技术领域
[0001] 本
发明涉及医药技术领域，具体的说，涉及一种靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体的制备及其在卵巢癌
肿瘤治疗中的应用。
背景技术
[0002] 卵巢癌是妇科肿瘤中恶性程度最高的
疾病，居妇科
恶性肿瘤死亡率首位，严重威胁着女性的生殖健康。卵巢癌发病隐匿，极易发生侵袭和远处转移，约70%～80%的卵巢癌患者诊断时即属于Ⅲ/Ⅳ期，其五年生存率仅为30%左右。卵巢癌的治疗以彻底的肿瘤减灭术为主，但由于其转移方式多表现为
腹腔内散在的广泛种植，故依靠手术彻底
切除肿瘤尚不可能，残存的散在肿瘤结节，必须依靠手术后的化疗。
[0003] 最常用的是以铂类为主的一线联合化疗方案。但因
化疗药物缺乏选择性且具有毒性反应，它在杀死肿瘤细胞的同时往往也杀死了正常的细胞，导致患者出现骨髓抑制、肾功能不全、消化道反应、心脏传导障碍等情况，
生活质量严重下降，一些患者甚至因化疗引起的感染及出血等并发症而死亡。致使药物利用度有限，使用剂量受限。此外，还有一些年老体弱或有心、肝、肾功能不全的患者无法耐受化疗的毒性反应而不能进行化疗，导致卵巢癌迅速进展而死亡。因此，需要一种有效的靶向
给药系统使药物到达肿瘤区。这种系统不仅可以提高药物在肿瘤区的浓度，更有效地杀伤肿瘤细胞，而且可以减小对正常细胞、组织的损害。
[0004] 已知肿瘤的发生、发展是由细胞
信号网络调控的多基因参与的极其复杂的过程,表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）信号通路在正常组织中多呈关闭状态,而在肿瘤组织中被激活开放,而且其活跃程度与肿瘤病情进展呈正相关。本
发明人和国内外的许多研究均提示人卵巢癌组织和细胞株中高表达EGFR。可以利用EGFR的配体EGF修饰载药的纳米粒载体，无疑将使细胞膜表面高表达EGFR的卵巢癌细胞的药物摄取量增加，从而使药物特异性作用于卵巢癌细胞，发挥药效，实现靶向治疗。在我们前期的文章和
专利（Wang Y，Biomaterials，2013，34：4068-4077；CN201210181369.8）中已经对此报道了EGF修饰纳米粒的靶向效果明显增强。
[0005] 顺铂，即顺式-二氯二
氨合铂（II），属于细胞周期非特异性药物，具有较高的细胞毒性，是卵巢癌治疗的一线药物。然而顺铂缺乏选择性且具毒性反应，它在杀死肿瘤细胞的同时往往也杀死了正常的细胞，导致患者出现严重的毒
副作用，生活质量严重下降。同时由于顺铂属于非脂溶性药物，而又微溶于
水（中国药典，2010），因此限制了对其制剂的开发，所以目前报道的顺铂脂质体普遍存在着包封率或载药量低的现象（CN201210037920.1报道的包封率为51%，载药量为4.0%；CN201010530655.1报道的包封率为71.25%，载药量为8.81%）。本发明根据顺铂的结构特点，制成了顺铂的前药，即顺铂-海藻酸钠连接体。该前药溶于水，增加了顺铂的分子量，更加有利于脂质体包被，本发明所制备的载顺靶向纳米海藻酸钠脂质体的包封率为89.92%，载药率为15.24%。另外，海藻酸钠，是一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的
稳定性、溶解性、粘性和安全性，在药物制剂，
食品添加剂等等各个方面得到了广泛的应用。
[0006] 目前，美国FDA已批准阿霉素脂质体制剂用于多发性骨髓瘤的
联合治疗，并有多种抗肿瘤脂质体制剂也已应用于临床。本发明，以临床上最常用的一线顺铂模型药（通过改性制成顺铂前药），国际公认的脂质体材料（安全无毒，
生物相容性好）为载体，EGF为靶向配体，最终形成EGF修饰的载顺铂靶向纳米海藻酸钠脂质体，从而主动靶向治疗卵巢癌。
发明内容
[0007] 本发明提供一种靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体，该顺铂脂质体便于制备，成本低，但载药率和包封率高，有利于更加有效的输送药物。利用人卵巢癌高表达EGFR而正常组织不表达或表达很低的特点，引入EGF，修饰脂质体，从而更加靶向特异性的作用于肿瘤组织，达到减毒增效的目的。
[0008] 本发明的另一目的是提供上述顺铂前药及脂质体的制备。
[0009] 本发明的另一目的是提供上述脂质体在卵巢癌中的应用。
[0010] 靶向肿瘤细胞的载药脂质体，其结构通常包括：1）配体，可以识别并结合肿瘤细胞表面特异性受体，易被细胞内吞；2）生物相容性的脂质材料制备的脂质体，包裹并运载抗肿瘤药物；3）连接基团，连接所述配体与脂质体。
[0011] 本发明在纳米粒表面联接人表皮生长因子EGF，该配体可以与肿瘤细胞表面其受体EGFR结合并发生细胞内吞。通过配体-受体的引导作用，EGF修饰的脂质体原则上可以应用于所有EGFR过度表达的肿瘤。
[0012] 本 发 明 选 择 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 的 脂 质 材 料：即 EPC（egg phosphatidylcholine,蛋黄卵磷脂）、CHOL（cholesterol，胆固醇）、mPEG2000-DSPE（1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine[methoxy(polyethyleneglycol)-2000]甲
氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰
乙醇胺)，amine-PEG2000-DSPE（胺基化的聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺）作为制备脂质体的生物相容性脂质材料。
[0013] 本发明提供了一种顺铂改性或前药的制备方法，即顺铂-海藻酸钠连接体。
[0014] 本发明提供了一种人表皮生长因子EGF修饰的包载顺铂的脂质体（靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体），包括以下结构：
[0015] 配体，为人表皮生长因子EGF，该配体可以选择性地识别并结合于肿瘤细胞表面的人表皮生长因子受体EGFR；
[0016] 生物相容性脂质材料制备的脂质体，脂质体中包裹并运载抗肿瘤药物，所述的生物相容性脂质材料EPC、CHOL、amine-PEG2000-DSPE以一定质量百分比为混合；以及[0017] 连接配体，将EGF连接在amine-PEG2000-DSPE上。
[0018] 其中所述的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体，相应的制备构成优先选择范围如下：
[0019] 磷脂，质量百分含量为50～70%；
[0020] 胆固醇，质量百分含量为5～15%；
[0021] 海藻酸钠，质量百分含量为5～20%；
[0022] 抗肿瘤药物顺铂，质量百分含量为5～20%；
[0023] 靶向分子，质量百分含量为0.1～0.8%；
[0024] 甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺mPEG2000-DSPE，质量百分含量为1～5%；
[0025] 胺基化的聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺amine-PEG2000-DSPE，质量百分含量为0.5～1%。
[0026] 另外，脂质体的粒径大小也会影响药物的靶向性，如果粒径过大，则在血液循环中很容易被网状内皮系统(RES)吞噬，导致药物迅速清除，无法实现靶向肿瘤细胞。本发明的特异性靶向肿瘤细胞的载药脂质体的粒径优选在80～100nm，再加上PEG化，可以有效减少RES的吞噬，延长循环时间，提高药物制剂的靶向性。
[0027] 靶向性纳米海藻酸钠脂质体制备方法，具体步骤如下：
[0028] (a)将顺铂与海藻酸钠偶联制备顺铂前药。具体方法为：
[0029] 将顺铂与海藻酸钠以质量比为2:1～1:2混合，溶解在双蒸水中，其中顺铂与海藻酸钠在水溶液中的质量百分含量分别为33.33%～66.67%和33.33%～66.67%，37℃恒温下反应24h连接形成SA-CDDP；所述的SA表示海藻酸钠；CDDP表示顺铂；
[0030] (b)制备靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体，具体方法为：
[0031] 采用
薄膜分散法，将卵磷脂、胆固醇、amine-PEG2000-DSPE将其混合溶于三氯甲烷溶液中，30～45℃下旋转
蒸发制成脂质薄膜，
真空干燥过夜。然后将含有顺铂前药SA-CDDP的水溶液加入到脂质薄膜中，混合水化30min，水浴超声3min(50W)，探针间断超声1min(100W)，即形成载顺铂纳米海藻酸钠脂质体。接着加入交联剂EDC和NHS分别1～2mg，室温下磁
力搅拌0.5～1h后，取50～100μg的人表皮生长因子EGF加入到上述溶液中，室温下避光继续搅拌4～6h，然后将其放入10K
超滤管中，4000～7500rpm下离心5～10min，除去EDC和NHS以及未反应的EGF，即得靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体。非靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体的制备的方法同上，只需要把amine-PEG2000-DSPE换成mPEG2000-DSPE即可。所述的卵磷脂、胆固醇、amine-PEG2000-DSPE或mPEG2000-DSPE、顺铂前药SA-CDDP的质量比为50～70%：5～15%：0.5～1%：1～5%：15～25%。其中所述的EPC代表为蛋黄卵磷脂，CHOL为胆固醇；所述的amine-PEG2000-DSPE为胺基化的聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺；所述的DDW为双蒸水；所述的EDC为
碳化二亚胺；所述的NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；所述的mPEG2000-DSPE为甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺。
[0032] 本发明的靶向性纳米海藻酸钠脂质体可以在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的的肿瘤为卵巢癌，相比各对照组该靶向脂质体具有更优异的抗肿瘤活性。
附图说明
[0033] 图1是本发明提供的顺铂海藻酸钠及其连接体SA-CDDP的傅里叶红外
光谱图；
[0034] 图2是本发明提供的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体的粒径分布图；
[0035] 图3是本发明提供的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体的电位分布图；
[0036] 图4是本发明提供的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体的透射电镜图；
[0037] 图5是本发明提供的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体的释药性能对比图；
[0038] 图6是本发明提供的非靶向性（PEG-Lip）和靶向性（EGF-Lip）脂质体的细胞摄取对比图；
[0039] 图7是本发明提供的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体对卵巢癌细胞SKOV3的细胞毒性研究对比图；
[0040] 图8是本发明提供的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体对卵巢癌荷瘤裸鼠的治疗效果对比图；
[0041] 图9本发明提供的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体对卵巢癌荷瘤裸鼠体重影响的对比图。
[0042] 符号说明
[0043] 图1：
波数为横坐标，%透过率为纵坐标，其中a为顺铂，b为顺铂和海藻酸钠的连接体，c为海藻酸钠。
[0044] 图2：粒径为横坐标，强度为纵坐标，其中Size(d.nm)为大小（直径，单位纳米），Intensity（percent）为强度（百分比）
[0045] 图3：Zeta电位为横坐标，强度为纵坐标，其中Apparent Zeta Potential(mV)为表面Zeta电位（单位毫伏），Total Counts为总计数，代表强度
[0046] 图5：Cumulative release of CDDP(%)表示顺铂累积释放率，Time(h)表示时间（小时），Free CDDP表示游离药物顺铂，CS-PEG-Lip表示载顺铂纳米海藻酸钠脂质体，CS-EGF-Lip表示靶向性载顺铂纳米海藻酸钠脂质体
[0047] 图6：PEG-Lip和EGF-Lip分别代表非靶向性和靶向性脂质体，White表示白光，Rh表示罗丹明
荧光燃料，Merge表示白光和荧光
叠加[0048] 图7：Free CDDP表示游离药物顺铂，PEG-Lip表示载顺铂纳米海藻酸钠脂质体，EGF-Lip表示靶向性载顺铂纳米海藻酸钠脂质体，Cell viability（%）表示细胞生存率，Concentration（μg/ml）表示浓度（微克/毫升），A、B、C分别表示24、48、72h[0049] 图8：Saline为生理盐水，PEG-Lip为纳米海藻酸钠脂质体空载体，EGF-Lip为靶向性纳米海藻酸钠脂质体空载体，Free CDDP表示游离药物顺铂，CS-PEG-Lip表示载顺铂纳米海藻酸钠脂质体，CS-EGF-Lip表示靶向性载顺铂纳米海藻酸钠脂质体，a、b、c、d、e、f分3
别为以上各组，Tumor volume(mm)表示肿瘤体积（单位立方毫米），Tumor weight(g)为瘤子的重量（单位克），Days after xenograft model was established表示从建立荷瘤模型的天数
[0050] 图9：Saline为生理盐水，PEG-Lip为纳米海藻酸钠脂质体空载体，EGF-Lip为靶向性纳米海藻酸钠脂质体空载体，Free CDDP表示游离药物顺铂，CS-PEG-Lip表示载顺铂纳米海藻酸钠脂质体，CS-EGF-Lip表示靶向性载顺铂纳米海藻酸钠脂质体，纵坐标%Weight loss表示体重丢失的百分率，横坐标Day表示治疗天数
具体实施方式
[0051] 下面结合
实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0052] 实施例1：发明的顺铂前药（顺铂海藻酸钠连接体）的制备
[0053] 精密量取20mg顺铂与20mg海藻酸钠，即质量比1:1。然后溶解在20mL DDW中，37℃恒温下反应24h，连接形成SA-CDDP。SA代表海藻酸钠，CDDP代表顺铂，DDW为双蒸水。
[0054] 傅立叶红外光谱仪FTIR分析：纯CDDP、SA及接枝共聚物SA-CDDP经KBr压片后用Thermo Nicolet380傅立叶红外光谱仪法进行红外光谱测定。图1为CDDP、SA和SA-CDDP-1的红外谱图比较SA（c）和SA-CDDP（b）的红外谱图，由c可见3445.90cm 处的吸收峰为-1 -1 -
OH基的伸缩振动峰；在1621.74cm 和1417.86cm 附近会出现两个吸收峰，前者是-COO 的-
反对称的伸缩振动，峰形宽，很强；后者是-COO 的对称伸缩振动峰，强度稍弱，峰形尖锐。
这均是海藻酸钠的特征吸收峰。与图1c相比图1b中除保留SA的特征谱带外，由于反对-
称伸缩振动的-COO 中的氧离子（作为一种强
碱）与铂Pt（作为一种弱的
路易斯酸）发生反-1 -1 -1
应，吸收峰增加了9.85cm （从1621.74cm 到1631.59cm ）。这种类型的键极化，作用到的-COO-基团的碳
原子上，会引起一个小的正电荷，并因此增加了的羰基具有更大的强度-1
和波数的可能性。此外，在SA-CDDP还增加了一个3285.17cm 的吸收峰，这是所连接顺铂的N-H基团的伸缩振动峰。
[0055] 实施例2：发明的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体的制备
[0056] 采用薄膜分散法，精密量取EPC10mg，CHOL2mg，amine-PEG2000-DSPE0.3mg，将其混合溶解在3mL三氯甲烷中，35℃下
旋转蒸发制成脂质薄膜，真空干燥过夜。然后取上述所制备的顺铂前药SA-CDDP2mL和3mL DDW加入到脂质薄膜中，混合水化30min，水浴超声3min(50W)，探针间断超声1min(100W)，即形成载顺铂纳米海藻酸钠脂质体。接着加入交联剂EDC和NHS分别2mg，室温下磁力搅拌30min后，取0.5mg/mL的EGF100μL加入到上述溶液中，室温下避光继续搅拌4～6h，然后将其放入10K超滤管中，4000rpm下离心10min，除去EDC和NHS以及未反应的EGF，即得靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体。非靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体的制备的方法同上，只需要把amine-PEG2000-DSPE换成mPEG2000-DSPE（0.8mg）即可。其中所述的EPC代表为蛋黄卵磷脂，CHOL为胆固醇；所述的amine-PEG2000-DSPE为胺基化的聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺；所述的DDW为双蒸水；所述的EDC为碳化二亚胺；所述的NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；所述的mPEG2000-DSPE为甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺。
[0057] 该脂质体溶液，呈典型浅蓝色乳光状，在4℃保存1月后，无沉淀产生。经
马尔文ZETA电位粒度分析仪测定该
纳米粒子粒径在100nm左右。平均粒径Z-Average size(d.nm)为112.37，粒度分布指数PdI为0.069，如图2，Zeta电位Zeta Potential(mV)为-23.83，如图3。取该脂质体适量稀释后，滴至
镀有碳膜的
铜网上，用4%的
醋酸双氧
铀水溶液负
染色，用
滤纸吸走多余的液体，自然干燥后在透射电镜下观察，为大小分布均匀，表面光滑，形态规整，椭圆形或球形粒子，能看到特征性指纹结构，如图4。
[0058] 实施例3发明的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体体外释放实验
[0059] 精密称取顺铂（CDDP）、载顺铂海藻酸钠脂质体(CS-PEG-Lip)，EGF修饰的载顺铂海藻酸钠脂质体((CS-EGF-Lip)各三份，2mL。置于预先处理好的
透析袋中，扎紧透析袋两端，悬浮于具塞锥形瓶中，锥形瓶中加入18mL PBS(pH=7.4)或MES(pH=5.5)缓冲液，将其置于恒温水浴
振荡器中（
温度为37℃±0.5℃,100rpm持续振荡）。分别于0.5、1、2、3、4、5、6、12、24、36、48、72(h)、4、5、6、7(d)取样，每次吸取透析袋外溶液2mL，随后立即补入温度为37℃的PBS或MES缓冲溶液2mL。将取出的2mL溶液用于电感耦合
等离子体发射光谱仪ICP-OES测定。以累积释放药物的百分率（%）对时间（hours）作图，绘制脂质体纳米粒的释药曲线。体外药物释放实验表明，所制备的载顺铂纳米海藻酸钠脂质体具有很好的缓释性，随着释放时间的延长，载顺铂纳米海藻酸钠脂质体纳米粒能够逐渐的释放药物，且pH越低缓释性强，见图5。
[0060] 实施例4发明的靶向性纳米海藻酸钠脂质
体细胞摄取实验
[0061] 在37℃、5%CO2
培养箱内孵育人卵巢癌细胞SKOV3，取对数生长期细胞进行实验，4
铺24孔板，每孔细胞的
密度为2×10 个，1mL培液，在37℃细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，去除培养液。分别在不同孔中加入含等量罗丹明B标记非靶向（PEG-Lip）和靶向（EGF-Lip）的脂质体的培养液50、150、300μL，37℃细胞培养箱中继续培养2h。吸取出培养液，用PBS漂洗3次。然后于荧光
显微镜下观察细胞对脂质体纳米粒的摄取情况。同时为了更好的观察细胞摄取的情况，我们通过流式细胞仪进行了摄取定量。上述实验进行避光操作。结果表明，与PEG-Lip脂质体相比，EGF-Lip脂质体能够更有效的被细胞所摄取，从而造成红色荧光强度增强，这种摄取随着浓度的增加而增加。这也证实，我们所制备的靶向性纳米海藻酸钠脂质体纳米粒具有更好的靶向效果，见图6。
[0062] 实施列5发明的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体的体外杀伤肿瘤细胞实验[0063] 主要采用CCK-8法测试。SKOV3卵巢癌细胞铺96孔板，每孔细胞的密度为5×103个，100μL，在37℃、5%CO2培养箱内培养24h后，去除培养液，分别加入含有不同顺铂药物浓度的载顺铂海藻酸钠脂质体、EGF修饰的载顺铂海藻酸钠脂质体纳米粒以及游离顺铂的培养液100μL（以只加培养液的细胞组为对照组），每个实验条件设置5个复孔。然后分别共孵育培养24、48、72h，加入CCK-810μL，继续培养1.5h，最后震荡30s，在酶标仪上测450nm处吸光值。细胞的存活率（%）=A实验/A对照×100%（A实验——实验组的平均吸光值，A对照——对照组的平均吸光值）。结果表明载顺铂海藻酸钠脂质体、EGF修饰的载顺铂海藻酸钠脂质体以及游离药物顺铂会随着浓度的增加或培养时间的延长，细胞存活率而逐渐降低，表现出对肿瘤细胞很强的体外杀伤作用，其中以所制备的靶向性载顺纳米海藻酸钠脂质体效果最明显，见图7。
[0064] 实施例6发明的靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体对荷SKOV3卵巢癌小鼠的治疗效果的实验
[0065] 雌性裸鼠，4～6周龄，20g左右，人卵巢癌细胞SKOV3，细胞于体外培养，培养基为1640，加10%胎
牛血清，37℃，5%CO2的培养箱中培养。裸鼠于皮下注射卵巢癌SKOV3细胞，
6
每只2×10 个细胞，10天后成瘤，随机分四组，每组6只。第一组为生理盐水Saline对照组，第二，三组为空载体组，即PEG-Lip/EGF-Lip，第四组为游离药物CDDP组，第五组为载顺铂纳米海藻酸钠脂质体组CS-PEG-Lip，第六组为靶向性载顺铂纳米海藻酸钠脂质体组CS-EGF-Lip。给药方法为尾静脉注射，注射剂量为5mg/kg(折合成顺铂浓度)，每隔一天给药一次，共16天，给药结束后第三天处死小鼠。每天记录裸鼠的肿瘤体积变化情况，存活情况和体重变化情况。结果表明，靶向性载顺铂纳米海藻酸钠脂质体肿瘤靶向性好，对肿瘤有明显的抑制作用，能够明显延长荷瘤裸鼠的存活时间，毒副反应底等，见图8，图9。
