发明领域：

本发明涉及一种将至少一种编码转化生长因子β超家族一员的基因导入至少一种 哺乳动物结缔组织细胞，用来生成或再生骨，特别是用来修复骨质疏松性骨折或融 合哺乳动物宿主的脊柱。

相关领域简述：

活骨组织的动态平衡是一个由调控信号调节的动态过程，例如激素，生长和分化 因子。已知刺激骨细胞繁殖的生长因子是骨形成蛋白(BMP)、转化生长因子-β蛋白质 (TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

骨质疏松症，其特点是低骨量和骨微结构的退化，会导致骨折，它是老年人中数 量增加的一个普通健康问题。骨质疏松症可由许多因素引起，例如但不局限于绝经、 钙缺乏性饮食、卵巢切除后、糖皮质激素-诱导的骨质疏松症，甲状腺功能亢进、制 动、肝素诱导的或免疫抑制诱导的骨质疏松症。

骨折愈合是一个复杂的过程，并仍不是很清楚。通过刺激患者骨质疏松的卵巢切 除和低钙饮食制造大鼠模型，骨折的骨头没有很好的愈合(Kubo等，Steroid Biochemistry & Molecular Biology，68：197-202，1999；Namkung-Matthai等，Bone， 28：80-86，2001)。因此，包括骨再生的治疗也大大改善了骨质疏松性骨折的治疗。

在骨科领域，一些细胞因子已经被认为是治疗骨科疾病的候选。骨形成蛋白已经 被认为是一种有效的骨形成刺激剂(Ozkaynak等，EMBO J，9：2085-2093，1990； Sampath和Rueger，Complication in Ortho，101-107，1994)，TGF-β已经被报导是一 种骨生成和软骨形成的刺激剂(Joyce等，J Cell Biology，110：2195-2207，1990)。转 化生长因子-β(TGF-β)被认为是一种多功能的细胞因子(Sporn和Roberts， Nature(London)，322：217-219，1988)，并在细胞生长、分化和细胞外矩阵蛋白合成 中起了调节作用(Madri等，J Cell Biology，106：1375-1384，1988)。TGF-β抑制体外 上皮细胞和破骨样细胞的生长(Chenu等，Proc Natl Acad Sci，85：5683-5687，1988)， 但它刺激了软骨内骨化，并最终在体内形成骨(Critchlow等，Bone，521-527，1995； Lind等，A Orthop Scand，64(5)：553-556，1993；和Matsumoto等，In vivo，8：215-220， 1994)。TGF-β诱导的骨形成是通过刺激骨膜下多能性细胞而调节的，所述多能细胞 最终分化为软骨-形成细胞(Joyce等，J Cell Biology，110：2195-2207，1990；和Miettinen 等，J Cell Biology，127-6：2021-2036，1994)。

骨科学中TGF-β的生物作用已经报导了(Andrew等，Calcif Tissue In.52：74-78， 1993；Borque等，Int J Dev Biol.，37：573-579，1993；Carrington等，J Cell Biology， 107：1969-1975，1988；Lind等，A Orthop Scand.64(5)：553-556，1993；Matsumoto等， In vivo，8：215-220，1994)。在小鼠胚胎中，染色显示TGF-β和来自间充质的组织紧 密相关，例如结缔组织、软骨和骨。除了胚胎学的发现，TGF-β存在于骨形成和软 骨形成的部位。它还能增加兔胫骨的骨折愈合。近来，TGF-β的治疗值已经被报导 (Critchlow等，Bone，521-527，1995；和Lind等，A Orthop Scand，64(5)：553-556， 1993)，但是短期的作用和高花费已限制了广泛的临床应用。

许多过度损伤的骨缺陷不会完全恢复并需要治疗性的干预，例如自体移植或从存 储骨移植。高失败率和这些传统的治疗相关。近来大多数可供选择的方法利用注入 骨诱导性蛋白的生物降解载体移植到损伤部位。见例如，美国专利第5,656,598 号。其他方法包括应用机械装置使得骨再生，例如美国专利第6,077,076和第6, 022,349号中所揭示的。这些方法一个主要的不利之处就是需要大量重组蛋白来获 得治疗作用，因为在体内治疗性蛋白的作用持续时间短。

脊柱椎体中骨退变是另外一个领域，其中融合椎体的骨形成会使饱受椎体塌陷导 致后背疼痛之苦的患者获得缓解。所以，文中治疗性申请需要改善骨形成蛋白释放 的时间长度。正如本申请中所描述的，本发明提供了一种在骨缺陷部位持续表达这 种骨形成治疗性蛋白的方法，从而导致有效的骨再生。

发明简述

本发明已满足了上文中的需要。本发明提供了一种将至少一种编码产物的基因导 入至少一种哺乳动物结缔组织细胞的方法，用来治疗哺乳动物宿主。这种方法包括 运用重组技术制造包含编码产物基因的DNA载体分子，并将包含编码产物基因的 DNA载体分子导入结缔组织细胞。所述DNA载体分子可以是任何能被输入和保留 在靶细胞或组织中的DNA分子，这样所述编码有意义产物的基因可被稳定表达。在 本发明中优选应用的DNA载体分子是病毒或质粒DNA载体。这种方法优选的包括 将编码产物的基因导入哺乳动物结缔组织细胞用作治疗。

本发明提供了一种在受低骨量折磨的患者骨缺陷部位形成骨的方法，包括：

a)将编码具有骨再生功能的蛋白质的基因插入载体，并操作性连接于启动子，和

b)用所述重组载体在体外转染或转导一群结缔组织细胞；和

c)将哺乳动物细胞移植到骨缺陷部位，并使骨缺陷部位形成骨。

在这种方法中，所述载体可以无限制的是逆转录病毒载体或质粒载体。所述基因 可以是TGF-β超家族的一员，特殊的是骨形成蛋白(BMP)。更特殊的，所述BMP可 以是BMP-2。此外，所述结缔组织细胞可以是成纤维或骨祖细胞。

在以上的方法中，骨在早期或晚期产生。

本发明还旨在提供一种融合脊柱的方法，包括：

a)将编码具有骨形成功能的蛋白质的基因插入载体；

b)用所述重组载体在体外转染或转导一群结缔组织细胞；和

c)使成骨有效量的转染或转导的结缔组织细胞群以及药学上可接受的载体和脊柱 接触，这样编码基因的DNA序列在脊柱表达导致了骨生成，由此脊柱融合了。

在这种方法中，所述载体可无限制的是逆转录病毒载体或质粒载体。所述基因可 以是TGF-β超家族的一员，特殊的是骨形成蛋白(BMP)。更特殊的，所述BMP可以 是BMP-2。此外，所述结缔组织细胞可以是成纤维或骨祖细胞。

在以上的方法中，骨在早期或晚期产生。

此外，本发明旨在提供一种愈合骨质疏松性骨折的方法，包括：

a)将编码具有骨再生功能的蛋白质的基因插入载体，并操作性连接于启动子，

b)用所述重组载体在体外转染或转导一群结缔组织细胞；和

将结缔组织细胞导入骨折部位，并使骨折愈合。

在这个方法中，所述载体可无限制的是逆转录病毒载体或质粒载体。所述基因可 以是TGF-β超家族的一员，特殊的是骨形成蛋白(BMP)。更特殊的，所述BMP可以 是BMP-2。此外，所述结缔组织细胞可以是成纤维或骨祖细胞。

在以上的方法中，骨在早期或晚期产生。

本发明的这些和其他对象通过以下本发明的详述、附带的参考图和所附的权利要 求被更好理解。

附图简述

本发明将通过以下给出的详细描述和附带的图被更好理解，后者的给出仅仅是为 了阐明，而不是限制本发明，其中；

图1A和1B显示了包含人类BMP2基因pMT-BMP2的结构。

图2A-2F显示了利用NIH3T3-BMP-2成纤维细胞的骨再生。图2A和2B显示了 在注射对照NIH3T3成纤维细胞(A)和NIH3T3-BMP-2(B)8周后的腿骨图。图2C-2F 显示了在处死动物之前对照(C&D)和实验(E&F)腿骨的X线检查。用表达BMP-2蛋 白细胞处理过的骨缺陷在注射8周后愈合。

图3A-3D显示了再生骨组织的组织学检查。制作再生骨组织的石蜡切片并用 Mason′s三色染色。结果显示再生骨组织(RB)的结构几乎和正常骨组织(NB)的相同。 图3A和3B显示了低放大率(40x)，图3C和3D显示了高放大率(100x)。点线表示再 生和正常骨组织之间的界限。

图4A-4I显示了用NIH3T3-BMP-2成纤维细胞的骨再生。将NIH3T3-BMP-2细胞 (2ml2×106细胞/ml)在缝合后注射入胫骨的缺损区域。(A-G)在细胞注射1、2、3、4、 5、6、7周后实施X线分析。(H)在注射后7周收获样本，并绘图。(I)在收获后进行 组织学检查。显示Mason’s三色染色的结果。

图5A-5I显示了用对照DMEM培养基的骨再生。将DMEM培养基(2ml)缝合后注 射入胫骨的缺损区域。(A-G)在注射培养基1、2、3、4、5、6周后实施X线分析。(H) 在注射后6周收获样本，并绘图。(I)在收获后进行组织学检查。显示Mason’s三色染 色的结果。

图6A和6B显示了大鼠TG001应用可吸收胶原海绵(ACS)载体在后外侧横突间处 理融合植入细胞4和6周后的X线图。在利用用于BMP-2后外侧横突间处理融合研 究的cDNA转染5×106成纤维细胞(小鼠)后，X线上左侧富集了桥骨。注意右侧如果 有的话，可能细胞较少，骨形成较少。

发明详述

在本申请中，“一种”和“一个”用来指对象的单数和复数。

正如这里所应用的，“联合”一种或多种治疗药物给药包括同时(一起)和以任何顺 序连续给药。

正如这里所应用的，关于核酸、蛋白质和蛋白片段或其衍生物的名词“生物活性” 定义为核酸或氨基酸序列模仿野生型核酸或蛋白质产生的已知生物功能的能力。

正如这里所应用的，名词“骨生长”涉及骨质量。TGF-β蛋白被认为系统的增加 骨量。这表现为在系统给药后，成骨细胞的数量和大小增加，骨化加衬骨表面沉积 的增加。

正如这里所应用的，“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们 在运用所述剂量和浓度时，对于暴露于其的细胞或哺乳动物是没有毒性的。通常， 药学上可接受的载体是含水的pH缓冲溶液。药学上可接受载体的实施例包括，不限 于例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸缓冲液；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(大约 低于10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、白明胶或免疫球蛋白；亲水性聚 合物例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖 氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA； 糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；形成盐的反荷离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂 例如TWEEN，聚乙二醇(PEG)，和PLURONICS。

正如这里所应用的，名词“结缔组织”是指任何连接和支持其他组织或器官的组 织，并包括但不局限于哺乳动物的韧带、软骨、腱、骨或滑膜。

正如这里所应用的，名词“结缔组织细胞”包括在结缔组织中发现的细胞，例如 成纤维细胞、软骨细胞(软骨细胞)和骨细胞(成骨细胞/骨细胞)，还有脂肪细胞(脂细 胞)和平滑肌细胞。优选的，所述结缔组织细胞是成纤维细胞、软骨细胞和骨细胞。 更优选的，所述结缔组织细胞是成纤维细胞。作为选择，所述结缔组织细胞是成骨 细胞或骨细胞。可以认识到本发明可用结缔组织细胞的混合培养基实施，也可以用 单一类型的细胞。也可认识到组织细胞可用例如化学或放射处理，这样所述细胞稳 定表达有意义的基因。优选的，所述结缔组织细胞当注射入宿主有机体时不会引起 负性免疫反应。可以明白同种异体细胞可用于此，同样自体同源细胞可用于细胞介 导的基因治疗或体细胞治疗。

正如这里所应用的，“结缔组织细胞”包括大量来源于普通亲本细胞的结缔组织 细胞。

正如这里所应用的，“宿主细胞”包括可或已经作为本发明载体受体的个体细胞 或细胞培养基。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，所述后代和原始亲本细胞不一 定是完全相同的(在形态学或完整DNA受体上)，这是因为自然、意外或诱导的突变 和/或变化。宿主细胞包括在体内用包含编码TGF-β超家族一员聚核苷酸的载体转染 或感染的细胞。

正如这里所应用的，名词“低骨量”指一种骨量低于年龄特异正常水平的疾病， 由世界卫生组织“骨折风险以及将其用于筛选绝经后骨质疏松的预测(Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis)(1994).世 界卫生组织研究组的报告，世界卫生组织技术组843”的标准定义，这里包含进来作 为骨量正常和骨质疏松水平的参考。而且，名词“骨量”指骨质量/单位面积，它有 时候指骨矿物密度。

正如这里所应用的，名词“保留”，当应用于脂质体输入的上下文中，表示导入 DNA保留在细胞中的能力。当在其他文中应用时，它表示靶DNA保留在靶细胞或 组织中的能力，从而产生治疗作用。

正如这里所应用的，名词“哺乳动物宿主”包括动物王国的成员，包括但不局限 于人类。

正如这里所应用的，名词“成熟骨”涉及矿化骨，和非-矿化骨，例如类骨质形 成对比。

正如这里所应用的，名词“成骨有效”指的是能影响成熟骨形成和发展的量。

正如这里所应用的，名词“骨祖细胞”或“骨祖细胞”是有变成骨细胞潜力的细 胞，并存在于骨膜和骨髓中。骨祖细胞来源于也存在于周围组织(肌肉)的结缔组织祖 细胞。

正如这里所应用的，名词“患者”包括动物王国的成员，包括但不局限于人类。

正如这里所应用的，一种组合物是“药学上或生理上可接受的”，如果接受的动 物可容忍给药或适合对那种动物给药。如果所述给药的量是生理有效的，那这种试 剂以“治疗有效的量”施用。如果一种试剂的存在可导致受试患者生理上可察觉的 变化，那么它就是生理有效的。

正如这里所应用的，“药学上可接受的载体和/或稀释剂”包括任何和所有溶剂、 分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂等等。应用这种药学活性物 质的介质和试剂在文中是熟知的。除非任何传统介质或试剂和所述活性成分不相容， 可将它们应用于治疗性组合物中。辅助活性成分也可被包含进所述组合物。

正如这里所应用的，“启动子”可以是任何活性DNA序列，并控制真核细胞中的 转录。所述启动子在真核细胞和/或原核中是有活性的。优选的，所述启动子在哺乳 动物细胞中是有活性的。所述启动子可在结构上表达或诱导。优选的，所述启动子 是可诱导的。优选的，所述启动子可由外部刺激诱导。更优选的，所述启动子可由 激素或金属诱导。同样，“增强子元件”也控制转录，它可被插入DNA载体结构， 并和本发明的结构一起应用而增强有意义基因的表达。

正如这里所应用的，“可选择标记”包括由稳定保存导入DNA细胞表达的基因产 物，并导致细胞表达改变的表型，例如形态的变化或酶活性。表达转染基因细胞的 分离通过将编码可选择标记的第二种基因导入相同的细胞而实现，例如有酶活性的， 可对抗生素或其他药物产生抵抗。可选择标记的实施例包括，但不局限于胸苷激酶、 二氢叶酸还原酶、氨基糖甙磷酸转移酶，它会对氨基糖甙抗生素产生抵抗，例如卡 那霉素、新霉素和遗传霉素、潮霉素B磷酸转移酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、 CAD(一种具有从头生物合成尿苷三种酶活性的单一蛋白质--氨甲酰磷酸酯合成酶、 天冬氨酸转氨甲酰酶和二氢乳清酸酶)，腺苷脱氨酶和天冬酰胺合成酶(Sambrook等， Molecular Cloning，Chapter 16.1989)，这里完整包含进来作参考。

正如这里所应用的，“受试者”是一种脊柱动物，优选的是哺乳动物，更优选的 是人类。

正如这里所应用的，“治疗”是指一种获得有益或理想临床结果的方法。对于本 发明来说，有益或理想的临床结果包括，但不局限于，症状的缓解，疾病程度的减 轻，疾病的稳定状态(例如没有恶化)，疾病进展的延迟或变慢，疾病状态的改善或减 轻，减轻(部分或全部)，可察觉或未察觉。“治疗”也指和如果没有接受治疗获得的 理想生存相比生存延长。“治疗”也指治疗性处理和预防性的措施。需要治疗的包括 那些已经患有疾病的以及预防疾病的。“减轻”一种疾病指疾病状态的程度和/或不理 想的临床表现减轻和/或进展的时间减慢或延长，这些都是和未治疗的情况相比。

正如这里所应用的，“TGF-β蛋白质”指的是蛋白质TGF-β超家族中的一员。

正如这里所应用的，“载体”、“聚核苷酸载体”、“结构”和“聚核苷酸结构”这 里互换应用。本发明的聚核苷酸载体可以是任何形式，包括但不局限于，RNA、DNA、 装在逆转录病毒衣胶囊中的RNA，装在腺病毒衣胶囊中的DNA，以其他病毒或病毒 样形式打包的DNA(例如单纯疱疹病毒以及腺相关病毒(AAV))，装在脂质体胶囊中的 DNA，和赖氨酸结合的DNA，和合成的聚阳离子分子结合的DNA，与化合物例如 聚乙烯二醇(PEG)结合的DNA，从而免疫“掩盖”分子和/或增加半衰期，或与非- 病毒蛋白质轭合。优选的，所述聚核苷酸是DNA。正如这里所应用的，“DNA”不 仅包括碱基A、T、C和G，还包括任何它们的类似物或这些碱基修饰后的形式，例 如甲基化核苷、核苷内部的改变，例如不带电荷的连接和thioate，糖类似物的应用， 以及被修饰和/或可供选择的脊柱结构，例如聚酰胺。

转化生长因子-β(TGF-β)超家族

转化生长因子-β(TGF-β)超家族包括一组结构相关的蛋白质，它们在胚胎发育期间 影响许多分化过程。这以初级氨基酸序列同型为基础，包括完全保存7个半胱氨酸 残基。所述家族包括，Mullerian抑制物质(MIS)，它对于正常雄性发育是所需的 (Behringer等，Nature，345：167，1990)，Drosophila decapentaplegic(DPP)基因产物， 它对于背腹轴的形成和成虫盘的形态形成来说是所需的(Padgett等，Nature，325：81- 84，1987)，激活素(Mason等，Biochem，Biophys.Res.Commun.，135：957-964，1986)， 它能诱导Xenopus胚胎中胚叶和前结构的形成(Thomsen等，Cell，63：485，1990)， 骨形成蛋白(BMP’s，例如BMP-2至BMP-15)，它能再次诱导软骨和骨的形成(Sampath 等，J.Biol.Chem.，265：13198，1990)。TGF-β基因产物可影响许多分化过程，包括脂 肪生成、肌形成、软骨形成、造血作用和上皮细胞分化(回顾，见Massague，Cell 49：437， 1987)，这里完整包含进来作参考。

TGF-β家族的蛋白质一开始合成为大的前体蛋白质，接着在从C-末端大约110- 140个氨基酸碱基簇处蛋白水解。所述蛋白质的C-末端区域都是结构上相关的，不 同的家族成员可根据它们同源的程度分为不同的亚群。虽然特殊亚群中的同源性范 围是70％-90％个氨基酸序列相同，但亚群之间的同源性明显较低，通常仅有20％- 50％。在各种情况下，活性种类似乎是C-末端片段的连有二硫化物的二聚体。对于 已经研究过的该家族大多数成员，已发现同二聚体种类具有生物活性，但还检测了 该家族的其它成员，如抑制素(Ung等，Nature，321：779，1986)和TGF-β(Cheifetz 等，Cell，48：409，1987)的异二聚体，但它们似乎具有与同二聚体不同的生物特性。

TGF-β基因超家族的成员包括TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(鸡)、TGF-β1、TGF- β5(非洲蟾蜍)、BMP-2、BMP-4、果蝇DPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、 果蝇60A、GDF-1、非洲蟾蜍Vgf、BMP-3、抑制素-βA、抑制素-βB、抑制素 -α和MIS。这些基因在Massague，Ann.Rev.Biochem.67：753-791，1998中有讨论，在 此将其全文并入以供参考。

优选地，TGF-β基因超家族的成员是BMP。更优选的，该成员是TGF-β1、TGF- β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。再优选的一 个是人BMP。最优选的成员是人BMP-2。

BMP

BMP是在骨骼开始形成前诱导间充质类型细胞分化成软骨细胞和成骨细胞的蛋 白质。它们促进软骨和骨骼形成细胞在骨折位置周围分化，同时也在其它异位(ectopic) 部位分化。这些蛋白质中的一些诱导碱性磷酸酶和胶原在成骨细胞内合成。一些BMP 直接作用于成骨细胞并促进它们的成熟，同时抑制肌细胞分化。其它BMP促进典型 的成纤维细胞转化成软骨细胞，同时能够诱导非成骨细胞类型表达成骨细胞表型。 属于TGF-β超家族的BMP家族包括：

BMP-2A或BMP-2-a(114个氨基酸)，也称为BMP-2。人、小鼠和大鼠蛋白质的 氨基酸序列是相同的。该蛋白质与果蝇有68％的同源性。

BMP-2B或BMP-2-β(116个氨基酸)，也称为BMP-4。小鼠和大鼠蛋白质的蛋白 质序列相同。

BMP-3(110个氨基酸)是一种糖蛋白，且与骨生成蛋白相同。人和大鼠的成熟蛋白 质有98％的同一性。

BMP-3b(110个氨基酸)与BMP-3(同一性82％)相关。人和小鼠的蛋白质显示有 97％的同一性(3个不同的氨基酸)。人和大鼠的蛋白质序列有两个氨基酸不相同。该 因子与GDF-10相同。

BMP-4与BMP-2B和DVR-4相同。该蛋白质与果蝇有72％的同源性。

BMP-5(138个氨基酸)。在氨基酸水平上，人和小鼠的蛋白质有96％的同一性。

BMP-6(139个氨基酸)与DVR-6和植物-特异性-相关蛋白-1相同。

BMP-7(139个氨基酸)与OP-1(成骨蛋白-1)相同。小鼠和人的蛋白质有98％的同 一性。BMP-5、BMP-6和BMP-7的成熟形式显示出75％的同一性。

BMP-8(139个氨基酸)与OP-2相同。该因子也被称为BMP-8a。

BMP-8b(139个氨基酸)与OP-3相同，且仅在小鼠中发现。该因子也被称为OP-3。

BMP-9(110个氨基酸)也被称为GDF-5。

BMP-10(108个氨基酸)已从牛来源被分离。牛和人的蛋白质是相同的。

BMP-11(109个氨基酸)已从牛来源被分离。人和牛的序列是相同的。该蛋白质也 被称为GDF-11。

BMP-12(104个氨基酸)也被称为GDF-7或CDMP-3。

BMP-13(120个氨基酸)与GDF-6和CDMP-2相同。

BMP-14(120个氨基酸)与GDF-5和CDMP-1相同。

BMP-15(125个氨基酸)在卵母细胞中特异性表达。鼠类的这种蛋白质与鼠GDF-9 最相关。

这些蛋白质中的一些以异二聚体的形式存在。例如，OP-1与BMP-2A相结合。

由于氨基酸序列同源性程度高(约90％)，BMP-5、BMP-6和BMP-7被认为是BMP 一个不同的亚家族。编码BMP-5和BMP-6的基因位于人染色体6上。编码BMP-7 的基因位于人染色体20上。可从脱矿物质的骨骼和骨肉瘤细胞分离BMP。已知它们 在胚胎各种上皮组织和间充质组织中表达。已知一些BMP(例如BMP-2和BMP-4) 将引发性质上完全相同的结果(形成软骨和骨骼)并有相互取代的能力。

骨生成蛋白和相关的BMP通过作为使单核细胞循环的有效化学引诱物，此外还 通过诱导单核细胞合成和分泌TGF-β1，也促进软骨成骨级联中的额外连续步骤。 TFG-β刺激下的单核细胞分泌许多趋化因子和促有丝分裂细胞因子到条件培养基， 这可聚集内皮细胞和间充质细胞，并促进胶原和相关基质组分的合成。

骨骼再生疗法

本发明揭示了将感兴趣的DNA序列输送到哺乳动物宿主结缔组织的体外和体内 技术。所述体外技术包括靶结缔组织细胞培养基，在体外将DNA序列、DNA载体 或其他有意义的传输载体转染入结缔组织细胞，接着将修饰过的结缔组织细胞移植 到哺乳动物宿主的目标骨缺损部位，这样在体内影响有意义基因产物的表达。

应该明白可能的是，将所述物质例如框架结构、矩阵或生物粘附例如棕黄层或其 他化学粘附，还有各种外来组织和生物可容性载体，以及其他辅助材料可与本发明 的遗传修饰细胞一起植入。一方面，本发明包括治疗组合物中的生物粘附剂，从而 有利于遗传修饰的结缔组织细胞和骨缺损部位或邻近部位接触。作为选择，可能将 这种物质排除在本发明给药系统中的组合物之外。

普通的技工将会明白治疗人类患者优选的细胞来源是患者自己的结缔组织细胞， 例如自体成纤维细胞或骨祖细胞(骨祖细胞)、骨细胞、成骨细胞或破骨细胞，也可以 应用同种异体细胞。

更特殊的，这种方法包括运用一种属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族一员的基因 产物，或具有生物活性的衍生物或其片段。

在本发明另外一种实施方案中，所提供的以治疗有效量胃肠外对患者施用包含 TGF-β超家族蛋白质和合适药物载体的化合物。

本发明另外一种实施方案提供了以预防有效量胃肠外对患者施用包含TGF-β超 家族蛋白质和合适药物载体的化合物。

在本申请中，提供了一种通过注射一种合适的哺乳动物细胞产生或再生骨的方 法，这种细胞用编码转化生长因子-β(TGF-β)超家族一员的基因转染或转导，包括但 不局限于BMP-2和TGF-β1、2和3，BMP-2是典型的实施例。

在本发明的实施方案中，明白了可以将细胞注入骨产生或再生的部位，而需要或 不需要脚手架材料或任何其他辅助材料，例如外来细胞或其他生物相容的载体。即 被修饰过的细胞可被注入骨再生的部位，而没有任何其他结构或框架的帮助。在本 发明一种实施方案中，这样的附加物质揭示于，例如美国专利第5,842,477号中， 并排除在本发明的组合物之外。

本发明的方法可应用于身体中所有类型的骨，包括但不局限于，非-连接的骨折(不 能愈合的骨折)，颅面重建、由于肿瘤切除的部分缺损，在髋移植矫正周围的骨增加(例 如25％髋移植物被现存移植物代替，因为髋移植物的寿命仅仅＜10年)，为了牙齿的 原因颌骨的骨重建。而且，其他靶骨包括用作脊柱融合的椎骨，大骨等等。

被修饰的细胞包括任何合适的哺乳动物结缔组织细胞，它会有助于骨的形成，包 括但不局限于成纤维细胞、骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞和破骨细胞，还包括软骨 细胞。然而，可以明白其他非-遗传修饰的细胞也可被包括在用来接触骨缺损部位的 组合物中，例如成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、软骨细胞等等。

作为体外处理宿主细胞的一种选择，可将编码有意义产物的基因导入脂质体，并 直接注射入骨折或骨缺陷部位或邻近部位，其中脂质体与结缔组织细胞融合，导致 在体内表达属于TGF-β超家族的基因产物。

如果提及“骨缺陷”或“缺陷骨”，应该明白这种缺陷可包括骨折、断裂和/或骨 的退变，包括由损伤或疾病导致的这些情况，进一步还包括脊柱椎骨的缺损，椎体 间椎间盘部分的退变。在本发明的一个方面，由于椎体间椎间盘退变导致的疼痛可 通过融合退变椎间盘周围的椎体而治疗。

作为体外处理宿主细胞的一种选择，，将编码有意义产物的基因导入缺损骨部位， 作为裸露的DNA。所述裸露DNA进入结缔组织细胞，导致体内表达属于TGF-β超 家族的基因产物。

整个说明书中揭示的体外治疗骨折或骨缺损的方法起初包括制造一种重组病毒 或质粒载体，它们包含编码蛋白质或其生物活性片段的DNA。接着将这种重组载体 用来感染或转染一群体外培养的结缔组织细胞，从而产生一群包含载体的结缔组织 细胞。接着将这些结缔组织细胞移植到哺乳动物宿主的目标骨缺损部位，从而影响 接下来缺损部位中蛋白或蛋白片段的表达。这种有意义DNA序列的表达对于完全修 复骨折或缺损是有益的。

更特殊的，这种方法包括运用一种能编码转化生长因子-β超家族一员的基因或编 码生物活性的衍生物或其片段和一种可选择的标记的基因，或一种生物活性的衍生 物或其片段的基因。

本发明另外一种实施方案包括运用一种能编码至少转化生长因子-β超家族一员 的基因或编码一种生物活性的衍生物或其片段的基因，以及运用任何对于文中技术 人员来说是所知的DNA质粒载体，它们能够通过输入稳定的保留在靶细胞或组织中， 不管所应用的传输方法是什么。

本发明另外一种实施方案提供了一种将编码产物的至少一个基因导入结缔组织 至少一个细胞中的方法，用来治疗哺乳动物细胞。这种方法包括运用非-病毒方法将 编码产物的基因导入结缔组织细胞。更特殊的，这种方法包括脂质体胶囊化、磷酸 钙共沉淀、电穿孔术或DEAE-右旋糖苷间介作用，还包括运用能够编码转化生长因 子超家族的一员或其生物活性衍生物或片段，以及一种可选择标记，或生物活性的 衍生物或其片段的基因。

本发明的另外一种实施方案提供了另外一种将编码产物的至少一个基因导入结 缔组织至少一个细胞中的方法，用来治疗哺乳动物宿主。这种其他方法包括运用利 用病毒的生物学方法，将DNA载体分子输入到靶细胞或组织。优选的，所述病毒是 伪-病毒，它的基因组已经被改变，这样伪病毒仅能被传输并稳定的保留在靶细胞中， 却没有保留在靶细胞或组织中复制的能力。所述已改变的基因组进一步通过重组 DNA技术处理，这样所述病毒基因组起到了DNA载体分子的作用，它包含在靶细 胞或组织中表达的有意义的异种基因。

本发明一种优选的实施方案是，通过将TGF-β基因传输到哺乳动物宿主结缔组织 中而将TGF-β蛋白质输入到目标缺损部位，通过应用所述说明书中揭示的体外技术 及逆转录病毒载体。换而言之，编码功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的有意DNA序列 并亚克隆入精选的逆转录病毒载体中，接着所述重组逆转录病毒载体生长到足够的 效价，并用它在体外感染培养的结缔组织细胞，并将转导的结缔组织细胞，优选自 体移植的细胞移植入骨缺损部位或治疗有效的邻近部位。

本发明另外一种优选的方法包括在体内应用腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体 或单纯疱疹病毒(HSV)载体直接将TGF-β超家族基因传输到哺乳动物宿主的结缔组 织中。换而言之，将编码功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的有意DNA序列亚克隆入各 自的病毒载体中。所述包含病毒载体的TGF-β接着生长到足够效价并移植入骨缺损 部位或有效成骨的邻近部位。

将DNA分子呈递至目标关节结缔组织的方法包括，但不局限于将DNA分子以胶 囊装入阳离子脂质体，将有意DNA序列亚克隆在逆转录病毒或质粒载体中，或将 DNA分子本身直接注射入骨缺损部位或有效成骨的邻近部位。所述DNA分子优选 的作为DNA载体分子出现，或是重组病毒DNA载体分子或重组DNA质粒载体分子。 有意异种基因表达的确保是通过将在真核细胞中有活性的启动子片段直接插入到异 种基因编码区域的上游。所述文中一个普通的技术人员会利用已知的载体构建策略 和技术来保证DNA分子进入结缔组织后有合适的表达水平。

文中的那些技术人员会意识到，所述运用脂质体的病毒载体不会被细胞分裂所限 制，后者是逆转录病毒影响结缔组织细胞感染和整合所需的。这种先前所述的运用 非病毒途径的方法包括运用一种能够编码属于TGF-β超家族一员的基因和可选择性 的标记基因，例如抗生素抵抗基因。

本发明另外一种实施方案包括在转移细胞之前保存结缔组织细胞。文中那些技术 人员意识到所述结缔组织细胞可冷冻保存在10％的DMSO液态氮中。

本发明者通过转染BMP-2表达结构制造稳定的成纤维细胞系。这些BMP-2制造 的细胞将活性BMP-2的高浓度在体内维持较长时间。

使骨质疏松性骨折愈合的治疗

骨质疏松是一种由于骨质丢失而导致的骨骼结构性退变，产生的原因有骨形成的 不平衡、骨再吸收或两者都有，这样再吸收支配了骨形成阶段，因此减少了所作用 骨的承重能力。对于一个健康的成年人来说，骨的形成和再吸收率是紧密协调的， 这样就维持了骨骼的更新。然而，在骨质疏松的个体中，这些骨重塑循环中产生了 不平衡，这导致了骨量的丢失以及骨连续性中微结构缺陷的形成。这些由于重塑顺 序混乱产生的骨骼缺损累积起来并最终达到一个点，骨骼的结构完整性严重损害， 就可能发生骨折。虽然这种不平衡在大多数个体中是随着他们的衰老(“老年性骨质 疏松”)而逐渐形成的，但它在绝经后的妇女中严重的多，并以较快的率发展。此外， 骨质疏松也会来源于营养和内分泌的不平衡，遗传性疾病和许多恶性转化。

本发明的一个目标是发明在受骨折之苦患者中产生骨的方法和组合物，这种患 者，例如受骨量减少疾病的痛苦，特别的所述疾病导致了骨重塑的不平衡。另外一 个目标是增加骨的生长，从而修复受骨疾病之苦儿童的骨折，包括代谢性骨疾病。 还有一个目标是修复有骨量丢失风险个体的骨折，包括绝经后的妇女、衰老的个体 和血液透析的患者。另外一个目标是提供修复结构损害骨微结构缺陷的方法和组合 物，包括修复骨折。因此，本发明的目标是刺激骨形成和增加骨量，任选的通过延 长的时间，特别是为了降低由于骨骼结构性退变而产生的新骨折发生率。

Namkung-Matthai等，Bone，28：80-86(2001)揭示了一种大鼠骨质疏松模型，其中 对骨折后早期的骨修复进行了研究。早期表示骨折后3-6周。Kubo等，Steroid Biochemistry&Molecular Biology，68：197-202(1999)也揭示了一种大鼠骨质疏松模型， 其中对骨折后晚期的骨修复进行了研究。晚期表示骨折后大约12周。这些参考条目 对于大鼠骨质疏松模型的揭示以及涉及骨质疏松的数据这里都完整包含进来作参 考。

另一方面，本发明旨在发明加强脊柱动物骨移植的方法，例如哺乳动物，通过根 据本发明在或邻近骨折或断裂部位施用遗传修饰的细胞。

骨折愈合测定在文中是已知的，包括骨折技术、组织学分析和生物机械分析，描 述于例如，美国专利第6,521,750号，完整的将它们对于导致骨折和测定骨折程 度的实验准则和修复过程，特别是骨质疏松受试者的揭示包含进来作参考。

在治疗性的申请中，如果一种治疗有效的组合物和所述结缔组织细胞联合施用 时，TGF-β蛋白配制用作局部施用。技术和制剂通常见于Remington’s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，latest edition。所述活性成分TGF-β蛋白 通常和一种载体结合，例如赋形剂稀释液，包括填充剂、混合剂、粘合剂、润湿剂、 崩解剂、表面活性剂、腐蚀聚合物或润滑剂，这依赖于给药方式和剂量形式的特点。 典型的剂量形式包括粉末、液体制剂，包括悬浮液、乳剂和溶液，颗粒和胶囊。

其他合适的药物载体的实施例是各种阳离子脂类，包括但不局限于N-(1-2，3-二油 基氧)丙基)-n，n，n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphophotidyl ethanolamine)(DOPE)。脂质体也是本发明TGF蛋白分子合适的载体。其他合适的载 体是缓慢-释放的凝胶或包含TGF蛋白分子的聚合物。

所述TGF-β蛋白可与一定量生理上可接受的载体或稀释剂混合，例如盐溶液或其 他合适液体。所述TGF-β蛋白分子也可与其他载体装置结合而保护TGF-β蛋白和其 生物活性形式免受降解，直至到达他们的目标和/或促进TGF-β蛋白或其生物活性形 式移动穿过组织屏障。

脊柱融合的基因治疗

本发明旨在发明一种融合脊柱靶椎体的方法，通过在需要融合椎体的脊柱部位施 用本发明的组合物。成骨有效量的转化或转染结缔组织细胞，这种成纤维细胞或骨 祖细胞和缺损部位或其成骨有效部位接触，由医生选择单次注射或多次注射，使之 最佳，从而导致了靶椎体的融合。

脊柱是一个顶部互相堆叠在一起的骨(椎骨)柱，在它们之间有缓冲的盘(椎间盘)。 在脊柱的中央是脊髓。脊神经来自于脊髓，并从椎体之间的空隙离开脊柱。凸出或 脱出的椎间盘会压迫存在的神经根。不稳定的脊柱使得骨之间相互滑动和摩擦，导 致后背疼痛，有时候会导致神经损害。

开展脊柱融合手术的对象通常是脊柱大体不稳(不正常运动)，过度活动引起的严 重椎间盘退变性疾病，脊椎前移(一个椎体滑移超过另外一个)，对于其他治疗无反应 的面(关节)疾病，以及骨折或肿瘤。脊柱融合治疗最佳的候选者是那些椎间盘非常不 正常，以致椎体间的空间坍塌了50％或更多，或已经坍塌这样周围骨变成了刺激。

骨移植，通常移植物用来在脊柱融合手术期间增加稳定性。在部分椎间盘被去除 后，椎骨变粗糙，将其塑形接受移植物。过了一段时间后，所述移植物将邻近节段 的椎体融合在一起。当骨融合后，椎体不再单独移动。这就使得脊柱更加稳定。典 型的，钉、板、笼、金属棒和其他移植物可应用于脊柱融合手术中来增加稳定性。

治疗性组合物

在本发明另外一种实施方案中，提供了一种以预防或治疗有效剂量经胃肠外施用 给患者的化合物，它包含编码结缔组织细胞的TGF-β超家族基因和一种合适的药物 载体。

在治疗的申请中，所述结缔组织细胞含有一种编码TGF-β超家族一员的基因，这 种细胞可配制用作局部给药。在本发明中，所述结缔组织细胞通常和一种载体结合 起来，例如赋形剂的稀释液，可包含填充剂、混合剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、 表面活性剂、腐蚀聚合物或润滑剂，这依赖于给药方式和剂量形式的特点。

适合注射应用的药物形式包括无菌水溶液(其中是水可溶的)或悬浮液，以及用作 临时配制无菌可注射溶液或悬浮液的无菌粉末。在所有情况下，所述剂量形式必须 是无菌的，它的流动性要到简单可注射的程度。它在制造和保存的条件必须稳定， 并且必须防止微生物的污染，例如细菌和真菌。所述载体必须是溶剂或分散型介质， 包含例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液态聚乙烯二醇等等)，它们合 适的混合物或植物油。维持合适的流动性可通过，例如应用涂层，如卵磷脂，在分 散体的情况下维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂。预防微生物的作用 可通过各种抗菌和抗真菌剂获得，例如三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、theomersal等。 在许多情况下，优选的包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过延迟吸收所述试剂组 合物而获得所述可注射组合物的延长吸收，例如利用单硬脂酸铝和白明胶。

尤其有利的是将胃肠外的组合物配制在剂量单位形式中，从而方便给药及剂量的 统一。这里应用的剂量单位形式是指实体上分离的单位，是治疗哺乳动物受试者合 适的单一剂量；每个单位都包含预先决定量的活性材料，计算这些量联合所需载体 可以产生理想的治疗作用。对于本发明剂量单位形式的详述，受规定为并直接依赖 于(a)所述活性材料的独特特点以及获得的特殊治疗作用，以及(b)文中对化合物的限 制，例如它是用来治疗身体健康损害的活受试者疾病的活性材料。

所述主要的活性成分以有效量配制为方便和有效的给药，并与合适的药物可接受 载体一起配制在剂量单位形式中。在包含辅助活性成分的组合物中，所述剂量参考 常规剂量以及所述成分的给药方式决定。

传输系统

各种传输系统是已知的，并可用来施用本发明的组合物，例如脂质体中的胶囊， 微颗粒、微胶囊，能够表达所述化合物的重组细胞，受体介导的内吞作用，构建一 种核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分等等，也可与其他生物活性剂一起施用。 可以系统或局部给药。

在特殊的实施方案中，理想是将本发明的化合物或组合物局部施用到需要治疗的 部位；这可以通过，但不是为了限制，例如在手术中局部输注，利用栓剂或移植物， 所述移植物是多孔、非多孔或明胶材料，包括细胞膜，例如sialastic膜或纤维。

本发明不局限于这里描述的特殊实施方案的限制。实际上，除了这里的描述外， 根据先前的描述和附图，本发明的各种修改对于那些文中的技术人员来说是显而易 见的。这些修改确定在所附权利要求的范围内。为了阐明本发明给出了以下的实施 例，而不是为了限制。

实施例

实施例1-骨再生的实验步骤

用人类胎脑cDNA和两种引物通过PCR(聚合酶链反应)克隆人类BMP2基因。5’ 引物是5’-TCCCAGCGTGAAAAGAGAGACTGC-3’(SEQ ID NO：1)，3’引物是5’- TTTTGCTGTACTAGCGACACCCACAACC-3’(SEQ ID NO：2)。在利用富含GC的PCR 系统(Roche)后，应用TOPO TA克隆成套工具(Invitrogen)克隆入pCRII-TOPO载体(图 1A)。为了克隆入逆转录病毒载体，用SalI剪切pCRIIbmp2 DNA，并用SalI和NotI 悬突将人类BMP2 cDNA插入物绑入pMTMLV中(图1B)。在转染前一天培养打包细 胞系GP-293细胞(5×105细胞/p60培养皿)。应用Fugene(Roche)将pMTMLV或pMT- BMP2转染至GP-293细胞。在转染48小时后，将新霉素加入培养基中，用来筛选抗 新霉素细胞。筛选持续10天。培养选出293MT和293MTBMP2细胞(5×105细胞/p60 培养皿)用作第二天的编码质粒pVSVG包膜的转染。在转染24小时后，为了感染镀 靶细胞NIH3T3(5×105细胞/p60培养皿)。将转染细胞的上清过滤通过低蛋白粘合过滤 器(0.45μm)，并在转染后48小时用相同体积的DMEM稀释。去除NIH3T3培养基， 并用过滤所得的上清替代。加入polybrene使得最终浓度为8μg/ml。在感染两天后， 开始新霉素筛选以获得NIH3T3-neo和NIH3T3-BMP-2细胞稳定的细胞系。筛选持续 10天。在24小时后测定产生的BMP2的量大约是150ng/105细胞。

实施例2-将NIH3T3-BMP-2细胞注射入兔

选择体重2.0-2.5kg的新西兰白兔用作动物研究。暴露胫骨，并用骨科器械制造 一个缺损(2cm长、0.5cm深)。在缝合后，将对照的NIH3T3-neo或NIH3T3-BMP-2 细胞(2ml 2×106细胞/ml)注射入缺损部位。在注射所述细胞8周后，进行放射分析和 组织学检查。

实施例3-每周X线检查

选择体重2.0-2.5kg的新西兰白兔用作动物研究。暴露胫骨，并用骨科器械制造 一个缺损(2cm长、0.5cm深)。在缝合后，将NIH3T3-BMP-2细胞(2ml 2×106细胞/ml) 注射入胫骨的缺损部位。接着在注射细胞后1、2、3、4、5、6和7周进行X线放射 分析。在注射后7周收获样本，并绘图。在收获后进行组织学检查。

图2A-2F显示用NIH3T3-BMP-2成纤维细胞的骨再生。图1A和1B显示了注射 对照NIH3T3成纤维细胞(A)和NIH3T3-BMP-2细胞(B)8周后的腿骨图。图2C-2F显 示了在处死动物之前对照(C&D)和实验(E&F)腿骨的X线检查。用表达BMP-2蛋白 细胞治疗的骨缺损在注射8周后愈合，而在用对照成纤维细胞处理的缺损中不产生 骨再生。

图3A-3D显示了再生骨组织的组织学检查。制造再生骨组织的石蜡切片并用 Mason’s三色染色。结果显示，再生骨组织(RB)的结构几乎和正常骨组织(NB)的相同。 图3A和3B显示了低倍放大(40x)，图3C和3D显示了高倍放大(100x)。点线表示再 生和正常骨组织之间的边界。这些结果表明再生骨组织的量和正常骨组织的相似。

图4A-4I显示了用NIH3T3-hBMP2成纤维细胞的骨再生。在缝合后将NIH3T3- BMP-2细胞(2ml 2×106细胞/ml)注入胫骨的缺损部位。在注射所述细胞后的1、2、3、 4、5、6和7周进行(A到G)X线分析。结果显示在注射所述细胞后3周，缺损已经 开始被新产生的骨组织填充，并在注射后6周完成。(H)在注射后7周收集样本并绘 图。这张图也显示了再生骨组织完全填充了缺损。(I)在收获后进行组织学检查。显 示Mason’s三色染色的结果。染色的结果表明被修复的骨组织和正常骨组织有相似的 特点。

图5A-5I显示了用对照DMEM培养基的骨再生。在缝合后将对照DMEM培养基 (2ml)注入胫骨的缺损部位。在注射所述培养基1、2、3、4、5、6周后进行(A到G)X 线分析。所得结果，和NIH3T3-hBMP2成纤维细胞的数据相比，显示所述缺损即使 在注射细胞6周后也没有被完全填充。(H)在注射后6周收集样本并绘图。这张图也 显示了不完全填充的缺损。(I)在收获后进行组织学检查。显示Mason’s三色染色的结 果。

实施例4-用NIH3T3-BMP2注射骨质疏松大鼠

所述骨质疏松大鼠模型，例如揭示于Kubo等，Steroid Bioche-mistry & Molecular Biology，68：197-202，1999；和Namkung-Matthai等，Bone，28：80-86，2001。暴露 胫骨，并用骨科器械制造一个缺损(2cm长、0.5cm深)。在缝合后，将对照的NIH3T3-neo 或NIH3T3-BMP-2细胞(2ml 2×106细胞/ml)注射入缺损部位。以数周间隔，尤其在注 射所述细胞8周后，进行放射分析和组织学检查。

实施例5-脊柱融合的实验步骤

克隆人类BMP2并转染至NIH3T3，正如上面的实施例1所述。分别培养来自人 类(包皮成纤维衍化细胞系，I型(Phase I))，小鼠(NIH-3T3，I型(Phase I))，大鼠(Lewis 大鼠假关节纤维组织衍化细胞，II型(Phase II))以及人类(假关节纤维/疤痕组织衍化成 纤维细胞，II型(Phase II))的粘附成纤维细胞并用BMP-2 cDNA通过逆转录病毒转染。 应用Dulbecco改进的Eagle培养基(Cellgro，Herndon，Vir-gina)，10％热失活的胎牛 血清(Gibco BRL，Grand Island，New York)和青霉素及链霉素(Cellgro，Herndon，Virgina) 使细胞在60mm的皿中生长。用逆转录病毒-BMP-2或-lacZ(阴性对照)感染成纤维细 胞4小时/天持续2天。完成ELISA来测定表达蛋白的浓度(ng/ml)。对于每个样本， 将量为5×106，10×106，20×106 BMP-2产生的细胞吸收到1×0.5cm的胶原止血海绵上 (ACS，Helistat，Integra LifeSciences，Plainsboro，NJ)。将0.16-0.18mg/ml rhBMP- 2(Genetics Institute，Cambridge，MA)吸到1×0.5cm ACS(阳性对照)上。将Morselized 髂嵴骨放在融合部位。

例6-将细胞注射入大鼠的脊柱

应用总共48只雌性成年(3-4个月)无胸腺rnu/rnu大鼠(I型24只；II型24只)。麻 醉大鼠。应用后正中线途径暴露L4和L5的横突。应用一种高速钻仅剥离横秃。冲 洗部位(抗生素-ringers溶液)。在L4和L5横突床之间植入细胞/ACS。每两周进行一 次X线检查，直至处死。手触L4-L5节段。在横突间发现有移动就认为是融合失败。 进行非-脱钙组织学检查。

图6A和6B显示了大鼠TG001应用可吸收胶原海绵(ACS)载体在后外侧横突间处 理融合植入细胞4和6周后的X线图。在利用用于BMP-2后外侧横突间处理融合研 究的cDNA转染5×106成纤维细胞(小鼠)后，X线上左侧富集了桥骨。注意右侧如果 有的话，可能细胞较少，骨形成较少。正如所示，骨再生并且脊柱融合了。

这里所有引用的参考数目都完整的包含进来做参考。

虽然为了阐明本发明特殊的实施方案，已经在上面进行了描述，但对于那些文中 的技术员来说，显而易见的是本发明细节的可发生各种变化但不背离本发明，正如 所附权利要求所限定的。

发明背景