本发明涉及一种治疗哺乳动物的青光眼的方法。鉴定了几种具 有由高IOP诱导的显著改变的表达并且在功能上与细胞信号发生和 细胞死亡有关的基因。这些基因有些表达增强，有些表达降低，被 称为眼内压调节早期基因或IPREG，包括：α2巨球蛋白、PSD- 95/SAP90相关蛋白-4、Reggie1-1、RBCK、Gzα、蛋白质磷酸酶1 γ、核糖体蛋白L23-相关产物、胶质细胞原纤维酸性蛋白、环核苷酸 门控阳离子通道、SPARC、B-2芳基胺N-乙酰转移酶、淀粉状蛋白 前体样蛋白2、双载蛋白1、Crybb2、Ras-相关p23、解旋酶Rap 30、蛋白体rPA28亚单位β、ATPase α-1亚单位、βA3/A1晶体蛋 白、β A4晶体蛋白、S-腺苷甲硫氨酸合酶、天冬酰胺合酶和几种 cDNA克隆和表达序列标签(EST)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗哺乳动物的青光眼的 方法，包括给哺乳动物施用有效量的抑制一种或多种上调的IPREG 的表达或活性的组合物。在一个实施方案中，所述上调的IPREG选 自α2巨球蛋白、PSD-95/SAP90相关蛋白-4、Reggie1-1、RBCK、 Gzα、蛋白质磷酸酶1γ、核糖体蛋白L23-相关产物、胶质细胞原纤 维酸性蛋白、环核苷酸门控阳离子通道、SPARC、和B-2芳基胺N- 乙酰转移酶。在另一个实施方案中，所述抑制性组合物含有一种或 多种选自下组的物质：小干扰RNA(siRNA)、反义寡核苷酸、中和 抗体、小分子、重组基因表达载体、重组基因病毒载体、合成肽、 重组多肽、拟肽和IPREG调节区抑制剂。在另外一个实施方案中， 通过眼内注射、局部结膜应用、局部角膜应用或利用机械递送装置 施用所述组合物。在另一个实施方案中，该方法进一步包括施用眼 内压正常化药物，该药物选自非选择性肾上腺素受体阻断剂、选择 性肾上腺素受体阻断剂、前列腺素、碳酸酐酶抑制剂、肾上腺素能 激动剂和缩瞳药。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物的青光眼的方法，包括给哺乳 动物施用有效量的提高一种或多种下调的IPREG的表达或活性的组 合物。在一个实施方案中，提高其表达的下调的IPREG是选自下组 的一种或多种物质：淀粉状蛋白前体样蛋白2、双载蛋白1、 Crybb2、Ras-相关p23、解旋酶Rap 30、蛋白体rPA28亚单位β、 ATPase α-1亚单位、βA3/A1晶体蛋白、β A4晶体蛋白、S-腺苷甲 硫氨酸合酶和天冬酰胺合酶。该组合物包含一种或多种提高下调的 IPREG的表达或活性的物质，并且可以通过上述途径给药，并且可 以进一步与眼内压正常化药物联合给药。
本发明还涉及通过施用有效量的既抑制至少一种上调的IPREG 的表达或活性又提高至少一种下调的IPREG的表达或活性的组合物 来治疗哺乳动物的青光眼。该组合物使用抑制IPREG的表达或活性 (对于上调的IPREG)和/或提高IPREG的表达或活性(对于下调 的IPREG)的物质调节所鉴定的IPREG。
本发明进一步涉及一种预防由高IOP介导的RGC死亡的方法， 包括给个体施用有效量的IPREG调节组合物，使得该组合物抑制一 种或多种上调的IPREG的表达或活性和/或提高一种或多种下调的 IPREG的表达或活性。另外，本发明还涉及一种预防哺乳动物的慢 性眼退化(chronic ocular degeneration)的方法，包括给哺乳动物施用 有效量的IPREG调节组合物，使得该组合物抑制一种或多种上调的 IPREG的表达或活性和/或提高一种或多种下调的IPREG的表达或活 性。
本发明还涉及一种检测患者的慢性眼退化的方法，包括测定患 者房水中的一种或多种IPREG蛋白的表达水平，并且将测定的表达 水平与具有正常眼功能的个体中相同的一种或多种IPREG蛋白的表 达水平进行比较。与具有正常眼功能的个体中相同的IPREG蛋白的 表达水平相比，一种或多种上调的IPREG蛋白的较高的表达水平和/ 或一种或多种下调的IPREG蛋白的较低的表达水平表示该患者具有 慢性眼退化。
本发明进一步涉及一种检测患者中的RGC应激的方法，包括在 最初时间点测定患者房水中一种或多种IPREG蛋白的表达水平，在 以后的时间点测定患者房水中相同的一种或多种IPREG蛋白的表达 水平，并且将在最初时间点测定的一种或多种IPREG蛋白的表达水 平与在以后时间点测定的表达水平进行比较，因此患者中较高的一 种或多种上调的IPREG蛋白的表达水平和/或较低的一种或多种下调 的IPREG蛋白的表达水平表示患者中发生了RGC应激。
还提供了一种鉴定眼内压调节早期基因(IRPEG)的方法，该方法 包括确定一种基因的表达是否被高眼压所改变，其中该基因的表达 不被视网膜神经节细胞(RGC)的损伤所改变。该方法进一步包括确定 该基因的表达是否在高眼压发生后早期改变，确定改变的该基因的 表达在高眼压或青光眼发生后是否持续，以及确定在高眼压降低后 该基因的表达是否仍然改变。在一个具体实施方案中，证实了所鉴 定的基因在RGC死亡和/或青光眼中的作用。本发明进一步涉及用 上述方法鉴定的IPREG。
本发明还涉及用来治疗青光眼、慢性眼退化或RGC死亡的药物 组合物。因此，本发明涉及一种含有有效量的至少一种抑制上调的 IPREG的表达或活性的物质和药物可接受的载体的药物组合物，其 中施用该组合物以治疗青光眼。在另一个实施方案中，施用该药物 组合物以治疗慢性眼退化或RGC死亡。另外，本发明还涉及一种药 物组合物，其含有有效量的至少一种提高下调的IPREG的表达或活 性的物质和药物可接受的载体，其中施用该组合物以治疗青光眼， 或者，在另外的实施方案中，用于治疗慢性眼退化或RGC死亡。本 发明进一步涉及一种药物组合物，其含有有效量的至少一种抑制上 调的IPREG的表达或活性的物质和至少一种提高下调的IPREG的表 达或活性的物质和可接受的药物载体，其中施用该组合物以治疗青 光眼、治疗慢性眼退化或RGC死亡。
附图说明
专利或申请文件包括至少一张彩色附图。具有彩色附图的本专 利或专利申请公开文本将由专利局在收到请求和必要的费用后提 供。
基于以下对本发明实施例实施方案的具体描述，以上所述将是 显而易见的。附图不一定是衡量、强调，而是说明本发明的实施方 案。
表1说明已经诱导高眼内压(IOP)然后用药物降低IOP的大鼠视 网膜的眼内压水平。
表2列出了在基因阵列芯片分析中鉴定的基因，这些基因具有 由于高IOP而引起的显著改变的表达，其基因表达相比正常IOP视 网膜具有相对改变。
表3列出了满足多种IPREG定义标准的基因的亚组，并且说明 了这些基因在诱导高IOP后的RNA表达水平的改变。
图1中的图A说明用倍他洛尔治疗小鼠高眼压模型的眼内压的 改变。
图1中的图B说明进行及不进行倍他洛尔治疗的小鼠高眼压模 型的视网膜神经节细胞损失。
图2是说明为差示基因阵列回收视网膜mRNA样品的实验程序 的流程图。
图3是说明青光眼大鼠视网膜中α2巨球蛋白转录物上调的 Northern印迹。
图4是说明正常、青光眼和视神经轴突切开大鼠视网膜中α2巨 球蛋白、双载蛋白1和Gzα的蛋白质表达水平的免疫印迹。
图5A-5B是一系列共聚焦显微照片，说明通过免疫组化研究所 见的正常和高IOP大鼠视网膜中α2巨球蛋白和LRP-1受体的表达。
图5C-5D是一系列共聚焦显微照片，说明通过免疫组化研究所 见的正常和高IOP大鼠视网膜中α2巨球蛋白和LRP-1受体的定位。
图6是免疫印迹，说明患有青光眼(G)和白内障(C)的人眼的房水 中α2巨球蛋白的表达。
图7是说明青光眼中上调的IPREG如何共同作用导致RGC死 亡的模型的示意图。
发明详述
本发明总的涉及通过调节可能与RGC凋亡有关的由高眼压触发 的基因异常表达和/或功能/活性来治疗和诊断哺乳动物的青光眼的方 法。本文使用的术语″眼内压调节早期基因″或″IPREG″描述了满足一 个或多个将基因与眼退化相关联的标准的基因。一个标准是候选基 因和/或基因产物的任何分子改变被高IOP诱导，而不是作为RGC 损伤的结果产生。另一个标准是这些分子改变在高IOP发生后的相 对早期触发。另外，优选地，由高IOP触发的基因和/或基因产物的 任何分子改变持续或长期存在，甚至在IOP已经正常化之后仍然存 在。在一个特别优选的方面，基因和/或基因产物的分子改变将致敏 或引发RGC死亡，换句话说，该基因将在死亡信号转导(例如上调 的基因产物)或神经保护(例如下调的基因产物)中具有直接或间 接的作用。
基因鉴定
在高IOP条件下差异表达的基因可以通过几种本领域公知的方 法鉴定，这些方法包括差异展示、基因阵列芯片、蛋白质组学和基 因组学方法，在一个具体实施方案中使用基因阵列芯片。使用基因 阵列系统的方法在本领域中公知，简要地说，mRNA可以从目标组 织(例如视网膜)中分离，以及从正常组织来源(即对照来源)和 目标组织来源(例如异常或病变组织)制备。由分离的mRNA制备 cDNA，并由纯化的cDNA制备标记的cRNA探针，然后将该探针与 基因阵列DNA芯片在杂交条件下孵育。芯片上已经与探针特异性结 合的基因可以通过检测何种标记物与cRNA探针结合来鉴定，并且 进行分析来检测与来自正常组织的cRNA探针杂交的基因阵列芯片 和与来自目标组织的cRNA杂交的基因阵列芯片之间基因表达变化 的倍数。通常进行统计学分析来确定在芯片之间发现的基因表达的 变化是否具有显著性，然后在组织本身中验证被认为具有显著性的 基因表达的变化(例如通过RT-PCR、northern印迹法、免疫印迹法 或免疫荧光法)。
对于本发明而言，视网膜mRNA的来源可以来自任何能够经历 和/或复制在青光眼中所见的改变(即高IOP、RGC死亡和高IOP正 常化后持续的RGC死亡)的系统；因此mRNA来源可以来自人组 织、实验动物模型或细胞/组织培养系统。对于本发明而言，使用巩 膜外静脉烧灼大鼠高眼压模型，并且从正常大鼠、改变为高IOP的 大鼠和改变为高IOP接着用药物正常化的大鼠切下的视网膜中分离 mRNA。鉴定了33种在诱导高IOP后具有显著改变的表达的基因和 表达序列标签(EST)。所有这些基因都是用于理解RGC损伤原因的 有意义的候选物，在大鼠模型中用药物使高IOP正常化后21天，鉴 定的9种基因保持显著改变的表达。
眼内压调节早期基因
鉴定了几种在诱导高IOP后在视网膜中的表达改变的基因。在 分析中发现具有上调的表达的基因是：α2巨球蛋白、PSD-95/SAP90 相关蛋白-4、Reggie1-1、RBCK、Gzα、蛋白质磷酸酶1γ、核糖体 蛋白L23-相关产物、胶质细胞原纤维酸性蛋白、环核苷酸门控阳离 子通道、SPARC、和B-2芳基胺N-乙酰转移酶，而显示下调的表达 的基因包括淀粉状蛋白前体样蛋白2、双载蛋白1、Crybb2、Ras-相 关p23、解旋酶Rap 30、蛋白体rPA28亚单位β、ATPase α-1亚单 位、βA3/A1晶体蛋白、βA4晶体蛋白、S-腺苷甲硫氨酸合酶、和天 冬酰胺合酶。多种基因所见的改变的表达与推测的青光眼中RGC死 亡的机制相符合，这些机制包括谷氨酸能应激、旁观者效应、生长 因子剥夺和轴突生长减少。
例如，一种鉴定为具有上调的表达的IPREG，α2巨球蛋白，与 其受体LRP-1结合，通过NMDA受体的激活导致细胞内Ca2+增多。 有意思的是，已经将NMDA受体活性与神经凋亡相关联。另外，α2 巨球蛋白结合并中和视网膜神经营养蛋白，特别是神经生长因子 (NGF)，NGF是一种重要的RGC的存活因子。因此α2巨球蛋白的过 量表达可能通过将其对NMDA受体的兴奋活性的作用加重到凋亡水 平和/或降低存活因子NGF的生物利用度而引起RGC死亡(见图 7)。
IPREG PSD95/SAP90也与NMDA受体结合，结合该受体的C- 末端，并且通过src-家族激酶诱导该受体的磷酸化和激活。已经发 现src-家族激酶Fyn、PSD95和NMDA受体之间复合体的形成增强 了脑缺血中的细胞死亡，而PSD95的抑制减少了缺血后神经元细胞 死亡。此外，激活NMDA受体的src家族激酶本身被蛋白质酪氨酸 磷酸酶和一种src家族磷酸酶特别是蛋白质磷酸酶1γ(PP1)激活， PP1也是在基因阵列分析中发现被上调的IPREG。PP1与RGC应激 相关联，因为发现它抑制损伤的成人中枢神经系统(CNS)中的轴突再 生长(见图7)。
另外，另一种上调的IPREG，Gzα，是NMDA受体的直接作用 物和通过第二信使的NMDA受体信号的介质。实际上，已经报道 Gzα在功能上以加剧神经元细胞死亡的方式使α2巨球蛋白/LRP-1受 体能够与GTPases相互作用。因此，IPREG α2巨球蛋白、PSD95、 PP1和Gzα的上调说明了通过增强NMDA受体激活引起RGC凋亡 的信号协调。
鉴定IPREG的方法
以前的研究已经鉴定了在高眼内压条件下表达改变的基因 (Ahmed F等人，Invest Ophtalmol Vis Sci 45：1247-1258，2004；Esson DW等人，Invest Ophtalmol Vis Sci 45：4450-4462，2004；Pang IH等人， Invest Ophtalmol Vis Sci 46：1313-1321，2005)。但是，这些基因表达的 改变无法解释甚至在患者眼内压正常化后观察到的持续的RGC死亡 以及之后的视力损失。因此，设置标准来鉴定最可能与高眼压和/或 导致青光眼状况继续恶化的RGC死亡保持有关的基因。也就是说， 视网膜基因表达的改变由高眼压触发，并且在高IOP正常化后保 持，引起RGC死亡。
相应地，提供了一种鉴定眼内压调节基因(IPREG)的方法，包括 确定一种或多种候选基因是否满足某些、优选地所有特定的标准。 将要用该方法评价的候选基因可以用多种方法发现/测定。例如，本 领域技术人员可以简单地选择一种或多种感兴趣的基因。通常，这 些候选基因的选择将基于该基因在眼睛(例如视网膜细胞)中已知 的表达，以及该基因与例如细胞活性/信号(例如生长、分化、存 活、粘附)的调节、高眼压和/或细胞死亡的相关性。另外，也可以 根据该方法所述的某些条件引起的基因表达的改变选择候选基因， 例如，通常在高眼内压、眼内压正常化、视力损失、视网膜细胞死 亡、视网膜细胞存活和/或青光眼条件下一种或多种基因的表达的改 变。通过(例如)利用差异展示或基因微阵列将基因在所选条件下 的表达与适当的对照(例如正常和/或非病变条件)进行比较可以确 定这些基因表达的改变。
在该方法中确定高眼压是否改变候选基因的表达。然而，优选 基因的表达对高眼压和青光眼是特异性的，也就是说，其表达不是 可能由于IOP升高而发生的普通RGC损伤的结果。为了确定基因表 达的改变是否只是由于RGC损伤而改变，可以在普通的、优选急性 的RGC损伤条件下利用其它合适的实验模型(例如视神经轴突切开 大鼠模型)来确定基因的表达。该方法中还确定在高眼压发生后基 因的表达是否早期改变。因此，进一步确定一种或多种基因的改变 的表达是否不同于以后的青光眼相关事件，是由高眼压特异性地引 起的。高眼压发生后足够早期的时间范围取决于许多因素，对于人 类患者包括：患者群体、实验动物模型(例如小鼠、大鼠、兔)或 者其它模型系统(例如细胞培养)，并且最好由熟练技术人员根据 对特定组、实验动物模型和/或其他模型系统的了解来确定。例如， 在此处使用的高眼压/青光眼模型-大鼠巩膜外静脉烧灼模型(见实 施例1)中，高眼压发生后基因的早期表达在诱导高IOP后大约1 天到7天或者大约3天到7天发生。
该方法进一步包括确定一种或多种候选基因的表达是否在高眼 压或青光眼发生后持续/长期存在。也就是，确定基因的表达是否在 发生高IOP后早期改变，基因表达是否长期改变。这一标准使得鉴 定的基因更可能与青光眼中所见的高眼压保持和RGC死亡有关。测 定满足这一标准的基因表达的时间范围也取决于患者群体或使用的 实验模型。通常，将发生高IOP后早期测定的基因表达与发生高 IOP后足够长时间测定的相同基因在某一时间点的表达进行比较。 在大鼠巩膜外静脉烧灼模型中，测定表达改变的基因持续表达的时 间点为大鼠眼睛烧灼后28天(见实施例1，第2组)。
IPREG的鉴定进一步包括确定在例如使用眼内压调节药物使高 眼压下降和/或正常化后基因的表达是否仍然改变。这一标准较好地 再现了在人类患者中常见的情况，即，尽管高眼压正常化，仍然继 续发生视野损失，因此这一标准有助于确保鉴定引起青光眼中眼退 化的基因。为了评价在高眼压下降后具有持续改变的表达的基因， 可以在高IOP发生后较快速地使眼内压下降/正常化。例如，在大鼠 巩膜外静脉烧灼模型中，在烧灼(例如诱导高IOP)后第3天用眼 内压正常化药物治疗大鼠，到烧灼后第7天观察到眼内压正常化， 并且在烧灼后第28天，即高IOP正常化后21天，测定基因表达 (参见实施例1，第3组)。为了确定基因表达是否长期发生，可 将IOP降低/正常化后稍后的时间点测定的基因表达与发生高IOP后 早期测定的基因表达和/或正常基因表达(例如发生/诱导高眼压之前 的或在正常个体/动物中所见的基因表达)进行比较。
基因的表达可以通过其它测定基因表达的方法(例如，northern 印迹法、逆转录酶PCR(传统的和实时的)、PCR)证实，通常是不 用于在基因鉴定中说明改变的表达的方法。另外，也可以测定伴随 的基因产物或蛋白质表达的改变，来证实在转录水平上发现的表达 改变也在蛋白质水平上发现。对于特定蛋白质/酶确定鉴定的基因和/ 或蛋白质的表达改变是否导致蛋白质活性(例如激酶活性、结合活 性、酶切活性、蛋白质激活或抑制活性)的改变也可能是有利的。 对蛋白质/酶活性的评价可以用许多本领域公知的方法进行(例如， 分光光度分析、荧光分析、量热法、化学发光法、放射性测量、色 谱分析)，并且依赖于具体的蛋白质/酶。
在利用上述方法将一种基因鉴定为IPREG后，该方法可以包括 其他方面，以更好地理解该基因及其与RGC死亡的调节和/或原因 和青光眼进展的潜在相关性。对于利用基因微阵列鉴定的候选基 因，例如，确定所鉴定的基因在视网膜和其它细胞/系统中的功能和/ 或作用可以提供关于说明该基因在青光眼和RGC死亡中的推定作用 的信息。该信息可被本领域技术人员从大量来源获得，包括国家生 物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)(例如PubMed(科学文章)、Entrez(基因组、基因、蛋白质)、 GenBank)、其它联机检索、教科书、论文、图书馆、科学演示文稿 等。特别有意义的是被认为和/或已知在避免细胞凋亡或在诱导细胞 凋亡中具有作用的鉴定的基因。因此，该方法可以进一步包括确定 基因是否与细胞死亡或细胞存活有关。通常这可以通过在上述一种 或多种资源中检索该基因来进行。具体而言，鉴定的与细胞死亡有 关的基因的上调和鉴定的与细胞存活有关的基因的下调符合它们与 RGC死亡的相关性。
该方法还可以进一步包括验证所鉴定的基因在青光眼中的体内 作用。确定所鉴定的基因是否在体内影响青光眼、慢性眼退化和/或 RGC死亡可以帮助确认该基因为青光眼治疗的有效靶标。相应地， 可以在体内降低上调的基因或基因产物的表达或活性，或者可以在 体内提高下调的基因或基因产物的表达或活性，并且例如测定对 RGC死亡的作用(例如预防)。确定基因或蛋白质在青光眼中的作 用所必需的所鉴定的基因或基因产物的表达或活性的改变水平可以 是在防止RGC死亡和/或青光眼进展中证明完全有效的水平，并且 本领域技术人员可以测定该水平。在一个实施方案中，将基因或基 因产物的表达或活性升高或降低至正常水平(例如在没有高眼压、 RGC死亡和/或青光眼的动物中发现的水平)。在体内降低(例如抑 制)或提高基因或基因产物的表达或活性可以用如以下“治疗方 法”部分所述的多种方法(例如诱变、小干扰RNA(siRNA)、反义 核苷酸、甲基化/脱甲基化、中和抗体、显性阴性多肽、拟肽)来实 现。操作所鉴定的基因或蛋白质(例如回到正常水平)的效果可以 用一种或多种动物模型(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猴)来确定， 如果成功，则最终在人类患者中进行确定。
本发明还涉及通过上述方法鉴定的IPREG。因此，鉴定的 IPREG满足该方法确定的标准。此外，也可以确定所鉴定的IPREG 是否与细胞死亡或细胞存活有关。在一个具体实施方案中，通常通 过确定将鉴定的IPREG的表达或活性增强或减弱(降低)至一定水 平(例如正常水平)是否防止RGC死亡和/或青光眼进展，来验证 IPREG在RGC死亡和/或青光眼中的作用。
治疗方法
相应地，本发明涉及调节异常上调的和/或下调的与青光眼有关 的基因的方法。该方法涉及使用上述实验模型(即巩膜外静脉烧灼 大鼠高眼压模型)鉴定的那些具有已知功能(例如α2巨球蛋白或双 载蛋白1)和未知功能(例如克隆rx05013或EST196604)的基因。 本发明的方法用来治疗哺乳动物，特别是人类。上述动物模型良好 地显示了在人类中见到的青光眼的特征，并且是一种用于在人体内 评价青光眼治疗效果的良好模型。
因此，本发明涉及一种通过施用有效量的组合物治疗患青光眼 的哺乳动物的方法，该组合物抑制一种或多种上调的IPREG的表达 或活性。特别是，该方法包括抑制一种或多种在基因阵列分析中鉴 定的上调的基因。在一个实施方案中，这些基因包括：α2巨球蛋 白、PSD-95/SAP90相关蛋白-4、Reggie1-1、RBCK、Gzα、蛋白质 磷酸酶1γ、核糖体蛋白L23-相关产物、胶质细胞原纤维酸性蛋白、 环核苷酸门控阳离子通道、SPARC、和B-2芳基胺N-乙酰转移酶。
本文使用的抑制上调的IPREG的表达或活性的组合物或物质是 指由减少上调的IPREG的基因或表达基因产物(例如DNA、RNA 或蛋白质)和/或抑制上调的IPREG的功能活性的任何物质组成的组 合物。降低IPREG基因或基因产物的表达水平可以用本领域技术人 员公知的许多方法来实现，包括，例如，IPREG的沉默化(例如通 过抑制特异性脱甲基酶)；定向破坏IPREG的正转录调节区(例如 通过同源重组或诱变)；抑制IPREG的正转录或翻译调节物的基因 或基因产物(例如使用反义寡核苷酸、小干扰RNA、中和抗体、显 性阴性基因/多肽、拟肽)；提高IPREG的负转录或翻译调节物的活 性或表达(例如使用重组基因表达载体、重组病毒载体、合成肽、 重组多肽、超等位基因/多肽)；或者抑制IPREG本身(例如使用反 义寡核苷酸、小干扰RNA、中和抗体、显性阴性基因/多肽、拟 肽)。上调的IPREG的功能活性可以用数种方法阻断，包括：直接 抑制IPREG蛋白的活性(例如通过使用中和抗体、小分子或拟肽、 显性阴性多肽)；抑制激活IPREG的基因和/或蛋白质(例如通过阻 断基因和/或蛋白质的表达或活性)；激活抑制IPREG的基因和/或 蛋白质(例如通过提高基因和/或蛋白质的表达或活性)；抑制作为 IPREG功能下游介质的基因和/或蛋白质(例如通过阻断介质基因和/ 或蛋白质的表达和/或活性)；引入负调节IPREG的基因和/或蛋白 质(例如通过使用重组基因表达载体、重组病毒载体、或重组多 肽)；或者基因置换，例如，置换为IPREG的亚效等位突变体(例 如通过同源重组、利用重组基因表达或病毒载体的过量表达，或者 诱变)。
因此，在一个实施方案中，抑制性组合物可以针对作为IPREG 的细胞受体或结合配偶体的蛋白质。例如，在一个实施方案中，所 抑制的IPREG是α2巨球蛋白，例如使用针对该蛋白质的中和抗 体。在另一个实施方案中，通过拮抗其受体(例如LRP-1)或拮抗 α2巨球蛋白功能的下游介质(例如IPREG Gzα和/或NMDA受体) 抑制α2巨球蛋白，例如使用抑制性肽或拟肽。或者，可以抑制α2 巨球蛋白的结合配偶体(例如NGF)，由此阻断α2巨球蛋白的功 能。类似地，抑制性组合物可以针对上调的IPREG，例如PSD-95， 或者与PSD-95形成复合物以共激活受体(例如NMDA受体)从而 介导细胞死亡的基因和/或蛋白质(例如Fyn)。在另一个实施方案 中，抑制性组合物可以针对其它α2巨球蛋白、Gzα和/或PSD-95功 能的下游介质，例如，该组合物可以抑制上调的IPREG PP1。
在该方法的一个实施方案中，为抑制一种或多种上调的IPREG 而施用的组合物可以含有小干扰RNA、反义寡核苷酸、中和抗体、 小分子、重组基因表达载体、重组基因病毒载体、合成肽、重组多 肽、拟肽或IPREG调节区抑制剂。如前所述，该组合物的物质可以 直接或间接抑制IPREG的表达、蛋白质表达或功能活性。该组合物 可以在适当的药物载体中通过数种途径之一施用，包括眼内注射、 局部结膜应用、局部角膜应用(例如滴眼剂、眼用凝胶)或者使用 机械递送装置或眼部插入物。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物的青光眼的方法，包括给哺乳 动物施用有效量的提高一种或多种下调的IPREG的表达或活性的组 合物。该方法还包括提高在基因阵列分析中鉴定的那些具有已知和 未知功能的基因的表达，在该方法的一个实施方案中，下调的基因 选自：淀粉状蛋白前体样蛋白2、双载蛋白1、Crybb2、Ras-相关 p23、解旋酶Rap 30、蛋白体rPA28亚单位β、ATPase α-1亚单位、 βA3/A1晶体蛋白、βA4晶体蛋白、S-腺苷甲硫氨酸合酶、和天冬酰 胺合酶。在一个具体实施方案中，提高其表达或活性的IPREG是双 载蛋白1。
如本文使用的提高下调的IPREG的表达或活性的组合物或物质 是指由增加下调的IPREG的基因或表达基因产物或提高下调的 IPREG的活性库(active pool)和/或活性的任何物质组成的组合 物。因此，该组合物可以包含防止IPREG沉默化(例如通过激活特 异性脱甲基化酶)、破坏IPREG的负转录调节区(例如通过同源重 组或诱变)、抑制IPREG的负转录或翻译调节物或IPREG功能的负 调节物(例如使用反义寡核苷酸、小干扰RNA或中和抗体)、或者 提高IPREG的正转录和/或翻译调节物、IPREG功能的正调节物、 IPREG本身或其下游介质的表达(例如使用重组基因表达载体、重 组病毒载体、合成肽或重组多肽)的任何物质。
相应地，提高下调的IPREG的表达或活性的组合物可以包含一 种或多种选自小干扰RNA、反义寡核苷酸、中和抗体、小分子、重 组基因表达载体、重组基因病毒载体、合成肽、重组多肽、显性阴 性基因或多肽、拟肽和IPREG调节区激活剂的物质。因此，该组合 物可以直接或间接提高下调的IPREG的表达或功能活性。
本发明还涉及通过给哺乳动物施用既调节上调的IPREG又调节 下调的IPREG的组合物治疗青光眼或青光眼相关问题的方法。例 如，本发明涉及一种治疗哺乳动物的青光眼的方法，包括给哺乳动 物施用有效量的既抑制至少一种上调的IPREG的表达或活性又提高 至少一种下调的IPREG的表达或活性的组合物。本发明还涉及一种 通过给个体施用有效量的调节一种或多种IPREG的组合物预防由高 IOP介导的RGC死亡的方法，该组合物抑制上调的IPREG的表达 或活性或者提高下调的IPREG的表达或活性。类似地，本发明进一 步涉及一种通过给哺乳动物施用有效量的调节一种或多种IPREG的 组合物预防哺乳动物的眼退化的方法，该组合物抑制一种或多种在 慢性眼退化中上调的IPREG的表达或活性或者提高一种或多种在眼 退化中下调的IPREG的表达或活性。
在该方法的一个进一步的实施方案中，该组合物抑制的上调的 IPREG包括选自下组的物质：α2巨球蛋白、PSD-95/SAP90相关蛋 白-4、Reggie1-1、RBCK、Gzα、蛋白质磷酸酶1γ、核糖体蛋白 L23-相关产物、胶质细胞原纤维酸性蛋白、环核苷酸门控阳离子通 道、SPARC、和B-2芳基胺N-乙酰转移酶，该组合物提高其表达的 下调的IPREG包括选自下组的物质：淀粉状蛋白前体样蛋白2、双 载蛋白1、Crybb2、Ras-相关p23、解旋酶Rap 30、蛋白体rPA28 亚单位β、ATPase α-1亚单位、βA3/A1晶体蛋白、βA4晶体蛋白、 S-腺苷甲硫氨酸合酶、和天冬酰胺合酶。
在该方法中调节一种或多种IPREG的组合物可以包含任何直接 或间接提高下调的IPREG的表达或功能和/或抑制上调的IPREG的 表达或功能的物质。因此，在一个进一步的实施方案中，该组合物 包含小干扰RNA、反义寡核苷酸、中和抗体、小分子、重组基因表 达载体、重组基因病毒载体和重组多肽、拟肽、IPREG调节区抑制 剂和IPREG调节区激活剂。上述组合物优选地也在适当的药物载体 中通过数种途径之一施用，包括眼内注射、局部结膜应用、局部角 膜应用和使用机械递送装置。
为了治疗青光眼而抑制α2巨球蛋白(上调的IPREG)的有效性 的实验检测表明，同时使用降眼内压药物增强了通过抑制α2巨球蛋 白见到的RGC存活(见表1和表2)。因此，所有治疗方法都可以 进一步包括与施用IPREG调节组合物(例如抑制上调的IPREG的 表达或活性和/或提高下调的IPREG的表达或活性)联合，或者除此 之外，施用几种眼内压正常化药物之一。眼内压正常化药物可以在 IPREG调节组合物治疗的任意时间给药；因此，眼内压正常化药物 可以在组合物治疗的整个过程中连续给药，也可以在有效量的组合 物之前、之后或者同时给药。由于人类患者更可能已经接受降眼内 压药物治疗，因此除任意降眼内压药物以外，可以以本领域技术人 员认为对于有效治疗患者合适的间隔施用IPREG调节组合物。有多 种药物可以在这些方法中用来降低眼内压，包括：非选择性β1肾上 腺素受体阻断剂、选择性β1肾上腺素受体阻断剂、前列腺素、前列 腺素类似物、碳酸酐酶抑制剂、docosanoid、肾上腺素能激动剂、胆 碱能药物和缩瞳药。在一个具体实施方案中，降眼内压药物使用选 择性β1肾上腺素受体阻断剂倍他洛尔。
剂量和合适的载体
根据本发明的方法，有效量的调节IPREG(即抑制其表达或活 性和/或提高其表达或活性)的组合物可以在可接受的药物载体中通 过适当的途径(例如眼内注射、局部结膜应用、局部角膜应用或使 用机械递送装置)单独地或与其他药物联合给哺乳动物施用。药物 组合物的有效量是在给药条件下足以达到所需治疗或预防效果的 量，例如，减轻和/或阻止RGC凋亡及青光眼进展的组合物给药 量。组合物可以作为单剂量或多剂量给药，以确保患者在治疗期间 保持组合物的治疗显著水平。剂量可以根据本领域公知的方法确 定，并且取决于为组合物选择的具体药物、对象年龄、体重、对药 物的敏感性和耐受性和总体健康状况。
组合物的制剂根据选择的给药途径而不同(例如溶液或乳 剂)。合适的药物载体可以含有不与组合物中的调节性物质相互作 用的惰性成分。可以使用标准药物配制技术，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中所述 的技术。用于肠胃外给药的合适的药物载体包括，例如，无菌水、 生理盐水、抑菌盐水(含有大约0.9％mg/ml的苯甲醇的盐水)、磷 酸盐缓冲液、汉克斯液、林格乳酸盐等。
诊断方法和试剂盒
本发明还涉及允许医生诊断青光眼或青光眼相关问题的方法。 高IOP的发生难以预测，通常，患者的结果是长期暴露于高IOP， 时间长度足以发生显著的眼退化，即在医生发现和/或证明高水平的 IOP之前。存在几种鉴定的IPREG，其蛋白质产物显示伴随的表达 水平增加(上调的IPREG)或降低(下调的IPREG)(例如α2巨球 蛋白、双载蛋白1和Gzα)。此外，许多IPREG蛋白是可溶性的， 在眼睛的房水中可检测到(例如α2巨球蛋白)。眼睛的房水可以通 过本领域技术人员公知的标准外科操作从患者采集。然后可以利用 本领域公知的任何方法检测房水中的可溶性蛋白质，包括免疫沉淀 法、免疫印迹法、免疫荧光法、色谱法(HPLC、离子交换或凝胶过 滤)或比活性法(例如可检测标记的底物的酶切和/或结合)，并对 检测到的蛋白质的表达水平进行定量。例如，图5显示了在青光眼 病人眼睛的房水中，α2巨球蛋白的表达可被检测到，并且显著上 调。
因此，本发明涉及一种检测患者的慢性眼退化的方法，包括测 定患者房水中的一种或多种IPREG蛋白的表达水平，并将测定的一 种或多种IPREG蛋白的表达水平与具有正常眼功能的个体中相同的 一种或多种IPREG蛋白的表达水平进行比较，在慢性眼退化个体中 上调的IPREG蛋白的较高的表达水平或在慢性眼退化个体中下调的 IPREG蛋白的较低的表达水平表示该患者具有慢性眼退化。一种或 多种IPREG蛋白的表达水平可以用本领域技术人员选择的上述任何 方法来测定，并且可以与使用相同方法在具有正常眼功能的个体中 (例如)或者在具有在特征上(例如在分子上)不同于青光眼的眼 部病症的个体中测定的相同的一种或多种IPREG蛋白的表达水平进 行比较。一种或多种IPREG蛋白的对照和/或正常表达水平可以在测 定患者的同时在来自正常个体的样品中测定，或者用于比较的表达 水平可以是以前为使用的具体方法建立的已知的、定量的标准。
在该方法中可以测定通过基因阵列分析鉴定的一种或多种或者 甚至全部IPREG的表达水平，在一个具体实施方案中，测定其表达 水平的IPREG蛋白是α2巨球蛋白和双载蛋白1。对患者中RGC应 激状态的了解对于医生确定和/或说明青光眼的严重程度和进展是重 要的。因此，本发明还涉及一种检测患者中的RGC应激发生的方 法，包括在最初时间点测定患者房水中一种或多种IPREG蛋白的表 达水平；在以后的时间点测定患者房水中相同的一种或多种IPREG 蛋白的表达水平；并且将在最初时间点测定的一种或多种IPREG蛋 白的表达水平与在以后时间点测定的表达水平进行比较，一种或多 种上调的IPREG蛋白的较高的表达水平和/或一种或多种下调的 IPREG蛋白的较低的表达水平表示患者中发生了RGC应激。一种或 多种IPREG蛋白的表达水平可以如前所述在患者的房水中测定和定 量(例如使用免疫化学法、色谱法或比活性法)。
进一步地，众所周知由于许多环境和遗传因素，个体对具体疗 法可能有不同的反应。因此，本发明还涉及利用与疗效相关联的 IPREG改变来预测具体青光眼治疗为有效的可能性的方法，特别 是，预测针对个体中的一种或多种具体IPREG对于青光眼治疗将有 用和/或成功的可能性。因此，在一方面，该方法涉及利用本领域技 术人员公知的任何核苷酸分析方法(例如SNP、荧光原位杂交 (FISH)、测序、PCR或错配检测分析)检测生物样品(例如血 液、细胞或唾液)中已确定/已知是青光眼疗效标记物的IPREG的遗 传改变(例如基因复制、缺失、重组、转座或序列突变)。另一方 面，该方法涉及利用上述方法(例如免疫化学方法、色谱法或底物 相互作用)或本领域技术人员公知的其他方法测定生物样品(例如 房水或细胞)中已确定其表达/活性与特定青光眼治疗成功有关的 IPREG蛋白的表达水平和/或活性。
也可以制备用于检测生物样品(例如房水)中IPREG蛋白的表 达水平的试剂盒。这样的试剂盒可以包括可与一种或多种IPREG蛋 白结合的抗体或功能片段，以及适合检测抗体(或抗体片段)与一 种或多种IPREG蛋白之间的复合体的存在的辅助试剂。抗体组合物 可以作为冻干形式提供，其单独提供或者与对所检测的一种或多种 IPREG蛋白的其它表位具有特异性的其它抗体组合。试剂盒中可以 包括抗体(可以标记或者不标记)以及辅助成分(例如缓冲液、稳 定剂、赋形剂、杀生物剂和/或惰性蛋白质，例如牛血清白蛋白)。 例如，抗体可以作为与辅助成分混合的冻干混合物提供，或者辅助 成分可以单独提供，由使用者组合使用。通常，基于活性抗体的含 量，这些辅助物质的含量低于大约5％重量，通常基于抗体的浓度， 总量至少为大约0.001％重量。当使用一种或多种能够与一种或多种 IPREG蛋白反应性抗体结合的第二抗体(例如二级抗体)时，这些 抗体可以在试剂盒中提供，例如，在第二个小瓶或容器中提供。如 果存在，则第二抗体一般被标记，并且可以通过与上述抗体制剂类 似的方法进行配制。试剂盒的成分(例如抗α2巨球蛋白抗体或抗体 片段和辅助试剂)可以单独包装或者一起包装在合适的容器(例如 瓶、盒、封套或管)中。
药物组合物
本发明还涉及在本发明方法中用于治疗哺乳动物或患者的药物 组合物。因此，本发明涉及一种药物组合物，其含有有效量的至少 一种抑制一种或多种上调的IPREG的表达或活性的物质(例如分 子、化合物、多肽)和药物可接受的载体，其中施用该组合物以治 疗青光眼。在进一步的实施方案中，药物组合物还用来治疗慢性眼 退化或RGC死亡。该药物组合物可以包含小干扰RNA、反义寡核 苷酸、中和抗体、小分子、重组基因表达载体、重组基因病毒载 体、合成肽、重组多肽、拟肽和IPREG调节区抑制剂。被药物组合 物抑制的上调的IPREG可以是在基因阵列分析中鉴定的具有已知或 未知功能的那些IPREG之一(见表2)。
本发明还涉及一种药物组合物，其含有有效量的至少一种提高 一种或多种下调的IPREG的表达或活性的物质和药物可接受的载 体，其中施用该组合物以治疗青光眼。在一个实施方案中，该药物 组合物包含提高在基因阵列分析中发现下调的IPREG的表达或活性 的物质(例如分子、化合物、多肽)，该组合物可以包含小干扰 RNA、反义寡核苷酸、中和抗体、小分子、重组基因表达载体、重 组基因病毒载体、重组多肽、拟肽和IPREG调节区激活剂。
本发明进一步涉及一种药物组合物，其含有有效量的至少一种 抑制一种或多种上调的IPREG的表达或活性的物质和至少一种提高 一种或多种下调的IPREG的表达或活性的物质和药物可接受的载 体，其中施用该组合物以治疗青光眼，在进一步的实施方案中，治 疗慢性眼退化或RGC死亡。该药物组合物针对的IPREG可以是在 使用任何有效和适当改变IPREG表达的物质的基因阵列分析中确定 具有显著改变的表达的任何IPREG。如前所述，药物组合物可以通 过几种途径之一给药，包括眼内注射、局部结膜应用、局部角膜应 用或使用机械递送装置。
实施例
实施例1.眼内压调节基因
眼内压的诱导
高IOP.在麻醉下进行大鼠眼睛巩膜外层烧灼。结膜切开后，分 离眼外肌，根据定位、相对固定性、较大管径和分支模式确定角膜 缘主引流静脉。用30″烧灼头对右眼三根巩膜外血管进行烧灼。每只 动物的左眼在假手术(结膜切开而不进行烧灼)后用作正常IOP对 照。
IOP测量.IOP用Tonopen XL眼压计在光麻醉(肌内注射4mg kg氯胺酮、0.32mg/kg赛拉嗪和0.4mg/kg乙酰丙嗪)下进行测量。 与其它仪器相比Tonopen读数的精度(甚至在麻醉下)已经得到确 定。大鼠在麻醉下的平均正常IOP为12mm Hg(范围为10-14mm Hg)，在烧灼的眼中升高至稳定的平均值21mm Hg(范围为18-24 mm Hg)超过4个月。这些数值与以前发表的数据相符。
无论烧灼左眼还是右眼，其IOP没有差异(数据未显示)；因 此，为了便于记录和管理而选择右侧。利用平面检眼镜检查证实 IOP升高的视网膜为正常灌注。烧灼使IOP升高大约1.7倍。证明这 种升高与人开角型青光眼的相关性高于其他模型，其他模型使压力 升高＞2倍，并且通常导致局部缺血。
高IOP的药物降低.每日作为滴眼剂应用选择性β-阻断剂(0.5％ 倍他洛尔，Alcon)。如示(例如在烧灼3天后)开始局部应用倍他 洛尔，在3天后导致IOP完全正常化。之后在应用倍他洛尔的情况 下IOP继续保持正常化。例如，当从烧灼后第3天开始应用倍他洛 尔时，眼睛从第1天至第6天具有高IOP，从第7天开始具有正常 化的IOP。倍他洛尔对于正常眼睛的IOP没有显著性影响。
通过烧灼一只眼的三根巩膜外血管以减少房水流出，在大鼠眼 睛中诱导高IOP，并且对侧眼进行假手术，用作对照(图1A)。在 静脉烧灼后3、7、14、21和28天，烧灼眼的IOP显著高于对照眼 (p≤0.01)。青光眼眼睛的平均IOP大约为21mm Hg，相比而言，正 常眼睛的平均IOP大约为12.6mm Hg。每天用倍他洛尔局部治疗减 少了房水的产生，并且降低了烧灼诱导的高IOP，但是对于对侧眼 的正常IOP没有显著影响(见图1A)。从烧灼后第3天开始的倍他 洛尔给药使高IOP从第7天开始完全正常化。用倍他洛尔治疗的烧 灼的眼睛与应用或不应用倍他洛尔的对照眼睛的IOP没有显著性差 异(图1A)。
高IOP诱导的RGC死亡
静脉烧灼导致的慢性高IOP以恒定速度引起积累性RGC损失 (Rudinski M等人，J Neurobiol 58：341-354，2004)。使用标记视网膜内 RGC体的逆行示踪剂(retrograde tracer)，我们证实在烧灼后3、4、5 周，平均RGC损失为大约15％、20％和27％。在烧灼后6周，平均 RGC损失为大约35％(未显示)。用倍他洛尔使IOP正常化降低了 RGC损失的平均速度，但没有阻止RGC损失(图1B)。在所示的 实验中，每日倍他洛尔给药使IOP从第7天开始正常化。因此，短 期(大约1周)暴露于高IOP触发了较低的但是显著的RGC损失速 度，但是这种死亡不依赖于持续的高IOP。这些动物数据复制了报 道的用药物降低IOP的患者的视野损失，所述视野损失在3年时影 响了25％的患者，在10年时影响了超过70％的患者(Kass MA等人， Arch Ophthalmol 107：1590-1598，1989；O′Brien C等人，Am J Ophthalmol 111：491-500，1991)。
视神经轴突切开术诱导的RGC死亡
为了与青光眼(为慢性眼内损伤)进行对比，研究了视神经轴 突切开术，这是一种急性眼外损伤。对于视神经轴突切开术，在4 天后见到最低的但是可检测到的RGC死亡，在损伤后10天发现大 约40％的RGC(Berkelaar M等人，J Neurosci 14：4368-4374，1994；Di Polo A等人，Proc Natl Acad Sci 95：3978-3983，1998)。由于青光眼和 轴突切开体内模型导致相当的RGC损失，在进一步的实验中，将诱 导高IOP后的第28天与视神经轴突切开术后的第4天进行比较，将 诱导高IOP后的第42天与视神经轴突切开术后的第10天进行比 较。
眼内压调节早期基因(IPREG)
RNA的制备.使用TRIZOL(Life Technologies)从视网膜组织 分离总RNA。汇集属于相同实验组的三个视网膜进行基因微阵列实 验。然后用RNAEASY(QIAGEN)进一步纯化RNA。RNA样品 的完整性通过使用2100生物分析仪(Agilent)在RNA 6000 Nano LabChip(Agilent)上运行试样份进行评价。
微芯片杂交.探针合成、杂交和扫描按照Affymetrix的方案在 McGill University和Genome Quebec Innovation Centre进行。对于所 示的实验，使用大鼠U34基因组阵列(8,700种基因，Affymetrix)。 简而言之，首先将RNA样品转化为双链cDNA(T7-(dT)24引物 (Genset))。然后纯化cDNA，并用来产生生物素化的cRNA探针 (Bioarray High Yield RNA转录物标记试剂盒(Enzo diagnostics))。将 一份纯化的cRNA在RNA 6000 Nano LabChip(Agilent)上分析，以证 实完整性和大小分布。杂交后立即将芯片置于Affymetrix GeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix)上。总共进行10次低严格条件的洗 涤(63SSPE，0.01％Tween-20，0.005％消泡剂)和4次高严格条件的洗 涤(100mM MES，0.1M NaCl，0.01％Tween-20，50C)(所有试剂均来 自Sigma)。然后将阵列与SAPE(链霉抗生物素/藻红蛋白染料， Molecular Probes)一起孵育，然后进行10次低严格条件的洗涤。将 阵列与生物素化的抗链霉抗生物素抗体(Vector Laboratories)一起孵 育，并再进行15次低严格条件的洗涤。将阵列置于Agilent GeneArray扫描仪2500(Affymetrix)中检测特异性结合的探针。用 Microarray Analysis Suite 5.0版(Affymetrix)分析扫描的图像。借助于 Kensington Discovery Edition 1.8版(Inforsense)进行统计学分析。
小心切下视网膜，以确保只制备视网膜mRNA进行基因微阵列 研究。从假手术的眼睛(正常IOP对照，第1组)、高IOP第28 天的眼睛(检测，第2组)和烧灼并从第3天起每日倍他洛尔治疗 的第28天的眼睛(第3组)获得样品。在第3组中，到第7天高 IOP回归正常水平。来自每一组(每组n＝4)的样品用基因微阵列进行 研究(见图2的流程图)。利用2.5倍的截断值来得到显著性 (p＜0.05)。
最初的分析集中于具有高IOP的视网膜(第2组)和正常IOP 的视网膜(第1组)之间的差异表达。在第2组中，在高IOP的第 28天时，32种基因的表达显著改变，一些降低，而另外一些升高。 这些基因是推断的眼内压调节早期基因(IPREG)(表1)。
表1.基因阵列结果。cDNA-阵列数据比较了高IOP第28天(A 列)和烧灼28天但是只经历7天高IOP(从第4天至第28天施用倍他 洛尔)的正常IOP(B列)眼睛相对于正常IOP的改变。两种情况都显 示相对于未烧灼的眼睛具有改变。

对正常IOP(第1组)和7天具有高IOP、另外21天具有正常 IOP的烧灼的眼睛(第3组)进行了进一步的比较，证明大多数候 选IPREG具有完全正常的表达。它们的表达与正常IOP视网膜没有 不同。这些基因表达的正常化的发生可能是由于i)RGC应激/死亡被 阻止，ii)改变的表达需要高眼压持续28天，或者iii)改变的表达 短期存在。
然而重要的是，尽管IOP完全正常化，但是相对于正常IOP视 网膜，8种候选IPREG仍保持显著改变的表达(表2)。双载蛋 白、AMPLP-2、β A4晶体蛋白和ras-相关p23的表达下调，α2巨球 蛋白、Gzα、PTP-1γ、reggie1-1和PSD95/SAP90相关蛋白4的表达 上调。从第7天到第28天的IOP正常化没有逆转3种基因(克隆 rX00382、蛋白质磷酸酶-1γ和环核苷酸门控阳离子通道)的表达的改 变；只是部分逆转了5种基因(α2巨球蛋白、Reggie 1.1、克隆 rX01295和rX05013、核糖体蛋白L23相关产物和囊泡蛋白克隆 RKIAS43)的表达的改变；但是完全逆转了Gzα的上调(表2)。
表2.满足IPREG标准的选择的基因
从表1中列出了满足所有IPREG标准的基因。也选择了其他部 分满足标准的基因。*表示神经元特异性蛋白质，而其它蛋白质在 其它细胞型中表达。半定量RT-PCR所示的数据代表3个独立的研 究。确定具有等量的mRNA和相等的凝胶加样量(数据未显示)。

重要的是注意到其表达在倍他洛尔治疗后21天完全正常化 的基因(例如Gzα)仍然可以是令人感兴趣的候选者。这些基因 也可能长期存在，尽管时间短于在我们的实验例中研究的IOP正 常化后21天(例子见表3)。
表3.用中和抗体针对α2巨球蛋白的青光眼治疗。每个数据点 表示至少6只眼睛的平均值(±sd)。通过染料从SC逆行进行RGC 标记。″-″表示“未治疗”。眼压不被眼内注射影响。

这些数据表明8种基因的视网膜表达的改变需要7天或者更短 时间的视网膜对高IOP的暴露。此外，在没有高眼压的随后的21 天，表达持续改变，表明这种改变是长期的。视网膜基因表达的改 变被认为先于RGC损失，因为在该例中RGC死亡最少。因此，这 些发现强烈提示这些基因可能与RGC死亡有关，特别是与IOP正常 化后继续的RGC死亡有关。
基因微阵列的确认
动力学分析.所有研究(基因阵列、RT-PCR、Northern印迹 法、Western印迹法、逆行标记的RGC的计数)都是对在术后指定 天数从对照(假手术的)或烧灼的眼睛中新鲜分离的视网膜进行 的。
RT-PCR.在指定的天数切下对照、高IOP或轴突切开的动物 的视网膜。提取总视网膜RNA(Trizol，GIBCO)，消化DNA(Dnase， 扩增级，GIBCO)，在第二次Trizol提取后再次纯化样品。对于RT- PCR分析，使用单视网膜(n＝3-5)。利用1μg总视网膜RNA和特异 性引物(SIGMA)产生互补cDNA。cDNA的PCR扩增用每种基因的 特异性引物进行。对于PCR，使用半定量PCR分析的严格条件。 在总共30个循环后获得候选基因的线性扩增，而β-肌动蛋白(用 作内部控制)在18个循环后在线性范围内。在三个独立的使用三 种独立制备的RNA样品的RT-PCR实验中，用STORM 840成像 系统扫描用来分析PCR产物的琼脂糖凝胶，并且用imagequant分 析软件进行定量分析。读数为平均值±SEM，每组(正常的IOP和 高IOP)中每一基因产物的数据对于作为内部控制的β-肌动蛋白 (100％)进行标准化。视网膜β-肌动蛋白mRNA的表达水平不随着 高IOP的提高而改变(数据未显示)。
为了证实基因微阵列分析的结果，用某些候选IPREG的特异性 引物对进行定量RT-PCR。用独立分离的视网膜mRNA样品进行的 几项RT-PCR实验定量地证实了双载蛋白、AMPLP-2、β A4晶体蛋 白和ras相关p23的下调，以及α2巨球蛋白、Gzα、PTP-1γ、 reggie1-1和PSD95/SAP90相关蛋白4的上调(见表3，有些数据未 显示)。
选择α2巨球蛋白进行进一步的研究。对视网膜α2巨球蛋白 mRNA的Northern印迹分析显示高IOP第28天比正常IOP高大约 3倍(p＜0.001)。这种增加被倍他洛尔治疗略微减弱，但是相对于正 常IOP仍然显著增加。相反，接受或未接受倍他洛尔治疗的正常 IOP的对照视网膜具有正常的和相当的α2巨球蛋白mRNA(图3)。
高眼压对IPREG的特异性调节
视神经轴突切开术.用赛拉嗪、乙酰丙嗪和乙酰丙嗪的混合物 麻醉250-300克的雌性Wistar大鼠。通过切开背侧眼窝并部分去除 泪腺和眼眶脂肪接近眼球。通过分离上直肌然后切开眼牵缩肌显现 视神经(ON)。在ON的眼球出口后5mm处形成纵向脑膜切口，避 开血管，以使视网膜循环不受影响。在眼球出口后5mm进行ON切 开术，以使视神经头不受影响。所有动物操作都由McGill动物福利 委员会(McGill Animal Welfare Committee)批准。
Western印迹分析.将一个视网膜匀浆化并且裂解(150mM NaCl， 50mM Tris pH 8.0，2％NP-40，PMSF，亮抑酶肽和抑肽酶)45分钟。 离心除去核和碎片后，使用试剂盒(BIORAD)测定可溶性蛋白质的浓 度。每泳道15g视网膜蛋白质在12％SDS-PAGE上分级分离，并转 移到硝酸纤维素膜上。用山羊抗大鼠α2巨球蛋白的多克隆抗体 (Sigma和Calbiochem)检测α2巨球蛋白。使用纯大鼠α2巨球蛋白 (Sigma)作为对照。用辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的抗体作为第二试 剂。免疫反应性带用增强的化学发光法(NEN)显示。
为了确定高眼压，而不是RGC死亡，是基因表达的特异性调节 物，将青光眼模型与视神经轴突切开模型进行比较。视网膜蛋白质 的定量western印迹分析用来自正常IOP、高IOP第28天和ON轴 突切开术第4天的样品进行。对于每种模型选择这些时间点研究显 著RGC死亡之前的分子改变。
在高IOP中，视网膜α2巨球蛋白表达显著上调2.3倍，但是在 视神经轴突切开中没有改变(图4)。相反，在青光眼和视神经轴 突切开模型中，Gzα蛋白(分别增加64％和43％)和双载蛋白(在两种 模型中减少大约30％)的视网膜水平具有相当的改变。因此，Gzα和 双载蛋白的改变不被高IOP特异性调节；实际上，它们可能是RGC 损伤的标记物，而α2巨球蛋白被高眼压特异性诱导。
实施例2.α2巨球蛋白在青光眼中的作用的验证
α2巨球蛋白及其受体在视网膜中的定位
逆行RGC标记.用3％DII(1，1-双十八烷基-3，3，3，3-四甲基吲哚 碳菁高氯酸盐)或3％荧光金标记RGC。简要地说，麻醉Wistar大 鼠，并将它们的头固定在立体定向仪上。暴露两个上丘(SC)，将染 料注入到每个半球的SC处的两个相邻部位(前囟后5.8mm，侧向 1.0mm，第一次染料溶液释放深4.5mm，第二次释放深3.5mm)。
平铺固定的视网膜和RGC计数.染料注入后7天，灌注固定大 鼠的脉管系统(经心脏灌注磷酸盐缓冲液(PB)，然后是4％的PB中的 PFA)，并摘出眼睛。后固定1小时后穿过巩膜形成切口，形成马尔 他十字图案，并且从视神经头处的视神经乳头凹陷(eyecup)上剥 离视网膜。将视网膜平铺固定在载玻片上(玻璃体侧向上)，风干，并 且覆盖以固定基质(Molecular Probes)。在荧光显微镜(Zeiss)下观察视 网膜。对于每个视网膜，每四分之一区域以20倍拍摄四张数码图片 (上、下、鼻侧和颞侧)。根据逆向运输的染料的存在和形态学识 别平铺固定的视网膜中的RGC。将所有四个四分之一区域中的RGC (每个视网膜16张图片)进行平均，并表示为RGC/mm2计数面积。
免疫组化和共聚焦显微镜检查.如上所述心内灌注大鼠，摘出 它们的眼睛，除去前部和晶状体。将剩余的视神经乳头凹陷浸没在 4％PFA中2小时，然后转移到30％蔗糖中于4℃数小时，包埋在 OCT(组织-Tek，Miles Laboratories，IN)中，并在液氮中在甲基丁烷中 冷冻。将径向冷冻切片(10-14m)置于明胶覆盖的玻片上。用含1％ Triton的PBS中的3％BSA在室温下封闭切片30分钟，并暴露于第 一抗体-抗α2巨球蛋白抗体(兔，1∶200(Calbiochem)或山羊，1∶100 (Sigma))和/或抗LRP1受体(1∶200 Santa Cruz)2小时。用抗胶质标 记物胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)的抗体(小鼠，1∶400 Chemicon) 或抗神经元标记物微管蛋白III(Tubulin III)的抗体(小鼠，1∶2000， Chemicon)进行双染色。第二抗体是FITC偶联的抗小鼠、Cy3-偶联 的抗兔或Alexa Fluor 488抗山羊抗体(以1∶250、1∶1000或1∶500稀 释度使用)，在室温下孵育1小时。用Zeiss共聚焦显微镜(LSM510) 记录共聚焦图像。
因为α2巨球蛋白是一种可溶性蛋白质，因此研究了它的定位及 其细胞受体(LRP-1)的定位(见图5A-5D)。在正常视网膜中，在大 多数RGC中发现了α2巨球蛋白，其中它与逆行示踪剂荧光金标记 和微管蛋白βIII(一种RGC-特异性标记物)共定位(数据未显 示)，但是也定位于米勒细胞和视网膜星形胶质细胞中。LRP-1受 体的阳性免疫染色也与荧光金阳性神经元共定位。在正常视网膜 中，几乎仅在RGC中检测到LRP-1免疫染色，而在青光眼(烧灼第 28天，具有高IOP)中，RGC中的LRP-1表达仍然较高，但是也在 fiver层中检测到，在推测的星形胶质细胞和米勒细胞过程中，LRP- 1与GFAP在该层中共定位。在使用由高渗盐水青光眼模型诱导的高 眼压大鼠制备的视网膜切片进行的研究中获得类似的α2巨球蛋白上 调和LRP共定位的数据(数据未显示)，提示该结果对于一种青光 眼动物模型不是特异的。
对大鼠房水的半定量western印迹分析证明在高IOP眼中比正 常对侧眼中激活的α2巨球蛋白显著增多(数据未显示)。与这些发 现相符，使用在手术期间收集的人房水进行的半定量研究证明激活 的α2巨球蛋白在青光眼房水中平均显著增多，而在白内障患者中没 有显著增多(图6)。
总之，数据表明在2个大鼠动物模型和人类中，α2巨球蛋白在 高眼压中上调，α2巨球蛋白与其受体LRP-1在RGC和其它视网膜 层中共定位，并且也存在于房水中。
在体内确认α2巨球蛋白为青光眼治疗靶标
眼内注射.在眼睛颞上侧四分之一进行结膜切开。用30G针在 眼壁上形成穿孔，以允许套管进入眼眶中。用直立微电极拉伸器 (Narishige)制备的玻璃套管(10μm厚)通过塑料管与Hamilton注 射器连接，以分配抗α2巨球蛋白兔抗体(Calbiochem)、对照PBS或 对照兔抗体(Sigma)的溶液。在术后第14天和第21天进行注射(在 具有正常IOP的假手术的对照眼中，以及具有高IOP的烧灼的眼 中)。眼内注射2μl的体积，其中含有总共大约2μg抗体。选择该 量是因为在完整大鼠视网膜的定量western印迹分析中估计在青光眼 眼睛中总共有大约1μg α2巨球蛋白(数据未显示)。眼压不受眼 内注射的影响，高IOP眼保持高IOP，正常IOP眼保持正常IOP (数据未显示)。
已经证实α2巨球蛋白与LRP-1的相互作用对神经元有害 (Lopes MB等人，FEBS Lett 338：301-305，1994；Yepes M等人，J Clin Invest 112：1533-1540，2003)，包括对RGC有害(Birkenmeier G等人， Neuroreport 8：149-151，1996；Birkenmeier G等人，FEBS Lett 416：193- 196，1997；Herz J，J Clin Invest 12：1483-1485，2003)。
为了评价α2巨球蛋白在RGC死亡中的可能的作用，向正常眼 睛中显微注射α2巨球蛋白，以确定是否接着发生青光眼样RGC死 亡。在这一例子中，通过单一眼内注射向正常眼睛中递送总共1-2 μg的α2巨球蛋白，在注射后第14天或第28天通过逆行标记对存活 的RGC进行计数。选择1-2μg的量以最好地模拟从大鼠高眼压模型 的青光眼眼睛的房水中定量的α2巨球蛋白的总量(数据未显示)。
与注射PBS载体的对侧眼组相比，快速眼内α2巨球蛋白注射导 致RGC进行性损失。在三个独立的实验中(每组n＝3、2、6只眼)， 在α2巨球蛋白注射后2周和4周与载体PBS相比分别有11±3％ (p≤0.01)和28±11％(p≤0.001)的RGC损失。
这些数据提示α2巨球蛋白诱导进行性RGC死亡，其动力学与 高眼压诱导的动力学相当。与以前的显示α2巨球蛋白mRNA和蛋白 质不依赖于高IOP持续过量表达的结果结合起来，这些结果有助于 解释高IOP正常化后的进行性RGC死亡。
利用第二个实验例证实α2巨球蛋白在RGC死亡中的作用。向 具有高IOP的青光眼眼内注射抗α2巨球蛋白的中和抗体，以确定是 否可以阻止RGC死亡。该实验模型是在开始α2巨球蛋白中和治疗 之前诱导高IOP 14天，以触发α2巨球蛋白的过量表达和RGC损 伤。应用中和作为单一治疗，或者与每日倍他洛尔治疗联合，以更 好地反映用降压药同时治疗青光眼患者的临床情况。中和抗体在烧 灼后第14天和21天给药，在术后第42天计数通过逆行标记鉴定的 活的RGC。在这个方案中，在第21天和第42天之间不给予抗体。 对照大鼠用对照抗体、盐水处理，或者不注射(见表3)。
高IOP 42天后，与正常IOP相比有33±6％RGC的损失(表 4，第3行对比第1行)。高IOP中的RGC损失是依赖于时间的。 在高IOP第28天有19±5％RGC的损失，高IOP第14天有8±5％ RGC的损失(表4，第4行和第5行)。每日应用倍他洛尔(从第 14天到第42天)将IOP正常化使RGC损失显著减少到19±1％ (表4，第8行对比第3行)。在青光眼第14天和第21天两次单独眼 内注射抗α2巨球蛋白抗体使RGC损失减少到21±3％(表4，第7 行对比第6行和第3行)。用抗α2巨球蛋白抗体联合倍他洛尔治疗 具有明显的神经保护作用，使RGC损失显著降低至11±4％(表4， 第10行对比第9行)。这种联合治疗明显优于单独的任一种治疗(表 4，第10行对比第7行和第8行)。联合治疗中的RGC计数与眼内 注射对照抗体的正常IOP眼中的RGC计数在统计学上没有不同(表 4，第10行对比第2行)，并且与经受14天高IOP的眼睛在统计学 上没有不同(表4，第10行对比第5行)。
对照抗体或盐水的对照眼内注射不改变正常视网膜中的RGC计 数(数据未显示)或者青光眼第42天的RGC计数(表4，第6行对 比第3行)，并且不改变应用倍他洛尔使IOP正常化的保护作用 (表4，第8行对比第9行)。
讨论
α2巨球蛋白基因上调
α2巨球蛋白基因和蛋白质仅在高IOP大约7天后就上调，不依 赖于高眼压，其表达持续超过20天。α2巨球蛋白mRNA的诱导对 于高IOP是特异性的，并且在视神经轴突切开术后不提高。因此， 短期高眼压足以引起视网膜中高眼压特异性的、长期的提高。这些 数据确定α2巨球蛋白在烧灼大鼠青光眼模型以及高渗盐水大鼠青光 眼模型中作为一种IPREG(数据未显示)，也证明了在青光眼人眼 中的表达高于白内障眼睛。
α2巨球蛋白损伤的机理
在青光眼中，α2巨球蛋白及其LRP-1受体富含于RGC中， LRP-1-α2巨球蛋白相互作用对于各种类型的神经元有害(Lopes MB 等人，FEBS Lett 338：301-305，1994；Yepes M等人，J Clin Invest 112：1533-1540，2003)，包括对RGC有害(Birkenmeier G等人， Neuroreport 8：149-151，1996；Birkenmeier G等人，FEBS Lett 416：193- 196，1997；Herz J，J Clin Invest 112：1483-1485，2003)。
与α2巨球蛋白的神经毒性作用相符，这种蛋白质在正常眼睛中 的眼内运输导致青光眼样RGC损失；而该蛋白质的中和显著减少或 延迟了青光眼中的RGC死亡，特别是在与眼压正常化药物联用时。
神经毒性机理包括通过激活NMDA受体(NMDAR)提高iCa++， 以及调节海马神经元中的谷氨酸盐神经传递(Bacskai BJ等人，Proc Natl Acad Sci 97：11551-11556，2000；Qui Z等人，J Biol Chem 277：14458-14466，2002；Qui Z等人，Neuroscience 122：291-303，2003； Qui Z等人，J Biol Chem 279：34948-34956，2004)。因此，眼中α2巨球 蛋白的上调可以使NMDAR具有正常的兴奋性活性，导致RGC死 亡。α2巨球蛋白也结合并且中和视网膜神经营养蛋白，特别是神经 生长因子(NGF)(Chiabrando GA等人，J Neurosci Res 70：57-64，2002； Skornicka EL等人，J Neurosci Res 67：346-353，2002)，NGF是重要的 RGC的存活或保持因子。因此，α2巨球蛋白的过量表达将导致生长 因子的生物利用度降低(参见图7中的模型)，并且可能是关于为 什么外来NGF的运输不能保护青光眼中的RGC的一种解释。
其它上调的基因和RGC损伤的关系
在高眼压中上调的其它IPREG可能与RGC死亡有关。特别感 兴趣的是一些这样的IPREG可以与α2巨球蛋白协同作用。
上调的PSD95/SAP90-相关蛋白-4(PSD95/SAP90)和GTPase Gzα 与NMDAR活性有关。PSD95/SAP90在不同于血影蛋白(spectrin) 的部位结合NMDAR的C-末端(Wechsler A和Teichberg VI，EMBO J 17：3931-3939，1998)，并且通过src-家族激酶诱导NMDAR磷酸化和 激活(Hou XY等人，Brain Res 955：123-132，2002)。Fyn-PSD95-NR复 合物制剂增强了脑缺血中的细胞死亡，而沉默化的PSD95减少了缺 血后神经元细胞死亡(Hou XY等人，Neurosci Lett 385：230-233， 2005)。
激活NMDAR的src-家族激酶(Hou XY等人，Brain Res 955：123- 132，2002)本身被蛋白质酪氨酸磷酸酶(Lei G等人，EMBO J 21：2977- 2989，2002；van Zundert B等人，Trends Neurosci 27：428-437，2004) (PTP)激活，因此上调的PTP-γ(PP1)可能与青光眼和RGC应激相 关。而且，蛋白质酪氨酸磷酸酶活性改变了NMDAR复合物中的亚 单位装配(Ferrani-Kile K和Leslie SW，Pharmacol Exp Ther 314：86-93， 2005)，并且在PTP-γ(PP1)和NMDAR之间存在正反馈回路(Szatmari E等人，J Biol Chem 280(45)：37526-35，2005)。
上调的Gzα是NMDAR信号的直接相互作用物和介质。实际上 已经报道了α2巨球蛋白/LRP-1受体和GTPase之间的功能增强加剧 了神经元死亡(Hashimoto Y等人，J Neurosci 20：8401-8409，2000)。视 网膜Gzα也可与几种Gi-偶联的受体的活性有关，所述受体包括5-羟 色胺(serotonin)和阿片样受体(Connor和Christie，1999)。Gzα在神经 元中高度表达(Kelleher KL等人，Brain Res Dev Brain Res 107：247-253， 1998)，并且被逆向转运到末端，在这里它可以通过减弱RAP-1活性 (Johanson SO等人，Neurochem Res 21：779-785，1996)抑制神经营养蛋 白信号发生和分化(Meng J和Casey PJ，J Biol Chem 277：43417-43424， 2002)(参见图7)。
基因下调和RGC损伤
视网膜双载蛋白(一种在胞吞作用和囊泡内化和转运中起关键 作用的蛋白质)的下调(Di Paolo G等人，Neuron 33：789-804，2002； Tomizawa K等人，J Cell Biol 163：813-824，2003)可以解释青光眼中受 损的轴突运输。双载蛋白由RGC表达(Hosoya O和Tsutsui K， Neurosci 19：2179-2187，2004)。同样，下调的RKIAS43是一种与突 触小泡膜蛋白VAT-1(一种胆碱能突触小泡膜蛋白)具有98.9％同 源性、与囊泡胺转运蛋白1具有80％同源性的EST；提示在胞吞作 用和囊泡功能中起作用。
减少的轴突运输在传统上被解释为由高压引起的压缩导致的视 神经头的机械″生理轴突切开术″。上述数据证明高眼压通过引起囊 泡运输蛋白表达的长期降低，引起逆向缺乏并且可以导致RGC死 亡，可以在功能上模拟生理轴突切开术。
下调的解旋酶与DNA修复有关，并且较低的DNA修复可以加 剧细胞死亡。与RGC死亡特别有关，解旋酶在功能上与拓扑异构酶 相关(Howard MT等人，Proc Natl Acad Sci 91：12031-12035，1994)，拓 扑异构酶活性是双载蛋白的转录诱导绝对需要的(Tsutsui K等人，J Biol Chem 216：5769-511％，2001)。因此，图7模型中所示的双载蛋 白的下调与解旋酶的下调相一致。最后，下调的淀粉状蛋白前体样 蛋白2与铜的内稳态有关，并且可能参与神经保护(White AR等人，J Neurosci 22：365-376，2002)。它们的缺乏可以使RGC对应激敏感。
结论
体内证据表明在大鼠青光眼模型中，高眼压调节一组关键的视 网膜基因产物。一组基因的表达由短期高眼压选择性调节，并且长 期持续改变，甚至在用药物使高眼压正常化后。与RGC死亡有关的 基因产物上调，而与RGC保持或存活有关的基因产物下调。可溶性 蛋白质α2巨球蛋白，一种明显上调的视网膜基因产物，被确认为防 止青光眼中RGC死亡的治疗靶标。
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相关申请
本申请要求2005年11月22日申请的美国临时申请No. 60/739,570的优先权。上述申请的完整内容在此引入作为参考。