乳清酸蛋白(whey acidic protein，WAP)最初从啮齿类动物的乳汁中分离出来，由于 蛋白为酸性蛋白，故而得名。之后，陆续从骆驼、兔、猪以及有袋目的负鼠，袋鼠的乳汁 中发现了WAP蛋白的存在，是一种广泛存在的乳清蛋白。所有的乳清酸蛋白都含有多个 半胱氨酸丰富区，每个区域有8个半胱氨酸，组成一个四对二硫键中心(four-disulfide core， 4-DSC)的结构域。在这个结构域里，6个半胱氨酸的相对位置和距离是固定的，只有两 个半胱氨酸的相对距离是可变的。4-DSC结构域除了半胱氨酸和一些位置保守的脯氨酸 (P)、谷氨酸(G)、天东氨酸(D)和赖氨酸(K)以外，其他部分保守性很低。从database中所 有已知的含有4-DSC的蛋白序列分析表明，4-DSC结构域的组成可以用以下模式表示： C1-(Xn)-C2-(Xn)-C3-(X5)-C4-(X5)-C5C6-(X3-X5)-C7-(X3-X4)-C8，X表示任何氨基酸，n表示 任何数量。在第一个半胱氨酸的附近，通常还有一个被称为WAP基序的保守序列， KXGXCXP。具有这样结构特征的蛋白，被称为乳清酸蛋白类蛋白，或乳清酸蛋白结构域 蛋白。在所有乳清酸蛋白结构域家族的成员中，一大类是来源于乳腺的乳清酸蛋白(WAP)， 另外一大类是非乳腺来源的小分子分泌蛋白，多为蛋白酶抑制剂。
随着基因组测序的飞快进程和大量EST序列的提交，公共数据库里含有4-DSC结构 域的非乳腺分泌蛋白越来越为人们所知。这些蛋白在各个组织里表达，多数只具有一个 4-DSC结构域和一些其他的功能域，功能也非常多样，大多数具有蛋白酶抑制剂活性。目 前，在人类基因组中，4-DSC结构域编码信息出现在一些不同的染色体上，其中很多编码 具有蛋白酶抑制剂功能的蛋白，如，在染色体16q24上的前列腺基质蛋白20(prostate stromal protein 20，ps20)，位于X染色体上的Kallmann综合症(低促性腺激素无睾症)基 因，位于染色体20q上的含有多个4-DSC结构域编码信息的基因簇，编码elafin、分泌白 细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、副睾蛋白(HE4)以及两个尚未鉴定的蛋白序列。ps20只有 一个4-DSC结构域，有生长抑制活性，对上皮细胞的增值有调节作用，被认为是一个潜 在的肿瘤抑制基因。副睾蛋白HE4最初在人、狗和兔的副睾中被发现，最初被认为有蛋 白酶抑制剂功能，与精子的除能相关，随着研究的深入，人们发现该基因在呼吸道、唾液 腺和肾脏等组织中都有表达，在卵巢癌细胞中甚至出现过表达，是卵巢癌的标记分子。从 鼠的基因组里克隆到一个在副睾和肾脏中表达的类似蛋白，据研究具有抗菌活性。研究得 最深入的是SLPI和elafin，两者都是具有抗菌活性的蛋白酶抑制剂，SLPI从最初由唾液 中分离出来到现在，其生物功能被广泛的揭示出来。SLPI由分泌或腺状上皮细胞表达， 许多组织中都可以检测到SLPI的表达，支气管、腮腺、大小肠、皮肤、乳腺、胰腺、雌/ 雄性生殖道以及肾脏等等。SLPI除具有跟其蛋白酶抑制剂活性相关的抗炎、抗菌活性以 外，还具有细胞增值的调控作用。Zhang等研究了SLPI对人子宫内膜上皮细胞的生长调 节作用，发现SLPI能增加细胞周期因子D1的表达，而对抑制原癌基因p21ras的LOX蛋 白以及IGFBP-3、TGF-β1的表达起着负调控的作用，暗示SLPI在上皮癌细胞中的高表 达是导致癌细胞增值异常的原因之一。
在大海马总RNA中分离发现一个编码WAP结构域家族的全新蛋白的基因，该蛋白具 有3个WAP结构域家族成员特有的4-DSC结构域和WAP基序，从blast结果来看，该蛋 白与从鲑鱼体腔液中分离出来的在排卵期表达量上调的排卵相关蛋白有最高的同源性(57 ％)，该排卵相关蛋白也属于WAP结构域蛋白家族，具有蛋白酶抑制剂活性和抗菌活性， 在鲑鱼体腔液中对卵起到保护作用，推测该新基因为一个新的蛋白酶抑制剂。对该蛋白的 功能进行研究能给WAP结构域家族的功能与结构域之间的关系提供新的线索和思路，并 有潜力开发为抗菌消炎药物。

本发明的目的在于提供一种新的海马蛋白酶抑制剂基因及其编码的蛋白。
本发明的另一目的在于提供上述基因编码的蛋白在制备抗菌消炎药物中的应用。
本发明用RT-PCR的方法，从雄海马总RNA中分离得到的海马蛋白酶抑制剂基因Hpi， 其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
上述本发明基因编码的蛋白(重组海马蛋白酶抑制剂，命名为hkHPI)，其氨基酸序 列如序列表中<400>2序列所示；该蛋白等电点为6.55，分子量为15.4千道尔顿。
该蛋白hkHPI是通过表达载体pETTRX-Hpi在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的， 表达量可达140mg/L。
所述表达载体pETTRX-Hpi是通过将Hpi基因插入到原核融合表达载体pETTRX(中 国专利申请号00124832.4)的Kpn I/Not I位点上而得到的，它是以硫氧还蛋白为融合伴 体，中间插有6×His的亲和标记位点及蛋白酶EK识别位点的高效表达载体。
本发明所选择的海马属于大海马(Hippocampus kuda Bleeker)，采自亿达洲海马养 殖场。
大海马cDNA文库的构建：首先匀浆海马组织，提取总RNA。反转录为一链cDNA 后合成双链cDNA，双链cDNA与pcDNA3.0(购自Invitrogen公司)载体连接后转化E.coli 并保存每个克隆子。通过对以上重组文库克隆进行大规模随机序列测定，从中得到了1个 新的编码海马蛋白酶抑制剂的克隆，命名为Hpi(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。 新基因编码143个氨基酸的成熟肽hkHPI(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)， 等电点为6.55，分子量为15,400道尔顿，具有典型的乳清酸蛋白一级结构的特征，分子 内含有23个半胱氨酸，形成11对二硫键(包含3个4对二硫键中心结构域，除第一个不 完整外，C端的两个都完整)。
本发明通过设计了一对引物，将编码海马蛋白酶抑制剂的新基因Hpi用PCR方法从 pcDNA3.0载体上扩增出来，克隆到原核融合表达载体pETTRX上，构建成表达质粒 pETTRX-Hpi，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体(pETTRX-Hpi)以T7为 启动子，采用分子伴侣TRX为融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达， TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设 计的上游引物含有蛋白酶EK位点，以便外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时 间，温度等条件的摸索和优化，hkHPI融合蛋白的表达量可达到140mg/L，并且基本上完 全处于可溶状态。
本发明还摸索和优化了重组hkHPI蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+ Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的融合蛋白，融合蛋白经EK蛋白酶切 割和进一步的S100凝胶柱层析，可得到纯度在85％以上的成熟重组海马蛋白酶抑制剂蛋 白。
本发明获得的重组海马蛋白酶抑制剂具有抑制丝氨酸蛋白酶的生物活性。将重组蛋白 hkHPI加入胰蛋白酶和弹性蛋白酶中，发现混合作用后蛋白酶活性明显降低。此外，重组 蛋白hkHPI还有抑制细菌生长的作用，能够不同程度的抑制革兰氏阴性、革兰氏阳性细菌 的生长，可用于制备抗菌消炎药物。
由本发明的含有hkHPI海马蛋白酶抑制剂成熟肽编码序列的表达质粒pETTRX-Hpi 经Kpn I/Not I双酶切，可得到429bp的片段，即为海马蛋白酶抑制剂hkHPI成熟肽编码 序列(其中包含蛋白酶EK识别位点)。
本发明的表达质粒的复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing. Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3) 菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。
附图说明
图1为本发明的海马蛋白酶抑制剂蛋白和乳清酸蛋白类的几个蛋白酶抑制剂蛋白的 比较结果，其中“*”表示相同；“：”表示差异较小；“.”表示差异明显；空格表示 完全不同。
图2为大海马总RNA电泳结果。
图3为海马蛋白酶抑制剂Hpi基因的RT-PCR电泳结果。1：1Kb DNAmarker；2：PCR 目的条带。
图4为含基因Hpi的pETTRX-Hpi表达质粒酶切鉴定图。1：1Kb DNA marker；2： pPETTRX-Hpi Kpn I/Not I双酶切。
图5为重组hkHPI蛋白诱导表达、亲和层析电泳图。1：经IPTG诱导的pETTRX-Phi 菌体总蛋白；2：诱导菌超声上清总蛋白；3：Ni2+亲和层析穿流蛋白峰；4：C液洗脱峰 总蛋白；5：D液洗脱峰总蛋白；6：E液洗脱峰总蛋白；7：low molecular weight marker。
图6为重组hkHPI分子筛层析的SDS-PAGE分析。1：经过亲和层析得到的TRX-Hpi 融合蛋白；2：TRX-Hpi融合蛋白经EK蛋白酶切割；3：二次Ni亲和层析；4：S-100 分子筛峰(纯化的重组Hpi)。5：low molecular weight marker。
图7为含基因Hpi的重组表达质粒pETTRX-Hpi构建图。

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制 本发明。
实施例一：大海马总RNA的提取和cDNA文库的构建
总RNA的提取和cDNA合成：分离玫瑰红绿海葵触手，采用Trizol法提取触手总R NA，抽提去除蛋白质。获得总RNA浓度为1.04μg/μl，其A260/A280＝1.637，经1％甲醛变 性胶电泳检测可见清晰的18s和28s两条带，比值＞1(见图2)，表明总RNA完整性良好。 取1ug总RNA以SMART III oligonucleotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG CCATTATGGCCGGG-3′)和CDSIII/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGAC ATG-d(T)30N-1N-3′)进行逆转录合成第一链，得到10μlcDNA第一链产物。2μl第一链产物 以5’PCR primer(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)，CDS III/3’PCR primer(5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N-1N-3’)进行二链扩增。将二链蛋白酶K 消化并纯化后进行Sfi I切割，连接入同样Sfi I酶切处理过的pcDNA3.0文库载体上。 随机测序获得一个蛋白酶抑制剂基因Hpi的表达序列标签(EST)，经软件分析发现该EST 为全长。
引物设计和RT-PCR扩增：依据该EST的两端核苷酸序列，用oligo引物设计软件辅 助分析，设计出两条引物。
上游引物(A1)：5’-AGG ATT CTC TCA AGA TTC A-3’
下游引物(A2)：5’-TC AGATGA GCT CAT GAC A-3’
每50μl PCR反应体积加入1μl cDNA单链作为模板，PCR扩增，电泳检测，发现在 430bp附近出现预期的特异性扩增带(见图3)，回收此带，连接入T载体随机测序，序列 与相应文库载体上的EST序列一致。
实施例二：重组海马蛋白酶抑制剂基因序列的分析
Blast同源分析表明，海马蛋白酶抑制剂基因Hpi编码167个氨基酸残基的前体蛋白， 其中包括24个氨基酸残基的信号肽和143个氨基酸残基的成熟蛋白。成熟蛋白分子量为 15.4kD，等电点为6.55，不含跨膜区，在84位氨基酸处有一个N糖基化位点；在第27 和45位氨基酸处各有一个蛋白激酶C磷酸化位点；52位氨基酸处有一个酪蛋白激酶II磷 酸化位点；在整个蛋白序列中，包含了3个乳清酸蛋白类的“4对二硫键中心”(four-disulfide core，4-DSC)结构域的标签。
由Blast结果还可以看出，hkHPI除了在“4对二硫键中心”的骨架部分与WAP家族 成员具有较高的相似性以外，其余氨基酸缺乏同源性，这一点上与该家族其他成员之间的 特征相吻合。
海马假定蛋白酶抑制剂的成熟蛋白具有WAP家族成员共有的保守的功能结构域(图 1)，由于该结构域是一个包含4对二硫键的保守结构，故称该结构域为“4对二硫键中心” (4-DSC)结构域。4-DSC结构域中含有的8个保守的半胱氨酸(C1～C8)之间相互成键， 构成稳定的刚性骨架结构，其二硫键的组成模式如下：SS1(C1，C6)，SS2(C2，C7)，SS3(C3，C5)， SS4(C4，C8)。各半胱氨酸之间的距离也有其保守性， C1-(Xn)-C2-(Xn)-C3-(X5)-C4-(X5)-C5-C6-(X3，X5)-C7-(X3，X4)-C8，X代表任何氨基酸，n代 表任意的氨基酸个数，(X3，X4)代表3～4个氨基酸。在C3与C8之间的序列是保守性相对 高的，而C2的位置则可变性较高。在对该家族所有成员的氨基酸序列进行的比对研究中 发现，位于C8位置附近，有一个保守的基序CXXP，在C1附近有一个保守基序KXGXCP， CX到C6之间也有一个保守基序CXXDXDCXGXXKCC，，在具有多个该结构域的家族成 员中，第一个结构域有时会不完整，存在C缺失的情况，但C端的最后一个结构域都是 完整的。以上WAP家族成员二级结构上的特征，海马假定蛋白酶抑制剂都符合，hkHPI 共有3个4-DSC结构域，除了第一个结构域中C2缺失外，第2、3结构域都是完整的。
由此可见，虽然hkHPI与不同来源的WAP家族成员之间相似性偏低，但功能结构域 上的保守性使我们进一步确认，hkHPI是新发现的WAP家族成员，具有该家族成员所具 有的蛋白酶抑制剂的活性。
实施例三：重组海马蛋白酶抑制剂表达质粒的构建
依据Hpi基因的两端序列合成一对引物，上游引物含Kpn I和Enterokinase切割位点， 下游引物含Not I切割位点。
上游引物(B1)：
5’-GG G GTA CCG  ACG ACG ACG ACA AAC AGG ATT CTC TCA AGA TTC A-3’
       Kpn I    Enterokinase site
下游引物不(B2)：
5’-ATA AGA AT G CGG CCG CTT ATC AGA TGA GCT CAT GAC A-3’
                Not I    Stop codon
以含Hpi基因的pcDNA3.0质粒为模板，B1、B2为引物PCR扩增，得到特异扩增的 单一条带，产物大小在450bp左右。PCR扩增产物先以Kpn I/Not I的组合克隆到原核融 合表达载体pPETTRX上，得到重组表达载体pETTRX-Hpi(其构建过程如图7所示)。表 达载体pETTRX-Hpi经Kpn I/Not I进行双酶切鉴定(酶切结果见图4)。表达载体 pETTRX-Hpi中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含Enterokinase蛋白酶 切割位点，以便切除融合伴侣TRX。
实施例四：重组海马蛋白酶抑制剂融合蛋白的表达
将pETTRX-Hpi转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE 电泳分析表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件DNA TOOL5.1 预测的理论值30kD相符(图5)。
经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索：菌体扩大培养不同时间后诱导表达 比较，基因工程菌的培养条件为：接单菌落于50ml氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm 培养过夜，取过夜培养物20ml接种于2L的氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养 至OD600＝0.6(扩大培养约2h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为0.1mM 和0.2％，25℃，250rpm诱导培养10h后离心收获菌体。经SDS-PAGE电泳分析分析表明， 在此条件下HPI融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的20％以上，几乎完全处于可溶状态(图 5)。
实施例五：重组海马蛋白酶抑制剂融合蛋白的纯化及成熟蛋白的获得
将收获的总菌体用TE(pH8.0)洗涤，再用Tis(50mM，pH8.0)悬浮，超声处理后，裂解 上清液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析一步纯化，经SDS-PAGE分析和薄层扫描 分析表明融合蛋白的纯度达到80％(图5)。以1L基因工程菌培养物为材料，最终获得约 120mg纯化的融合蛋白。
为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，缩短对重组蛋白的处理时间，在用 Ni2+亲和色谱层析纯化重组蛋白时，我们采用一步法进行纯化。根据载体质粒 pETTRX-Hpi所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点，我们选用了较简化 的洗脱条件：50mMTris，500mMNaCl，pH7.0(A液)；50mMTris，500mMNaCl，pH8.0(B液)； 100mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH8.0(C液)；150mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl， pH8.0(D液)；250mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH8.0(E液)。重组hkHPI多肽在 E液被洗脱下来(图5)。从SDS-PAGE结果来判断分离效果最好的部分。
利用Folin-酚法测定重组hkHPI的蛋白浓度，收获浓度在0.7mg/ml以上的洗脱液，加 入Enterokinase进行切割，用SDS-PAGE检测酶切结果，可明显看到20kD附近代表成熟hkHPI 的谱带(图6)。将反应液用Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析柱纯化(条件同前)，收 获含成熟hkHPI的洗脱峰，并用Sephacryl S100凝胶过滤层析柱进一步纯化(洗脱液为 PBS)，便得纯度在85％以上的成熟重组海马蛋白酶抑制剂蛋白hkHPI(图6)。
实施例六：重组海马蛋白酶抑制剂融合蛋白的酶抑制剂活性
将实施例五所得的重组蛋白hkHPI溶液经G-25 sepharose层析柱更换缓冲系统，由E 液(含250mM咪唑和500mM NaCl的50mM Tris，pH8.0)换成含有100mM NaCl的50mM Tris(pH8.0)溶液，且用后一种溶液将重组蛋白hkHPI溶液稀释至575nM。取稀释好的 重组蛋白hkHPI溶液200μl，与等体积(200μl)的0.02mg/ml胰蛋白酶混合，25℃放置30 分钟。另取一管不加重组蛋白的作为完全活性对照，一管不加胰酶也不加重组蛋白的做为 空白对照。
25℃条件下，在以上各管中加入1ml BAEE底物溶液，混匀，在253nm的光波长下连 续测定5分钟内光吸收值的变化。胰酶一个酶活单位定义为每分钟催化底物发生反应，使 253nm的光吸收增加0.001所需要的酶量。胰酶活性计算公式为：U＝k×V/(0.001×0.2)， 其中，k为A253-时间曲线的斜率，V为反应总体积(ml)，0.2为测活时胰酶溶液的体积(ml)。 斜率的降低为hkHPI的抑制活性。结果显示，重组蛋白hkHPI对胰酶有明显抑制作用。
                             序列表
<110>中山大学
<120>一种海马蛋白酶抑制剂基因及其应用
<160>2
<210>1
<211>429
<212>DNA
<213>大海马(Hippocampus kuda Bleeker)
<220>
<221>mat peptide
<222>(1)…(429)
<400>1
cag gat tct ctc aag att cac cca aaa cca ggc gaa tgt gcc cgt cgt   48
Gln Asp Ser Leu Lys Ile His Pro Gly Pro Gly Glu Cys Ala Arg Arg
1               5                   10                  15
gct tta ctt gca aca tca aaa aag gga tgt gtg agt gac caa gac tgc   96
Ala Leu Leu Ala Thr Ser Lys Lys Gly Cys Val Ser Asp Gln Asp Cys
            20                  25                  30
cct ggg gac cac aag tgt tgc gtc ttc gac tgt gaa gat gtc tgc gtc   144
Pro Gly Asp His Lys Cys Cys Val Phe Asp Cys Glu Asp Val Cys Val
        35                  40                  45
cct cct tct ttc aat agg cca gga gtg tgt ccg aat aca aca ggg cag   192
Pro Pro Ser Phe Asn Arg Pro Gly Val Cys Pro Asn Thr Thr Gly Gln
    50                  55                  60
atc ggg ttt tgt gcc ttc ctc tgc ttt gat gac aga gac tgt tcg gac   240
Ile Gly Phe Cys Ala Phe Leu Cys Phe Asp Asp Arg Asp Cys Ser Asp
65                  70                  75                  80
gag agg aaa tgc tgc cgc aac gga tgt ggt gga tat aat tgc atg gta   288
Glu Arg Lys Cys Cys Arg Asn Gly Cys Gly Gly Tyr Asn Cys Met Val
                85                  90                  95
cct ttc aaa gtg aag ccg ggc cat tgc cct ccg ccc gaa gta att acc   336
Pro Phe Lys Val Lys Pro Gly His Cys Pro Pro Pro Glu Val Ile Thr
            100                 105                 110
acg tgt gca tcg aac tgc ttc cat gac ggt cag tgt cca ggt gac cag   384
Thr Cys Ala Ser Asn Cys Phe His Asp Gly Gln Cys Pro Gly Asp Gln
        115                 120                 125
aaa tgc tgc cag aca gcc tgt ggt caa ggc tgt cat gag ctc atc       429
Lys Cys Cys Gln Thr Ala Cys Gly Gln Gly Cys His Glu Leu Ile
    130                 135                 140
<210>2
<211>143
<212>PRT
<213>大海马(Hippocampus kuda Bleeker)
<220>
<221>mat peptide
<222>(1)…(143)
<400>2
Gln Asp Ser Leu Lys Ile His Pro Gly Pro Gly Glu Cys Ala Arg Arg
1               5                   10                  15
Ala Leu Leu Ala Thr Ser Lys Lys Gly Cys Val Ser Asp Gln Asp Cys
            20                  25                  30
Pro Gly Asp His Lys Cys Cys Val Phe Asp Cys Glu Asp Val Cys Val
        35                  40                  45
Pro Pro Ser Phe Asn Arg Pro Gly Val Cys Pro Asn Thr Thr Gly Gln
    50                  55                  60
Ile Gly Phe Cys Ala Phe Leu Cys Phe Asp Asp Arg Asp Cys Ser Asp
65                  70                  75                  80
Glu Arg Lys Cys Cys Arg Asn Gly Cys Gly Gly Tyr Asn Cys Met Val
                85                  90                  95
Pro Phe Lys Val Lys Pro Gly His Cys Pro Pro Pro Glu Val Ile Thr
            100                 105                 110
Thr Cys Ala Ser Asn Cys Phe His Asp Gly Gln Cys Pro Gly Asp Gln
        115                 120                 125
Lys Cys Cys Gln Thr Ala Cys Gly Gln Gly Cys His Glu Leu Ile
    130                 135                 140