本发明可在不同引发剂比例下引发上述反应，反应一定时间，得到反应液。所述反应的温度优选为15℃～50℃，更优选为20℃～40℃，最优选为25℃～35℃。所述的反应时间优选为2d～7d，更优选为3d～5d，最优选为4d。在本发明中，所得反应液可包含不同分子量的聚(L-谷氨酸乙二醇单甲醚酯)。

[0099] 得到反应液后，本发明实施例将L-胱氨酸-N-环内酸酐与L-苯丙氨酸-N-环内酸酐加到上述溶液中，优选在氮气气氛下，搅拌，反应，得到纳米凝胶。

[0100] 本发明以L-胱氨酸-N-环内酸酐与L-苯丙氨酸-N-环内酸酐为原料，可以先将两者混合均匀，再加入到上述反应液中。在本发明中，所述L-苯丙氨酸-N-环内酸酐具有式II结构，所述L-胱氨酸-N-环内酸酐具有式III结构。本发明对两者的来源均没有特殊限制，可以通过上文所述的相应制备方法获得，也可以采用市售产品。

[0101]

[0102] 在本发明中，所述两种引发剂摩尔数之和与L-胱氨酸-N-环内酸酐的摩尔数之比优选为1：(2～20)，更优选为1：(5～10)，最优选的为1：10。所述两种引发剂摩尔数之和与L-苯丙氨酸-N-环内酸酐的摩尔数之比优选为1：(2～20)，更优选为1：(5～10)，最优选的为1：10。所述反应的温度优选为15℃～50℃，更优选为20℃～40℃，最优选为25℃～35℃。所述反应的时间优选为2d～7d，更优选为3d～5d，最优选为4d。

[0103] 在本发明的优选实施例中，将所述反应液与L-胱氨酸-N-环内酸酐及L-苯丙氨酸-N-环内酸酐混合，进行反应后，将得到的溶液与乙醚混合，依次经过滤和真空干燥，得到纳米凝胶。其中，所述混合、过滤和真空干燥均为本领域技术人员熟知的技术手段，本申请并无特殊限制。

[0104] 得到纳米凝胶后，本发明按照本领域常用的方法对其进行分析。所述纳米凝胶包括苯硼酸基团、吗啉基团、谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节、苯丙氨酸链节和胱氨酸链节；所述纳米凝胶通过二硫键形成交联网络结构；所述纳米凝胶为聚氨基酸类材料。

[0105] 本发明提供的纳米凝胶可作为抗肿瘤药物的载体，形成智能靶向于肿瘤细胞的智能纳米凝胶载药颗粒。在本发明中，该载药颗粒表面带有苯硼酸与吗啉基团，可以靶向于唾液酸基团过度表达的肿瘤细胞，且在肿瘤组织pH值条件下转变为正电荷，从而促进肿瘤靶向和内吞。并且，本发明通过二硫键交联形成纳米凝胶结构，在肿瘤部位靶向富集以及内吞后，该载药颗粒可以快速释放药物，达到抑制肿瘤的效果。其次，该载药颗粒具有寡聚乙二醇的外壳，可以抗血液蛋白吸附，从而延长血液循环时间。

[0106] 此外，本发明制得的纳米凝胶主要以生物可降解的氨基酸和寡聚乙二醇为结构单元，生物相容性好，在体内可降解，且降解产物对人体无害，具有相当好的应用前景。

[0107] 本发明提供了一种抗肿瘤纳米凝胶载药体系，包括：

[0108] 纳米凝胶和负载在所述纳米凝胶上的抗肿瘤药物；

[0109] 所述纳米凝胶为上文所述的纳米凝胶。

[0110] 本发明实施例提供的载药体系是一种集血液长循环、肿瘤靶向与药物控制释放等于一身的智能抗肿瘤载药纳米凝胶体系。

[0111] 本发明提供的抗肿瘤纳米凝胶载药体系包括上文所述的纳米凝胶，以其为载体来担载抗肿瘤药物。在本发明中，所述抗肿瘤药物可选自阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱和紫草素中的任意一种。所述纳米凝胶与抗肿瘤药物的质量比优选为(0.1～1)：1，更优选为(0.3～0.8)：1，最优选为(0.4～0.5)：1。

[0112] 本发明还提供了一种抗肿瘤纳米凝胶载药体系的制备方法，包括：

[0113] 将纳米凝胶和抗肿瘤药物溶解于溶剂中，加水后，依次经搅拌、透析和冻干，得到抗肿瘤纳米凝胶载药体系；所述纳米凝胶为上文所述的纳米凝胶。

[0114] 本发明实施例将上文所述的纳米凝胶与抗肿瘤药物溶解于溶剂中，优选搅拌一定时间。其中，所述纳米凝胶与抗肿瘤药物与上文所述的内容一致，在此不再赘述。所述溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，更优选为二甲基亚砜；所述搅拌的时间优选为8h～12h。

[0115] 然后，本发明实施例可向上述溶液中加去离子水，再依次经搅拌、透析和冻干，得到载药体系。在本发明的优选实施例中，可加入与上述溶剂等体积的去离子水。所述搅拌的时间优选为8h～24h，更优选为8h～16h，最优选为8h。所述透析的温度优选为4℃～20℃，更优选为4℃～8℃，最优选为4℃；所述透析的时间优选为4h～12h，更优选为4h～8h，最优选为8h。此处，本发明对所述冻干没有特殊限制。

[0116] 得到抗肿瘤纳米凝胶载药体系后，本发明进行细胞毒性、药物释放和肿瘤抑制等测试。本申请制备的抗肿瘤纳米凝胶载药体系主要由上文所述的纳米凝胶与抗肿瘤药物组成。在本发明实施例中，所述纳米凝胶表面带有苯硼酸靶向性和吗啉基团以及内核具有还原响应性。所述抗肿瘤纳米凝胶载药体系可以通过EPR效应与特异性靶向效应在肿瘤组织部部位富集，能促进肿瘤靶向和内吞，可以快速释放药物，达到抑制肿瘤的效果。本发明制备的载药纳米颗粒在后期细胞与动物实验表征中表现出很好的肿瘤靶向效果与肿瘤抑制效果，因此具有相当好的应用前景。

[0117] 为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的纳米凝胶、其制备方法和抗肿瘤纳米凝胶载药体系及其制备方法进行具体地描述。

[0118] 实施例1

[0119] 称取10g L-谷氨酸与20mL乙二醇单甲醚在搅拌条件下混合，滴加5mL浓硫酸，在搅拌条件下进行反应，得到反应液。调节所述反应液的pH值至中性，进行离心，然后将离心得到的固体用甲醇溶解，得到混合液。将所述混合液倾倒入异丙醇中进行离心，将离心得到的固体真空干燥，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯。

[0120] 实施例2～5

[0121] 按照实施例1的方法，分别制备得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯；不同之处在于，与10g L-谷氨酸进行反应的原料分别为：40mL二乙二醇单甲醚、60mL三乙二醇单甲醚、80mL四乙二醇单甲醚和100mL五乙二醇单甲醚。

[0122] 实施例6～10

[0123] 在无水条件下，分别将1g实施例1～5制得的L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯与0.6g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃的温度下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃，分别进行缩合反应2h。

[0124] 反应结束后，分别将得到的反应液在过量石油醚中沉降，依次经分离、洗涤、重结晶和干燥，分别得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐。

[0125] 实施例11

[0126] 分别称取1.6g式102所示的苯硼酸类引发剂和0.28g式201所示的吗啉类引发剂，再称取20.8g实施例8制得的L-谷氨酸三乙二醇单甲醚-N-环内酸酐，均加入到反应瓶中，采用氮气气氛保护，然后加入100mL N,N-二甲基甲酰胺，反应3天，得到包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液。

[0127] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.48g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到上述反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。

[0128] 实施例12～14

[0129] 按照实施例11中制备包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液的方法，分别制备得到包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液；不同之处在于，式102所示的苯硼酸类引发剂和式201所示的吗啉类引发剂的质量比例分别为：1.2g：0.56g、0.8g：0.84g、0.4g：1.12g。

[0130] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.48g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后分别加入到上述反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，分别得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。由以上实施例可知，本发明控制不同引发剂的比例，引发制备聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)，进而制备了纳米凝胶。

[0131] 实施例15

[0132] 分别称取1.6g式102所示的苯硼酸类引发剂和0.28g式202所示的吗啉类引发剂，再称取20.8g实施例8制得的L-谷氨酸三乙二醇单甲醚-N-环内酸酐，均加入到反应瓶中，采用氮气气氛保护，然后加入100mL N,N-二甲基甲酰胺，反应3天，得到包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液。

[0133] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.48g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到上述反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。

[0134] 按照本领域常用的方法对得到的纳米凝胶进行分析，结果参见图1～图3和表1、表2，图1为实施例15所制备的纳米凝胶的核磁共振氢谱图，图2为实施例15所制备的纳米凝胶的红外光谱谱图，图3为实施例15所制备的纳米凝胶的透射电镜图，表1为实施例15所制备的纳米凝胶的元素分析、表2为实施例15～18所制备的纳米凝胶的相关结构表征。

[0135] 表1 实施例15所制备的纳米凝胶的元素分析

[0136] N(％) C(％) H(％) S(％)
实施例15 7.07 51.50 6.715 4.670

[0137] 表2 实施例15～18所制备的纳米凝胶的相关结构表征

[0138]实施例 N(Glu-OEG3) N(Phe) N(Cys) 分子量产率(％)
15 10 2.5 2.5 3630 97.2

[0139]16 10 2.5 5 4150 95.3
17 10 2.5 7.5 4680 96.2
18 10 2.5 10 5220 94.4

[0140] 其中，N(Glu-OEG3)，N(Phe)，N(Cys)分别表示各氨基酸类链节数与两种引发剂分子个数之和之比；分子量为纳米凝胶分子量与引发剂分子个数之和之比。

[0141] 由以上分析结果可知，所述纳米凝胶包括苯硼酸基团、吗啉基团、谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节、苯丙氨酸链节和胱氨酸链节；所述纳米凝胶通过二硫键形成交联网络结构。

[0142] 实施例16

[0143] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.95g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到实施例15得到的包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。按照本领域常用的方法对得到的纳米凝胶进行结构表征，结果参见表2。

[0144] 实施例17

[0145] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.43g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到实施例15得到的包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。按照本领域常用的方法对得到的纳米凝胶进行结构表征，结果参见表2。

[0146] 实施例18

[0147] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.90g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到实施例15得到的包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。按照本领域常用的方法对得到的纳米凝胶进行结构表征，结果参见表2。

[0148] 实施例19

[0149] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与2.37g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到实施例15得到的包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。

[0150] 按照本领域常用的方法对得到的纳米凝胶进行结构表征，结果参见表3，表3为实施例19～22所制备的纳米凝胶的相关结构表征。

[0151] 表3 实施例19～22所制备的纳米凝胶的相关结构表征

[0152]实施例 N(Glu-OEG3) N(Phe) N(Cys) 分子量产率(％)
19 10 2.5 2.5 3630 97.2
20 10 2.5 5 4150 95.3
21 10 2.5 7.5 4680 96.2
22 10 2.5 10 5220 94.4

[0153] 其中，N(Glu-OEG3)，N(Phe)，N(Cys)分别表示各氨基酸类链节数与两种引发剂分子个数之和之比；分子量为纳米凝胶分子量与引发剂分子个数之和之比。

[0154] 实施例20

[0155] 将1.14g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.90g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到实施例15得到的包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。按照本领域常用的方法对得到的纳米凝胶进行结构表征，结果参见表3。

[0156] 实施例21

[0157] 将1.71g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.90g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到实施例15得到的包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。按照本领域常用的方法对得到的纳米凝胶进行结构表征，结果参见表3。

[0158] 实施例22

[0159] 将2.28g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.90g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到实施例15得到的包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。按照本领域常用的方法对得到的纳米凝胶进行结构表征，结果参见表3。

[0160] 由以上实施例可知，本发明制备了包含不同聚苯丙氨酸链节的聚氨基酸纳米凝胶。

[0161] 实施例23

[0162] 分别称取1.6g式102所示的苯硼酸类引发剂和0.28g式203所示的吗啉类引发剂，再称取20.8g实施例8制得的L-谷氨酸三乙二醇单甲醚-N-环内酸酐，均加入到反应瓶中，采用氮气气氛保护，然后加入100mL N,N-二甲基甲酰胺，反应3天，得到包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液。

[0163] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.48g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到上述反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。

[0164] 实施例24

[0165] 分别称取1.6g式102所示的苯硼酸类引发剂和0.28g式204所示的吗啉类引发剂，再称取20.8g实施例8制得的L-谷氨酸三乙二醇单甲醚-N-环内酸酐，均加入到反应瓶中，采用氮气气氛保护，然后加入100mL N,N-二甲基甲酰胺，反应3天，得到包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液。

[0166] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.48g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到上述反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。

[0167] 实施例25

[0168] 分别称取1.6g式101所示的苯硼酸类引发剂和0.28g式201所示的吗啉类引发剂，再称取20.8g实施例8制得的L-谷氨酸三乙二醇单甲醚-N-环内酸酐，均加入到反应瓶中，采用氮气气氛保护，然后加入100mL N,N-二甲基甲酰胺，反应3天，得到包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液。

[0169] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.48g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到上述反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。

[0170] 实施例26

[0171] 分别称取1.6g式103所示的苯硼酸类引发剂和0.28g式202所示的吗啉类引发剂，再称取20.8g实施例8制得的L-谷氨酸三乙二醇单甲醚-N-环内酸酐，均加入到反应瓶中，采用氮气气氛保护，然后加入100mL N,N-二甲基甲酰胺，反应3天，得到包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液。

[0172] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.48g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到上述反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。

[0173] 实施例27

[0174] 分别称取1.6g式104所示的苯硼酸类引发剂和0.28g式201所示的吗啉类引发剂，再称取20.8g实施例8制得的L-谷氨酸三乙二醇单甲醚-N-环内酸酐，均加入到反应瓶中，采用氮气气氛保护，然后加入100mL N,N-二甲基甲酰胺，反应3天，得到包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液。

[0175] 将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.48g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，然后加入到上述反应液中，在氮气气氛下搅拌，反应3天。将得到的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到包含聚氨基酸链节的纳米凝胶。由以上实施例可知，本发明控制不同引发剂比例，引发制得包含聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的反应液，进而制得纳米凝胶。

[0176] 实施例28～32

[0177] 称取100mg实施例17制得的纳米凝胶，并分别与10mg、20mg、40mg、60mg、80mg阿霉素溶解于10mL二甲基亚砜中，搅拌12h。然后，分别加入10mL去离子水，搅拌24h，再经透析和冻干等，分别得到载药体系。由以上实施例可知，本发明制备了不同载药量的载药纳米凝胶。

[0178] 实施例33～41

[0179] 按照实施例29的方法，分别制备得到载药体系；不同之处在于，抗肿瘤药物分别为表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱、紫草素。由以上实施例可知，本发明制备了负载不同药物的纳米凝胶载药体系。

[0180] 实施例42

[0181] 在pH值为7.4、6.8和5.5以及10mM谷胱甘肽存在的不同pH值环境下，分别将实施例29得到的载药体系进行药物释放测试，结果参见图4，图4为实施例29所制备的纳米凝胶载药体系的药物释放曲线。由图4可知，本发明提供的纳米凝胶通过二硫键形成交联网络结构，当载药的纳米凝胶进入细胞后，在细胞内高谷胱甘肽的浓度下，作为交联点的二硫键断裂，纳米凝胶解体，从而快速释放药物，达到逐级响应的智能释放药物的效果，实现抑制肿瘤的目的。

[0182] 将得到的载药体系对B16F10细胞(购买于中科院细胞库)进行细胞毒性试验，具体方法为：将B16F10细胞均匀种在96孔板中，每孔细胞数7000，分别用pH＝6.5，pH＝7.4，含有谷胱甘肽(增加细胞内谷胱甘肽浓度)，丁酰亚环酰亚胺(谷胱甘肽合成抑制剂)的培养基培养，体积为200μL。然后，将阿霉素浓度依次为10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.1562mg·mL-1的阿霉素溶液加入到pH＝7.4孔板中，将载药阿霉素粒子加入到pH＝6.5，pH＝7.4，含有谷胱甘肽，丁酰亚环酰亚胺培养基的孔板中，有一组不经过任何处理作为对照组，再次培养24小时。最后吸去培养基，用含有噻唑蓝的溶液处理，分别测试在490纳米处的吸收值。其中，细胞存活率使用以下公式计算，即载药组紫外吸收值与空白组紫外吸收值之比×100：

[0183]

[0184] 结果参见图5，图5为实施例29所制备的纳米凝胶载药体系的细胞毒性试验结果。

[0185] 采用B16F10抑制瘤模型，对所述载药体系进行肿瘤抑制情况试验，具体方法为：选取负载B16F10移植瘤，体重为20g左右的雄性C57鼠18只，分为三组，每组6只，分别通过尾静脉注射生理盐水，阿霉素，载药纳米颗粒，注射的阿霉素剂量为5mg·kg-1。固定时间测量肿瘤长径和短径，肿瘤体积使用以下公式计算：肿瘤体积＝长径×短径×短径/2。测量15天后，处死。结果参见图6，图6为实施例29所制备的纳米凝胶载药体系的肿瘤抑制曲线。

[0186] 由图5和图6可知，该纳米载体在肿瘤组织pH值条件下(～6.5)，具有较生理条件下较高的细胞毒性，这是由于吗啉基团的质子化，发生电荷转变，增加内吞效率造成的。此外，在高谷胱甘肽的细胞中，该纳米载体具有较高的细胞抑制效果，这是由于纳米凝胶在细胞内还原性条件下发生解离，加速释放出药物的结果。

[0187] 在体外抑瘤实验中也可以看出，载药纳米凝胶具有较阿霉素极大提高的抑瘤效果，这是苯硼酸靶向以及吗啉电荷翻转促进内吞和细胞内还原响应释放综合作用的结果，这些结果表明，该载药纳米凝胶在抗肿瘤中具有极大的应用前景。

[0188] 综上所述，本发明提供的纳米凝胶包括苯硼酸基团、吗啉基团、谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯链节、苯丙氨酸链节和胱氨酸链节；并通过二硫键形成交联网络结构。本发明提供的纳米凝胶可作为抗肿瘤药物的载体，形成智能靶向于肿瘤细胞的智能纳米凝胶载药颗粒。在本发明实施例中，该载药颗粒表面带有苯硼酸与吗啉基团，可以靶向于唾液酸基团过度表达的肿瘤细胞，且在肿瘤组织pH值条件下转变为正电荷，从而促进肿瘤靶向和内吞。并且，本发明通过二硫键交联形成纳米凝胶结构，在肿瘤部位靶向富集以及内吞后，该载药颗粒可以快速释放药物，达到抑制肿瘤的效果。其次，该载药颗粒具有寡聚乙二醇的外壳，可以抗血液蛋白吸附，从而延长血液循环时间。

[0189] 此外，本发明提供的纳米凝胶主要以生物可降解的氨基酸和寡聚乙二醇为结构单元，生物相容性好，在体内可降解，且降解产物对人体无害，具有相当好的应用前景。

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